medios de cultivo

5/16/2018 Medios de Cultivo - slidepdf.com

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MEDIOS DE CULTIVO. TIPOS, CLASIFICACIÓN, ENUMERACIÓN,ELABORACIÓN GENERAL Y UTILIZACIÓN DE LOS MISMOS.TECNICAS DE INOCULACION, INCUBACION Y RECUENTO DELA MUESTRA BIOLOGICAS.

1.- INTRODUCCION

2.- MEDIOS DE CULTIVO2.1.- CONDICIONES GENERALES PARA EL CULTIVO DEMICROORGANISMOS

2.1.1.- DISPONIBILIDAD DE NUTRIENTES ADECUADOS2.1.2.- CONSISTENCIA ADECUADA DEL MEDIO2.1.3.- ESTERILIDAD DEL MEDIO

2.2.- CLASIFICACION

2.2.1.- SEGÚN SU ESTADO FISICO2.2.2.- SEGÚN SU COMPOSICION2.2.3.- SEGÚN AL USO AL QUE SE DESTINEN

2.3.- COMPOSICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO2.4.- CONTROL DE CALIDAD

3.- PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO3.1.- MODELO ESTANDAR DE PREPARACION

4.- MEDIOS DE USO COMUN EN EL LABORATORIO.

4.1.- AGAR SANGRE.4.2.- AGARCHOCOLATE4.3.- AGAR MCCONKEY4.4.- CALDO TIOGLICOLATO4.5.- AGAR SCHAEDLER 4.6.- AGAR KANA-VANCO4.7.- AGAR BBE4.8.- AGAR SALMONELLA-SHIGELLA4.9.- KLIEGER (KIA)4.10.-AGAR SABOREUAD

4.11.- AGAR MUELLER-HINTON4.12.- AGAR THAYER-MARTIN4.13.- AGAR CLED

5.- INCUBACION6.- INOCULACION.

6.1.- SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO LÍQUIDO6.2.- SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO SÓLIDO

6.2.1.- TUBO.6.2.2.- PLACA PETRI.

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http://danival.org/notasmicro/medioscult/medios_kv.html

http://danival.org/notasmicro/medioscult/medios_bbe.html

http://danival.org/notasmicro/medioscult/medios_ss.html







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1.- INTRODUCCION

Koch realizó sus investigaciones utilizando en un primermomento rodajas de patata como soporte nutritivo sólido, pero no

tardó en recurrir al caldo de carne líquido, diseñado por Loeffler, alque, en 1881, añadió gelatina, logrando un medio sólido transparenteideal para la observación de la morfología macroscópica de lascolonias microbianas. En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri,comienza a utilizar placas de cristal planas, que se llaman desdeentonces placas de Petri, para sustituir a las clásicas bandejas devidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces.Actualmente se han preparado más de 10.000 medios de cultivodiferentes.

Uno de los sistemas más importantes para la identificación demicroorganismos es observar su crecimiento en sustanciasalimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El materialalimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio deCultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio decultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son:temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo

debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios ydebe estar exento de todo microorganismo contaminante.

2.- MEDIOS DE CULTIVO

La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientescomplejos similares en composición a los líquidos orgánicos delcuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es unainfusión de estractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros

ingredientes2.1.- CONDICIONES GENERALES PARA EL CULTIVO DEMICROORGANISMOS

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio decultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia yque, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.

2.1.1.- DISPONIBILIDAD DE NUTRIENTES ADECUADOSUn medio de cultivo adecuado para la investigación

microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno,azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias

http://danival.org/gente/koch.html





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ciertas vitaminas y otras sustancia inductoras del crecimiento.Siempre han de estar presentes las sustacnias adecuadas paraejercer de donantes o captadores de electrones para las reaccionesquímicas que tengan lugar.

Todas estas sustancias se suministraban originalmente enforma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos delevadura. Sin embargo, la preparación de estas sustancias para suaplicación a los medios de cultivo provocaban la pérdida de los

factores nutritivos lábiles. Actualmente, la forma más extendida deaportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que,además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno ycarbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelenutilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de

atacar los aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógenopresentes en la peptona.

Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por loque se añade a muchos medios sustancias como suero, sangre,líquido ascítico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertoscarbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio,manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento,generalmente de naturaleza vitamínica. Muy a menudo se añaden almedio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas

actividades metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer deinhibidores selectivos de ciertos microorganismos.

