medios de cultivo

MEDIOS DE CULTIVO

Caldo Nutritivo - Caldo simple

Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el desarrollo de microorganismos con escasos requerimientos nutricionales.Su uso está descripto en muchos procedimientos para el análisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria.

FundamentoMedio no selectivo, contiene pluripeptona y extracto de carne que constituyen la fuente de carbono y nitrógeno necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano.Puede ser utilizado además, como preenriquecimiento en la búsqueda de Salmonella spp. a partir de alimentos, ya que permite recuperar células dañadas, diluir metabolitos tóxicos y sustancias inhibitorias.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Pluripeptona 5.0 Emplear 8 g de polvo por litro de agua destilada. Si es necesario, calentar hasta disolver. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121°C durante 15 minutos.

Extracto de carne 3.0

pH final: 6.9 ± 0.2

SiembraPor inoculación directa de la muestra o del microorganismo en estudio.

IncubaciónEn aerobiosis, a 35-37 ºC durante 24 horas.

ResultadosExaminar los tubos para evaluar el crecimiento por turbiedad. Cuando sea necesario, subcultivar en medios sólidos apropiados y realizar la identificación bioquímica.

Microorganismos Crecimiento

P. mirabilis ATCC 43071 Bueno

E. coli ATCC 25922 Bueno

S. aureus ATCC 25923 Bueno

S. epidermidis ATCC 14990 Bueno

S. typhimurium ATCC 14028 Bueno

P. aeruginosa ATCC 27853 Bueno

Características del medioMedio preparado: ámbar claro.

AlmacenamientoMedio deshidratado: a 10-35 ºC.Medio preparado: a 2-8 ºC.

Agar Nutritivo – Agar simple

Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento de microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos.Su uso está descripto en muchos procedimientos para el análisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria.

FundamentoPor las características de sus componentes es un medio usado para el cultivo de microorganismos poco exigentes en sus requerimientos nutricionales. No contiene inhibidores del desarrollo bacteriano. La pluripeptona es la fuente de carbono y nitrógeno para el desarrollo bacteriano. El agregado de cloruro de sodio permite el enriquecimiento con sangre de carnero u otras sustancias para facilitar el cultivo de microorganismos exigentes.


Pluripeptona 5.0 Suspender 31 g de polvo por litro de agua destilada. Mezclar y dejar reposar 5 minutos. Calentar suavemente agitando y hervir 1 o 2 minutos hasta su disolución. Distribuir y esterilizar a 121°C durante 15 minutos.


Cloruro de sodio 8.0

Agar 15.0

pH final: 7.3 ± 0.2

SiembraEn superficie o por la técnica de pour plate, según el uso a que se destine.

IncubaciónEn aerobiosis, a 35-37 ºC durante 24 horas.

Resultadosa- Agar nutritivo:


P. mirabilis ATCC 43071 Bueno-excelente

E. coli ATCC 25922 Bueno-excelente

S. aureus ATCC 25923 Bueno-excelente

B. cereus ATCC 10876 Bueno-excelente

E. faecalis ATCC 29212 Bueno-excelente

P. aeruginosa ATCC 27853 Bueno-excelente

B -Agar nutritivo suplementado con 5% de sangre de carnero:

Microorganismos Crecimiento Hemólisis

S. pyogenes ATCC 19615 Abundante Beta

S. pneumoniae ATCC 6305 Abundante Alfa


Características del medioMedio preparado: ámbar claro a medio ligeramente opalescente.


Sangre Agar Base: ENRIQUECIDO

Medio para propósitos generales, para el aislamiento y cultivo de numerosos microorganismos.Con la adición de sangre, el medio es útil tanto para el aislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y anaerobios nutricionalmente exigentes a partir de una gran variedad de muestras, como para la observación de reacciones de hemólisis.También, este medio de cultivo, puede utilizarse como medio base para preparar el medio agar chocolate.

FundamentoLa infusión de músculo de corazón y la peptona, otorgan al medio un alto valor nutritivo, que permite el crecimiento de una gran variedad de microorganismos, aún de aquellos nutricionalmente exigentes. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.El agregado de sangre al medio de cultivo, en concentración final de 5-10 %, aporta nutrientes para el crecimiento bacteriano, y permite detectar hemólisis.

Fórmula (en gramos por litro)

Infusión de músculo de corazón 375.0

Peptona 10.0


Agar 15.0

pH final: 7.3 ± 0.2

InstruccionesSuspender 40 g del polvo en un litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos y mezclar perfectamente hasta obtener una suspensión homogénea. Calentar con agitación frecuente y hervir 1 minuto. Esterilizar 20 minutos a 121°C. Enfriar a 45-50°C agregar sangre desfibrinada al 5%. Homogeneizar y distribuir en placas.

