Monitorizaciónen continuode la calidad del aguaMediante biosensoresde microorganismos luminiscentes

T. Díez-Caballero Amau, S. Craig, J. Verdiell Cubedo,S. Casanova Planes y T. Díez-Caballero Carmona

Biosensores, S.L.

1. Introducción

La luminiscencia de

microorganismos es el principiode un nuevo tipo de biosensores

al que se considera con unamplio espectro de uso, rapidez

en los análisis y automatización.La estabilidad y precisión en su

utilización, así como la mediciónen continuo, han mostrado unos

resultados fiables, pareciendoasegurar, en un futuro próximo,

una mejora en el control de lacalidad de las aguas, siempre y

cuando la legislación contemple~I arp/~o de estos métodos.

La comunidad científica de la

Unión Europea ha venido trabajan-do, durante más de diez años, para lapuesta a punto de distintos tipos debiosensores capaces de determinarparámetros de la calidad del agua.En los últimos años se ha estableci-do un consenso entre investigadoresen esta área para establece el peñllque defina un biosensor "ideal". Sequiere que el biosensor cuantifiqueparámetros de interés y trascenden-cia para el conocimiento de la cali-dad del agua; que permita la moni-torización en continuo; que sea defuncionamiento robusto, estable ycon sensibilidad suficiente; que elcoste por análisis permita realizaréstos de forma automatizada y conla frecuencia necesaria. Biosenso-

res, S.L., en el periodo 1995-2003,ha desarrollado y puesto en funcio-namiento dos tipos de biosensoresmicrobianos que reúnen las caracte-rísticas del perfil "ideal" para la de-terminación de la demanda bioquí-mica de oxígeno (DBO), la toxici-dad integral y la concentración demicroorganismos aerobios en mues-tras de agua. Actualmente, la em-presa, dentro del proyecto BIO-CARTE (Biosensors for in situ eva-luatiol1 01 bioavailability 01 pollu-tants based 011transcriptional regu-lators a la carte), está desarrollandotecnología para la cuantificación encontinuo de moléculas químicas es-pecíficas en muestras líquidas usan-do microorganismos luminiscentes.

Para que las nuevas tecnologíasen el área medioambiental que se

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están desarrollando puedan contri-buir satisfactoriamente a la mejorareal del medio ambiente, es urgentee imprescindible que los legislado-res (de la UE y otros estados) ac-tualicen las normativas hoy en uso,con frecuencia tecnológicamenteobsoletas, e incorporen las tecnolo-gías eficaces que se van obtenien-do. No hacerlo así significa prejui-cio medioambiental y desmotiva-ción para empresas y científicosque trabajan en esas tecnologías.

2. Un ejemplode tecnologíade biosensoresmicrobianos

El sensor microbiano de toxici-dad-DBO (DBO-TOX) se basa enla utilización de microorganismossensores específicos que se dese-chan tras cada análisis realizado,dando gran robustez y fiabilidad ala estrategia analítica. Este sumi-nistro de microorganismos está ca-racterizado por su estabilidad en lacomposición, actividad y concen-tración. Usando el principio de res-pirometría, el sensor mide la canti-dad de oxígeno que se requiere porla población microbiana, para me-tabolizar la materia orgánica pre-sente en una muestra de agua. Elrespirograma, completado en 15 ó20 minutos, también provee de in-formación sobre la composición delos materiales biodegradables. Así,el perfil de la curva respirométricapermite relacionarlo con la compo-sición de la muestra en azúcares,proteínas o lípidos. El consumo deoxígeno disuelto es la consecuen-

@ Ingeniería Químicawww.alcion.es

l. Suministro de oxígeno

2. Bectrodo de oxígeno disuelto

3. Celda madre

4. Celda de iocubación

5. Celda de reacción

A. Unidad de refrigeración (8"C)

6. Medionutritivo

8. Muestra

9. Panón

10. Disolución de lavado

B. Unidad de reacción (25°C)

- - - -. Eapa L Vaciado- .- .- EIapa 2. Traw.ase de mic:rooIganismo Yrea1immIacióa de la cdda madre- - - Eapa 3 Y6. PaIróo- .-. Etapa 4. IncuNción de la lDIJCStr.I- ..- Etapa 5. Muestra a la cdda de reacciónEtapa6. Lavado

Figura 1. &quema del sistema hidráuliCDdel DBO-TOX

cia de la respiración microbiana ypennite calcular de fonna automa-tizada la concentración de materiaorgánica en la muestra de agua. CICLO 1

CS1 MS CS2La inhibición de la velocidad de

respiración microbiana para unamuestra de DBO estándar se utili-za para detectar y cuantificar la to-xicidad total en una muestra desco-nocida. Cada ciclo de medida usauna alícuota nueva de la suspen-sión microbiana.

