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MEMORIA JUSTIFICATIVA DEL PROYECTO URA10/02:
DETERMINACIÓN DEL ORIGEN DE COMPUESTOS DISRUPTORES
ENDOCRINOS Y ESTUDIO DE LA PRESENCIA Y CARACTERIZACIÓN DE
LOS EFECTOS DE DISRUPCIÓN ENDOCRINA EN POBLACIONES DE
PECES (CHELON LABROSUS) DE ESTUARIO (RESERVA DE LA BIOSFERA
DE URDAIBAI, ESTUARIOS DEL BUTRÓN Y OIARTZUN) Y COSTA VASCA.
Investigadores: Maren Ortiz-Zarragoitia (IP), Miren P. Cajaraville, Maria Carmen
Barbero, Teresa Serrano y Eunate Puy-Azurmendi (Grupo de Investigación consolidado
de Biología Celular en Toxicología Ambiental), Departamento de Zoología y Biología
Celular Animal, Facultad de Ciencia y Tecnología, UPV/EHU.
En Leioa a 14 de Marzo de 2011.
Contacto:
Dr. Maren Ortiz-Zarragoitia
Departamento de Zoología y Biología Celular
Facultad de Ciencia y Tecnología
Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea
Bº Sarriena, s/n, 48940 Leioa
Telf: 946013548, Fax: 946013500
e-mail: [email protected]
http://www.ehu.es/GrupoBCTA
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Determinación del origen de compuestos disruptores endocrinos y estudio de la
presencia y caracterización de los efectos de disrupción endocrina en poblaciones
de peces (Chelon labrosus) de estuarios (Reserva de la Biosfera de Urdaibai,
estuarios del Butrón y Oiartzun) y costa vasca.
RESUMEN: Los disruptores endocrinos son capaces de interaccionar con el sistema
endocrino de los organismos, afectando entre otros, la reproducción y el desarrollo de
los mismos. Estas alteraciones pueden, en caso extremo, producir una disminución
dramática de la población afectada poniendo en riesgo su viabilidad. Algunos de estos
compuestos como los pesticidas, plastificantes, hormonas sintéticas y alquilfenoles entre
otros están recogidos en la Directiva Marco del Agua de la UE. En el presente proyecto
se ha estudiado el origen de los compuestos disruptores endocrinos en cuatro estuarios
de la costa vasca y se ha caracterizado la presencia de efectos de disrupción endocrina
en cuatro poblaciones de mubles. También se han estudiado muestras de mubles
obtenidas en mar abierto. Los resultados han demostrado la presencia de compuestos
disruptores endocrinos en las cuatro poblaciones de mubles estudiadas. Los niveles de
alquilfenoles y hormonas estrogénicas que se cuantificaron en la bilis de los mubles son
similares a los descritos en otras especies que habitan o han sido expuestas a efluentes
de aguas urbanas o de depuradoras. Los mubles de Arriluze, Plentzia y Gernika
mostraron acumulación de alquilfenoles (principalmente nonilfenol), mientras que los
mubles de Pasaia contenían niveles altos de hormonas estrogénicas en bilis. Mencionar
también los niveles elevados de bisfenol A cuantificados en los mubles de Gernika y
también en las poblaciones de Arriluze y Pasaia. En cuanto a las respuestas biológicas
se han observados alteraciones asociadas al aparato reproductor. El estudio histológico
de las gónadas ha demostrado la presencia de individuos intersex en las poblaciones de
Gernika (3/30) y Pasaia (1/30). Además, en las cuatro poblaciones estudiadas se han
cuantificado alteraciones en la expresión de genes diana asociados con el desarrollo y la
reproducción. Cabe mencionar los niveles de expresión elevados del gen de la
vitelogenina en hígados de peces macho de Gernika y Plentzia, confirmando la
exposición de estos organismos a compuestos con actividad estrogénica (feminizante).
Por último destacar, que aunque el estudio de los mubles capturados en mar abierto ha
estado condicionado por las capturas, se ha observado la presencia de un animal con
gónadas intersex (1/200).
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INDICE
FINALIDAD DEL PROYECTO Y OBJETIVOS PLANTEADOS EN LA
SOLICITUD ………………...........................................................................................4
TAREAS DESARROLLADAS …………………………………………………….....6
RESULTADOS Y LOGROS ALCANZADOS …………………………..................13
CONCLUSIONES...…………………………………………………………………..22
CONSIDERACIONES Y RECOMENDACIONES DERIVADAS DEL
PROYECTO…………………………………………………………………………...25
PLAN DE DIFUSIÓN Y TRANSFERENCIA………………………………………27
ANEXO IMÁGENES…………………………………………………………………28
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FINALIDAD DEL PROYECTO Y OBJETIVOS PLANTEADOS EN LA
SOLICITUD
La Directiva Marco del Agua (DMA, 2000/60/CE), aprobada por el Parlamento
Europeo y la Comisión Europea en 2000, establece un marco de actuación comunitario
en el ámbito de la política de aguas. El objeto de dicha Directiva es establecer un marco
para la protección de las aguas continentales, las aguas de transición, las aguas costeras
y las aguas subterráneas. Con este fin la DMA, en sus artículos 8 y 16, establece los
procesos para el seguimiento del estado de las aguas superficiales, de las aguas
subterráneas y de las zonas protegidas y las estrategias para combatir la contaminación
de las aguas. Los estados miembros y las administraciones locales deben desarrollar y
establecer programas de seguimiento del estado de las aguas con objeto de obtener una
visión general, coherente y completa del estado de las aguas en cada demarcación
hidrográfica. Estos programas deben incluir el estudio del estado y potencial químico y
ecológico de las masas de agua. Se establece además el desarrollo de muestreos para el
estudio de parámetros biológicos como la abundancia y composición de la fauna
acuática (especialmente invertebrados y peces). Estos indicadores biológicos descritos
en el Anexo V de la DMA serán aplicables en ecosistemas de masas aguas de transición
(estuarios) y aguas costeras. La composición y la abundancia de especies clave
utilizadas para el desarrollo de estos índices biológicos, depende directamente de la
capacidad reproductiva de dichas especies. Es sabido que ciertos contaminantes
ambientales pueden alterar el sistema reproductor y endocrino de las especies acuáticas
y producir una disminución dramática de la población afectada poniendo en riesgo su
viabilidad. Este fenómeno definido como disrupción endocrina por la Organización
Mundial de la Salud consta de cualquier alteración en el sistema endocrino que afecta,
entre otros, la reproducción y el desarrollo de los organismos y en caso extremo
producir una disminución dramática de la población afectada.