Preparación de la placa de Agar Sangre: añadir en forma aséptica un 5% de sangre estéril desfibrinada a temperatura ambiente, el agar debe estar a 45°C.

Preparación de Agar Chocolate: después de añadir la sangre y agitando frecuentemente se mantiene el medio de cultivo a 80°C por 10 minutos hasta que adquiera un color pardo chocolatado.

SiembraPor inoculación directa del material en estudio, sobre la superficie del medio de cultivo.

IncubaciónEl tiempo, temperatura y atmósfera de incubación, dependerán del microorganismo que se quiera aislar.

Resultados

Microorganismos Crecimiento Hemólisis

E. coli ATCC 25922 Abundante --

S. aureus ATCC 25923 Abundante Beta

S. pyogenes ATCC 19615 Abundante Beta



Limitaciones-Las reacciones hemolíticas de muchos microorganismos son diferentes al usar sangre de caballo respecto a la sangre de carnero, tal es el caso de algunas cepas de estreptococos grupo D, que producen beta hemólisis en el agar suplementado con sangre de caballo pero no en agar suplementado con sangre de carnero, y son mal clasificados como Estreptococos Grupo A al usar sangre de caballo.

Características del medioMedio preparado: ámbar.

Medio preparado con 5% de sangre de carnero: rojo cereza.


Agar Cerebro Corazón Infusión – Agar enriquecido

Es un medio sólido muy apropiado para el cultivo de bacterias y hongos, incluyendo los de difícil desarrollo.

FundamentoEs un medio muy rico en nutrientes, que proporciona un adecuado desarrollo microbiano. La infusión de cerebro de ternera, la infusión de corazón vacuno y la peptona, son la fuente de carbono, nitrógeno, y vitaminas. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el fosfato disódico otorga capacidad buffer. El agar es el agente solidificante.El agar cerebro corazón mantiene los mismos principios que el caldo para el cultivo de estreptococos y otras bacterias exigentes. Con el agregado de 10% de sangre de caballo desfibrinada, fue utilizado para el crecimiento de Histoplasma capsulatum y de hongos patógenos. Por tratarse de un medio que contiene glucosa, no es un agar sangre apropiado para la observación de reacciones de hemólisis.Con el agregado de 20 Ul de Penicilina y 40 µg/ml de estreptomicina, se utiliza este medio para el aislamiento de hongos patógenos.


Infusión de cerebro de ternera 200.0

Disolver 52 g de polvo en un litro de agua destilada. Calentar a ebullición hasta su disolución total. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C.

Infusión corazón vacuno 250.0

Peptona 10.0


Glucosa 2.0

Fosfato disódico 2.5

Agar 15.0

pH final: 7.4 ± 0.2

SiembraDe acuerdo a los fines de empleo.

IncubaciónEl tiempo, la temperatura y la atmósfera de incubación, serán las óptimas y dependerán del microorganismo que se esté investigando.

Resultados


Aspergillus niger Bueno

Neisseria meningitidis Bueno

Streptococcus pyogenes ATCC 19615 Bueno

Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 Bueno

Características del medioMedio preparado: ámbar claro.


Infusión Cerebro Corazón– Medio Liquido enriquecido

Medio líquido adecuado para el enriquecimiento y cultivo de bacterias aerobias y anaerobias, de microorganismos exigentes como estreptococos, neumococos y otros microorganismos de difícil desarrollo. Con el agregado de 20 Ul de Penicilina y 100 µg/ml de amicacina, se utiliza este medio para el cultivo de hongos patógenos.

FundamentoEs un medio muy rico en nutrientes, que proporciona un adecuado desarrollo microbiano. La infusión de cerebro de ternera, la infusión de corazón vacuno y la peptona, son la fuente de carbono, nitrógeno, y vitaminas. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el fosfato disódico otorga capacidad buffer.Los nutrientes de este caldo son muy apropiados para los hemocultivos, ya que en esta infusión desarrollan todas las especies de estreptococos excepto los tiol y piridoxal dependientes. Los estafilococos que crecen en esta infusión suelen dar mejores reacciones en la prueba de la coagulasa. Con el agregado de 20 Ul de Penicilina y 100 µg/ml de amicacina, se inhibe la flora bacteriana cuando se utiliza este medio para el cultivo de hongos patógenos.


Infusión de cerebro de ternera 200.0 Suspender 37 g del polvo en un litro de agua destilada. Calentar a ebullición hasta disolver completamente. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Los tubos que no se usen inmediatamente deberán calentarse en un baño hirviendo para la eliminación del oxígeno retenido. Enfriar rápidamente sin agitar.

