Métodos de Siembra

yTécnica Aséptica

Apartados de este ejercicio

A. Finalidad del ejercicioB. Métodos de siembra

C. Técnica asépticaD. Asa e hilo de platino: Pasos para la manipulación en condiciones asépticas

E. Placas petri: Pasos para la manipulación en condiciones asépticasF. Recipientes de vidrio; tubos, matraces, etc.: Pasos para la manipulación en condiciones asépticas

G. Pipetas de vidrio estériles: Pasos para la manipulación en condiciones asépticas H. Asa de Drigalski o asa acodada de vidrio: Pasos para la manipulación en condiciones asépticas

A. Finalidad del ejercicio El objeto de este ejercicio es comprender la técnica más importante, más distintiva y más esencial en un laboratorio de microbiología: La técnica aséptica en los métodos de siembra. Se intenta mostrar o dar a conocer algunas de sus características. Para ello, se describen algunos métodos de siembra, algunas reglas generales y algunos ejemplos de casos concretos.

B. Métodos de siembra

Métodos de siembra

Existen muchos métodos de siembra o de transferencia de microorganismos o de inocular medios de cultivo. Generalmente se realiza en 3 etapas: 1)Esterilizar el asa, hilo o pipeta de siembra; 2)Obtener o extraer el inóculo y 3)Transferirlo al medio estéril

A continuación se describen algunos ejemplos:

En tubo

En medio líquido con asa

Transferir asépticamente, con el asa de siembra, una pequeña muestra de los microorganismos, desde el tubo que contiene el material problema al tubo con medio de cultivo estéril. Sumergir el asa en el líquido y agitar para desprender y diluir la muestra. Incubar el tubo recién sembrado en estufa, durante 24-48 horas a la temperatura óptima de crecimiento.

En medio líquido con pipeta

Introducir asépticamente la pipeta Pasteur o la pipeta graduada en el medio líquido que contiene los microorganismos y, aspirando de forma adecuada, sacar una cantidad establecida de material que se transfiere al tubo con medio de cultivo estéril. Incubar en estufa a la temperatura y tiempo adecuados

En medio sólido (agar inclinado)

Con el asa de siembra estéril tomar los microorganismos de la muestra e inocular el tubo realizando un movimiento de zig-zag en la superficie. El proceso se inicia en el fondo y se va avanzando hacia arriba por el área inclinada. Incubar en estufa a la temperatura y tiempo adecuados.

En ocasiones los medios sólidos en agar inclinado deben sembrarse "en picadura y en estría". En este caso debe sembrarse con hilo de siembra y consiste en introducir primero el hilo en la parten no inclinada del agar (fondo del tubo) haciendo una línea recta y posteriormente sembrar en zig-zag sobre la superficie inclinada.

En medio semisólido

La siembra en este tipo de medio, que contiene una proporción menor de agar que los medios sólidos y que se introduce en tubos, se lleva a cabo con un hilo de siembra esterilizado, con el cual se toma la muestra. El medio queda inoculado al introducir el hilo en profundidad hasta el fondo del tubo, retirándolo posteriormente por la misma trayectoria utilizada al realizar la picadura.

Este método de siembra se utiliza normalmente para comprobar si el microorganismo es inmóvil ( si solo crece a lo largo de la línea de siembra) o es móvil (en el caso de crezca desplazándose más allá de la

línea de siembra). Por esta razón es muy importante realizar esta siembra adecuadamente ya que una siembra con asa o con un cierto movimiento de vaivén podría originar un patrón de crecimiento que se interpretaría erróneamente como movilidad bacteriana. Incubar en estufa a la temperatura y tiempo adecuados.

En placa de petri

Extensión en superficie con asa acodada o asa de Driglasky

Depositar sobre la superficie de una placa con agar una gota ó 0,1 ml de una determinada dilución del cultivo de microorganismos problema y extenderlo con ayuda del asa de Driglasky, previamente esterilizada, en todas las direcciones hasta que esté completamente seco. Incubar la placa, en posición invertida, a la temperatura y tiempo adecuados según el tipo de microorganismo. Incubar la placa en posición invertida para evitar que el agua de condensación se deposite sobre la superficie del medio, dificultando la obtención de colonias aisladas.