Este proyecto tenía como actuación principal el estudio de la presencia de compuestos
disruptores endocrinos en la costa vasca y la caracterización de los efectos de disrupción
endocrina en peces (Chelon labrosus) de la costa vasca. Nuestro grupo de investigación
había descrito con anterioridad la presencia de efectos de disrupción endocrina en peces
Chelon labrosus (mubles) que habitan la Reserva de la Biosfera de Urdaibai. Estos
peces mostraban gónadas intersex (feminización del tejido gonadal con presencia de
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gametos femeninos dentro del tejido testicular) y niveles elevados de vitelogenina en
plasma. En la solicitud se planteó realizar el estudio en tres estuarios (Urdaibai, Butrón
y Oiartzun) y en peces de mar abierto. Finalmente se incorporó una cuarta población de
mubles (Abra) en base a los datos previos de los que disponíamos y que detallaremos
mas adelante.
Los objetivos específicos que se plantearon en la solicitud fueron lo siguientes:
1- Caracterizar la respuesta de los mubles Chelon labrosus que habitan los estuarios y la
costa vasca en cuanto a parámetros biológicos (biomarcadores) relacionados con la
reproducción y el desarrollo. Para ello se pretende estudiar la presencia e intensidad de
alteraciones gonadales en mubles, con especial énfasis en la observación de posibles
efectos de intersexualidad mediante métodos de histología convencional y evaluar sus
posibles efectos sobre la capacidad reproductiva (fertilización, viabilidad de
gametos…). También determinar en los mubles los niveles de vitelogenina,
biomarcador temprano de xenoestrogenicidad (mediante herramientas de biología
molecular, RT-PCR y ELISA) y de la expresión de genes relacionados con la
reproducción como las aromatasas y de receptores nucleares hormonales (ER y RXR).
2- Cuantificar los niveles de metabolitos de disruptores endocrinos en la bilis de mubles
Chelon labrosus en estuarios y la costa vasca.
3- Determinar el origen de disruptores endocrinos (alquilfenoles, bisfenol A, hormonas
naturales y sintéticas, PAHs, ftalatos y compuestos organoestánnicos) en muestras de
sedimento de la Reserva de la Biosfera de Urdaibai, y en los estuarios del Butrón y el
Oiartzun.
4- Transferir los resultados a la Administración y sentar las bases para el
establecimiento de un programa de seguimiento de los efectos de disrupción endocrina.
También, plantear posibles estrategias de actuación como medidas correctoras o de
remediación.
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TAREAS DESARROLLADAS
Selección de puntos de muestreo y recogida de muestras.
En el presente proyecto se han abordado tres tipos de muestreos diferentes. Primero, y
como se mencionaba en la solicitud, los muestreos en las poblaciones de estuarios se
realizaron durante los meses de mayo-junio. Estos muestreos se realizaron en el canal
de Gernika en la Reserva de la Biosfera de Urdaibai, el puerto de Plentzia en el estuario
del Butrón y en el puerto de Trintxerpe en el estuario del Oiartzun (Puerto de Pasajes).
Además, también se decidió recoger mubles en el puerto de Arriluze en el estuario del
Abra, ya que aunque este punto no estaba recogido en la solicitud se consideró una
población de estudio importante. Nuestro grupo había descrito, en anteriores estudios,
efectos de disrupción endocrina en los mubles de Arriluze y era importante continuar
con su estudio y poder compararlo con las otras poblaciones.
Se recogieron 30 mubles por cada población de estudio, mediante pesca con caña. Los
mubles capturados se anestesiaron sumergiéndolos en una solución subletal de
benzocaína. Posteriormente, se midió su talla desde la parte frontal del pez hasta la parte
final sin incluir la aleta caudal, y también se registró su peso. Inmediatamente se
procedió a extraer sangre de la vena caudal con jeringuillas heparinizadas (2 ml por
individuo), se transfirió la sangre a microtubos eppendorf de 2 mL y se centrifugó la
sangre a 1000 rpm durante 5 min, para extraer el plasma. Se recogió el plasma de los
tubos y se transfirió a nuevos microtubos eppendorf (1.5 mL) que contenían una gota de
aprotinina comercial (Sigma-Aldrich) para evitar la degradación de proteínas. El plasma
se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido y se mantuvo así hasta su transporte al
laboratorio, donde se almacenó congelado a -80ºC hasta su análisis.
Por otro lado, se procedió a la disección de los peces extrayendo el cerebro, las gónadas
y el hígado. El cerebro se introdujo en un vial estéril (2 mL) que contenía RNAlater
(Invitrogen) para conservar el RNA presente en el tejido, y se congeló inmediatamente
en nitrógeno líquido. En el laboratorio, estas muestras fueron almacenadas en
congeladores a -80ºC hasta su análisis. Con una porción de las muestras de hígado y
gónada, también se procedió del mismo modo que con las muestras de cerebro y se
mantuvieron en nitrógeno líquido hasta su transporte al laboratorio. Otra porción de la
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gónada y el hígado se recogió en cassetes de histología y se sumergieron en fijador 10%
de formalina tamponada con 2.5% de glutaraldehído. Se mantuvieron a 4ºC durante 24
horas hasta su posterior procesamiento. El resto de la gónada y del hígado se etiquetó
debidamente envueltos en papel de aluminio y se congelaron en nitrógeno líquido. Estas
muestras se almacenaron a -40ºC a su llegada al laboratorio y forman parte del Banco
de Especimenes de la UPV/EHU, que servirán en futuros estudios. Por último se
recogieron muestras de bilis de cada individuo utilizando una jeringuilla estéril de 1
mL. La bilis se extrajo directamente del saco biliar adyacente al hígado. La muestra de
bilis se transfirió a viales de plástico inerte de 2 mL (Corning) y se congeló rápidamente
en nitrógeno líquido. Posteriormente en el laboratorio se almacenaron las muestras a -
80ºC hasta su análisis.
También se recogieron muestras del sedimento para su posterior análisis químico. Las
muestras de sedimento (unos 500 g) se recogieron manualmente de la capa superficial
en Arriluze, Gernika y Plentzia, y con una draga van Veen en el caso de Pasaia. Los
sedimentos se guardaron en botes de cristal ámbar, previamente lavados con acetona, se
y se transportaron en neveras a 4ºC hasta la llegada al laboratorio, donde se congelaron
a -20ºC. Estas muestras se han enviado al grupo del IDAEA-CSIC de Barcelona para su
análisis.