Infusión corazón vacuno 250.0

Peptona 10.0


Glucosa 2.0

Fosfato disódico 2.5

pH final: 7.4 ± 0.2

SiembraPor inoculación directa de la muestra o del microorganismo en estudio.

IncubaciónEl tiempo, la temperatura y la atmósfera de incubación, serán las óptimas y dependerán del microorganismo que se esté investigando.

Resultados Examinar los tubos para evaluar el crecimiento por turbiedad. Cuando sea necesario, subcultivar en medios sólidos apropiados y realizar la identificación bioquímica.


Neisseria meningitidis Bueno a excelente

Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 Bueno a excelente

Streptococcus pyogenes ATCC 19615 Bueno a excelente

Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 Bueno a excelente

Control Negativo Resultado

Medio sin inocular Sin cambio

Características del medioMedio preparado: ámbar claro, sin precipitado.


Agar Manitol Salado – Agar selectivo – Staphylococcus

Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciación de estafilococos.Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patogénicos a partir de muestras clínicas, alimentos, productos cosméticos y otros materiales de importancia sanitaria.También, este medio puede utilizarse para el cultivo de especies halófilas de Vibrio, si no se dispone de medios apropiados (TCBS Medio, Medio Marino, etc.), aunque algunas especies pueden no desarrollar.

Fundamento Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentración salina. Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o púrpura. Las colonias sospechosas, se repicarán en un medio sin exceso de cloruro de sodio para efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa.En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentración) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompañante, y el rojo fenol es el indicador de pH. Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración de sal y fermentan el manitol, producen ácidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo.Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el manitol.Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color.Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de una zona del mismo color o púrpura.



Suspender 111 g de polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121°C durante 15 minutos.

Pluripeptona 10.0

d-Manitol 10.0


Agar 15.0

Rojo de fenol 0.025

pH final: 7.4 ± 0.2

SiembraSembrar en superficie un inóculo denso de la muestra.

IncubaciónDe rutina: durante 18-24 horas a 35-37 °C, en aerobiosis.La American Public Health Association (A.P.H.A) recomienda la incubación durante 3 días a 32 °C, en aerobiosis.

Resultados

Microorganismos Crecimiento Características de las colonias

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Excelente Amarilla

Staphylococcus epidermidis ATCC 14990

Bueno Roja

Escherichia coli ATCC 25922 Inhibido Inhibido

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Inhibido Inhibido

Características del medioMedio preparado: rojo

Almacenamiento:Medio deshidratado: a 10-35 ºC. Medio preparado: a 2-8 ºC.

Agar Mac Conkey – Agar selectivo para Enterobacterias

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.

Fundamento En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y la precipitación de las sales biliares. Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.


Peptona 17.0 Suspender 50 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta uniformar. Calentar suavemente y hervir 1 a 2 minutos hasta disolver. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

Pluripeptona 3.0

Lactosa 10.0

Mezcla de sales biliares 1.5


Agar 13.5

Rojo neutro 0.03

Cristal violeta 0.001

pH final: 7.1 ± 0.2

Siembra- Sembrar en superficie. - Utilizando la técnica de Pour Plate: sembrar 1 ml de muestra y agregar aproximadamente 15 ml de medio de cultivo fundido y enfriado a 45-50 ºC.

IncubaciónDurante 18-48 horas, a 35-37 ºC, en atmósfera aeróbica

Resultados

Microorganismos Colonias

Escherichia coli ATCC 25922 Rojas con halo turbio

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Rosadas mucosas

Salmonella typhimurium ATCC 14028 Incoloras, transparentes

Shigella flexneri ATCC 12022 Incoloras, transparentes

Proteus mirabilis ATCC 43071 Incoloras, transparentes

Enterococcus faecalis ATCC 29212 Diminutas, incoloras, opacas

Características del medioMedio preparado: rojo púrpura

Almacenamiento:Medio deshidratado: a 10-35 ºC. Medio preparado: a 2-8 ºC.

TCBS Medio – Agar Selectivo para Vibrio

Medio selectivo para el aislamiento y cultivo de Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus y otras especies de Vibrio a partir de heces, agua y alimentos contaminados. También es conocido como Agar Tiosulfato Citrato Bilis Sacarosa, o como Agar Selectivo para Vibrios.