2.1.2.- CONSISTENCIA ADECUADA DEL MEDIOPartiendo de un medio líquido podemos modificar su

consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar,con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido. Losmedios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de quemuchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente atemperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de

que otros tienen la capacidad de licuarla.Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por suversatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de medioslíquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio.

2.1.3.- ESTERILIDAD DEL MEDIOTodos los medios de cultivo han de estar perfectamente

estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedanalterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbianonormal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. Elsistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave(que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante)



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2.2.- CLASIFICACION

Se pueden realizar distintas clasificaciones atendiendo a suestado físico, composición, el uso al que se destinan:

2.2.1.- SEGÚN SU ESTADO FISICOSe dividen en sólidos, semisólidos y líquidos:

Sólidos, presentan en su composición una agentesolidificante (AGAR) en proporción de 12 a 15 gramos porlitro.Semisólidos, presentan AGAR en su composición, pero auna concentración mucho menor, entre 2,5 a 4 gramos delagente solidificanteLíquidos, no presenta ningún agente solidificante

2.2.2.- SEGÚN SU COMPOSICIONSe dividen en empíricos, sintéticos y semisintéticos;

empíricos, en su composición aparecen sustanciasorgánicassintéticos, en su composición aparecen sustancias químicasdefinidassemisintéticos, en su composición aparecen moléculas denaturales hidrolizadas

2.2.3.- SEGÚN AL USO AL QUE SE DESTINEN

Se dividen en: enriquecidos, diferenciales o aislamiento, selectivose inhibidores, transporte y mantenimiento, uso general, para filtrosde membrana.

enriquecidos, suelen ser medios con un nutriente simpleque presentan enriquecedores, tales como sangre decaballo, etc.diferenciales o de aislamiento, contienen colorantes,azucares e indicadores para provocar la respuestabioquímica conocidaselectivos e inhibidores, además de los componentes de los

medios diferenciales, contienen en su composición unaserie de agentes que sirven para inhibir la floraacompañante de la muestra a estudiar, y aislar, de estaforma, el microorganismo que se busca.transporte y mantenimiento, se utilizan en la recogida,transporte y conservación de muestras biológicas. sonmedios muy reductores que inhiben las reaccionesenzimáticas autodestructivas dentro de las células evitandolos efectos destructivos de la oxidación.uso general, son medios que soportan el crecimiento de

una amplia variedad de microorganismos fastidiosos.filtros de membrana, son medios que permiten el examende grandes volúmenes con un baja concentración de



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microorganismos, la separación de los microorganismos delmedio de cultivo e incluso su cambio de un medio decultivo a otro, permite el crecimiento sin interrupción delmicroorganismo.

2.3.- COMPOSICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los constituyentes mas utilizados en la composición de losmedios de cultivo son: agar, peptona, extracto de carne, extracto delevadura, sangre, plasma, suero, bilis, sales biliares, gelatina,carbohidratos, indicadores,

Agar, comercialmente se presenta en gránulos y polvos, laconcentración en la que se encuentra en los medios decultivo, dependerá del uso que quiera darse al medio.Peptona, es un producto de composición variable, obtenido

generalmente de la hidrólisis ácida o enzimática de lasproteínas vegetales o animales.Extracto de carne, contiene bases orgánicas solubles,productos de degradación de las proteínas, vitaminas yminerales.Extracto de levadura, se consigue a partir de levadura depan o de cerveza y es una fuente de aminoácidos yvitaminas del complejo B.Sangre, las mas utilizada es la de sangre o carnero, tieneque estar libre de agentes antimicrobianos para evitar la

inhibición el crecimiento de los

microorganismos. Se debe de comprobar siempre laesterilidad, así como la ausencia de citratos ya que inhibenel crecimiento de estafilococos.Plasma, se utiliza para emplear la actividad coagulasa delas bacterias, se emplea plasma humano o de conejo.Suero, se prepara a partir de sangre recolectada sin adiciónde anticoagulante, eliminando el líquido que se separacuando se contrae el coágulo.

Bilis, contiene varios ácidos biliares, como compuestosconjugados con aminoácidos, bilirrubina y biliverdina.Sales biliares, inhiben el crecimiento de bacteriasgrampositivas y bacilos en forma de esporas, sin afectar eldesarrollo de los bacilos entéricos gramnegativos.Gelatina, proteína obtenida mediante extracción dematerial colágeno a partir de tejidos animales... Es unagente solidificante pero se emplea poco ya que bastantesbacterias provocan su licuación.Carbohidratos se adicionan por dos motivos

fundamentales: para incrementar el valor nutritivo delmedio y para detectar reacciones de fermentación de losmicroorganismos que ayuden a identificarlos.