El segundo tipo de muestreo se realizó en mar abierto. Durante la recogida de muestras
en mar abierto y como se adelantaba en la memoria de solicitud del proyecto, se ha
colaborado con los Dres Javier Franco y Guzmán Diez de AZTI-Tecnalia, que han
facilitado los ejemplares de estudio. AZTI-Tecnalia tiene una red sistemática de
observadores biológicos en los puertos pesqueros de Bizkaia y Gipuzkoa, la cual nos ha
facilitado la información de capturas de mubles a su llegada a puerto. Esta parte del
trabajo ha resultado ser la más compleja, ya que las capturas dependieron de los barcos
de pesca de bajura y solo se consiguieron 200 peces repartidos en cuatro meses. Estos
peces fueron directamente transportados conservados en hielo de la lonja del puerto al
laboratorio, donde fueron procesados siguiendo el protocolo descrito para los peces
capturados en los estuarios.
Por último, el tercer sistema de recogida de muestras ha derivado del problema con la
captura de individuos en mar abierto. Al no conseguirse muestras sistemáticas, se pensó
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en intentar caracterizar el ciclo del muble capturando muestras en una sola población
mensualmente. Esta tarea se inició en Septiembre de 2010 en Pasaia y seguimos
realizando las capturas con el objetivo de cubrir un ciclo reproductor completo. Los
peces en este caso, también son procesados como se ha descrito anteriormente.
Tarea 1: Estudio de los parámetros biológicos relacionados con la reproducción y el
desarrollo de los mubles
Esta Tarea se ha realizado con las muestras de plasma, gónada, cerebro e hígado. El
plasma se almacenó a -80ºC hasta su procesamiento, con el fin de cuantificar los niveles
de vitelogenina mediante ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) específico para
vitelogenina de muble. Este ensayo se ha realizado en colaboración con el grupo del
profesor Ángel Maquieira de la Universidad Politécnica de Valencia (UPV). Se ha
conseguido purificar la proteína vitelogenina de los mubles y tras su inyección en
conejos se ha conseguido aislar anticuerpos específicos para la vitelogenina de los
mubles. El análisis de las muestras de campo consiste en incubar, en placas de 96
pocillos, el plasma de los mubles con los anticuerpos específicos para la vitelogenina
del muble. Tras la incubación, si existe presencia de vitelogenina en la muestra, el
anticuerpo queda atrapado en el pocillo y posteriormente, con un anticuerpo secundario
con actividad enzimática, se consigue colorear el pocillo y se hace una lectura de
absorbancia con un lector de microplacas. En las mismas microplacas junto con las
muestras de plasma, también se miden unos pocillos en los que se ha incluido
vitelogenina purificada de muble a diferentes concentraciones, consiguiéndose una recta
patrón. Esta recta patrón de concentraciones conocidas de vitelogenina servirá para
cuantificar los niveles de vitelogenina en cada muestra de plasma analizada.
En este momento, el desarrollo del análisis de vitelogenina en plasma mediante ELISA
está finalizando, ya que la puesta a punto del sistema específico ELISA ha requerido
más tiempo del estimado. También y junto con la purificación de la vitelogenina, se ha
trabajado en la purificación de la proteína coriogenina. Esta proteína se expresa al igual
que la vitelogenina ante exposición a estrógenos. Varios trabajos destacan que puede ser
incluso un marcador más sensible que la propia vitelogenina. Por lo tanto se ha
procedido al igual que con la vitelogenina a aislar la proteína y desarrollar anticuerpos
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específicos que puedan ser empleados en un sistema de cuantificación rápido, tipo
ELISA. Las muestras de plasma del presente proyecto también serán analizadas para la
cuantificación de la coriogenina en cuanto se termine su puesta a punto. El desarrollo de
ambos sistemas de detección ELISA, redundará en dos herramientas muy útiles,
específicas y rápidas para el estudio de efectos xenoestrógenicos en mubles de la costa
vasca.
Con las muestras para el estudio de los niveles de expresión de genes asociados a la
reproducción (aromatasas cyp19a1 y cyp19a2, vitelogenina y receptores nucleares
hormonales er y rxr), se procedió de la siguiente manera tanto para el cerebro, la gónada
y el hígado. Las muestras fueron descongeladas, se retiró el exceso de RNAlater con un
papel secante y se introdujo cada muestra en un vial de 2 mL que contenía 1 mL de
Trizol (Invitrogen) y microbolas de teflón. Se homogenizaron las muestras en un
disruptor de tejidos (Hybaid). Posteriormente se recogió el homogenizado y se transfirió
a un microtubo eppendorf estéril de 2 mL. Se añadieron 200 µL de cloroformo y se
centrifugaron las muestras a 12000 rpm a 4ºC en una centrífuga eppendorf para la
separación de proteínas, DNA y RNA. Tras este primer centrifugado se recogió el
sobrenadante que contenía el RNA y se transfirió a una columna de extracción de RNA
(RNeasy kit, Ambión). Siguiendo el protocolo del kit comercial de extracción se
consiguió el RNA total de cada muestra. Posteriormente una alícuota de muestra
conteniendo 1 µg/µL de RNA se transfirió a un nuevo microtubo eppendorf estéril y se
procedió a la síntesis de cDNA utilizando otro kit comercial (SuperScript First Strand
Synthesis, Invitrogen). El excedente de RNA de cada muestra se almacenó a -80ºC y las
muestras de cDNA se almacenaron a -40ºC. El análisis de la expresión de los genes de
interés se realizó mediante PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR). Para ello se
utilizaron cebadores y sondas de oligonucleótidos específicos para los genes
seleccionados en mubles, desarrollados recientemente por nuestro grupo de
investigación y sintetizadas por encargo por la compañía AppliedBiosystems. El
proceso consistió en, tras descongelar el cDNA, coger una alícuota de 1 µg de cDNA y
proceder a su análisis con los cebadores y las sondas específicas para cada gen incluidas
en el kit comercial de PCR a tiempo real de AppliedBiosystems. La lectura de los
niveles de expresión se realizó con el termociclador 7100 de AppliedBiosystems.
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Para el estudio histológico de las muestras de hígado y gónada, tras 24 horas en fijador
se transfirieron a alcohol de 70º y se deshidrataron químicamente en un proceso de
alcoholes seriados con ayuda del procesador de tejidos automático Leica ASP300.
Posteriormente se incluyeron en resina de metacrilato (Tecnovit 7100). Se realizaron
secciones en microtomo de 5 µm de grosor y se tiñeron con un protocolo convencional
de hematoxilina/eosina. Finalmente el estudio histológico se realizó en un microscopio
Olympus BX60 acoplado a un sistema de ordenador de captura de imágenes. Se prestó
especial atención a las fases gametogénicas, procesos de intersexualidad y agregados de
melanomacrófagos (células de respuesta inmune en peces).
Tarea 2: Determinación y cuantificación de compuestos disruptores endocrinos
(metabolitos de alquilfenoles, bisfenol A y hormonas estroénicas) en muestras de bilis
de los mubles.