FundamentoEn el medio de cultivo, el extracto de levadura, la peptona de carne y la tripteína aportan nutrientes para el desarrollo bacteriano. Es este, el medio selectivo más adecuado para el aislamiento de las especies de Vibrio, e inhibidor para la mayoría de las enterobacterias. Esta inhibición se basa en las altas concentraciones de tiosulfato y citrato, la presencia de bilis y un pH fuertemente alcalino. La degradación de la sacarosa es variable entre las especies de Vibrio y las colonias son verdes para las cepas que no la utilizan y amarillas para aquellas que producen ácido a partir de este azúcar. Esto es debido al viraje del color de los indicadores de pH azul de timol y azul de bromotimol, del color azul al amarillo en medio ácido. Es importante tener en cuenta, que la proporción de sacarosa en el medio está equilibrada de forma tal que

no inhiba el crecimiento bacteriano por exceso de ácido. El cloruro de sodio favorece el crecimiento de microorganismos. El tiosulfato de sodio aporta azufre y junto con el citrato férrico permiten la detección de producción de ácido sulfhídrico.Aumentando la concentración de cloruro de sodio y disminuyendo la temperatura de incubación, pueden aislarse especies marinas sin importancia sanitaria.


Extracto de levadura 5.0

Suspender 89 g del polvo en un litro de agua destilada. Calentar hasta ebullición y hervir de 1 a 2 minutos. NO AUTOCLAVAR. Distribuir en placas de Petri estériles.

Peptona de carne 5.0

Tripteína 5.0

Citrato de sodio 10.0

Tiosulfato de sodio 10.0

Bilis de buey 8.0

Sacarosa 20.0


Citrato férrico 1.0

Azul de bromotimol 0.04

Azul de timol 0.04

Agar 15.0

pH final: 8.6 ± 0.2

Siembra

1-Materiales clínicos: a-materia fecal: suspender 1 gramo de heces o el contenido del hisopo en 10 ml de Agua Peptonada Alcalina (B02-159-05, B02-159-06) e incubar de 6 a 8 horas a 35-37°C, en aerobiosis.b-materiales provenientes de infecciones extraintestinales: no es necesario realizar enriquecimiento previo en Agua Peptonada Alcalina.

2-Agua: Filtrar de 1 a 10 litros (el volumen deseado) de agua con membrana de 0.22µ.Colocar la membrana en un recipiente conteniendo Agua Peptonada Alcalina e incubar de 6 a 8 horas a 35-37°C, en aerobiosis.

3-Alimentos: Licuar 25 g de la muestra con 225 ml de Agua Peptonada Alcalina (B02-159-05, B02-159-06) e incubar de de 6 a 8 horas a 35-37°C, en aerobiosis.

En todos los casos sembrar una alícuota del caldo de enriquecimiento en la superficie de una placa de TCBS, por estriado, para el aislamiento de colonias.

IncubaciónEn aerobiosis, durante 18-24 horas a 35-37°C.

Resultados

Microorganismo Crecimiento Características de las colonias

Vibrio cholerae BuenoAmarillas de 2-3 mm de diámetro, de borde traslúcido

V. parahaemolyticus BuenoCentro verde azulado, borde traslúcido

V. alginolyticus Bueno Amarillas grandes

Aeromonas spp. Inhibido --

E. coli Inhibido --

Características del medioMedio preparado: verde azulado.


Agar Salmonella Shigella – Medio selectivo

Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su presencia.

FundamentoEs un medio de cultivo selectivo y diferencial.La selectividad, esta dada por la sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayoría de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp. Es diferencial debido a la fermentación de la lactosa, y a la formación de ácido sulfhídrico a partir del tiosulfato de sodio.Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obteniéndose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo. Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes. La producción de ácido sulfhídrico se evidencia como colonias con centro negro debido a la formación de sulfuro de hierro. Para aumentar la selectividad, se recomienda incubar previamente la muestra en Selenito caldo (B02-120-05).


Pluripeptona 5.0

Suspender 60 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta homogeneizar. Calentar a ebullición durante 2 o 3 minutos. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Enfriar a 45-50°C y distribuir unos 20 ml por placa. Secar la superficie del medio unos minutos en la estufa.


Lactosa 10.0

Mezcla de sales biliares 8.5

Citrato de sodio 8.5


Citrato férrico 1.0

Agar 13.5

Verde brillante 0.00033

Rojo neutro 0.025

pH final: 7.0 ± 0.2

SiembraSembrar por estriado la superficie del medio de cultivo.Recomendaciones, se aconseja sembrar en forma conjunta una placa de agar E.M.B. (B02-101-05) o de agar Mac Conkey (B02-114-05).

IncubaciónDurante24-48 horas a 35-37 °C, en aerobiosis.

Resultados

Microorganismos Colonias

Salmonella typhimurium ATCC 14028 Transparentes, centro negro

Shigella flexneri Incoloras

Shigella sonnei Incoloras

Proteus mirabilis ATCC 43071 Transparentes, centro negro

Escherichia coli ATCC 25922 Rosadas a rojas

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Rosadas cremosas y mucosas

Enterococcus faecalis ATCC 29212 Incoloras, de muy escaso crecimiento

Características del medioMedio preparado: rojo naranja.