Es una técnica usada para el aislamiento de colonias, que permite igualmente el recuento de bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente el volumen de muestra sembrado.

Estría múltiple en superficie

Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre un área pequeña de la superficie de la placa con agar nutritivo, en forma de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para no dañar el agar.

Se flamea el asa, se enfría y después de rozar la siembra realizada previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estría. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada, siempre en posición invertida.

Mediante esta técnica se obtienen colonias aisladas a partir de un cultivo que contenga un elevado número de bacterias.

Homogenización en masa

En una placa de Petri vacía se deposita un pequeño volumen conocido de muestra y a continuación se añade el medio de cultivo (agar ) fundido y atemperado aproximadamente a 45ºC. Se mezclan ambos por rotación suave de la placa (movimientos circulares y de vaivén). De esta forma los microorganismos se distribuirán de forma homogénea en el medio de cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar.

Otra variación de esta técnica consiste en inocular el medio de cultivo, fundido y atemperado, contenido en un tubo, con un determinado volumen de la muestra. La homogeneización de la muestra y el medio de cultivo se realiza por rotación del tubo entre las manos, antes de verterlo sobre la placa. En ambos casos, tras homogeneización, se dejan enfriar las placas hasta que se solidifique el medio y posteriormente se incuban a la temperatura adecuada (siempre en posición invertida).

C. Técnica aséptica

Técnica aséptica

Ya hemos visto que existen diversas técnicas de inoculación, ya sea en tubo de ensayo, placa de Petri, matraz, etc., siendo necesario en cualquiera de ellas, hacerlo en condiciones asépticas, es decir, tomando todas las precauciones necesarias para evitar la contaminación tanto de los cultivos como de la persona que está realizando la siembra, para lo cual se requiere:

Algunas reglas generales

Limpiar el área de trabajo utilizando algún desinfectante como puede ser solución de benzal u otro.

Esterilizar el asa de siembra calentándola “al rojo” en la parte más alta de la llama del mechero antes y después de la siembra.

Flamear las bocas de los recipientes antes y después de tomar la muestra a inocular.

Realizar la siembra en el menor tiempo posible a efecto de minimizar el tiempo de exposición en el que puede ocurrir la contaminación.

Algunas casos concretos como ejemplo

En los próximos apartados de este ejercicio se verán algunos ejemplos concretos de pasos a llevar acabo para la manipulación en condiciones asépticas

D. Asa e hilo de platino: Pasos para la manipulación en condiciones asépticas:

Pasos o Fases para la manipulación en condiciones asépticas del asa o hilo de platino

Esterilizar

Forma de esterilizaciónSituar el asa aproximadamente perpendicular a la mesa de trabajo y flamear hasta que el filamento alcance un rojo vivo en toda su longitud. Cuando se quiera introducir en recipientes de cuello estrecho (Tubos, matraces, frascos, etc.) debes flamear también la parte del mango que vaya a estar dentro del recipiente durante algún momento de la manipulación.

Es necesaria la esterilización para evitar que se contamine la muestra que se va a manipular. RECUERDA que el asa SIEMPRE debe esterilizarse ANTES y DESPUÉS de su utilización.

Enfriar y utilizar

Forma de enfriar el asa después de su ESTERILIZACIÓN,

SIEMPRE se debe dejar enfriar unos segundos en la zona aséptica.

Es necesario dejarla enfriar para que al ponerla en contacto con la muestra a manipular no esterilice ésta (destruya los posibles microorganismos) por la elevada temperatura.

Se deja enfriar dentro de la zona aséptica (zona libre de microorganismos) para que no se vuelva a contaminar antes de su utilización.

Uso del asa o hilo de siembra.

Después de ENFRIARSE, puede ser utilizada para diferentes tipos de siembra.

NUNCA debe de salir de la zona aséptica para

evitar que se vuelva a contaminar.

Esterilizar

ESTERILIZACIÓN después de su utilización.

DESPUÉS de la utilización SIEMPRE hay que volver a esterilizar el asa antes de dejarla en el puesto de trabajo PARA EVITAR CONTAMINAR el ambiente, el puesto de trabajo y/o el personal.

E. Placas petri

Pasos o Fases para la manipulación en condiciones asépticas de las placas de Petri

Colocar

COLOCAR la placa en el puesto de trabajo.

