mecanismos moleculares de la respuesta a estrés en
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Mecanismos moleculares de la respuesta a estrés en Schizosaccharomyces pombe:
papel de las MAPKAP quinasas Cmk2 y Srk1
Marta Sánchez Marinas
Tesis Doctoral
Tesis presentada para optar al grado de Doctora en Biología por la
Universitat de Barcelona.
Barcelona, Septiembre de 2012
Programa de Doctorado de Biomedicina de la Universitat de Barcelona
Directora de Tesis: Rosa Aligué Alemany
Departament de Biologia Cel·lular, Immunologia i Neurocències
Índice
INTRODUCCIÓN ..................................................................................... 7
1. LAS RESPUESTAS CELULARES AL ESTRÉS AMBIENTAL ............................................................... 9
1.1 Schizosaccharomyces pombe: modelo de estudio .................................................. 9
Características generales ........................................................................................................ 9
Ciclo de vida y ciclo celular.................................................................................................... 10
1.2 Las rutas de MAPK en S. pombe ............................................................................ 11
La ruta de la SAPK: Stress Activated Protein Kinase .............................................................. 11
- SENSORES ................................................................................................................... 12
- MODULADOR DE LA RESPUESTA MCS4 .............................................................................. 13
- MÓDULO DE MAP QUINASAS .......................................................................................... 13
- EFECTORES DE LA MAPK STY1 .......................................................................................... 14
- REGULACIÓN NEGATIVA DE LA VÍA ..................................................................................... 15
La ruta de integridad celular ................................................................................................. 16
- SENSORES ................................................................................................................... 16
- MÓDULO DE MAP QUINASAS .......................................................................................... 17
- EFECTORES DE PMK1 ..................................................................................................... 18
- REGULACIÓN NEGATIVA .................................................................................................. 18
Cross-talk entre la SAPK y la vía de integridad celular .......................................................... 19
2. ESTRÉS OSMÓTICO ...................................................................................................... 19
3. ESTRÉS OXIDATIVO ...................................................................................................... 20
Toxicidad por metales y metaloides...................................................................................... 22
Respuestas celulares a metales y metaloides ....................................................................... 23
- GLUTATIÓN ................................................................................................................. 23
- REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL: ZIP1 Y PAP1 ..................................................................... 23
- REGULACIÓN DEL TRANSPORTE DE METALES Y METALOIDES ..................................................... 24
- ARSÉNICO ................................................................................................................... 25
4. ANTECEDENTES: MAPKAP QUINASAS ............................................................................ 26
OBJETIVOS ........................................................................................... 29
RESULTADOS ........................................................................................ 33
CAPÍTULO I: REGULACIÓN DE LA MAPK STY1 EN LA RESPUESTA A ESTRÉS OSMÓTICO: PAPEL DE LA
QUINASA SRK1 Y LA PROTEÍNA DE UNIÓN A RNA RNC1. ......................................................... 35
I.1 Srk1 juega un papel en la respuesta a estrés osmótico regulando la actividad
de la MAPK Sty1 .......................................................................................................... 37
I.2 La función de Srk1 sobre la fosforilación de Sty1 es independiente de su
función en el arresto del ciclo celular ......................................................................... 38
I.3 El residuo Tyr173, esencial para la actividad de la MAPK, no está
correctamente defosforilado en ∆srk1 ....................................................................... 39
I.4 Srk1 no ejerce su función reguladora de Sty1 a través de la MAPKK Wis1............ 40
I.5 El efecto de Srk1 sobre la activación de Sty1 es independiente de la respuesta
transcripcional de Sty1/Atf1 ....................................................................................... 42
I.6 La proteína de unión a RNA Rnc1 participa en la respuesta a estrés osmótico y
es reguladora de la MAPK Sty1 ................................................................................... 43
I.7 Las proteínas reguladoras de Sty1, Srk1 y Rnc1, tienen funciones
independientes en la respuesta a estrés osmótico .................................................... 45
I.8 Rnc1 regula los niveles de mRNA de varios componentes de la ruta de la SAPK .. 46
CAPÍTULO II: PAPEL DE CMK2 EN LA RESPUESTA A ARSENITO ................................................. 49
II.1 Especificidad de Cmk2 en la respuesta a distintos estreses ................................. 51
II.2 Cmk2 afecta a la activación de Sty1 por arsenito ................................................. 55
II.3 La función de Cmk2 en la respuesta a arsenito es independiente de la de Pap1 . 58
II.4 Papel del glutatión en la respuesta a arsenito y relación con Cmk2 .................... 59
II.5 La función de Cmk2 en la respuesta a arsenito es independiente de la de Zip1 .. 61
II.6 Posible efecto de Cmk2 en el transporte de arsenito ........................................... 64
DISCUSIÓN ........................................................................................... 67
CAPÍTULO I: REGULACIÓN DE LA MAPK STY1 EN LA RESPUESTA A ESTRÉS OSMÓTICO: PAPEL DE LA
QUINASA SRK1 Y LA PROTEÍNA DE UNIÓN A RNA RNC1 .......................................................... 69
I.1 Srk1 regula la fosforilación de la MAPK Sty1 después de la respuesta a estrés
osmótico ..................................................................................................................... 71
I.2 La proteína de unión a RNA Rnc1 .......................................................................... 74
Rnc1, un nuevo componente en la respuesta a estrés osmótico ...........................................75
Rnc1, regulador negativo de la SAPK .....................................................................................75
Rnc1, elemento de cross-talk entre vías de MAPKs? .............................................................76
CAPÍTULO II: PAPEL DE CMK2 EN LA RESPUESTA A ARSENITO ................................................. 79
II.1 Especificidad de Cmk2 en la respuesta a distintos oxidantes ............................... 81
II.2 Regulación de Cmk2 .............................................................................................. 83
II.3 La ausencia de Cmk2 produce un aumento en la activación de Sty1 por
arsenito ....................................................................................................................... 83
II.4 La función de Cmk2 en la respuesta a arsenito es independiente de la de los
factores Pap1 y Zip1, y la ausencia de la quinasa produce un aumento de su
activación .................................................................................................................... 84