Almacenamiento:Medio deshidratado: a 10-35 ºC.

Medio Tioglicolato USP Con Indicador

Medio de cultivo preparado de acuerdo con la Farmacopea Norteamericana para el control de esterilidad de productos biológicos y farmacéuticos. Además es utilizado para cultivar microorganismos anaerobios, microaerófilos y aerobios, y también para detectar la presencia bacteriana en materiales normalmente estériles.

FundamentoEste medio de cultivo tiene una composición bastante similar a la del medio Tioglicolato sin indicador. Permite el desarrollo de una amplia variedad de microorganismos, incluidos los nutricionalmente exigentes y se observa que las bacterias estrictamente aerobias, crecen en la parte superior, mientras que las anaerobias facultativas o anaerobias estrictas crecen en las profundidades del medio. La presencia de grupos -SH- (aportados por cisteína, tioglicolato, glutatión, etc.) en medios de cultivos con digestos proteicos facilita el aislamiento de diversas bacterias anaerobias. El tioglicolato de sodio disminuye el potencial redox del medio de cultivo y neutraliza el efecto antibacteriano de conservadores mercuriales. La resazurina actúa como un indicador de la óxido-reducción, que es de color rosado fucsia en presencia de oxígeno y la glucosa facilita el desarrollo microbiano al brindar una buena fuente de energía. La presencia de una baja cantidad de agar, retarda la dispersión de CO2 y O2.


Tripteína 15.0Suspender 29,5 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Calentar y agitar con frecuencia hasta disolución total.Distribuir en recipientes adecuados y esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Enfriar y guardar a temperatura ambiente protegido de la luz. Si el medio preparado presenta más de un 30% de oxidación volver a calentar para eliminar el oxígeno absorbido.


Glucosa 5.5


Tioglicolato de sodio 0.5

Agar 0.75

L-cistina 0.5

Resazurina 0.001

pH final: 7.1 ± 0.2

SiembraConsultar bibliografía de referencia (por ejemplo: Farmacopea Nacional Argentina 7º Edición y USP XXVII).

IncubaciónEl tiempo, temperatura y condiciones de incubación dependerán del microorganismo que se quiera recuperar.

Resultados


Streptococcus pyogenes ATCC 19615 Bueno

Clostridium perfringens Bueno

S. aureus ATCC 25923 Bueno

Bacteroides fragilis ATCC 25285 Bueno

Características del medioMedio preparado: ámbar claro ligeramente opalescente.


Caldo Tetrationato - Enriquecimiento

Medio de cultivo utilizado para el enriquecimiento selectivo de Salmonella spp. a partir de heces, orina, alimentos y otros materiales de importancia sanitaria.

FundamentoEl medio de cultivo contiene peptona que provee los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, y carbonato de sodio que neutraliza y absorbe metabolitos tóxicos. La selectividad está dada por la presencia de tiosulfato de sodio, tetrationato (generado en el medio por el agregado de la solución iodo-iodurada) y sales biliares, los cuales permiten el desarrollo de bacterias que contienen la enzima tetrationato reductasa, como ser la Salmonella spp. e inhiben el desarrollo de la flora acompañante.Para evitar la proliferación de especies de Proteus spp., se recomienda agregar 40 mg/l de Novobiocina, antes de la solución iodada


Peptona 5.0 Suspender 46 g del polvo en 1 litro de agua destilada. Mezclar vigorosamente y llevar a ebullición. Enfriar a 45°C o menos. Agregar 20 ml de solución iodurada. Mezclar y distribuir 10 ml por tubo, en tubos estériles. No debe calentarse luego de agregar la solución iodada. El medio base puede mantenerse a 4°C , dura varios meses, pero una vez agregada la solución iodada debe usarse

Sales biliares 1.0

Carbonato de calcio 10.0


pH final: 8.4 ± 0.2

Solución iodo iodurada

Iodo 6.0

en el mismo día. Ioduro de potasio 5.0

Agua 20.0

SiembraPuede realizarse la siembra partiendo de un caldo de preenriquecimiento o en forma directa conservando la proporción 1:10.

IncubaciónDurante 12-24 horas a 35-37 ºC, en aerobiosis

Resultados


Salmonella typhi Escaso

Salmonella typhimurium ATCC 14028 Bueno-excelente

Salmonella enteritidis ATCC 13076 Bueno-excelente

Escherichia coli ATCC 25922 Escaso

Características del medioMedio preparado: suspensión blanco lechosa.

Almacenamiento:Medio deshidratado: a 10-35 ºC.Medio preparado: a 2-8 ºC.