Siempre hay que colocar la placa INVERTIDA dentro de la zona aséptica que origina el mechero.

Abrir

ABRIR la placa en condiciones asépticas.

Forma de ABRIR la placa en condiciones asépticas:

La APERTURA de la placa SIEMPRE orientada hacia la llama del mechero.La TAPA de la placa debe colocarse boca arriba dentro de la zona aséptica que origina el mechero como se muestra en el esquema.

Utilizar

Si en algún momento durante la utilización y/o manipulación ponemos la placa Petri abierta (base y/o tapa) fuera de la zona aséptica se CONTAMINARÁ con los microorganismos del ambiente o con nuestros propios microorganismos.

Cerrar y colocar

CERRAR y COLOCAR la placa después de utilizarla.

Se CIERRA La placa después de utilizarla dentro de la zona aséptica y al final SIEMPRE tiene que quedar invertida como se muestra en el esquema.

Si en algún momento durante la manipulación ponemos la placa Petri abierta o semiabierta fuera de la zona aséptica se CONTAMINARÁ con los microorganismos del ambiente o con nuestros propios microorganismos.

F. Recipientes de vidrio: tubos, matraces, etc.

Pasos o Fases para la manipulación en condiciones asépticas de los recipientes de vidrio: tubos, matraces, etc.

Colocar

COLOCAR los tubos o matraces en el puesto de trabajo.

Siempre que contengan algún producto en su interior (medio de cultivo, suspensión de microorganismos...) o estén estériles, deben estar tapados con una torunda de algodón o con un tapón.Los tubos o matraces a utilizar se colocan en una gradilla a la izquierda en el puesto de trabajo.

Esta colocación facilita la manipulación del material de vidrio en condiciones asépticas.

Abrir

ABRIR los tubos o matraces en condiciones asépticas.

La posición del tubo o recipiente de vidrio será oblicua, dirigiendo la apertura hacia la llama del mechero. El algodón se toma con el dedo meñique de la mano opuesta a la que sostiene el recipiente.

flamear, utilizar y flamear

FLAMEAR la boca de los tubos o matraces.

Después de abrir el tubo o matraz en condiciones asépticas, se flamea la boca durante unos segundos mediante un movimiento de rotación.

Después de su utilización y antes de cerrarlo hay que volver a flamear.

Cerrar

CERRAR y COLOCAR el tubo o matraz.

Después de flamear CERRAR el tubo o matraz y colocarlo.

G. Pipetas de vidrio estériles

Pasos o Fases para la manipulación en condiciones asépticas de las pipetas de vidrio estériles

Colocar

COLOCAR las pipetas estériles en el puesto de trabajo.

Colocar como se muestra en el esquema.

Abrir

ABRIR las pipetas en condiciones estériles.

Se agarra con la mano izquierda la pipeta estéril por la punta y se desenvuelve con la derecha por la parte de atrás.

Flamear

FLAMEAR las pipetas.

Después de abiertas se flamean ligeramente como indican las flechas del esquema.

Pipetear

PIPETEAR en condiciones estériles.

Procurar mantener la pipeta lo más horizontal posible.

Utilizar

UTILIZAR las pipetas en condiciones estériles.

Procurando que no se vierta muestra en el puesto de trabajo.

Colocar

COLOCAR las pipetas después de su utilización.

Después de su utilización colocar las pipetas dentro de un recipiente.

Si la muestra que se ha pipeteado contiene microorganismos el recipiente debe de tener un desinfectante (normalmente lejía).

H. Asa de Drigalski o asa acodada de vidrio

Pasos o Fases para la manipulación en condiciones asépticas del asa de Drigalski o asa acodada de vidrio

Colocar

COLOCAR en el puesto de trabajoComo se muestra en el esquema

Introducir en alcoholy Flamear

ESTERILIZARSiempre hay que esterilizar el asa antes de UTILIZARLA.

Para lo que PRIMERO se introduce en alcohol y posteriormente se flamea como se muestra en el esquema.

Enfriar

Después de la esterilización se deja enfriar,

durante unos segundos en la zona aséptica (como se muestra en el esquema), o apoyándola sobre el interior de la tapa de la placa que se va a sembrar.

Utilizar

Después de estéril y fría se utiliza para extender una muestra líquida en una placa.