II.5 El glutatión en la respuesta a arsenito .................................................................. 85
II.6 Cmk2 y la regulación de los niveles intracelulares de arsénico ............................ 87
CONCLUSIONES .................................................................................... 93
MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................... 97
1. CEPAS Y PLÁSMIDOS .................................................................................................... 99
2. TÉCNICAS DE GENÉTICA MOLECULAR .............................................................................. 102
Obtención de DNA .................................................................................................... 102
Amplificación de DNA ............................................................................................... 102
Clonaje ...................................................................................................................... 102
3. CONDICIONES DE CULTIVO Y TRANSFORMACIONES ............................................................ 103
S. pombe ................................................................................................................... 103
Escherichia coli .......................................................................................................... 105
4. ENSAYOS DE SENSIBILIDAD Y TRATAMIENTOS DE ESTRÉS ..................................................... 105
5. ANÁLISIS DE PROTEÍNAS ............................................................................................. 106
Extractos proteicos ................................................................................................... 106
Inmunoprecipitación ................................................................................................. 106
Electroforesis de proteínas ....................................................................................... 106
Western blot ............................................................................................................. 107
6. ANÁLISIS DE RNA ..................................................................................................... 108
Aislamiento de RNA .................................................................................................. 108
Electroforesis de RNA ............................................................................................... 108
Northern blot ............................................................................................................ 108
BIBLIOGRAFÍA .................................................................................... 111
INTRODUCCIÓN
Introducción 9
1. Las respuestas celulares al estrés ambiental
Constantemente expuestas a cambios ambientales adversos que causan un estrés
fisiológico, las células eucariotas han desarrollado mecanismos de adaptación para
hacerles frente (Estruch, 2000; Hohmann, 2002). Esta respuesta desencadena una
reacción general en la célula que les permite sobrevivir en condiciones desfavorables. Así,
las células cuentan con sensores específicos que detectan cualquier alteración del medio
como cambios de temperatura, radiación, presión osmótica, pH, disponibilidad de
nutrientes y presencia de ciertos iones o agentes químicos. Una vez detectado, los
mecanismos de transducción de señales conducen el estímulo a un amplio rango de
efectores que materializan una respuesta específica como la reprogramación de la
expresión génica, el arresto de la proliferación y los cambios metabólicos y morfológicos
necesarios para la adaptación celular.
Es de gran interés, y objeto de muchas investigaciones, entender cómo las células sensan
y distinguen los distintos estímulos estresantes y cómo responden a estos insultos. Las
principales rutas de señalización implicadas en la transmisión de los estímulos
extracelulares son las cascadas de MAPKs (Mitogen Activated Protein Kinase) y se
encuentran altamente conservadas en todos los eucariotas (Waskiewicz y Cooper, 1995;
Sheikh-Hamad y Gustin, 2004). Por ello, la levadura puede ser un buen modelo para
investigar la naturaleza de estos mecanismos y averiguar cómo los eucariotas superiores
detectan y responden a distintos tipos de estímulos a nivel celular.
1.1 Schizosaccharomyces pombe: modelo de estudio
Características generales
S. pombe es una levadura de fisión que se caracteriza por los rasgos generales del filo de
los Ascomicetos, pero es altamente divergente en términos de secuencia génica.
Pertenece al subfilo Archaeascomicetos, una rama ancestral que según se cree se separó
hace 400 millones de años, próximo a la divergencia de los hongos de plantas y animales
hace unos 1000 millones de años (Sipiczki, 2000) (figura 1). Por eso, la divergencia
observada entre muchas de las proteínas de S. pombe con otras levaduras como
Saccharomyces cerevisiae es tan grande como la que presentan con sus respectivos
homólogos en humanos.
S. pombe tiene una morfología cilíndrica de tamaño de 12-15 por 3-4µm y su membrana
celular está recubierta por una pared celular. Posee una serie de características que lo
hacen muy adecuado como modelo de estudio: su genoma (que consta de 3 cromosomas
y unas 5000 ORF predichas) está totalmente secuenciado (Wood et al, 2002) y su ciclo
biológico es rápido (unas 3 horas) y mayoritariamente haploide. Ello permite una
manipulación genética sencilla para delecionar genes, integrar epítopos para marcar
10 Introducción
proteínas, o promotores para condicionar la expresión génica, e incluso introducir
mutaciones puntuales. Además, el ciclo sexual permite dirigir cruces para obtener dobles
mutantes.
Ciclo de vida y ciclo celular
En condiciones favorables, las células de S. pombe son haploides y se dividen
asexualmente (ciclo mitótico). En condiciones más adversas, ante la limitación de
nutrientes, las células paran su ciclo mitótico e inician un ciclo sexual. Las células de S.
pombe pueden tener dos tipos sexuales diferentes h+
y h- (heterotálicas) o un tercero h
90
(homotálicas, que pueden cambiar su tipo sexual). Tras la limitación de nutrientes y si en
la población existen células de dos tipos sexuales diferentes, se da el proceso de
conjugación entre dos células de tipo sexual opuesto. La fusión de éstas da lugar a un
zigoto diploide, que se divide por meiosis y genera un asca zigótica tras el proceso de
esporulación. Las cuatro esporas haploides se liberan cuando la pared del asca se lisa, y
son capaces de sobrevivir largo tiempo hasta que las condiciones ambientales vuelven a
ser favorables, momento en el que se produce la germinación y entran nuevamente en el
ciclo mitótico. Si las condiciones del medio mejoran en el momento de la formación del
zigoto, éste puede desarrollar un ciclo vegetativo diploide. Sin embargo, las células
diploides son bastante inestables, y fácilmente inician el proceso de meiosis sin previa
conjugación para generar ascas azigóticas (figura 2).
Respecto a su ciclo mitótico, al igual que el resto de eucariotas, está compuesto de 4
fases: G1, S, G2 y M. Difiere del ciclo en mamíferos en la duración de éstas, siendo G1
relativamente corta, y G2 la más larga, ocupando el 70% del ciclo aproximadamente. La
división se da por la formación de un septo que divide a la célula en dos, proceso que
finaliza en G1. La separación ocurre con la degradación del septo al comienzo de la fase S.
Figura 1. Filogenia de la levadura de fisión. Los tiempos son: (1) hace 1200 millones de años (Ma);
(2) 1100 a 1000 Ma; (3) 600 a 500 Ma; (4) 400 Ma; (5) 420 a 330 Ma; (6) 250 Ma (Sipiczki, 2000)
Introducción 11
El crecimiento de las células hijas tras la división es monopolar y en cuanto alcanzan un
tamaño crítico se da el proceso conocido como NETO (New End Take Off), para activar el
crecimiento bipolar, ya en G2. Como el resto de levaduras, la mitosis en S. pombe es
cerrada, es decir, no se da una ruptura de la envoltura nuclear y la separación de los
cromosomas tiene lugar dentro del núcleo.