Caldo Selenito - Enriquecimiento

Medio de enriquecimiento para el aislamiento de Salmonella spp. a partir de materiales clínicos, especialmente heces.

FundamentoEste caldo selectivo favorece el crecimiento de Salmonella spp.En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, el selenito de sodio inhibe la flora Gram positiva y la mayoría de la flora entérica excepto Salmonella spp. durante las primeras 8-12 horas de incubación.


Peptona 5.0 Suspender 23 g del polvo en un litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar ligeramente hasta su disolución completa. Evite el calentamiento

Lactosa 4.0

Fosfato de sodio 10.0

excesivo.No esterilizar en autoclave. Distribuir en tubos estériles un volumen

Selenito de sodio 4.0

pH final: 7.0 ± 0.2

Siembra-Materia fecal: a un tubo con 10-15 ml de caldo selenito, agregar 1-2 ml de una suspensión de materia fecal. -Tejido infectado: macerar 1-2 g de tejido en 10-15 ml de caldo selenito, usando una varilla estéril. -Orina: a un tubo con unos 5 ml de caldo selenito doble concentración, agregar igual volumen de orina.

IncubaciónA 35-37 °C, durante 16-24 horas, en aerobiosis.Luego, subcultivar en medios selectivos: Salmonella Shigella Agar (B02-138-05/06), Hektoen Entérico Agar (B02-110-05/06), Verde Brillante Agar (B02-124-05/06), Mac Conkey Agar (B02-114-05/06).

Resultados


Salmonella enteritidis ATCC 13076 Bueno

Salmonella typhimurium ATCC 14028 Bueno

Escherichia coli ATCC 25922 Regular-Escaso

Proteus mirabilis ATCC 43071 Regular-Escaso

Limitaciones-Se aconseja usar el medio el mismo día de la preparación.-No incubar el medio de cultivo sembrado por mas de 24 horas, debido a que el efecto inhibitorio del selenito disminuye luego de las primeras 6-12 horas de incubación, y además porque no es favorable para la mayoría de las cepas de Salmonella, que pueden no recuperarse.-La única ventaja de incubar durante 48 horas es el incremento de la recuperación de Salmonella pullorum.

Características del medioMedio preparado: ámbar claro, traslúcido.


TSI Agar - Diferencial

Medio universalmente empleado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico.

FundamentoEn el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.



Suspender 62,5 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar con agitación frecuente, hervir 1 o 2 minutos hasta disolución total. Llenar hasta la tercera parte de los tubos de ensayo. Esterilizar a 121°C por 15 minutos. Enfriar en pico de flauta profundo.

Pluripeptona 20.0


Lactosa 10.0

Sacarosa 10.0

Glucosa 1.0

Sulfato de hierro y amonio 0.2


Rojo de fenol 0.025

Agar 13.0

pH final: 7.3 ± 0.2

SiembraA partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del medio.

IncubaciónA 35-37°C durante 24 horas, en aerobiosis.

Resultados

1-Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa.2-Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa,

lactosa y/o sacarosa.3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azúcares.4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas.5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico.

Microorganismo Pico/Fondo Producción de gas Producción deácido sulfhídrico

E. coli ATCC 25922 A/A + -

K. pneumoniae ATCC 700603

A/A + -

P. mirabilis ATCC 43071 K/A + +

S. typhimurium ATCC 14028

K/A - +

S. enteritidis ATCC 13076 K/A + +

S. flexneri ATCC 12022 K/A - -

P. aeruginosa ATCC 27853 K/K - -

A: ácidoK: alcalino

Características del medioMedio preparado: rojo


Simmons Citrato Agar

Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía.

FundamentoEn el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como única fuente de carbono, usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno, con la consiguiente producción de alcalinidad.

El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de citrato permeasa.


Citrato de sodio 2.0Suspender 24,2 g del medio deshidratado por litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar en posición inclinada.


Fosfato dipotásico 1.0

Fosfato monoamónico 1.0

Sulfato de magnesio 0.2

Azul de bromotimol 0.08

Agar 15.0

pH final: 6.9 ± 0.2

SiembraA partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie un inóculo ligero , usando una ansa sin arrastrar el agar.

IncubaciónA 35-37 ºC, durante 24-48 horas, en aerobiosis.Algunos microorganismos pueden requerir hasta 4 días de incubación.

Resultados

-Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.-Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.