Una vez añadida la muestra, en condiciones estériles en la placa, los movimientos para extender ésta de forma homogénea por toda la superficie de la placa se muestran en el esquema.

Introducir en alcohol y flamear

ESTERILIZACIÓN después de su utilización.

DESPUÉS de la utilización SIEMPRE hay que volver a esterilizar el asa antes de dejarla en el puesto de trabajo PARA EVITAR CONTAMINAR el ambiente, el puesto de trabajo y/o el personal.

Características de los cultivos bacterianosAlgunas veces las especies bacterianas se pueden identificar basándose en el aspecto que tienen sobre o dentro de distintos medios. La pigmentación, el tamaño y la forma de las colonias bacterianas tal y como se va desarrollando en placas de agar pueden proveer elementos de identificación cuando se observan tanto bajo luz reflejada como transmitida. La observación de las características de crecimiento de los organismos en cultivos en caldo puede ser de gran utilidad.

Hay ciertos peligros que pueden presentarse en el momento de hacer el examen del cultivo; los principales son la contaminación y la variación de especies. Ambos problemas se deben evitar para lograr buenos resultados.

Las variaciones de especies se pueden deber a (1) una modificación inducida por el ambiente de una característica genéticamente controlada, (2) mutaciones espontáneas no dirigidas y (3) la adquisición de una nueva variedad de genes como consecuencia de la reproducción sexual. Por lo común, el primero de estos factores tiene un efecto temporal, es decir, se manifiesta sólo en tanto prevalezcan las condiciones del medio ambiente. Sin embargo, el segundo y tercer factores ejercen una influencia permanente.

En las figuras siguientes, se describen algunos ejemplos de tipos de crecimiento asociados con cultivos en agar y en caldo.

Formas de crecimiento de las colonias

Características de los bordes de las colonias bacterianas

Características de elevación de las colonias bacterianas

Características comunes de cultivos en caldo

Aislamiento y cultivo puroApartados de este tema

A. Medios de CultivoB. Obtención de cultivos puros

C. Aislamiento por agotamiento de estríasD. Tandas de estrías

E. Buen aislamiento y comprobaciónF. Selección de colonias para resiembra

G. Verificación de la selecciónH. Ejemplos de cultivos puros y mezclados (mixtos)

A. MEDIOS DE CULTIVOUn medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. La diversidad metabólica de los microorganismos es enorme: por ello, la variedad de medios de cultivo es también grande. no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos. Veremos una idea general sobre algunos de los constituyentes habituales de un medio de cultivo. El fundamento de los medios selectivos o diferenciales que se

emplearan en otras prácticas será explicado en cada una de ellas.

Constituyentes habituales 1. Agar. El agar se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. El componente dominante en el agar bacteriológico es un polisacárido, al que acompañan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Un gel de agar al 1-2 % en agua licua hacia los 100 ºC y se gelifica alrededor de los 40 ºC, dependiendo de su grado de pureza. Con la excepción de algunos microorganismos marinos, el agar no es empleado como nutriente.2. Extractos. Para su preparación, ciertos órganos o tejidos animales o vegetales (p. ej., carne, hígado, cerebro, semillas) son extraídos con agua y calor, y posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados son frecuentemente empleados en la confección de medios de cultivo. Ejemplos: extracto de carne, de levadura. de malta, etc.3. Peptonas. Son mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y sales minerales que se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o vegetales (soja, carne. gelatina. caseína. etc.). Las peptonas

son muy ricas en péptidos y aminoácidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales.4. Fluidos corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguíneo son frecuentemente añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos patógenos. La sangre no puede ser esterilizada y debe, por tanto, ser obtenida en condiciones asépticas directamente de un animal sano. Los fluidos corporales no solamente contribuyen con factores de crecimiento, sino también con sustancias que neutralizan inhibidores del crecimiento de algunas bacterias.5. Sistemas amortiguadores. Algunos componentes son incorporados al medio de cultivo para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Los microorganismos más comunes son neutrófilos (el pH óptimo para su crecimiento está próximo a la neutralidad). y además sales como fosfatos bisódicos o bipotásicos, o sustancias como las peptonas, previenen una desviación del pH.6. Indicadores de pH. Indicadores ácido-base se añaden a menudo a los medios de cultivo con objeto de detectar variaciones del pH.7. Agentes reductores. Cisteina, tioglicolato y otros son agentes reductores que se añaden a los medios de cultivo para crear condiciones que permitan el desarrollo de los microorganismos microaerófilos o anaerobios.8. Agentes selectivos. La adición de determinadas sustancias al medio de cultivo puede convertirlo en selectivo. Por ejemplo, cristal violeta, sales biliares. azida sódica, telurito potásico. antibióticos, etc.. a la concentración adecuada, actúan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos.