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Indicadores, para detectar, por ejemplo, la formación deácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacteriasy no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya quees rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta deGenciana se usa como inhibidor ya que impide el

crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram-positivas).

2.4.- CONTROL DE CALIDAD

Los medios de cultivo pueden prepararse en el laboratorio apartir de diferentes ingredientes químicos o a partir de productos enpolvo deshidratados comerciales, pero también pueden adquirirsemedios listos para su uso. El laboratorio debe asegurarse de que lacalidad de los medios de cultivo y reactivos es apropiada para losensayos realizados. Se recomienda que provengan de empresas

certificadas según ISO 9000. El laboratorio debe asegurarse de que lacertificación cubre todas las operaciones relevantes, entre ellas las desuministro y entrega, cuando estas influyan en la calidad de losproductos, deberá solicitar también, una copia del certificado deregistro ISO 9000 a los proveedores de los productos.

El fabricante debería aportar, inicialmente, una "especificaciónde calidad" que incluya el mayor número posible de los puntossiguientes:

caducidad del producto

condiciones de almacenamientocontrol de esterilidad, incluyendo criterios de aceptabilidadcontroles de la eficacia, incluyendo el microorganismo usado,referencia de la colección de cultivos y criterios de aceptabilidadfecha de emisión de la especificación, plan y frecuencia demuestreo

Se recomienda realizar controles adicionales con carácteraleatorio, para asegurarse de que los productos siguen cumpliendolas especificaciones requeridas. Estos controles pueden incluirse en el

programa interno de control de calidad. Los medios de cultivo,productos en polvo deshidratados y reactivos comerciales debenconsumirse antes de la fecha de caducidad. El laboratorio deberegistrar la fecha de recepción, la fecha de caducidad y la fecha deapertura del envase. El almacenamiento debe realizarse en lascondiciones apropiadas. Todos los envases, especialmente los quecontengan medios deshidratados, deben estar herméticamentecerrados. No deben utilizarse medios deshidratados que presentenapelmazamiento o un cambio de color.

Los lotes de medios preparados según formula en el laboratoriodeben verificarse para comprobar que facilitan el crecimiento dedeterminados cultivos microbianos procedentes de una colección



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reconocida y debe verificarse que los medios selectivos inhiben elcrecimiento de microorganismos no deseados, así como demostrar suesterilidad. Si se dispone de aislados bien caracterizados yreconocidos por otros laboratorios, pueden también ser utilizadoscomo cepas para el control de calidad de los medios.

En lugar de utilizar el método frecuente de cultivo en línea, serecomienda utilizar un procedimiento cuantitativo que consiste eninocular en el medio un número conocido, normalmente pequeño, demicroorganismos y evaluar el número de microorganismosrecuperados. Este método puede utilizarse para establecer el nivel derecuperación por debajo del cual se rechaza un lote.

Atendiendo a los factores que hemos comentado el control decalidad se puede clasificar atendiendo, a su presentación y

almacenamiento:Atendiendo a su presentación:

Placa Petri : 2,5mesesTubo: 6 mesesVial : 6 mesesFrasco : 8 mesesLaminocultivos: 6 meses:

Almacenamiento, encamaras frías a una temperatura entre 4-8ºC



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3.- PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

La preparación de los medios de cultivo deshidratados, es enesencia, una simple manipulación que pone especial atención en lacalidad del medio y en la esterilidad del proceso. Si se utiliza un

medio comercializado, las instrucciones de uso vienen detalladas encada envase y debe seguirse de forma estricta.