Microorganismo Citrato permeasa Color del medio

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Positivo Azul

S. typhimurium ATCC 14028 Positivo Azul

E. coli ATCC 25922 Negativo Verde

S. flexneri ATCC 12022 Negativo Verde

Limitaciones-Si se usa un inóculo denso para sembrar el medio de cultivo, puede variar el color del pico del verde al amarillo-amarronado. Esto no afecta el color verde del resto del medio de cultivo, pero puede afectar la visualización

azul de un resultado positivo.-Inóculos muy densos, pueden originar resultados falsos positivos. -Cuando se siembra una serie de pruebas bioquímicas a partir del mismo cultivo, se debe esterilizar la aguja de inoculación antes de inocular la prueba del citrato o sino inocularla primero. Cualquier arrastre de materia orgánica puede originar resultados falsos positivos.

Características del medioMedio preparado: verde.


Lisina Hierro Agar.

Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilación / desaminación de la lisina y en la producción de ácido sulfhídrico.

FundamentoEn el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de ácido sulfhídrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilación de la lisina, tiene lugar en medio ácido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada.Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubación se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo.La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formación de sulfuro de hierro.Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno forma un color rojizo en la superficie del medio.


Peptona de gelatina 5.0 Suspender 35 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Dejar embeber unos 15 minutos. Calentar cuidadosamente, agitando con frecuencia


Glucosa 1.0

y hervir durante un minuto hasta la disolución completa. Distribuir y esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Enfriar en pico de flauta dejando un fondo vertical apto para la punción.

Lisina 10.0

Citrato de hierro y amonio 0.5


Púrpura de bromocresol 0.02

Agar 15.0

pH final: 6.7 ± 0.2

SiembraPor punción profunda con aguja de inoculación.

IncubaciónEn aerobiosis, durante 24 horas a 35-37 °C.

Resultados

1- Decarboxilación de la lisina:

-Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta.-Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.

2-Desaminación de la lisina:

Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del género Proteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp.

3-Producción de ácido sulfhídrico:

-Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el límite del pico y fondo)

MicroorganismosColor en el pico de flauta Color en la base del

tuboEnnegrecimiento del medio

Proteus mirabilis ATCC 43071 Rojo Amarillo Negativo

Salmonella typhimurium ATCC 14028 Púrpura Púrpura Positivo

Salmonella enteritidis ATCC 13076 Púrpura Púrpura Positivo

Providencia spp. Rojo Amarillo Negativo

Citrobacter freundii Púrpura Amarillo Positivo

Morganella spp.* Rojo Amarillo Negativo

Edwarsiella spp. Púrpura Púrpura Positivo

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Púrpura Púrpura Negativo

Escherichia coli ATCC 25922 Púrpura Púrpura Negativo

*Algunas especies de Morganella spp., pueden desaminar la lisina.

Características del medioMedio preparado: color violeta.


SIM Medio - Diferencial

Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

FundamentoEl triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la tripteína, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de Kovac´s o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo. Las cepas móviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la punción de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhídrico se distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.


Tripteína 20.0 Suspender 30 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar hasta disolver; calentar agitando y hervir durante un minuto. Distribuir unos 4 ml en tubos de hemólisis y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Solidificar en posición vertical.

Peptona 6.1

Sulfato de hierro y amonio 0.2


Agar 3.5

pH final: 7.3 ± 0.2

SiembraA partir de un cultivo de 18-24 horas en medio sólido, sembrar por punción profunda con aguja de inoculación recta (no usar ansa con anillo). Se debe inocular el centro del tubo, y la punción debe abarcar 2 tercios de profundidad del medio de cultivo desde la superficie. Es importante que la siembra se realice en línea recta.

IncubaciónDurante 24 horas, a 35-37 °C, en aerobiosis. Luego de la incubación, agregar 3-5 gotas de reactivo de Kovac´s o de Erlich.

Resultados

Cepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas allá de la línea de siembra. Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la línea de siembra. Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o en todo el medio. Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac´s o de Erlich. Cepas indol negativas: sin cambio de color.

Microorganismo Movilidad Indol Producción de ácido sulfhídrico

E. coli ATCC 25922 + + -


- - -

P. mirabilis ATCC 43071 + - +


+ - +

S. enteritidis ATCC 13076 + - +

S. flexneri ATCC 12022 - - -

Limitaciones-En las bacterias aerobias estrictas, que sólo crecen en superficie, la movilidad puede ser difícil de observar.-Algunas bacterias productoras de melanina como M. morganii, pueden dar un color parduzco, que no debe confundirse con el color negro debido a la producción de ácido sulfhídrico.

Características del medioMedio preparado: ámbar.


Christensen Medio (Urea Agar Base).

Medio utilizado para diferenciar microorganismos en base a la actividad ureásica.Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como Proteus spp., otras enterobacterias y estafilococos.