Tipos de medios de cultivo

1. Medios de cultivo generales. Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos. Normalmente se trata de medios de cultivo que no contienen agentes selectivos.2. Medios de cultivo de enriquecimiento. Favorecen el crecimiento de un determinado tipo de microorganismo, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto.3. Medios de cultivo selectivos. Permiten el crecimiento de un tipo de microorganismos determinado, inhibiendo el desarrollo de los demás.4. Medios de cultivo diferenciales. Son aquellos en los que se ponen de relieve propiedades que un determinado tipo de microorganismo posee.

Preparación

En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se encuentran comercializados, normalmente bajo la forma de liofilizados que es preciso rehidratar. En general. la preparación de un medio de cultivo se reduce simplemente a pesar la cantidad deseada del mismo y redisolverla en agua destilada (libre de inhibidores del crecimiento) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termolábiles se esterilizan por filtración y se añaden al resto de los componentes previamente esterilizados en autoclave.Antes de su esterilización, los medios líquidos en caldo se distribuyen en los recipientes adecuados (tubos o matraces). En ningún caso la altura del líquido en el recipiente debe exceder un tercio del volumen total de éste. Si es un medio sólido, habitualmente se procede a hervir el agar en un baño Maria antes de esterilizarlo.Una vez hervido, se distribuye en caliente en tubos o matraces (no en placas de Petri), se tapa y se esteriliza.Finalizada la esterilización en el autoclave:Los medios líquidos se dejarán enfriar a temperatura ambiente.Los medios sólidos contenidos en tubos deben inclinarse para que al solidificarse, adopten la forma de agar inclinado (slant) si tal es su finalidad.Las placas de Petri pueden también ser preparadas ahora, vertiendo el medio aún fundido y estéril dentro de ellas en un ambiente aséptico (p. ej., en la proximidad de la llama de un mechero Bunsen). Es posible asimismo conservar el medio destinado a placas solidificado y estéril en tubos, que se fundirán al baño María en el momento de prepararlas.Caldos y medios sólidos pueden conservarse, una vez esterilizados, a temperatura ambiente. Sin embargo, para reducir su deshidratación y el consiguiente cambio de las concentraciones de los componentes es preferible conservarlos a 4ºC

B. OBTENCIÓN DE CULTIVOS PURO

En la naturaleza los microorganismos se encuentran en comunidades más o menos complejas.

Cultivo de una muestra de aire . Continene diversos tipos de microrganismos que dan diversos tipos de colonias

Cultivo de una muestra de sangre de un matadero de porcino. Contiene diversos tipos de colonias ccompuestas por microorganismos con morfologia diferente al observarlos con el microscopio de contraste de fase

Por eso, una técnica esencial en Microbiología es la de obtención de cultivos puros, a partir de los cuales son posibles estudios sobre las propiedades del microorganismo.

Cultivo puro Un cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismo.

Etapas en obtencion de cultivo puroDos etapas o fases principales son necesarias para obtener un cultivo puro de una una población mezclada:

Aislamiento

La muestra debe ser diluida o 'agotada' hasta que los diversos microorganismos se separen unos de otros sobre la superficie del agar para que formen, despues de la incubación, colonias aisladas. Esta placa se denomina placa de aislamiento

ResiembraUna vez que se obtienen colonias aisladas, se efectua la resiembra cogiendo con el asa de platino de una sola colonia aislada y se transfiere a un nuevo medio.

Técnicas de aislamiento Para obtener cultivos puros es necesario recurrir a las llamadas técnicas de aislamiento.

Aislamiento en medio de cultivo sólido

Aunque existen otras, las técnicas mas utilizadas emplean un medio de cultivo sólido, en el que los microorganismos generan colonias separadas

Se puede demostrar que prácticamente cada colonia procede de una sola célula o de un grupo de células del mismo tipo si el microorganismo forma agregados. Por ello, lo más correcto es hablar de unidades formadoras de colonias (UFC) al referirnos al origen de una colonia. Normalmente, el cultivo descendiente de una colonia es un cultivo puro.