Figura 2. Ciclo de vida de S. pombe (Sabatinos y Forsburg, 2010)
1.2 Las rutas de MAPK en S. pombe
La ruta de la SAPK: Stress Activated Protein Kinase
Numerosos estudios han demostrado la importancia de las vías de señalización de las
SAPKs (Stress Activated Protein Kinases) en la respuesta a estrés (Kyriakis y Avruch, 2012).
En mamíferos, estas quinasas son p38 y JNK.
En S. pombe, sólo existe una vía de la SAPK que responde a múltiples estreses, cuya MAPK
es Sty1. Los mutantes carentes de los principales componentes de esta vía muestran
fenotipos que comprenden una morfología alargada consistente con el defecto en la
transición G2/M (Shiozaki y Russell, 1995); la disminución de la viabilidad en la fase
estacionaria; defectos en la conjugación y la meiosis (Shiozaki y Russell, 1996); ausencia
de crecimiento causada por condiciones hiperosmóticas, presencia de agentes oxidantes,
metales, por el choque térmico y la radiación UV, entre otras condiciones (Warbrick y
Fantes, 1991; Millar et al, 1995; Degols et al, 1996; Degols y Russell, 1997). Estas
observaciones evidenciaron el papel crítico de la MAPK Sty1 en la supervivencia ante un
amplio rango de estímulos adversos. En posteriores trabajos se han ido describiendo
algunos de los elementos que componen la vía completa de la SAPK, y los mecanismos
específicos que permiten la adaptación a cada tipo de estrés (revisado en (Perez y
Cansado, 2010). En la figura 3 se representan esquemáticamente y a continuación se
describen los componentes principales de la ruta de la SAPK en S. pombe.
12 Introducción
- SENSORES
A pesar del exhaustivo estudio de la ruta de la SAPK durante las últimas décadas, se
conoce aún muy poco sobre los mecanismos de detección del estímulo extracelular. Sólo
para el caso del estrés oxidativo inducido por peróxido de hidrógeno (H2O2) se ha descrito
el sistema de dos componentes como sensor. Está compuesto por unas histidina quinasas
(Mak2 y 3) que se autofosforilan en presencia de H2O2 y por la fosfotransferasa Mpr1 que
transfiere el fosfato al regulador de la respuesta Mcs4 para iniciar la activación del
módulo de MAPKs. Una L-gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, la Tdh1, participa
también en este sistema, siendo necesaria para la asociación de Mrp1 a Mcs4 (revisado
en (Morigasaki y Shiozaki, 2010)).
Wis1
Wak1 Win1
Mcs4
Mpr1
Mak2 Mak3
Pcr1
CESR
Sty1P
P
Pyp1 Pyp2
Ptc1 Ptc3
Cmk2
Srk1
Plo1eEF2 eEF3α
eIF2-α
Csx1
Tor1
Atf1
Tdh1
Ptc4
Progresión del ciclo celular en G2/M
Estrés nutricional
Choque térmicoArsenito
H2O2
Estrés osmóticoChoque fríoGravedadDeprivación de glucosaRadiación UVPro-oxidantesMetales y Metaloides…
?
Tpx1
H2O2
Control dela traducción
Figura 3. La vía de la SAPK en S. pombe
Introducción 13
Se ha propuesto también la participación de la peroxiredoxina Tpx1 como sensor de H2O2,
implicado en la activación de Sty1 mediante un mecanismo que requiere de la formación
de un puente disulfuro entre ambas proteínas (Veal et al, 2004).
Para otros estímulos como el estrés osmótico, el de metales u otros pro-oxidantes no se
han hallado todavía sensores específicos. Un mecanismo alternativo de activación de Sty1
ante algunos estímulos es la inhibición de las fosfatasas. Así, se ha descrito para el caso
del choque térmico una activación de Sty1 resultante de la inhibición de la fosfatasa Pyp1
(Nguyen y Shiozaki, 1999). Un modelo similar se propone para parte de la activación de
Sty1 por arsenito (Rodriguez-Gabriel y Russell, 2005), cadmio y dosis bajas de glucosa
(Zhou et al, 2010). La inhibición de otra fosfatasa, Pyp2, mediada por Tor1 en condiciones
de limitación de nutrientes, es otro mecanismo de activación de Sty1 (Petersen y Nurse,
2007).
- MODULADOR DE LA RESPUESTA MCS4
Mcs4 forma un complejo con los sensores Mpr1 y Tdh1 y con las MAPKK (ver siguiente
apartado) y es esencial para la activación de la ruta de señalización de la SAPK ante
diversos estímulos (Shieh et al, 1997). Su fosforilación por Mpr1 es necesaria para la
activación de Sty1 sólo en presencia de peróxido de hidrógeno (Buck et al, 2001), y el
mecanismo por el cual lo hace en respuesta a otros estreses es aún desconocido.
- MÓDULO DE MAP QUINASAS
i) MAPKKK
Wak1/Wis4/Wik1 y Win1 son las dos MAPKKK existentes en S. pombe. Ambas son
capaces de fosforilar y activar la MAPKK Wis1, aunque Wak1 es la principal responsable
de la activación de la vía en condiciones de hiperosmolaridad y de bajas temperaturas
(Samejima et al, 1997; Soto et al, 2002). En respuesta a bajas concentraciones de
peróxido de hidrógeno juegan papeles redundantes pudiendo una compensar a la otra,
pero a dosis elevadas es necesaria la presencia de ambas para la total activación de la
cascada (Quinn et al, 2002).
ii) MAPKK
La fosforilación dual de Wis1 por parte de las MAPKKK Wak1 o Win1 es esencial para la
activación de Sty1 por todos los estímulos ambientales descritos (Shiozaki et al, 1998)
excepto para el caso del choque térmico y el arsenito (Nguyen y Shiozaki, 1999;
Rodriguez-Gabriel y Russell, 2005).
iii) MAPK
Sty1 se activa por la fosforilación de Wis1 en la Thr171 y la Tyr173 en respuesta a todos
los estímulos comentados anteriormente. La activación de Sty1 es transitoria, y la cinética
y duración de ésta depende de la naturaleza y magnitud del estímulo. En condiciones
14 Introducción
normales, se localiza en el citoplasma junto con el resto del módulo de MAPKs y, tras su
activación, es translocada al núcleo (Gaits et al, 1998). Pim1, un factor intercambiador de
nucleótidos Ran GDP/GTP es necesario para la acumulación de Sty1 en el núcleo,
mientras que la exportina Crm1 participa en su exporte (Gaits y Russell, 1999).