La preparación de los medios de cultivo, consta de tres partes,medios deshidratados (seguir instrucciones del fabricante), material(agua y esterilización). Respecto al agua, esta debe de ser destilada yno debe de contener cloro, además debe de presentar unaconductividad adecuada y un contenido iónico tal como indican lasespecificaciones de agua purificadas de la USP

3.1.- MODELO ESTANDAR DE PREPARACION

En la preparación de los medios de cultivo en un laboratorio deMicrobiología, se siguen los siguientes pasos:

Paso 1, se disuelve la cantidad de medio que aconsejanlos manuales de microbiología del medio que se va afabricar en el volumen de agua destilada o desionizadaque se nos indique. La disolución se debe hacercalentando y agitando al mismo tiempo, cuando se tratade un medio de cultivo sólido o semisólido, hasta que se

disuelva por completo. Si el medio de cultivo es líquidocon una fuerte agitación e suficiente.Paso 2, se esteriliza el medio de cultivo, ya disuelto, enautoclave. Después de permanecer en el autoclave eltiempo requerido, (1litro de medio necesita 15 minutosde autoclave a 121ºC, ciclo de esterilización), se abrelentamente y se deja que se atempere.Paso 3, los medios se trasladan a una zona estéril, parairlos enfriando lentamente y añadirles, si procede, lossuplementos requeridos para cada medio (sangre,

antibióticos, vitamins,etc).Paso 4, se dosifica el medio de cultivo, la temperaturaoscila entre 45-50ºC, en el tipo de envase que se vaya arequerir en condiciones totalmente asépticas.



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4.- MEDIOS DE USO COMUN EN EL LABORATORIO.

A continuación se exponen los medios mas utilizados en ellaboratorio de Microbiología con sus características.

4.1.- AGAR SANGRE.

El AS al 5% con base de Tripticasa-Soja es un medio de usogeneral que permite el crecimiento tanto de microorganismosexigentes como no exigentes, que incluyen bacterias aerobias yanaerobias, aunque no es medio de elección para anaerobios. Permitevisualizar reacciones hemolíticas que producen muchas especiesbacterianas. Tiene por base una fuente proteica (digeridos trípticos,digeridos proteicos de soja) con una pequeña cantidad de hidratos decarbono naturales, cloruro sódico y 5% de sangre.

La aportación de caseína y peptonas de soja al agar deTripticasa-soja hace el medio en muy nutritivo por el suministro denitrógeno orgánico, particularmente aminoácidos y pépticos decadena más larga. La presencia de estas peptonas en el mediopermite el cultivo de una gran variedad de gérmenes aerobios yanaerobios que crecen rápidamente, así como los del géneroCándida. También permite el crecimiento de algunos gérmenesexigentes como estreptococos, pneumococos, Brucella,corinebacterias, Erysipelothrix y Pasteurella.

Permite así mismo determinar la capacidad de algunasbacterias de producir enzimas extracelulares que actúan sobre losglóbulos rojos, ya sea por lisis completa (hemólisis beta, produce unhalo transparente alrededor de la colonia hemolítica), parcial(hemólisis alfa, coloración verdosa alrededor de la colonia) o porausencia de alteración (hemólisis gamma).

La producción de hemolisinas por las bacterias depende demuchos factores ambientales como pH o atmósfera de incubación.

Las muestras que puedan contener Brucella o Neisseria debenincubarse en atmósfera enriquecida en CO2. Las muestras quepuedan contener Brucella o Neisseria deben incubarse enatmósfera enriquecida en CO2.

4.2.- AGAR CHOCOLATE

Este medio utiliza la misma base que el Agar Sangre.Antiguamente se añadían los hematíes a la base fundida y se elevabala temperatura para lisarlos parcialmente y que soltasen al medio sus

componentes. Esto daba al medio su habitual color pardo chocolate.El Agar chocolate es un medio destinado principalmente alaislamiento de gonococos y meningococos, pero en el que pueden



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crecer muchos otros microorganismos exigentes. Con un medioanálogo a éste es con el que Thayer y Martin han hecho sus primerosasilamientos selectivos de gonococos, después de añadir antibióticos.

El Agar chocolate lleva Hemoglobina que aporta al medio otros

factores, en particular el factor V (nicotín-adenina nucleótido)termosensible, que no se encuentran en el Agar chocolate puedenaportarse en una mezcla químicamente definida: el PolyViteX. El Agarchocolate con PolyViteX permite el cultivo de la mayor parte de losgérmenes encontrados en patología humana o veterinaria.

La siembra de líquidos cefalorraquídeos, pus, resiembra dehemocultivos, etc., es favorable en este medio, pero estáparticularmente indicado para aislamiento de las Neisserias patógenas y de los Haemophilus.