Aislamiento por agotamiento en estrías

Se trata de un método rápido y simple de agotamiento progresivo y continuo del inóculo sobre un medio sólido contenido en una placa de Petri. El objetivo es obtener, a partir de un elevado número de bacterias, un número reducido de ellas distribuidas individualmente sobre la superficie de la placa. Al incubar ésta, cada una de las bacterias originará una colonia.

C. AISLAMIENTO POR AGOTAMIENTO EN ESTRÍAS

Método más utilizado

Es el método más frecuentemente utilizado para el aislamiento en Microbiología

Otra técnica consiste en obtener una suspensión de la mezcla de microorganismos y hacer diluciones seriadas que se vierten en

una placa Petri hasta conseguir colonias aisladas.

Recomendaciones previas

Debe colocarse la placa en posición invertida sobre la mesa de trabajo y, tomando la parte que contiene el medio de cultivo, levantarla hasta la altura de la llama del mechero. Allí, con ella en posición casi vertical, se realizarán las sucesivas tandas de estrías.Para realizar las estrías oscile el asa de siembra sobre la superficie del agar mediante un balanceo sucesivo y rápido de la muñeca. No haga mas presión sobre el agar que la debida al propio peso del asa y su mango. Es muy importante emplear un asa de siembra en buen estado, pues una rota o deteriorada rasgará el agar.

Procedimiento

1. Esterilizar el asa flameándola en el mechero hasta conseguir un rojo incandescente.2. Enfriar el asa en la proximidad de la llama. Tomar una porción de la muestra mediante la técnica descrita anteriormente.3. Transferir el inóculo a un área pequeña de la superficie de la placa, próxima al borde. Extenderlo formando estrías muy juntas sobre la superficie de una porción pequeña de la placa.4. Flamear el asa de nuevo y enfriarla. Rozar una vez con el asa de siembra las estrías sembradas la primera vez y realizar sobre una porción virgen de la placa una segunda tanda de estrías que no toque la primera.5. Flamear y enfriar el asa. Repetir exactamente la operación descrita en el punto anterior pero rozando al empezar la segunda tanda de estrías. Las nuevas series de estrías no deben tocar ninguna de las series anteriores.6. Flamear el asa y tapar la placa de Petri. Esta se incubará a la temperatura adecuada en posición invertida; de otra manera, el agua de condensación que se iría depositando sobre la superficie del agar impediría la obtención de colonias aisladas.

D. TANDAS DE ESTRIAS

La finalidad es la misma: conseguir colonias aisladas. Lo que varia es el númeror de tandas o la forma de realizarlas

2 tandas de estrias

3 tandas de estrias

4 tandas de estrias

Otros tipos de tandas

Radial

La finalidad es siempre la misma: conseguir colonias aisladas, es decir, un buen aislamiento. Lo mas frecuente son la siembra con 3 o 4 tandas de estrias

E. BUEN AISLAMIENTO Y COMPROBACIÓN DE UN BUEN AISLAMIENTO

Como se trata de obtener cultivos puros, se requiere para las resiembras utilizar colonias aisladas.

Por ello, hay que utilizar

Buen aislamiento

Un buen aislamiento en la siembra por agotamiento mediante tandas de estrias se consigue cuando se obtienen colonias aisladas para efectuar las resiembras

Mal aislamiento

Si no se consiguen colonias aisladas, hay que repetir la siembra por agotamiento mediante estrias utilizando un mayor número de tandas de estrias para asegurar el buen aislamiento

ComprobaciónUna vez que dispongamos de colonias aisladas, se puede comprobar que cada una representa un solo tipo de microorganismo. Para ello se puede realizar una tinción e incluso un agotamiento por estrías de la propia colonia sobre una nueva placa de Petri.