- EFECTORES DE LA MAPK STY1
i) Factores de transcripción Atf1 y Pcr1
El sustrato principal de Sty1 es el factor de transcripción Atf1 (homólogo a ATF-2 en
eucariotas superiores), que se encuentra constitutivamente localizado en el núcleo
(Takeda et al, 1995; Shiozaki y Russell, 1996; Wilkinson et al, 1996). Su fosforilación por
parte de Sty1 en 11 sitios diferentes promueve la estabilidad del factor induciendo su
acumulación (Lawrence et al, 2007) y es también necesaria para su activación como
factor de transcripción (Sanso et al, 2008). Atf1 forma heterodímeros con otro factor de
transcripción, Pcr1 (Kanoh et al, 1996) para regular la transcripción de genes cuyos
productos son necesarios para la respuesta adaptativa a diferentes estreses, aunque una
parte de estos genes solo requiere de la presencia de Atf1 para su inducción (Lawrence et
al, 2007; Sanso et al, 2008). El perfil transcripcional inducido ante distintos tipos de estrés
ha sido estudiado a nivel global del genoma (Chen et al, 2003) y la respuesta se ha
denominado CESR (Core Environmental Stress Response). La comparación de éste con el
programa inducido en las mismas condiciones en S. cerevisiae (Gasch et al, 2000)
evidenció la conservación de esta respuesta, común en dos especies de levadura lejanas.
Entre los genes que presentan una inducción tras el estrés se encuentran aquellos
involucrados en el metabolismo de carbohidratos, la detoxificación de ROS, el
plegamiento y la degradación de proteínas, las funciones mitocondriales y vacuolares, y el
transporte de metabolitos. Otro conjunto de genes relacionados con el consumo de
energía y el crecimiento, se reprime en estas condiciones. Además de los genes comunes
regulados ante distintos tipos de estrés, otros programas de expresión génica más
específicos se dan para un estrés concreto o para un subconjunto de estreses. En general
éstos son menos dependientes de Sty1/Atf1 y requieren de otros reguladores específicos
(Chen et al, 2003). Finalmente, la vía Sty1-Atf1/Pcr1 juega múltiples funciones en la
cromatina, como promover la recombinación y el mantenimiento de la heterocromatina
en el locus de mating, además de la regulación de la expresión génica en respuesta a
estrés (revisado en (Sanso et al, 2011).
ii) Proteínas de unión a RNA: Csx1, Cip1 y Cip2
Otro nivel de regulación de la respuesta a estrés viene dado por proteínas que se unen y
regulan distintos mRNAs. Csx1 es necesaria para la supervivencia al estrés oxidativo pero
no al osmótico. En presencia de H2O2 se une a los mRNA de atf1+ y pcr1
+ y los estabiliza,
modulando de esta forma la expresión de genes dependientes de Sty1/Atf1/Pcr1 en estas
Introducción 15
condiciones (Rodriguez-Gabriel et al, 2003). Sty1 fosforila Csx1, pero esta modificación no
es necesaria para la función de Csx1 en el estrés oxidativo. Cip1 y Cip2 son también
proteínas de unión a RNA y fueron aisladas por su co-purificación con Csx1, cuya función
parecen contrarrestar (Martin et al, 2006). También por purificación con Csx1 se halló
Upf1, una helicasa que forma parte del sistema NMD (Nonesense-mediated mRNA Decay)
y actúa en la misma vía que Csx1 para estabilizar el mRNA de atf1+ en respuesta a estrés
oxidativo (Rodriguez-Gabriel et al, 2006).
iii) Factores reguladores de la traducción:
Sty1 juega también un papel en la adaptación traduccional al estrés. Favorece el inicio de
traducción, reduciendo la fosforilación del factor eIF2α (Dunand-Sauthier et al, 2005), que
es crítica para la inhibición de la síntesis proteica general en respuesta a múltiples
estreses (Zhan et al, 2002). Además, regula negativamente la actividad de las quinasas de
eIF2α, Gcn2 y Hri2 específicamente en respuesta a estrés oxidativo (Berlanga et al, 2010).
Por último, se ha demostrado la asociación in vivo entre Sty1 y el factor de elongación
eEF2 y al factor de inicio de la traducción eIF3 (Asp et al, 2008).
iv) Quinasas
Para la regulación de la progresión del ciclo celular ante perturbaciones ambientales, Sty1
activa a quinasas que inhiben la entrada en mitosis, como Srk1 en el caso del estrés
osmótico (Lopez-Aviles et al, 2005) y Plo1 ante el choque térmico o el estrés por
centrifugación (Petersen y Hagan, 2005).
Por otro lado, la quinasa Cmk2 es también sustrato de Sty1 y ha sido involucrada en la
respuesta específica al estrés oxidativo (Sanchez-Piris et al, 2002), aunque la función que
desempeña es aún desconocida.
Dada su relevancia en esta tesis, más adelante se describirán con mayor detalle las
características de las MAPKAP quinasas.
- REGULACIÓN NEGATIVA DE LA VÍA
La regulación precisa de la magnitud y la duración de la activación de las MAPKs es crucial
para una respuesta adecuada frente a los estímulos externos (Dube y Tremblay, 2005). La
hiperactivación de las MAPKs tiene consecuencias perjudiciales y frecuentemente se
asocia a diversas enfermedades humanas como el cáncer, la diabetes, la inflamación, la
autoinmunidad o procesos infecciosos. En S. pombe, una activación constitutiva de Sty1
resulta letal (Millar et al, 1995). Por ello es crítica la existencia de mecanismos de
inhibición de la vía. Los principales reguladores negativos de las MAPKs son las fosfatasas
que revierten la fosforilación por la MAPKK. En S. pombe, las tirosina fosfatasas Pyp1 y
Pyp2 (Millar et al, 1995; Shiozaki y Russell, 1995), y las serina/Treonina fosfatasas PP2C,
Ptc1, Ptc3 y Ptc4 (Degols et al, 1996; Nguyen y Shiozaki, 1999; Di et al, 2012), son las
encargadas de la defosforilación de Sty1.