FundamentoEn el medio de cultivo, la tripteína y la glucosa, aportan los nutrientes para el desarrollo de

microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el rojo de fenol es el indicador de pH.Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberando amoníaco y dióxido de carbono. Estos productos alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al rojo. En este medio, la fermentación de la glucosa activa la enzima ureasa, acelerando la velocidad del metabolismo en aquellos organismos que hidrolizan lentamente la urea, como especies de Enterobacter o Klebsiella.


Tripteína 1.0 Suspender 24 g de polvo en 950 ml de agua destilada. Dejar reposar 2 minutos. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 50°C y agregar 50 ml de una solución de urea al 40% previamente esterilizada por filtración o cloroformo. Fraccionar en tubos de hemólisis y solidificar en pico de flauta con fondo profundo.

Glucosa 1.0


Fosfato monopotásico 2.0

Rojo de fenol 0.012

Agar 15.0

pH final: 6.8 ± 0.2

SiembraA partir de un cultivo puro de 18-24 horas, estriar la superficie del pico de flauta. Algunos microorganismos pueden requerir mayor tiempo de incubación.Se recomienda no punzar la capa profunda para controlar el color.

IncubaciónEn aerobiosis, durante 24-48 horas a 35-37 °C.

Resultados

Microorganismo Actividad ureásica Color del medio

Proteus mirabilis ATCC 43071 Positiva Rojo-Rosado

K. pneumoniae ATCC 700603 Positiva débil Rojo-Rosado

Escherichia coli ATCC 25922 Negativa Amarillo

S. flexneri ATCC 12022 Negativa Amarillo

S. typhimurium ATCC 14028 Negativa Amarillo

Limitaciones-Bacterias que hidrolizan lentamente la urea, como ser Klebsiella, Enterobacter y Citrobacter, viran al color rojo-rosado de todo el medio de cultivo luego de varios días de incubación.-No calentar o sobrecalentar el medio de cultivo porque la urea se descompone facilmente.

Características del medioMedio preparado: amarillo


MR-VP Medio – Medio diferencial

Medio utilizado para la realización del ensayo de Rojo de Metilo y Voges Proskauer. Es particularmente útil para la clasificación de enterobacterias.

FundamentoEn el medio de cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano y la glucosa es el hidrato de carbono fermentable.La glucosa puede ser metabolizada por los microorganismos, a través de distintas vías metabólicas. Según la vía utilizada, se originarán productos finales ácidos (ácido láctico, ácido acético, ácido fórmico), o productos finales neutros (acetil metil carbinol).Esta diferencia en el metabolismo bacteriano, podría ser reconocida por la adición de un indicador como rojo de metilo, para revelar la presencia de productos ácidos, y por la adición de alfa naftol e hidróxido de potasio para evidenciar la presencia de productos finales neutros. Voges y Proskauer, describieron una coloración rojiza que aparecía después de adicionar hidróxido de potasio a los cultivos de ciertos microorganismos en medio con glucosa. Esta coloración se debe a la oxidación del acetilmetil carbinol a diacetilo el cual reacciona con la peptona del medio para dar un color rojo.


Pluripeptona 7.0 Suspender 17 g del polvo por litro de agua destilada. Calentar suavemente agitando hasta disolver. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121°C durante 15 minutos.

Glucosa 5.0

Fosfato dipotásico 5.0

pH final: 6.9 ± 0.2

SiembraPor inoculación directa, a partir del cultivo en estudio.

IncubaciónEn aerobiosis, a 35-37°C por 3 días.

Revelado de pruebas bioquímicas

a-Prueba del rojo de metilo:

Añadir unas gotas de una solución de rojo de metilo al 0.04%, observar el color del medio.

b-Prueba del Voges Proskauer:

Añadir 0,6 ml de alfa naftol al 5% en alcohol etílico absoluto y 0.2 ml de hidróxido de potasio al 40% a 2.5 ml de cultivo. Agitar vigorosamente el tubo, y dejar a temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Observar el color de la superficie del medio.

Resultados

1-Prueba del rojo de metilo: Positivo: color rojo.Negativo: color amarillo.

2-Prueba de Voges Proskauer: Positivo: desarrollo de un color rojo en pocos minutos después de una completa agitación del tubo.Negativo: ausencia de color rojo.

Microorganismo Crecimiento RM VP

E. coli ATCC 25922 Bueno + -


Bueno - +

P. mirabilis ATCC 43071 Bueno + -


Bueno + -

Citrobacter freundii Bueno + -

Enterobacter aerogenes Bueno - +

LimitacionesEn algunas cepas positivas para la prueba VP, pueden no desarrollar el color rojo en la superficie mediante el revelado por la metodología descripta anteriormente. En estos casos, se recomienda calentar el medio de cultivo para favorecer el desarrollo de color rojo.

Características del medioMedio preparado: ámbar claro, transparente sin precipitado.


medios de cultivo

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