D Oz .b)

CICLO 3

CS1 MS CS2

3. Sistema hidráulicode referencia

El mantenimiento de las condi-ciones físico-químicas estándaresen cada ciclo de medida (tempera-tura, volúmenes, muestras,...) se fa-cilita con un ambiente controlado,como se puede observar en la figu-ra l. La unidad A se mantiene a unatemperatura de goC para alimenta-ción de los reactivos y la unidad B

a una temperatura de 25°C paracondiciones óptimas de cultivo delos microorganismos. Mediante larealización del ciclo automatizadose controla la calibración y drenajedel sistema hidráulico, así como laincubación e inyección de lasmuestras y patrones para la obten-ción del nivel de oxígeno disuelto.Por otra parte, también se encargadel cultivo de microorganismos enla celda madre (manteniendo lascondiciones físico-químicas nece-sarias), así como de la inyección demedio nutritivo en ésta.

4. Ciclo analítico

El respirograma representativopara cada ciclo de medida se mues-tra en la figura 2. Dos muestras es-tándar (de DBO conocida) son uti-lizadas en cada ciclo de medida. Laprimera muestra estándar (CS!) esutilizada para calibrar el sistema,mientras que la segunda (CS2),idéntica a la primera, pennite lavaloración de cualquier tóxico enla muestra de interés (ME) (porejemplo, salida de aguas de una de-puradora de agua). La unidad dereacción recibe un tratamiento

LCICLO 2

CS1 ME CS2

.

L

CICLO4 (TÓXICO)¡ i

~S1 TOX ~S2. ~ ::.'\\:~~: ~.:-i-: ;

Tiempo

Figura2. ComparacióndelnivelderespiraciónmicrobianadeDBOestándar:aJmuestJ¡¡deaguanotóxica(ME)y(Sl"bJmuestJ¡¡tóxicadeagua(TOX)

junio 04

I

4:

40

.lOi

oO 50 100 150

acondicionador en cada medidapara así garantizar unas condicio-nes equivalentes para cada muestradesconocida.

Así, el sistema DBO-TOX cal-cula la DBO para una muestra uti-lizando la correlación del área delrespirograma para esta muestradesconocida con la referencia es-

tándar de DB05"

5. Ventajasfrente al DB05

Las medidas de DBO realizadasen diversas EDARs en España,usando el sensor microbiano de to-xicidad-DBO han sido valoradasobjetivamente (BIOSET, encuen-tro de acción concertada, Paris,2000). Las mediciones del DBO-TOX muestran una buena correla-

ción con DBOs (r=O.98,Fig. 3) Yse obtienen en sólo 30 minutos enlugar de los cinco días requeridosen el método tradicional de medidaDB05" La Tabla 1 remarca algunasde las ventajas del sensor micro-biano DBO-TOX en relación conotras técnicas como las medidas

tradicionales de DBOs'

Permite la cuantificación simul-tánea de la toxicidad integral delagua (esto es, el efecto que se pro-duce sobre el metabolismo de losmicroorganismos sensores por latotalidad de sustancias presentesen la muestra a analizar: metales

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Figura3.Correlaci6ndeD80 y D805

microorganismos en la muestraanalizada midiendo el producto deuna reacción enzimática específicaque es proporcional a la concentra-ción de microorganismos aerobios,utilizando resto de material.

. . Ventajas del biosensorde concentración microbiana(Biocounter):

1. Esta tecnología permite la rá-pida y automática determinaciónde una concentración microbianaen una muestra de agua (por ejem-plo, efluente de aguas residuales),en tiempo real.