16 Introducción
Pyp1 es la principal responsable de mantener bajos los niveles de activación de Sty1 en
condiciones normales, mientras que tanto Pyp1 como Pyp2 juegan un papel en la
inactivación de la vía después de la respuesta a estrés.
La expresión basal de pyp1+, así como la inducida por estrés de pyp1
+, pyp2
+ y ptc1
+
depende de la vía de Sty1/Atf1, por lo que estos elementos constituyen un mecanismo de
retroalimentación negativa (Degols et al, 1996; Gaits et al, 1997).
Como se ha comentado anteriormente, las fosfatasas pueden actuar como “sensores”
frente al choque térmico, condición en la que la unión entre la MAPK Sty1 y la fosfatasa
Pyp1 se interrumpe provocando un aumento rápido de la activación de Sty1, que
posteriormente se atenúa por la actuación de Ptc1 y Ptc3 (Nguyen y Shiozaki, 1999).
Las fosfatasas son citoplasmáticas y de esta manera la translocación transitoria de Sty1 al
núcleo tras su activación, la aísla de sus reguladores hasta que se relocaliza en el
citoplasma quedando accesible a las fosfatasas para su inhibición (Gaits y Russell, 1999).
La fosfatasa Ptc4 se ha descrito recientemente con una función específica en respuesta a
H2O2. Sorprendentemente se encuentra en la mitocondria, igual que una pequeña parte
de Sty1, por lo que Ptc4 podría encargarse de inactivar la fracción mitocondrial de Sty1
(Di et al, 2012).
La ruta de integridad celular
La vía de la SAPK no es la única implicada en la respuesta al estrés ambiental. También, en
algunos casos, lo está la ruta de integridad celular, cuya MAPK es Pmk1. Las funciones
principales de esta vía son la regulación de la construcción de la pared celular, la
citocinesis, la morfogénesis, la fusión de vacuolas durante el estrés hipotónico y la
homeostasis iónica (revisado en (Perez y Cansado, 2010). La ausencia de Pmk1 produce
sensibilidad a estrés osmótico, cambios evidentes en la morfología celular, multiseptación
(especialmente en situaciones de estrés térmico u osmótico) e hipersensibilidad a
enzimas líticas de la pared (Toda et al, 1996; Sengar et al, 1997; Zaitsevskaya-Carter y
Cooper, 1997; Sugiura et al, 1999; Loewith et al, 2000). Los componentes principales de la
ruta se esquematizan en la figura 4 y se describen a continuación.
- SENSORES
En S.pombe se desconoce la identidad de los sensores implicados en la detección de los
estímulos y la activación de la ruta de integridad celular. Sin embargo, en S. cerevisiae sí
se han identificado y se trata de proteínas transmembrana que actúan detectando
cambios en la pared celular provocados por distintos tipos de estrés y transmiten el
estímulo a una proteína Rho y al resto de elementos de la vía (revisado en (Levin, 2005).
Sí que se han hallado en S.pombe las proteínas Rho implicadas en la transmisión de la
señal hasta el módulo de MAPKs. Rho2 actúa sobre la proteína quinasa C, Pck2, para
Introducción 17
activar las MAPKs (Ma et al, 2006). Las proteínas activadoras de GTPasas (GAPs) Rga2,
Rga4 y Rga7 son reguladoras negativas de la actividad de Rho2 e inhiben también así la
actividad de Pmk1 (Villar-Tajadura et al, 2008; Soto et al, 2010).
No todos los elementos descritos participan en la transmisión de todos los tipos de
estímulos activadores de la vía. Así, la activación de Pmk1 inducida por estrés hipertónico
o hipotónico sí depende de Rho2-Pck2, pero la inducida por estrés oxidativo o durante la
separación celular es totalmente independiente de éstas (Barba et al, 2008).
Pek1
Mkh1
Pck2
Rho2
Rga2
Rga4
Pmk1P
P
Pyp1 Pyp2
Ptc1 Ptc3?
Rnc1Nrd1
Atf1
Pmp1
Rga7
Mbx1
Estrés osmótico, hipotónico y alcalinoDEMCafeínaCalcoflúorDeprivación de glucosa
Choque térmico
H2O2
Figura 4. Vía de integridad celular en S. pombe
- MÓDULO DE MAP QUINASAS
Una única MAPKKK, Mkh1, es la responsable de transmitir el estímulo al resto de
componentes del módulo (Sengar et al, 1997). Mkh1 fosforila y activa la MAPKK Pek1
(Sugiura et al, 1999) en respuesta a estímulos externos. En ausencia de estímulos, sin
18 Introducción
embargo, Pek1 actúa como inhibidor de la señal hacia Pmk1, así que las señales que se
transmiten por esta vía generan respuestas del tipo todo o nada. La activación de la
MAPK central, Pmk1, se da por fosforilación en los residuos conservados Thr186 y Tyr188
por parte de Pek1 (Loewith et al, 2000). Las tres quinasas interaccionan in vivo formando
un complejo ternario. Mkh1 y Pek1 se localizan en el citoplasma y en el septo, mientras
que Pmk1 se encuentra tanto en el citoplasma como en el núcleo, así como en el huso
mitótico y en el septo durante la citocinesis (Madrid et al, 2006).
Pmk1 se activa por varias condiciones estresantes como la presión hipo o hiperosmótica,
el ayuno de glucosa, el daño en la pared y el estrés oxidativo, y esta activación es
absolutamente dependiente de Mkh1 y Pek1 (Madrid et al, 2006).
- EFECTORES DE PMK1
Se conocen pocos sustratos de la MAPK Pmk1. Por un lado se ha propuesto que el factor
de transcripción Atf1, diana de Sty1, también lo es de Pmk1 en respuesta al estrés
causado por daño en la pared celular (Takada et al, 2007). El gen ecm33+, codificante de
una proteína de la pared celular anclada a glicosil-fosfatidil-inositol (GPI), es una diana
transcripcional de Pmk1 y Atf1 (y de Mbx1, un factor de transcripción de tipo MAD-box) y
se ha involucrado en la regulación negativa de la ruta de Pmk1 (Takada et al, 2010).
Por otro lado, Pmk1 fosforila y regula negativamente la actividad de la proteína de unión
a RNA Nrd1. Ésta se une y estabiliza al mRNA de cdc4+, codificante para la cadena ligera
de la miosina II, y participa así en la regulación de la separación celular (Satoh et al, 2009).