Estos trabajos que en principio se contemplaron pudieran realizarse en el IDAEA-CSIC
de Barcelona, se han realizado finalmente en colaboración con el grupo de Química
Analítica de la UPV/EHU (Dres. Olatz Zuloaga y Asier Vallejo), ya que recientemente
han conseguido optimizar la técnica de cuantificación para muestras de bilis en mubles.
Las muestras de procesaron de la siguiente forma:
Las muestras de bilis se descongelaron y fueron inmediatamente hidrolizadas.
Posteriormente se realizó una hidrólisis enzimática de las muestras asistida por
ultrasonidos focalizados. Las muestras fueron limpiadas mediante extracción en fase
sólida (SPE) y derivatizadas mediante sililación de los compuestos de interés con
BSTFA + 1% TMCS en piridina. Finalmente la cuantificación de los metabolitos
(alquilfenoles, bisfenol A y hormonas estrogénicas) se realizó mediante cromatografía
de gases masas (GC-MS).
Tarea 3: Determinación de sustancias disruptores endocrinos (alquilfenoles, bisfenol A,
hormonas naturales y sintéticas, PAHs y ftalatos) en muestras de sedimento
Esta Tarea se está llevando a cabo en el IDAEA-CSIC de Barcelona por el grupo de los
Dres. Damiá Barceló y Miren López de Alda.
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Las muestras de sedimento se mantuvieron congeladas a -20ºC hasta su análisis. Tras
descongelar las muestras, se liofilizaron, se tamizaron y se realizaron tres extracciones
diferentes para obtener los distintos compuestos de interés. Para la obtención de las
hormonas estrogénicas la extracción se realizó mediante ultrasonicación en una mezcla
de acetona:metanol (1:1) (pressurized liquid extraction, PLE). Posteriormente, tras la
purificación por extracción en fase sólida (SPE) se cuantificaron los niveles de
hormonas estrogénicas mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en
tandem (liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS). Los
hidrocarburos aromáticos policíclicos se extrajeron mediante ultrasonicación en
hexano:diclorometano (1:1). La purificacion de los PAHs se realizó con hexano por
SPE y se cuantificaron mediante cromatografía de gas/espectrometría de masas
(GC/MS). Los compuestos como el bisfenol-A, alquilfenoles y ftalatos se extrajeron por
ultrasonicación en diclorometano:metanol (7:3) y se purificaron mediante SPE con
metanol. La cuantificación de los alquilfenoles, ftalatos y bisfenol-A se realizó por LC-
MS/MS. Para cuantificar los niveles de compuestos organoestánicos en sedimentos se
utilizó la técnica de GC/FPD (gas chromatography-flame photometric detection). Los
análisis químicos de los sedimentos no han podido completarse todavía debido a
problemas metodológicos que ya han sido solucionados y en breve tendremos
resultados.
Tarea 4: Transferencia de los resultados a la Administración y diseñar un programa de
seguimiento de los efectos de disrupción endocrina en peces de la costa vasca.
Dentro se esta tarea se ha recopilado los datos obtenidos mediante las distintas técnicas,
y se ha procedido a su integración. También ha consistido en la redacción de la
memoria final para su transferencia a la Administración. A la vista de los resultados
obtenidos, se plantea a la administración competente la necesidad de diseñar un
programa de seguimiento de los efectos de disrupción endocrina en peces de la costa
vasca. Con este fin, nuestro grupo de investigación se ofrece a colaborar con la
Administración o agentes implicados en el desarrollo de medidas correctoras o de
remediación y también colaborará con el personal responsable de la Administración
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ofreciendo asesoramiento y apoyo científico para el desarrollo de propuestas de
actuación.
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RESULTADOS Y LOGROS ALCANZADOS
Estudio de las poblaciones de mubles de estuario
Estudio histológico del desarrollo gametogénico y histopatológico de la gónada.
Como se ha comentado en el apartado anterior, finalmente se han analizado cuatro
poblaciones de mubles: Arriluze y Gernika (de las cuales ya disponíamos de datos
previos) y Plentzia y Pasaia (poblaciones sin ningún dato de referencia en cuanto a
efectos de disrupción endocrina).
El estudio histológico de la gónada demostró que las cuatro poblaciones tenían gónadas
en fases del desarrollo similares. Las gónadas eran pequeñas y en su mayoría
correspondían a individuos muy poco desarrollados. Las gónadas de las hembras
mostraban ovocitos pequeños y basófilos a la tinción utilizada (hematoxilina/eosina),
claramente previtelogenicos (estadíos I y II). Las gónadas de los machos mostraban
gametos indiferenciados, formando un tejido compacto y homogéneo. Esta situación es
normal para la época de estudio, ya que todo apunta a que los mubles en nuestra costa
se reproducen en invierno y es en la época de verano donde almacenan reservas, para en
otoño comenzar con la gametogénesis. Entre las poblaciones estudiadas parece que la
población de Plentzia estaba un poco más desarrollada que las otras, ya que algunas
pocas hembras mostraron ovocitos que habían comenzado ha incorporar reservas. De
todas formas, esto no se considera biológicamente relevante, ya que la mayoría de peces
estudiados estaban en las fases tempranas de inmaduro y desarrollo.
El estudio histopatológico de las mismas muestras deparó la presencia de organismos
intersex. Estos mubles eran machos que en sus testículos tenían ovocitos dispersos. Se
encontraron peces intersex en Gernika (2/14 machos) y en Pasaia (1/10 machos). Estos
peces mostraban ovocitos previtelogénicos aislados entre el tejido testicular
indiferenciado. Gónadas similares fueron descritas por nuestro grupo en peces de
Gernika durante el periodo 2006-2007 y por varios otros grupos en peces que habitan
alrededor de efluentes de aguas residuales urbanas. De todas formas, el estadío de
desarrollo gametogénico tan temprano que mostraron los mubles macho de las cuatro
estaciones estudiadas, puede haber limitado la aparición de más individuos intersex. Se
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recomienda realizar este tipo de estudio en fases del desarrollo gametogénico mas
avanzadas, que para el muble en nuestra costa pudieran ser en septiembre-octubre, antes
del comienzo de la migración reproductora. También, dentro del estudio histopatológico
de la gónada, mencionar que en mubles de Pasaia y Arriluze se detectaron agregados de
melanomacrófagos. Los agregados de melanomacrófagos, se muestran como
concentraciones de células marrones entre el tejido gonadal. Su presencia ha sido
debatida por diferentes autores, y aunque no está clara su causa, parece ser que en
situaciones de contaminación o estrés pueden aparecer. En un trabajo previo, nuestro
grupo observó un efecto similar en gónadas de salmonete (Mullus barbatus) capturados
alrededor de la zona de influencia de efluentes urbanos de la ciudad de Marsella (zona
de Cortiou).