4.3.- AGAR MCCONKEY

El agar MacConkey II es una medio selectivo y diferencial parala detección de organismos coliformes y patógenos entéricos.Actualmente existen una gran cantidad de medios diseñados para elaislamiento, cultivo e identificación de bacterias entéricas. El artículobase sobre el agar MacConkey, uno de los primeros que sedesarrollaron, fue publicado en 1905 y contenía una descripcióndetallada de su composición y de los diferentes patrones de

crecimiento obtenidos. Su composición se ha modificado ennumerosas ocasiones

Actualmente existen una gran cantidad de medios diseñadospara el aislamiento, cultivo e identificación de bacterias entéricas. Elartículo base sobre el agar MacConkey, uno de los primeros que sedesarrollaron, fue publicado en 1905 y contenía una descripcióndetallada de su composición y de los diferentes patrones decrecimiento

obtenidos. Su composición se ha modificado en numerosas ocasiones.La fórmula del agar MacConkey II es de 1983 y se diseñóespecialmente para mejorar su capacidad de inhibir el “swarming” deProteus spp y para alcanzar una definitiva diferenciación entrefermentadores y no fermentadores de la Lactosa.

Este medio es ligeramente selectivo ya que la concentración desales Biliares, que inhiben el crecimiento de los microorganismosGram positivos, es baja en relación con otros medios similares. Seincluye también cristal violeta para inhibir el crecimiento de lasbacterias Gram positivas, especialmente estafilococos y enterococos.



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La diferenciación de organismos entéricos se lleva a cabo con lacombinación de Lactosa con el indicador Rojo neutro. Se producencolonias rosas a rojas si el aislado es capaz de fermentar la Lactosa ycolonias sin color en caso contrario.

colonias lactosa (-): incoloras (= no hay fermentación de laLactosa). Salmonella, Shigella, Pseudomonas colonias lactosa (+): rosa/rojo ladrillo rodeadas de un halo desales biliares precipitadas. E. coli (rosa/roja), E. aerogenes (rosa y mucosa)

4.4.- CALDO TIOGLICOLATO

Es el caldo de enriquecimiento más utilizado en Microbiología.Contiene 0,075 % de Agar para evitar que las corrientes de

convección transporten el oxígeno de la superficie a toda la masa delcaldo. El ácido tioglicólico actúa como agente reductor, disminuyendoaun más el potencial de óxido-reducción del medio.

Con el agregado de muchos factores nutrientes (Caseína,extractos de Levadura y Carne, Vitaminas, etc.), el medio permite eldesarrollo de la mayor parte de las bacterias patógenas. Hay distintasfórmulas modificadas en las que se han incluido otros componentes:un indicador de óxido-reducción (Resazurina), Glucosa, Vitamina K1 yHemina.

4.5.- AGAR SCHAEDLER

Schaedler + 5% sangre de cordero es un medio reductor estáparticularmente adaptado al cultivo de los gérmenes anaerobios. Lapresencia de factores de crecimiento tales como el extracto delevadura, la hemina y la vitamina K3, así como la adición de la sangrede cordero, permiten el crecimiento de especies exigentes.

Debido al elevado contenido en glucosa de este medio, la

intensidad de la hemólisis de los estreptococos puede disminuir.Sembrar lo más rápidamente posible la muestra a su llegada allaboratorio. Las muestras deben ser transportadas en un medio quegarantice la anaerobiosis (Portagerm tubo o frasco). Después desembrar, colocar inmediatamente las placas en la jarra deanaerobiosis o bien en sistema individual.

4.6.- AGAR KANA-VANCO

Se utiliza para el aislamiento rápido de Bacteroides sp. Contiene75 µg/ml de Kanamicina, que inhibe a la mayoría de los bacilosaerobios, facultativos y anaerobios excepto Bacteroides, y 7,5 µg/mlde Vancomicina, que inhibe a la mayoría de los microorganismos









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grampositivos. Contiene también sangre "lacada" de conejo quepermite la pigmentación precoz de los Bacteroides sp pigmentados.

Muchas cepas de B. assaccharolyticus y B. gingivalis nocrecerán en este medio debido a su sensibilidad a la Vancomicina. Las

levaduras y otros microorganismos resistentes a la Kanamicinapueden crecer en este medio, en consecuencia, debe realizarse unatinción Gram y confirmar la tolerancia al aire de todos los organismosaislados.