Además, recientemente se ha descrito que la fosforilación de Nrd1 por Pmk1 estimula su
localización en los gránulos de estrés, dónde regula su formación, afectando a la
resistencia a estrés (Satoh et al, 2012).
- REGULACIÓN NEGATIVA
Como la ruta de la SAPK, la actividad de la ruta de integridad celular debe estar también
regulada de manera precisa. El principal regulador negativo de la vía es la fosfatasa de
especificidad dual Pmp1 que se une y defosforila los dos residuos, Tyr186 y Thr188, de la
MAPK Pmk1 (Sugiura et al, 1998). La regulación de esta fosfatasa se da a nivel post-
transcripcional, modulándose la estabilidad de su mRNA por la proteína de unión a RNA
Rnc1. La actividad de Rnc1 incrementa en respuesta a estrés por la fosforilación de Pmk1,
constituyendo un mecanismo de retroalimentación negativa de la ruta (Sugiura et al,
2003).
Además, las fosfatasas de la ruta de la SAPK citadas anteriormente también contribuyen a
la inhibición de Pmk1. Mientras que Ptc1 y Pyp1 controlan el nivel de activación basal de
la MAPK, tanto Pyp1 como Pyp2 y Ptc1 limitan la activación de la ruta en la respuesta a
estrés osmótico (Madrid et al, 2007).
Introducción 19
Cross-talk entre la SAPK y la vía de integridad celular
Ciertos estímulos como el estrés osmótico, el oxidativo o el choque térmico, producen la
activación tanto de Sty1 como de Pmk1 (Madrid et al, 2006). La existencia de respuestas
compartidas ante determinados estreses entre las rutas de la SAPK y de integridad celular
sugiere que debe existir una interconexión entre ambas en algún punto. Ante el estrés
osmótico inducido por KCl se produce un aumento transitorio de la fosforilación de las
dos MAPKs. Mcs4 es imprescindible para la activación de Sty1 en estas condiciones
mientras que Rho2 y Pck2 lo son para Pmk1, así que no parece haber una interconexión
de las rutas a este nivel. Sin embargo, sí que existe una conexión a nivel de los
reguladores negativos de la vía, las fosfatasas. La ausencia de elementos de la vía de la
SAPK produce un incremento en la fosforilación de Pmk1 tanto en condiciones normales
como ante la respuesta a estrés. Las fosfatasas Pyp1, Pyp2 y Ptc1, inducidas por
Sty1/Atf1, participan también en la inhibición de Pmk1 (Madrid et al, 2007). Además,
recientemente se ha descrito otro elemento común en la regulación de ambas vías, Cpc2
(ortólogo de RACK1), que regula positivamente la traducción de las fosfatasas Pyp1 y
Pyp2 (Nunez et al, 2009).
En general, la sensibilidad causada por la ausencia de Pmk1 en presencia de distintos
estreses no es tan dramática como la causada por la de Sty1, lo que sugiere que la ruta de
integridad celular sirve en algunos casos para reforzar la respuesta de la SAPK en el
control de la supervivencia y de la adaptación en estas condiciones.
2. Estrés osmótico
Uno de los estreses ambientales más comunes es el cambio en la presión osmótica.
Sensibles a estos desequilibrios, cuando la osmolaridad extracelular aumenta, las células
pierden agua por difusión pasiva afectándose su viabilidad. En todos los tipos celulares la
principal respuesta adaptativa en estas condiciones es la acumulación de osmolitos que
les permite equilibrar su presión osmótica con la del medio extracelular para evitar la
pérdida de agua.
El cambio de volumen que sufren las células tras la pérdida de agua provoca además un
impacto considerable en la fisiología celular alterando el crecimiento, el transporte
vesicular y la estructura de las membranas.
En S. pombe la respuesta celular a este cambio, mediada por la SAPK, implica la inducción
de un programa transcripcional para inducir la expresión, entre otros, del gen de la
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (gpd1+) (Aiba et al, 1995), encargada de la síntesis de
glicerol, el principal osmolito que permite recuperar el equilibrio osmótico. Se induce
también la expresión de transportadores iónicos y reguladores del potencial de
membrana como Trk1 y Trk2 en el caso del potasio (Calero et al, 2000; Yamuy et al,
20 Introducción
2005). Además de los cambios en la expresión génica, en respuesta a estrés osmótico se
induce un arresto transitorio de la progresión del ciclo celular para permitir la adaptación.
La MAPKAP quinasa Srk1 es la encargada del arresto en G2/M en estas condiciones
(Lopez-Aviles et al, 2005).
La osmoadaptación es parte de la osmoregulación celular, la cual juega un papel
importante en el crecimiento y la morfogénesis (Hohmann, 2002). Dado que los cambios
osmóticos pueden controlarse fácilmente experimentalmente, muchos investigadores
han escogido la osmoadaptación para estudiar principios de la biología celular y
molecular.
3. Estrés oxidativo
El estrés oxidativo se produce como consecuencia de un desequilibrio en el estado redox
de la célula debido a un aumento de las especies reactivas de oxígeno (ROS). Éstas
afectan multitud de funciones celulares por el daño que causan tanto en los ácidos
nucleicos como en las proteínas y los lípidos, y se han visto asociadas a diversas
enfermedades. Para evitar este daño, las células poseen sistemas de defensa que
mantienen bajos los niveles de estos oxidantes. El incremento de ROS se produce cuando
se pierde el equilibrio entre la producción y la detoxificación de las mismas.
El término ROS engloba al colectivo de especies químicas formadas por una reducción
parcial del oxígeno que incluyen el anión superóxido (O2·-), el peróxido de hidrógeno
(H2O2), y el radical hidroxilo (OH·). El aumento en la producción de ROS se puede dar bien
por cambios metabólicos celulares o bien por la exposición a agentes oxidantes externos.
La principal fuente celular de ROS proviene de la fuga de electrones durante el transporte
de éstos en la cadena respiratoria. La donación de un electrón a la molécula de oxígeno
produce el anión O2·-, que puede reducirse y formar H2O2, que a su vez puede dar lugar,
mediante la reacción de Fenton, al radical OH·. Debido a sus propiedades químicas
intrínsecas, cada ROS reacciona preferentemente con unas biomoléculas concretas. El OH·
reacciona indiscriminadamente con todas ellas, siendo la especie más nociva.