Estudio de los niveles de expresión de genes asociados a efectos de disrupción
endocrina
Los niveles de expresión de genes relacionados con el desarrollo y la reproducción
como las aromatasas cyp19 (a1 y a2), la vitelogenina y los receptores hormonales
nucleares er y rxr son sensibles a contaminantes disruptores endocrinos. En el presente
estudio, los niveles de expresión de vitelogenina (vtg) en hígado fueron
significativamente elevados en los machos de Gernika y Plentzia, pero también
detectables en los machos de Arriluze y Pasaia. Los valores cuantificados en los machos
de Gernika y Plentzia son a tener en cuenta, ya que se asemejan a los cuantificados en
hembras, siendo en Plentzia incluso superiores. Este resultado indica que todas las
poblaciones estudiadas están afectadas por compuestos xenoestrogénicos, como se
detallará mas adelante. Los niveles de expresión del gen de la vitelogenina en hembras,
fueron también más altos en las hembras de Gernika y Plentzia en comparación con los
cuantificados en las hembras de Arriluze y Pasaia. Aunque como hemos mencionado
anteriormente, algunas hembras de Plentzia tenían gónadas un poco más desarrolladas
que el resto de las hembras estudiadas, esto podría en parte justificar los niveles de
expresión de vitelogenina cuantificados en estas hembras. Sin embargo, siendo los
niveles obtenidos comparables a los cuantificados en las hembras de Gernika y en los
machos de Plentzia y Gernika, todo parece indicar que las hembras de Plentzia también
están siendo afectadas por compuestos hormonales estrogéncos. No se han detectado
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cambios en la expresión del gen rxr en hígados de machos. Los machos de todas las
poblaciones estudiadas tenían niveles de expresión similares. En cuanto a los niveles de
expresión de rxr en hígado de hembras, estos fueron más elevados en las hembras de
Gernika y Pasaia en comparación con las hembras de Arriluze y Plentzia, aunque estas
diferencias no fueron estadísticamente significativas. El rxr se ha asociado con procesos
del desarrollo en peces y es un receptor que responde a distintas situaciones
ambientales. Por ejemplo, se ha descrito que el RXR de los peces puede unirse a
contaminantes tipo tributilestaño (TBT) y alterar el desarrollo gonadal. Sin embargo, en
el presente estudio no parece que su expresión en hígado fuese considerablemente
alterada. Por último, los niveles de expresión del er en hígado de mubles macho no
mostraron diferencias entre las poblaciones estudiadas, aunque algunos machos de
Pasaia sí tenían valores elevados. Esto podría indicar que en Pasaia también habían
compuestos disruptores endocrinos. En cuanto a los niveles de expresión de er en el
hígado de las hembras, Plentzia mostró niveles significativamente elevados en
comparación con las otras poblaciones, y en especial con las hembras de Gernika, que
mostraron los niveles más bajos de todo el estudio. El ER en condiciones fisiológicas
normales suele unirse a la hormona 17β-estradiol y regula las síntesis de vitelogenina en
hembras de peces.
En gónada se cuantificaron los niveles de expresión de la aromatasa cyp19a1, rxr y er.
Los niveles de expresión de la aromatasa cyp19a1, no mostraron variación entre las
poblaciones de estudio ni entre sexos. Esto puede deberse al escaso desarrollo
gametogénico observado en los mubles analizados. La aromatasa gonadal (CYP19A1)
se sobreexpresa durante el desarrollo gametogénico en hembras, y en el presente trabajo
este proceso todavía esta en fases del desarrollo muy tempranas, con lo que su expresión
es escasa. De todas formas, sí que se observaron valores más elevados de cyp19a1 en
las gónadas de las hembras de Plentzia, Gernika y Pasaia en comparación con las
hembras de Arriluze. En cambio, los machos de Arriluze fueron los que mostraron los
niveles de expresión más altos en comparación con el resto de poblaciones estudiadas,
aunque la variabilidad entre individuos fue tan grande que las diferencias no fueron
estadísticamente significativas. La expresión de cyp19a1 no suele estar directamente
regulada por estrógenos, pero se suele cuantificar como marcador de desarrollo gonadal,
especialmente en hembras. Los disruptores endocrinos, sin embargo, sí pueden modular
su actividad, perjudicando el correcto desarrollo de la gónada. La expresión en gónada
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de rxr mostró diferencias significativas entre las distintas poblaciones de estudio. En
Plentzia la expresión de rxr en gónada de machos fue muy alta en comparación con los
machos de Arriluze, pero estadísticamente significativa con los machos de Gernika. Los
machos de Pasaia mostraron valores cercanos a los de Plentzia. Como se ha mencionado
anteriormente, se ha sugerido que el rxr puede estar asociado con problemas de
disrupción endocrina, como por ejemplo los procesos de intersex. Aunque los únicos
peces intersex que se han descrito en el presente estudio fueron en las poblaciones de
Gernika y Pasaia, también en los machos de Plentzia se están observando claros efectos
de disrupción endocrina mediante el análisis de la expresión de genes específicos (caso
del vtg). Pudiera ser, que un estudio histológico en mubles con gónadas más
desarrolladas demostrara también la presencia de organismos intersex en Plentzia. El
estudio de los niveles de expresión en gónada de er puede también apuntar en este
sentido. Los machos de Pasaia y Plentzia son los que mayores niveles de expresión
tuvieron en comparación con los de Gernika, y especialmente con los de Arriluze. Al
igual que en el hígado, los machos de Pasaia fueron los que tuvieron niveles de
expresión más altos, lo cual parece confirmar que también Pasaia es una zona sensible
en cuanto a disruptores endocrinos. No se detectaron diferencias en los niveles de
expresión de er entre las hembras de las diferentes poblaciones estudiadas. Solamente
mencionar que las hembras de Arriluze tuvieron niveles de expresión más altos, pero la
variabilidad interindividual de estas hembras fue también muy alta.
Por último los niveles de la aromatasa cyp19a2 en cerebro de los mubles mostraron
diferencias estadísticamente significativas entre las poblaciones estudiadas. Los niveles
más altos se cuantificaron en el cerebro de los machos de Plentzia. También mostraron
valores algo más elevados, pero moderadamente los machos de Pasaia. Igualmente tanto
las hembras de Plentzia como las de Pasaia mostraron valores mas elevados que las
hembras de Arriluze y Gernika (con este último grupo las diferencias no fueron
estadísticamente significativas). La expresión de cyp19a2 en cerebro de pez es un
marcador temprano de xenoestrogenicidad por compuestos hormonales. Todo parece
indicar que tanto Pasaia como Plentzia son zonas con presencia significativa de
compuestos hormonales.