4.7.- AGAR BBE ( Bacteroides Bilis Esculina)

El medio BBE es un medio selectivo para el aislamiento eidentificación presuntiva de bacterias del grupo Bacteroides fragilis.Fue presentado en 1978 por Livingston y sus colaboradores. La

mayor parte de las infecciones humanas producidas por bacteriasanaerobias son debidas a gérmenes pertenecientes al grupoBacteroides fragilis (B. fragilis, B. thetaiotaomicron, B. ovatus, B.distasonis y B. vulgatus). Es importante una rápida detección eidentificación de estos microorganismos ya que se ha observado unincremento de la resistencia a antibióticos mayor que en otros gruposde anaerobios.

El agar BBE permite una inhibición selectiva demicroorganismos anaerobios facultativos y de la mayor parte de los

anaerobios Gram negativos debido a que contiene amikacina y oxgall.La diferenciación del grupo Bacteroides fragilis se basa en la hidrólisisde la esculina con producción de esculetina y dextrosa. La esculetinareacciona con la sal de hiero presente en el medio (citrato férricoamónico) produciendo una coloración marrón oscuro-negro rodeandoa las colonias de de las cepas del grupo Bacteroides fragilis.Contiene Amikacina que inhibe el desarrollo de los microorganismosaerobios, Bilis que inhibe a la mayoría de anaerobios excepto los delgrupo B. fragilis y otras pocas especies, y Esculina que es útil parala detección de este grupo de microorganismos ya que por lo general

son Esculina positivos.También pueden crecer en este medio: Fusobacterium

mortiferum, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus sp, levadurasy algunos otros microorganismos.

4.8.- AGAR SALMONELLA-SHIGELLA

Agar altamente selectivo que se utiliza para el aislamiento deSalmonella y de alguna especies de Shigella. Se diseñó paradiferenciar fermentadores de lactosa de los que no la fermentan,proporcionando buena inhibición de coliformes sin restringir elcrecimiento de otros bacilos Gram-negativos (BGN) patógenos.









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Salmonella y Shigella (y otros no fermentadores de lactosa)producen colonias transparentes, translúcidas, mientras los pocosfermentadores de lactosa que se desarrollan dan colonias mucosas,rojizas.

Bacteria Crecimientobacterias

Color

Salmonella enteritidis bueno incoloraProteus mirabilis aceptable incoloraShigella flexneri regular incoloraEnterococcus faecalis escaso incoloraEnterobacter aerogenes

regular crema/rosa

4.9.- AGAR KLIEGER (KIA)

Se recomienda para la identificación de bacilos entéricosgramnegativos. Se basa en la fermentación de dextrosa y lactosa yen la producción de ácido sulfhídrico (H2S). Se recomienda paraidentificar posteriores cultivos de colonia tomados de mediosprimarios (Agar McConkey, Agar SS, etc). El rojo de fenol es elindicador de la producción de ácido y el sultafo ferroso es de laproducción de H2S

Bacteria Crecimiento

bacteriano

Pendiente Base Gas H 2S

E .coli Buena Amarilla(*)

Amarilla Si No

P.vulgaris Buena Rojo (**) Amarilla No SiS.eneteritidis

Buena Rojo Amarilla Si Si

(*) Amarillo: ambiente ácido(**) Rojo: ambiente rojo

4.10.- AGAR SABOREUAD

Es un medio diferencial, recomendado para el cultivo ycrecimiento de hongos. Para que ocurra el crecimiento selectivo dehongos sobre bacterias en las muestras a analizar, este medio tansolo depende de la reacción ácida (pH 5,6)

Hongo CrecimientoCandida albicans BuenoSaccharomyces

cerevisae

Bueno

Apergillus Níger Bueno



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4.11.- AGAR MUELLER-HINTON

Específico para la realización de antibiogramas, existen dosvariantes, Agar Mueller-Hinton/Sangre y Agar Mueller-Hinton/Chocolate , estas variaciones se realizan para obtener la

sensibilidad antimicrobiana de ciertos microorganimos, St.Pneumoniae y Haemophilus spp. Respectivamente.

4.12.- AGAR THAYER-MARTIN

Es un medio empleado para el crecimiento de Neisseria spp, demuestras que contengan flora acompañante (bacterias y hongos).Básicamente, el medio es un Agar Chocolate con los factores V y X, alque se añaden cuatro antibióticos para que actúen de inhibidores(Vancomicina, Colistina, Anfotericina, Trimetopin)

Bacteria CrecimientoN. gonorrhoeae BuenoN. meningitidis BuenoC.albicans Inhibido

4.13.- AGAR CLED

Utilizado como medio diferencial para el aislamiento,enumeración e identificación de microorganismos en orina. Al tener

deficiencia electrolítica, este medio inhibe la aglomeración de Proteusspp al no formar el sobrecrecimiento en lámina. El medio incluyelactosa, para detectar contaminantes coniformes que fermenten lalactosa, que hace que el medio en torno a la colonia vire a coloramarillo.