Los sistemas de detoxificación de ROS en la célula (revisados en (Herrero et al, 2008))
comprenden una defensa enzimática y otra no enzimática. Forman parte de la defensa
enzimática: i) la superóxido dismutasa (SOD), encargada de catalizar la reacción de
dismutación de O2·- a H2O2; ii) las catalasas, que median la descomposición de H2O2 en O2
y H2O y iii) las peroxidasas, que utilizan residuos de cisteína para la reducción de
peróxidos (figura 5). La defensa no enzimática la componen pequeñas moléculas
antioxidantes que neutralizan las ROS actuando de donadores de electrones, como el
glutatión (GSH), la tiorredoxina (Trx) y la vitamina E, que tiene un papel fundamental en la
peroxidación lipídica.
Introducción 21
Figura 5. Eliminación enzimática de ROS. La superóxido dismutasa (SOD) cataliza la reacción de
O2·- a H2O2. El H2O2 es descompuesto por las catalasas (CAT), las peroxidasas, como glutatión
peroxidasas (GPx), y por peroxiredoxinas (Prx). El tiol de una cisteína en Prx se oxida a ácido
sulfénico (Prxox) y es reducido por la tioredoxina (Trxred). Si el ácido sulfénico es oxidado a ácido
sulfínico, es la sulfiredoxina (Srxred) la responsable de su reducción (Aguirre et al, 2005).
Existen además mecanismos para reparar el daño causado por las ROS: las
oxidorreductasas reducen los puentes disulfuro generados por la oxidación de los
residuos de cisteína de ciertas proteínas utilizando el GSH y la Trx como donadores. Las
glutation transferasas (GSTs) catalizan la glutationización de proteínas que impide la
modificación irreversible de sus tioles por ROS y, además, sirven para conjugar el
glutatión con los agentes oxidantes y facilitar su detoxidicación.
Como se ha comentado en el apartado anterior, en S. pombe las rutas de MAPKs
participan en la respuesta celular al estrés oxidativo, pero existen también otras rutas
específicas para este estrés, constituidas por el factor de transcripción Pap1 y su
activador la peroxiredoxina Tpx1, y el factor de transcripción Prr1.
Pap1 pertenece a la familia de activadores de la transcripción AP-1, homólogo del factor
c-jun de mamíferos, y es necesario para la adaptación a peróxidos (Quinn et al, 2002). La
oxidación de Pap1 produce cambios conformacionales en la región NES (Nuclear Export
Signal) que impiden su interacción con la exportina Crm1, induciendo su acumulación
nuclear y con ello, la activación transcripcional de genes implicados en la respuesta
antioxidante (Toone et al, 1998; Castillo et al, 2002; Chen et al, 2008). El H2O2 induce la
formación en Pap1 de un puente disulfuro intramolecular responsable del cambio
estructural que enmascara el NES (Castillo et al, 2002). Tpx1 (tiorredoxina peroxidasa) es
la encargada de transmitir la señal redox a Pap1, pero sólo a bajas concentraciones del
oxidante. A concentraciones más elevadas, la oxidación de un residuo de cisteína causa la
inactivación temporal de Tpx1, hasta que los niveles de H2O2 se restablecen (Bozonet et
al, 2005; Vivancos et al, 2005). A estas dosis más elevadas del oxidante, es la ruta de Sty1
la encargada de asegurar la tolerancia a través del factor de transcripción Atf1.
22 Introducción
El mecanismo molecular de activación de Pap1 es distinto para diferentes estímulos. Así,
por ejemplo, mientras el H2O2 oxida de forma reversible sus residuos de cisteína para la
formación del puente disulfuro, el dietilmaleato (DEM) induce una modificación
irreversible (Castillo et al, 2002) en Pap1.
El factor de transcripción Prr1, regulador de la respuesta del sistema de dos
componentes, también se ha implicado en la respuesta a estrés oxidativo (Ohmiya et al,
1999) regulando la expresión de genes antioxidantes junto con Pap1 (Chen et al, 2008;
Calvo et al, 2012).
Aunque los sistemas de reparación inducibles ante el estrés oxidativo son comunes para
distintos tipos de oxidantes, las células presentan mecanismos de defensa que son
específicos para cada oxidante particular. Análisis globales del genoma en S. cerevisiae
han revelado la especificidad de estas respuestas, sugiriendo que ningún oxidante es
representativo del “estrés oxidativo” general (Thorpe et al, 2004; Thorsen et al, 2009).
Son agentes prooxidantes los peróxidos (como el de hidrógeno o el t-BOOH), distintos
xenobióticos que actúan como agentes oxido-reductores cíclicos (como el paraquat o la
menadiona), metales y metaloides (como el cadmio o el arsenito), agentes químicos
oxidantes de tioles (como la diamida), etc.
Dada su relevancia en este trabajo, a continuación se describe con mayor detalle los
mecanismos de toxicidad de los metales y metaloides y las respuestas celulares de
defensa ante ellos, prestando mayor atención al arsénico en particular.
Toxicidad por metales y metaloides
Los metales y metaloides tóxicos se encuentran ampliamente presentes en la naturaleza
y, localmente, pueden alcanzar concentraciones elevadas que afectan profundamente los
sistemas biológicos. Para garantizar la supervivencia celular en estos ambientes, todos los
organismos han desarrollado mecanismos de detoxificación y tolerancia, cuya pérdida de
función se ha relacionado con diversas enfermedades humanas, incluyendo trastornos
neurológicos y cardiovasculares y diversos tipos de cáncer (Beyersmann y Hartwig, 2008;
Jomova y Valko, 2011). Al mismo tiempo, algunos metales se usan como agentes
terapéuticos (Thompson y Orvig, 2003).
El impacto de los metales en el medio ambiente así como su importancia para la salud
humana ha incentivado la investigación de su actividad biológica, permitiendo el avance
en la comprensión de las respuestas en distintos organismos. Aún así, los mecanismos de
toxicidad y de defensa a nivel molecular son todavía bastante desconocidos, pero su
exploración presenta un potencial para la prevención y el tratamiento de los trastornos
ocasionados por los metales, así como el desarrollo de métodos para la biorremediación
de la contaminación del medio ambiente por estos compuestos.