17
En conclusión, los niveles de expresión de genes asociados con la reproducción y el
desarrollo en diferentes tejidos del muble, demostraron la exposición de las cuatro
poblaciones estudiadas a contaminantes tipo disruptores endocrinos. En las poblaciones
de Plentzia y Gernika los mubles parece que estaban afectados por compuestos
xenoestrogénicos (fue muy clara la inducción de la expresión de la vitelogenina tanto en
machos como en hembras). Además, Plentzia mostró también niveles de expresión de
cyp19a2 muy elevados tanto en machos como en hembras. En Arriluze y Pasaia las
respuestas obtenidas fueron más complejas, quizás debido a la presencia de compuestos
muy distintos que puedan antagonizar entre ellos. De todas formas, en el caso de la
expresión de genes en gónada Pasaia fue muy similar a Plentzia.
Determinación de los niveles de compuestos disruptores endocrinos en la bilis de los
peces
El estudio de la presencia de compuestos disruptores endocrinos en la bilis de los peces,
parece corroborar lo descrito mediante los estudios biológicos. Se detectaron disruptores
endocrinos en las muestras de bilis analizadas de las cuatro poblaciones de interés. Los
niveles para los alquilfenoles (octilfenol y nonilfenol) estaban en el rango de los 2000
ng/g cuantificados en los mubles de Pasaia hasta los 13000 ng/g cuantificados en los
mubles de Arriluze. Los peces de Plentzia mostraron niveles de 10000 ng/g y en
Gernika de 6500 ng/g. Los niveles de bisfenol A (compuesto policarbonato prohibido
recientemente por la Unión Europea y Canadá por su potente efecto hormonal), fueron
altos en la bilis de los peces de Gernika (1400 ng/g), pero también en los peces de
Pasaia (800 ng/g) y Arriluze (600 ng/g). Sin embargo no se detectó bisfenol A en la bilis
de los peces de Plentzia. En cuanto a los niveles de hormonas estrogénicas los valores
fueron de 1000 ng/g en mubles de Arriluze, 4000 ng/g en mubles de Plentzia, 600 ng/g
en Gernika y 14000 ng/g en Pasaia. Destacar que entre las hormonas analizadas fueron
el metil-etinilestradiol y el etinilestradiol las que mayor presencia aportaron. El
etinilestradiol es una hormona sintética utilizada en la píldora anticonceptiva y cuya
presencia en el medio acuático se debe por deposición de origen antrópico. En general,
los valores obtenidos son similares a los valores cuantificados en peces que habitan
zonas contaminadas por efluentes residuales urbanos o de depuradoras. Estos datos
confirman que las poblaciones de estudio están afectadas por contaminantes de origen
18
urbano y con capacidad de actuar como disruptores endocrinos, aunque cada población
mostró particularidades. Haciendo una descripción más detallada, se puede observar que
los mubles de Gernika estaban mayormente expuestos a bisfenol A y alquilfenoles
como el nonilfenol y los peces de Plentzia contenían alquilfenoles y sobre todo
hormonas estrogénicas. La presencia de estos compuestos justifica los niveles de
vitelogenina elevados cuantificados en ambas poblaciones, así como la presencia de
peces intersex en Gernika. También el hecho de que Plentzia muestre a nivel de
expresión génica los perfiles típicos de poblaciones afectadas por xenoestrogenicidad.
La población de Arriluze tenía sobre todo alquilfenoles y bisfenol A en bilis y los peces
de Pasaia mostraron sobre todo biodisponibilidad de bisfenol A y hormonas
estrogénicas. Esto explicaría la presencia de mubles intersex en Pasaia. Por otro lado, el
hecho de que tanto en Pasaia, pero especialmente en Arriluze, los efectos sobre la
expresión de los genes estudiados fuesen más moderados en comparación con lo
observado en los mubles de Gernika y Plentzia, sugiere la presencia de otro tipo de
contaminantes o de mezclas complejas no estudiadas en este trabajo. Tanto Arriluze
como Pasaia son los estuarios de la costa vasca que reúnen mayor población, industria y
tráfico marítimo y que muestran niveles de contaminantes varios (orgánicos, metálicos,
hormonales…), por lo que las posibles sinergias y antagonismos dentro de estas
muestras complejas pueden ocultar distintos procesos o demostrarlos como inhibición
de la respuesta. Gernika y Plentzia son estuarios menos densos, con menor complejidad
de vertidos y mucho mas afectados por efluentes urbanos.
Estudio de las poblaciones de mubles de mar abierto
Esta tarea ha dependido de la ayuda ofrecida por los investigadores de AZTI-Tecnalia y
de las capturas de mubles por la flota de bajura del puerto de Ondarroa. El muble no es
una especie comercial en nuestra zona, y solamente se captura cuando hay escasez de
especies con mayor valor comercial. Ante esta situación solo pudimos conseguir mubles
de mar abierto en los meses de Febrero, Marzo, Abril y Octubre. En total 50 mubles por
mes. Además la especie capturada en mar abierto siempre fue el Mugil cephalus y no el
Chelon labrosus. Aunque ambas especies muestran un comportamiento parecido y
genéticamente están muy emparentadas (ambas se clasifican dentro de los mugílidos), el
hecho de ser otra especie podría añadir confusión al presente estudio. Además, por la
19
experiencia de nuestro grupo no parece que el Mugil cephalus penetre en nuestros
estuarios como sí lo hace el Chelon labrosus, que reside habitualmente en ellos. Por lo
tanto se decidió realizar solamente el estudio histopatológico de la gónada en los
ejemplares capturados en mar abierto, por establecer las fases gametogénicas y describir
la presencia de efectos tipo intersex.
Los ejemplares de Mugil cephalus capturados en los meses de Febrero, Marzo y Abril
mostraron gónadas en puesta y post-puesta, siendo Abril el mes con mayor número de
ejemplares en post-puesta. Las muestras del mes de Octubre mostraron gónadas en fases
de gametogénesis avanzadas, indicando que los peces se estaban preparando para el
periodo reproductor. Este resultado parece confirmar que los mugílidos en nuestras
costas se reproducen durante los meses de invierno. En cuanto al estudio de la presencia
de alteraciones tipo disrupción endocrina, se observó un individuo intersex (1/200), que
mostraba tejido testicular diferenciado con ovocitos vitelogénicos dispersos. Aunque la
prevalencia fue bastante baja (1/200) no deja de ser preocupante la presencia de
organismos intersex. Este proceso no es un proceso natural, como puede ser el
hermafroditismo que a niveles muy bajos puede suceder. El proceso de intersex suele
ser debido por exposición a compuestos hormonales. Esto indicaría que el Mugil
cephalus aunque no penetre en nuestros estuarios de forma clara, sí que puede ser
afectado por disruptores endocrinos. Sería interesante poder analizar más en detalle y de
forma más regular mubles de mar abierto para confirmar esta observación.