200 250 300

DB05 (n;/l)

400 450 910350

2. Rápida y ajustada determina-ción de concentraciones microbia-nas en 2-10 minutos, mostrandoresultados equivalentes a los obte-nidos mediante las costosas, tem-poralmente, técnicas estándar delaboratorio que toman entre 24 y48 horas (recuento viable a 22°C).

pesados, disolventes, pesticidas,antibióticos, etc.). La figura 2bmuestra el efecto de una muestratóxica de agua (TOX) en la señalrespirométrica obtenida con la se-gunda referencia estándar de DBO.La toxicidad se cuantifica usandola inhibición de velocidad del me-tabolismo microbiano de la refe-rencia estándar de DBO (CS2) si-guiendo la exposición a una mues-tra de agua desconocida.

6. Biosensor parala cuantificaciónautomatizada demicroorganismosen "tiempo real"

3. El Biocounter puede suminis-trar información valiosa no sóloconcerniente a la contaminaciónmicrobiana total de efluentes resi-duales, sino que también la proba-ble concentración de coliformesfecales presentes. En este caso, es-tas bacterias abarcarán una por-ción, relativamente constante, deltotal de la biomasa microbiana deuna EDAR, con lo que de este mo-do puede estimarse la cantidad decoliformes fecales presentes enuna muestra de agua residual.

..

Otro equipo que ha desarrolladola empresa anteriormente citadapermite cuantificar la densidad de

4. La capacidad de una capturade datos a distancia permite la mo-nitorización de la calidad del agua

Tabla 1. Ventajas delsensormicrobiano con respecto

a otras técnicas como la medida de DBOs

a. ROBUSTO - Auto-calibración doble y diseño operacional robusto.

b. SENSIBLE A UN ANCHO ESPECTRO DE VALORES DE DBO y VARIOS CONTAMINANTES.

c. AUTO-SUFICIENTE.

d. AUTO-CAlIBRACION.

e. INFORMACION EN -TIEMPO REAl:'

f. FACILIDAD DE USO PARA El ANAlISIS y RECOGIDA DE DATOS.

g. PROBADA UTILIDAD INDUSTRIAL

h. ANAlISIS DE BAJO COSTE- 0.5 € por análisis

i. FAlICIDADDE MANTENIMIENTO- Simple renovación de líquidos consumibles cada 15 días.

~~ RIO JARAMA ESPAÑA

.....

..... ('

.....

.....

,....

....

6a 11

r~I

('

6b Tiempo AnalyliGal Cyele

Figura 4. La detección de 080 y la identificación de contaminación orgánica, eventos usando el sensor 080- rox.

La figura a muestra la cuantificación de 080 en 'tiempo real' en relación can niveles de oxígeno disuelta (figuras b y cl.

Tabla 11.Avances aportados por latecnología de biosensores microbianos

Tecnología deBiosensoresmicrobianos Tecnología Actual

DBO

TiempoAnálisisTipodeAnálisisMonitorización"on-line"IdentificaciónEpisodiosContaminantesCosteporAnálisisControlAguastóxicasFiabilidadRetroalimentaciónderesultadossobreelproceso

35 minutosAutomático

SiSi

0'5€Si

+++

5 días (DBO-5)Manual

No posibleNo

36€No+

Si No

CUANTIFICACION DE MICROORGANISMOS

Tiempo AnálisisTipo de AnálisisMonitorización "on-line"

Costepor AnálisisFiabilidadRetroalimentaciónde

resultadossobre el proceso

5 minutosAutomático

Si0'5 €

24-48horas

Manual(cultivoen placa)No Posible

42€++ ++

Si No

TOXICIDADTOTALENLlQUIDOS

Tiempo AnálisisTipo AnálisisMonitorización "on-line"

Costepor AnálisisFiabilidadRetroalimentaciónde

resultadossobre el proceso

45 minutosAutomático

Si0'5€

120minutosManual

No Posible6€

++ ++

Si No

desde un centro de control, inte-grando una red de estos dispositi-vos en puntos críticos en las líneasde aguas residuales.

5. Probada utilidad industrial.El Biocounter ha sido incorporadoen la estación de alannas para lacalidad del agua de la Confedera-ción Hidrográfica del río Tajo. Condos años de biomonitorización enel campo, este dispositivo ha de-mostrado ser un método confiable,eficiente y exacto para el controlde la calidad del agua.