Bacteria Crecimiento ColorE. coli Bueno TransparenteP. mirabilis Bueno TransparenteS. aureus Bueno Amarillo



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5.- INCUBACION

A la hora del crecimiento bacteriano, existen una serie defactores que pueden modificar dicho desarrollo, para la cual debemosde utilizar unos parámetros correctos de incubación para que

posteriormente permita realizar una buena identificación.

5.1.- CONDICIONES ADECUADAS DE HUMEDAD

Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en laatmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las célulasvegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever elmantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivoa 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua quemantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y

evitar así que se deseque el medio.

5.2.- PRESENCIA (O AUSENCIA) DE OXÍGENO Y OTROS GASES

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera contensión de oxígeno normal (aerobios estrictos). Algunas puedenobtener el oxígeno directamente de variados sustratos (anaerobiosfacultativos) Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se

desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígenoambiental. En un punto intermedio, los microorganismosmicroaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmenteanaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras losanaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse acualquiera de las citadas condiciones.

5.3.- HUMEDAD

Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en laatmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las célulasvegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever elmantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivoa 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua quemantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos yevitar así que se deseque el medio.

5.4.- LUZ AMBIENTAL

La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en laoscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes

como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos.



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5.5.- pH

La concentración de iones hidrógeno es muy importante para elcrecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos sedesarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que

requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que lapresencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden elcrecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterarsus procesos metabólicos normales.

5.6. TEMPERATURA

Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima atemperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a0ºC y los termófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores

(hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecenen rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, ylos saprofitos tienen rangos más amplios.



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6.- SIEMBRA E INOCULACION.

La siembra consiste en disponer las bacterias que queremosestudiar en un medio de cultivo de una forma adecuada, La siembrapuede ser: Para aislamiento, para poder llevar a término el estudio de

un microorganismo es condición necesaria aislarle del resto demicroorganismos acompañantes.Otras técnicas, son pruebas que no permiten aislamento, en estecaso se pueden utilizar tantos medios sólidos como líquidos.

6.1.- SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO LÍQUIDO

Se puede realizar atendiendo al instrumento con que siembre,bien asa de siembra, pipeta o hisopo.

Asa de siembra, los tubos, del que se a va a sembrar y el que

contiene el medio, se toman con la mano izquierda, colocandolas bocas a la misma altura. Con la mano derecha se toma elasa de siembra, se esteriliza en la llama en posición verticalhasta que se ponga incandascente. Se destapan los tubos,tomando se esterilizan las bocas de los tubos pasándolos porla llama, se introduce el asa en el material y se introduce en elmedio de cultivo hasta el borde de líquido. Por ultimo seesteriliza el asa y el tubo se agita para una buenahomogenización del inóculo.Tubo, se puede utilizar cualquier pipeta, pero generalmente se

utiliza la pipeta PASTEUR, se utiliza la técnica expuestaanteriormente, pero esta vez el inóculo el liquido.Hisopo, el hisopo o torunda debe de ser estéril y vieneprotegido dentro de un tubo de plástico

6.2.- SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO SÓLIDO

Atendiendo al tipo de medio sólido, nos podemos encontrar quesean en tubo, placa PETRI

6.2.1.- TUBO.El agar tiene que estar en posicion inclinada, dejando unalengüeta en la parte superior y en la parte inferior una parte másancha. Se pueden realizar dos técnicas, por estría y picadura, enambos casos nos dice las características bioquímicas de la bacteria aestudiar (fermentación de azucares, movilidad, reducción demetales, etc.)

6.2.2.- PLACA PETRI.Se realiza en agar, se emplea para aislamiento de bacterias y

para la realización de antibiogramas. En este último caso,previamente se tiene que realizar una dilución de la muestra (con labacteria totalmente aislada) y se siembra con el hisopo en el medio



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en el cual se va a realizar el antibiograma, generalmente Mueller-Hinton, aunque atendiendo al tipo de bacterias podemos emplearagar sangre (hemólisis) y agar chocolate (factores X y V).

medios de cultivo

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