F. SELECCIÓN DE COLONIAS PARA LA RESIEMBRA

Tomar muestra de una colonia aislada de una placa de Petri para obtener un cultivo puro

Antes de tocar la colonia con el asa de siembra, enfriar el asa tocando la superficie del agar en una zona donde no exista crecimiento

Con el asa enfriada coger de la parte superior de una colonia aislada

Para resembrar en otra placa o en tubo

Si existen varios tipos morfológicos de colonias que indican una población mezclada, se efectúan tantas resiembras como tipos morfológicos

Despues de la incubación, todos los organismos en el nuevo cultivo seran descendientes del mismo organismo, es decir, será un cultivo puro

G. VERIFICACIÓN DE LA SELECCIÓN DE COLONIAS

Si tiene alguna duda sobre que colonias selecionar para el aislamiento, le aconsejamos que se adiestre sobre estos ejemplos

Placa # 1

Haga clic con el cursor sobre alguna colonia para ver la información que aparece en la ventana de alerta

Placa # 2

Haga clic con el cursor sobre alguna colonia para ver la información que aparece en la ventana de alerta

I. MORFOLOGÍA DE LAS COLONIAS

Colonia Una colonia es una masa visible de microorganismos que crecen sobre la superficie del agar y que proceden, generalmente, de un simple

microrganismo

Morfología de las colonias

Las colonias difieren unas de otras en sus características morfológicas:

- forma- elevación o perfil- bordes- aspecto superficial- caracteristicas ópticas

- pigmentación

Un microrganismo produce un tipo de colonias Cada microorganismo suele producir sobre el mismo medio colonias con las mismas características morfológicas

Diversos tipos de colonias en una placa indica cultivo mezclado Cuando en una placa de aislamiento se encuentran diversos tipos morfologicos de colonias, casi siempre indica que no es un cultivo puro

Cultivo puro da identico tipo de colonias

H. EJEMPLOS DE CULTIVOS PUROS Y MEZCLADOS Cultivos puros

Cultivos mezclados

Conservación y Mantenimiento de cultivosExisten diversos procedimientos para conservar y mantener cultivos microbianos. El método adecuado depende del tipo de miroorganismo y del período de tiempo de conservación que se requiera.

Mantenimiento durante períodos cortos

El método más habitual es la refrigeración simple, ya que entre 4 y 8ºC permanecen viables durante varias semanas muchos cultivos puros de bacterias, levaduras y hongos crecidos sobre medios que contienen agar. Se debe tener en cuenta que algunos microorganismos son capaces de crecer a las temperaturas comunes de refrigeración (psicrófilos). El principal problema es que se contaminen los cultivos de bacterias con hongos que crecen mejor a esas temperaturas.

La refrigeración simple constituye también un método de conservación a largo plazo si se combina con la resiembra periódica de los cultivos; esta suele hacerse en pequeños tubos con agar inclinado (slant) y sembrando en superficie por estrías. La periodicidad recomendable de estas resiembras oscila entre los 15 y 30 días según el microorganismo de que se trate. A partir de 1 mes, el medio de cultivo, y el cultivo en general, empepieza a secarse demasiado.

Mantenimiento a largo plazo

Los procedimientos más habituales son:

• Congelación o crioconservación . Para conservar cultivos congelados se recomienda que la tgemperatura sea,como mínimo, -30ºC por lo que no son recomendables los congeladores habituales (aproximadamente -20ºC). Por ello se recurre a congeladores especiales para laboratorio que alcanzan temperaturas inferiores a -70ºC o, incluso mejor, a nitrógeno líquido (entre -150 y -195ªC). Los resultados varían de un microorganismo a otro y la congelación inicial destruye siempre una cierta proporción de microorganismos, incluso empleando crioprotectores.

Un método sencillo y económico para el mantenimiento de las cepas bacterianas es la congelación de los cultivos en pequeños viales (1-2mL)

que contengan leche descremada estéril al 10% o glicerol estéril al 15% como crioprotectores. También se comercializan crioviales con microperlas porosas y un medio de cultivo especial para la conservación de cepas congeladas.

Según la tempratura, los períodos de consevación pueden llegar a superar los 10 años.

• Liofilización . Es un proceso que permite desecar casi totalmente una estructura biológica, previamente congelada, sublimando bajo vacío el agua (hielo) que contiene.

Los microorganismos se liofilizan en presencia de un agente protector y se guardan en ampollas selladas al vacío, con lo que se puede llegar a lograr períodos de conservación de más de 20 años.

Puedes ver un vídeo sobre la reconstitución de cultivos liofilizados aquí.

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