Caracterización del ciclo reproductor del muble Chelon labrosus en la costa vasca
Como ya se mencionó en el apartado anterior, la escasa regularidad de la captura de
mubles en mar abierto así como el hecho de que fuese otra especie, nos movió a buscar
una alternativa posible para la caracterización del ciclo reproductor del Chelon labrosus
en nuestra costa. Se procedió a la captura de mubles mensualmente en Pasaia desde
Septiembre de 2010. Se seleccionó el punto de Pasaia por ser un lugar con abundante
presencia de mubles y de fácil captura durante casi todo el año. Este trabajo se
prolongará por lo menos hasta completar un ciclo reproductor completo. Los datos
obtenidos hasta ahora, se basan en el estudio histológico de la gónada. Se ha observado
que de Septiembre hasta Diciembre la gónada de los mubles hembras y machos aumenta
20
en tamaño respecto al peso corporal (índice gonado-somático, GSI). Los estadíos
gametogénicos descritos muestran gónadas que inician la gametogénesis en Septiembre
(testículos con gametos tempranos pero estructurados en cistos y ovarios con ovocitos
en vitelogénesis temprana) y gónadas con gametos maduros en Diciembre
(espermatozoides en los testículos y ovocitos vitelogénicos y maduros en los ovarios).
Asimismo, el índice hepato-somático (HSI) en hembras aumenta a la vez que el GSI, lo
cual confirma la producción de vitelogenina en el hígado de las hembras, proteína
esencial en el proceso de ovogénesis. No es el caso de los machos, cuyo hígado apenas
varía en peso durante el desarrollo gametogénico. Por lo tanto, y siempre teniendo en
cuenta que son todavía pocos meses de estudio, se confirma que el muble comienza la
gametogénesis al final del verano en los estuarios vascos y que para comienzo del
invierno muestra gónadas preparadas para la reproducción.
Destacar en este apartado la presencia de mubles intersex a lo largo del estudio. La
prevalencia de mubles intersex oscila entre un 10-22% de la población total de mubles
estudiada entre septiembre y noviembre. Además los parámetros de GSI y
especialmente de HSI son muy similares a los cuantificados en hembras. Por lo tanto,
estos resultados refuerzan las observaciones realizadas en el estudio de mayo-junio. A la
vista de estos datos, puede ser recomendable realizar el estudio histológico de la gónada
de los mubles entre los meses de septiembre-noviembre, ya que al estar la gónada mas
desarrollada posibilita una mejor detección de organismos intersex. En este momento,
estamos realizando el estudio de expresión de vtg y cyp19a1 en estos mismos mubles,
para ver si la respuesta también se mantiene a nivel molecular.
Otros logros de interés del proyecto
Aunque el proyecto no estaba enfocado a establecer colaboraciones con otros grupos de
investigación ni promover programas de formación científica, sí que ha posibilitado este
tipo de interacciones siempre necesarias en la investigación.
Por un lado se ha estrechado la colaboración con los investigadores de AZTI-Tecnalia,
especialmente con los grupos de los Dres. Javier Franco y Guzmán Diez que han
ayudado en la obtención de mubles en mar abierto. Además, el análisis de la bilis de los
21
mubles ha servido para fortalecer la colaboración que ya existía con el grupo de
Química Analítica de la UPV/EHU y en especial con los Dres. Olatz Zuloaga y Asier
Vallejo. Este proyecto ha permitido comprobar en muestras de campo la fiabilidad de la
técnica desarrollada para el análisis de la bilis en mubles. Por otro lado, se sigue
colaborando con el grupo del Prof. Ángel Maquieira de la Universidad Politécnica de
Valencia en el desarrollo y optimización del sistema ELISA para la cuantificación de
vitelogenina y coriogenina en plasma de mubles. También se ha colaborado con el
grupo de Química Ambiental del IDAEA-CSIC de Barcelona en el análisis de las
muestras de sedimento. Finalmente mencionar que este proyecto ha contado con la
colaboración como investigadora Erasmus Mundus de la Prof. Iman Mohamed Kamel
Abu mourad de la Universidad de El Cairo, que ha aportado su experiencia en el
análisis de las muestras de genómica. Esta colaboración puede servir de base para
futuros trabajos en común, ya que el Chelon labrosus es una especie con presencia en el
Mar Mediterraneo. Además, en el marco del presente proyecto se ha incorporado a la
licenciada Cristina Bizarro como becaria predoctoral (UPV/EHU). Esta estudiante
predoctoral ha participado en el estudio histológico de las gónadas de muble y
actualmente está desarrollando el seguimiento del ciclo reproductor del muble, dentro
de su Tesis de Master.
22
CONCLUSIONES
La principal conclusión del presente proyecto es que se ha demostrado la presencia de
disruptores endocrinos en las cuatro poblaciones de mubles estudiadas (Arriluze,
Plentzia, Gernika y Pasaia) y que los mubles están mostrando signos de disrupción
endocrina. Detalladamente las conclusiones para cada población son:
Arriluze: Poca respuesta estrogénica tanto en machos como en hembras. Sin embargo,
sí se han detectado niveles altos de alquilfenoles y bisfenol A en bilis. Esta población
está expuesta, por lo tanto, a compuestos disruptores endocrinos y quizá el escaso
desarrollo gametogénico observado no haya posibilitado detectar efectos de disrupción
endocrina. Es posible también que otros compuestos presentes en el medio (PAHs,
TBT…) puedan interaccionar con el sistema de respuesta de los peces, ya que el Abra
es una zona de contaminación bastante diversa. Los resultados de los análisis químicos
de los sedimentos ayudaran a clarificar este supuesto.
Gernika: Población claramente afectada por compuestos disruptores endocrinos,
especialmente xenoestrógenos. Los niveles elevados de vtg cuantificados en machos y
hembras, así como la presencia de mubles intersex son marcadores biológicos claros de
estrogenicidad. Además, el análisis de la bilis ha confirmado la presencia de
alquilfenoles y bisfenol A, conocidos compuestos estrogénicos. Estos resultados
confirman los efectos descritos por nuestro grupo para la misma población de mubles en
un estudio realizado durante los años 2006-2007 dentro del proyecto Derbiur (Cátedra
UNESCO-UPV/EHU). El origen de estos compuestos puede ser tanto urbano (efluentes
de depuradoras) como industrial (efluentes de industrias adyacentes), ya que son
sustancias ampliamente utilizadas en compuestos plásticos.