7. Aplicaciones realesde estos equipos

El sensor microbiano DBO-TOX se ha empleado con éxito enla monitorización de la calidad delas aguas de ríos y estaciones dedepuración de aguas residuales enEspaña. La figura 4 ilustra la de-manda biológica de oxígeno (6a)relacionada a los cambios en losniveles del oxígeno disuelto debi-do a las respiración microbiana (6by 6c) durante la monitorización entiempo real en el río Jarama. Ladoble calibración en cada cicloasegura que el valor de DBO obte-nido de la muestra de agua es realy no un artefacto. Estos resultadoshan sido confirmados por las másde 50.000 horas de funcionamientocontinuado en este río. En la TablaTIpuede observarse una comparati-va, de múltiples parámetros esen-ciales, entre las técnicas utilizadasactualmente y las tecnologías basa-das en biosensores microbianos.

8. BIOCARTE: el futurode los biosensoresmicrobianos

BIOCARTE es un proyecto delV Programa Marco de la U.E., enel que participa Biosensores, S.L.,junto a cinco centros públicos deinvestigación europeos (CentroNacional de Biotecnología del CE-SIC, Departamento de Microbiolo-gía del Inst. Env. Sci. Technol. EA-WAG (Suiza), Section for naturalSciences del SOdertons hogskola(Suecia) y el Dep. of Molecular &Cell Biology of University ofAberdeen (Reino Unido) ). bajo 1&

JU~'O0411

figura5. Unaplacadelosmicroorganismosmodificadosgenéticamenteconluminiscencia(tiposensorBIOCARTEJ

coordinación del Profesor JuanLuis Ramos (CSIC, Granada).

Los centros públicos participan-tes son expertos en la modificacióngenética de microorganismos parapermitir la detección de moléculasespecíficas en un líquido a travésde la cuantificación de la luz gene-rada por genes de luciferasa, intro-ducidos en los microorganismossensores, diseñados específicamen-te para este fm.

La tecnología de biosensoresmicrobianos automatizados descri-ta en el presente artículo, junto alconocimiento y aplicaciones espe-cíficas de la genética microbianaaportados por los otros participan-tes en el BIOCARTE, harán posi-ble obtener, al final de este proyec-to (2006), un equipo de gran utili-dad para atender necesidades ana-líticas hasta hoy inalcanzables.

Como toda nueva herramienta,los biosensores microbianos que

utilizan microorganismos genética-mente modificados harán posible suutilización no sólo en aquellas apli-caciones para las que se están dise-ñando, sino para otras muchas, hoyaun difíciles de imaginar. Así, porejemplo, una fábrica de productosquímicos, cuyos vertidos tóxicoscontengan tolueno, benceno y mo-léculas de disolventes de gran toxi-cidad ambiental, podrá monitorizar-los en continuo utilizando estos bio-sensores con microorganismos lu-miniscentes (Fig. 5), sensibles a ca-da tipo de molécula de interés.

Estos microorganismos, diseña-dos con sensibilidad genética espe-cífica, permitirán cuantificar lamolécula diana para la que se handesarrollado, incluso cuando éstase encuentre en una muestra juntoa otras muchas moléculas contami-nantes o interferentes. La figura 6muestra cómo se puede adaptar albiosensor DBO para la detecciónde luminiscencia microbiana. Estaadaptación es sólo la primera fasede integración, ya que, una vez ha-ya fmalizado el proyecto, el sensorde luminiscencia será integrado enel mismo sistema de DBO-TOX,reduciendo así el tamaño y aumen-tando la precisión de las medidas.

9. Conclusiones

Los biosensores analizados enel artículo han demostrado ser he-rramientas de múltiples aplicacio-nes, de muy bajo coste de uso, y de

figura6.Elequipo

adaptadoparacapturardatos

deOBOyluminiscencia

paraBIOCARTE

gran fiabilidad y robustez. La in-vestigación en el campo de los bio-sensores está en un punto crítico,en el que la tecnología se ha pues-to por delante de la legislación,quedando ésta obsoleta frente a losnuevos instrumentos para valorarla calidad medioambiental. La uti-lización de la bioluminiscencia essólo el principio en un nuevo tipode biosensores con un amplio es-pectro de uso. Estos sensores apor-tarán una nueva dimensión en laobtención de resultados, debido asu rapidez en los análisis y auto-matización. La estabilidad y preci-sión en la utilización de estos bio-sensores, así como su medición encontinuo, proporcionan unos resul-tados fiables que sin duda reporta-rán, en un futuro próximo, una me-jora en el control de la calidad delas aguas, siempre y cuando la le-gislación contemple la utilizaciónde estos métodos.

IQ

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