Plentzia: Los mubles de Plentzia al igual que los de Gernika muestran síntomas claros
de exposición a disruptores endocrinos con efectos xenoestrogénicos. Aunque no se han
detectado individuos intersex en Plentzia (quizás debido al escaso desarrollo
gametogénico de los peces estudiados), los niveles de expresión elevados tanto de vtg
como de cyp19a2, son marcadores específicos de estrogenicidad. Este supuesto queda
confirmado con el análisis químico de la bilis, donde se encontraron niveles altos de
alquilfenoles y hormonas estrogénicas. Todo parece indicar, que los estrógenos
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presentes en Plentzia tengan un origen principalmente urbano o agrícola (efluentes de
depuradoras-aguas residuales urbanas o agrícolas)
Pasaia: La población de Pasaia mostró respuestas de disrupción endocrina, como la
presencia de peces intersex. Además, al seguir estudiando esta población durante los
meses de otoño-invierno hemos comprobado que la presencia de machos con gónadas
intersex es mayor a la obtenida en el estudio de mayo-junio. Con lo que se recomienda
realizar este tipo de estudios en el periodo de gametogénesis (septiembre-noviembre)
que facilita el estudio de la gónada. Por otro lado, y al igual que lo descrito para los
peces de Arriluze, los efectos sobre la expresión de genes asociados a alteraciones
endocrinas no mostraron respuestas significativas. Sin embargo, los niveles de bisfenol
A y de hormonas estrogénicas en bilis fueron bastante altos, lo que indica exposición a
disruptores endocrinos. Quizás, la mezcla de diversos contaminantes en esta zona
portuaria y la fase tan temprana del desarrollo gametogénico en los peces estudiados en
mayo-junio, dificulte determinar los patrones de respuesta. El análisis de los sedimentos
podrá ayudar a clarificar este aspecto.
Mubles capturados en mar abierto: Aunque ya se han comentado las dificultades
encontradas para obtener muestras sistemáticas de los mubles en mar abierto y que eran
de otra especie de mugílido (Mugil cephalus), el hecho de encontrar un individuo
intersex puede ser una señal a tener en cuenta. Se recomienda poder realizar un estudio
más exhaustivo de los peces de mar abierto (con capturas mas regulares a lo largo del
año), para confirmar si realmente también están expuestos a compuestos disruptores
endocrinos, ya que esto podría ser también una amenaza para otras especies comerciales
de peces presentes en nuestras costas.
Ciclo reproductor del muble: Este trabajo está recién comenzado y hasta cerrarse
como mínimo un ciclo reproductor entero es pronto para sacar conclusiones. De todas
formas los muestreos de septiembre-diciembre de 2010, demuestran que la
gametogénesis ocurre durante los meses de otoño en nuestros estuarios y que es durante
el invierno cuando los peces consiguen la madurez reproductora. Como está descrito en
la bibliografía especializada en peces, es durante el periodo de gametogénesis cuando
parece que los peces son más sensibles a los contaminantes disruptores endocrinos, cosa
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que se confirma con la observación de un mayor número de machos intersex en Pasaia
durante este periodo en comparación con los capturados en mayo-junio.
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CONSIDERACIONES Y RECOMENDACIONES DERIVADAS DEL
PROYECTO
A la vista de los resultados obtenidos se recomienda el desarrollo de un programa de
bioseguimiento de alteraciones tipo disrupción endocrina en los estuarios vascos y
ampliar este estudio a otros estuarios de nuestra costa que puedan ser sensibles a este
tipo de contaminantes. Dentro de la actual legislación europea sobre la calidad de las
aguas superficiales (Directiva Marco del Agua 2000/60/CE), se recomienda la
implementación de programas de monitoreo biológico para establecer la salud de los
ecosistemas acuáticos con el fin de conseguir una calidad y gestión del medio acuático
optimo. Por lo tanto, en propuesta a la Administración competente, proponemos un
programa de bioseguimiento con mubles que podría seguir el siguiente esquema:
- Selección de puntos de muestreo en zonas susceptibles de estar contaminadas por
disruptores endocrinos (zonas industriales, receptores de aguas de depuradoras, aguas
residuales sin tratamiento alguno, zonas de agricultura)
- Captura de mubles durante los meses de septiembre-noviembre que es cuando ocurre
la gametogénesis y los peces pueden ofrecer respuestas más fáciles de cuantificar e
interpretar.
- Se recomienda realizar una recogida de muestras similar a la empleada en el presente
proyecto, realizando un estudio escalonado de los distintos parámetros, sin necesidad de
estudiar todos. Una propuesta sería:
Paso 1- Análisis histológico de la gónada (presencia de intersex, alteraciones en
el desarrollo gametogénico) y de niveles de vitelogenina en plasma mediante ELISA
(aunque no tenemos todavía resultados de este parámetro en nuestros peces, estudios
previos han demostrado su eficacia y está siendo aplicado en programas ambientales
como los que realiza el ICES). La cuantificación de niveles de expresión de vtg en
hígado es también una alternativa válida, pero quizás algo más costosa
económicamente.
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Paso 2: Análisis de metabolitos químicos en bilis. En caso de obtener señales de
disrupción endocrina en el paso 1, se trataría de caracterizar que tipos de contaminantes
son biodisponibles para los peces y pueden ser el origen de los efectos observados.
Paso 3: Estudio de las repuestas de expresión génicas en varios tejidos (cerebro,
hígado y gónada) de los mubles, para establecer lo mejor posible los tipos de repuestas
obtenidos. Este estudio estaría más enfocado a comprender mejor el tipo de respuesta en
los mubles afectados. En caso de no ser necesario el análisis de la expresión génica, las
muestras recogidas se pueden almacenar el en Banco de Especimenes Biológicos de la
UPV/EHU, que servirá para posteriores estudios a largo plazo.
También recomendamos extender este trabajo en ejemplares de mar abierto, para
comprobar si estas poblaciones están realmente afectadas por compuestos disruptores
endocrinos, que puedan afectar su capacidad reproductora y la de otras especies de
interés comercial de nuestra costa. Finalmente, mencionar que nuestro grupo de
investigación se ofrece para colaborar y asesorar en el desarrollo de este tipo de estudios
con las administraciones/gestores competentes, así como participar en la formación del
personal necesario.
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PLAN DE DIFUSION Y TRANSFERENCIA
Se prevé la difusión de los resultados obtenidos en el proyecto mediante su publicación
en revistas científicas de alto impacto, así como su presentación en congresos de ámbito
tanto nacional como internacional. También se contempla la publicación y difusión de
los resultados obtenidos en revistas de carácter divulgativo. Como se mencionado en el
apartado anterior, nuestro grupo de investigación estaría dispuesto a colaborar con las
administraciones/gestores implicados en el desarrollo de un plan específico de
biomonitoreo de los efectos disruptores endocrinos en poblaciones de peces de la costa
vasca. Asimismo, también mostramos nuestra disposición a transferir nuestra
experiencia y conocimiento en la formación de personal cualificado para realizar las
tareas descritas en el presente proyecto.