Introducción 23
La toxicidad de cada metal particular depende de sus propiedades fisicoquímicas y sus
preferencias de ligando, pero se atribuye, en general, a: i) la reactividad con los grupos
sulfidrilo, que produce daños irreversibles en ciertas proteínas afectando procesos
celulares fundamentales, ii) la inhibición de los mecanismos de reparación del DNA y iii) la
generación de ROS que causa un estrés oxidativo (bien por la inhibición de enzimas
específicas o por la depleción de antioxidantes, bien por otros mecanismos indirectos)
(revisado en (Wysocki y Tamas, 2010). Además de los mecanismos de toxicidad generales,
existen también muchas dianas específicas de cada metal y metaloide, por lo que la célula
combate esta toxicidad mediante distintos sistemas.
Respuestas celulares a metales y metaloides
Las respuestas celulares frente a los metales incluyen la activación de vías de
señalización, la inducción transcripcional de la defensa antioxidante, la regulación de la
progresión del ciclo celular y la adaptación metabólica, comunes a otros tipos de estrés.
Sin embargo, difieren en los mecanismos de defensa y detoxificación, siendo muy
importantes en el caso de los metales: i) el ajuste de su transporte, para impedir su
entrada en la célula y estimular su eliminación, ii) la quelación de los mismos con
glutatión, metalotioneínas y fitoquelatinas para evitar su toxicidad y iii) el secuestro en la
vacuola (revisado en (Wysocki y Tamas, 2010).
- GLUTATIÓN
El glutatión constituye un mecanismo muy importante de detoxificación de metales dada
su función a distintos niveles. En primer lugar, su unión al metal es necesaria para el
secuestro en la vacuola (Ghosh et al, 1999). En segundo lugar, como principal tampón
antioxidante de la célula, protege del estrés oxidativo inducido por los metales (Grant,
2001). Por último, ejerce la glutationización, evitando el daño irreversible de grupos
sulfidrilos de las proteínas resultado de la unión de éstas a los metales (Pompella et al,
2003).
- REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL: ZIP1 Y PAP1
En S. pombe, el factor de transcripción Zip1, homólogo a Nrf2 en mamíferos (Baudouin-
Cornu y Labarre, 2006), ha sido involucrado en la respuesta a metal(oid)es, siendo las
células carentes de Zip1 altamente sensibles a la presencia de cadmio y arsenito (Harrison
et al, 2005; Rodriguez-Gabriel y Russell, 2005). En presencia de cadmio, Zip1 se estabiliza
e induce la transcripción de un conjunto de genes implicados en la síntesis de glutatión,
así como un arresto del ciclo celular. En ausencia de estímulo, la proteína Pof1 media su
constante degradación por el proteasoma (figura 6) (Harrison et al, 2005). La ausencia de
24 Introducción
Zip1 sin embargo, no produce sensibilidad a H2O2, lo que sugiere que no debe ser
necesario para la detoxificación de las ROS generadas por los metales (Rodriguez-Gabriel
y Russell, 2005).
Figura 6. Modelo de la función y regulación de Zip1 (Harrison et al, 2005).
Por otro lado, también el factor Pap1 juega un papel confiriendo resistencia a metales y
múltiples drogas (Turi y Rose, 1995; Castillo et al, 2002; Castillo et al, 2003). Un estudio
reciente ha demostrado que Pap1 media las respuesta antioxidante y la de resistencia a
múltiples drogas con efectores diferentes, puesto que la inducción de los genes que
confieren resistencia a drogas es independiente del factor Prr1, que sí es necesario para
la respuesta antioxidante (Calvo et al, 2012). La deleción de Pap1 también causa
sensibilidad a cadmio y arsenito (Toone et al, 1998; Harrison et al, 2005; Rodriguez-
Gabriel y Russell, 2005).
- REGULACIÓN DEL TRANSPORTE DE METALES Y METALOIDES
La entrada indeseada de metales y metaloides tóxicos a la célula tiene lugar a través de
vías diseñadas para la asimilación de compuestos similares estructuralmente que son
esenciales para ésta (como Fe, Mn, Zn, fosfato, sulfato y glicerol). Los sistemas más
eficientes para la tolerancia a metal(oid)es tóxicos incluyen la inhibición de la entrada y la
expulsión de los mismos bien fuera de la célula, bien en compartimentos como las
vacuolas. A diferencia de las rutas de entrada, las de exportación presentan una elevada
especificidad para cada metal o metaloide particular y están estrictamente reguladas por
mecanismos que detectan dicho compuesto.
Introducción 25
Los metales pesados como el cadmio son internalizados a través de transportadores
implicados en la asimilación de cationes esenciales como zinc, manganesio o calcio; los
oxianiones de cromo, selenio y molibdeno se asimilan vía transportadores de sulfato. Los
metaloides como el arsenito o el antimonito se transportan a través de los canales
bidireccionales de membrana pertenencientes a la familia de las MIPs (Major Intrinsic
Proteins). Éstas son las acuagliceroporinas responsables de la entrada de agua y solutos
neutros pequeños como el glicerol (figura 7). Finalmente, las formas de metaloides
análogas al fosfato se incorporan mediante los transportadores de este último. Los
transportadores que secuestran en la vacuola metales y metaloides conjugados con
glutatión o fitoquelatinas son menos específicos y pertenecen a la familia de proteínas de
resistencia a múltiples drogas de los transportadores ABC (ATP-Binding Cassette). Por
último, las bombas de extrusión de la membrana plasmática son ATPasas de tipo P en el
caso de los metales pesados, y los metaloides también se expulsan vía bombas de iones
primarias o secundarias (revisado en (Wysocki y Tamas, 2010; Zangi y Filella, 2012).
Fps1
AQP7/9GlpF
Figura 7. Transportadores de metaloides en procariotas y eucariotas. El modelo muestra una
comparación de las vías del transporte de arsenito en E. coli (A), S. cerevisiae (B), y una célula de
mamífero generalizada (C). En los tres, la captación de arsenito es facilitada por una
acuagliceroporina (Liu et al, 2002b).
- ARSÉNICO
Este metaloide altamente tóxico, presente en suelos y aguas contaminadas, ha sido
relacionado con varias enfermedades humanas incluyendo trastornos cardiovasculares
(Navas-Acien et al, 2005) y neurológicos (Vahidnia et al, 2007), diabetes (Huang et al,
2011) y lesiones hepáticas (Mazumder, 2005). Además, el arsénico ha sido ampliamente
documentado como carcinógeno humano, causando varios tipos de cáncer (Yoshida et
al, 2004) por múltiples modos de acción, como la inducción de estrés oxidativo, la
inhibición de la reparación del DNA, la alteración de su patrón de metilación, y la
inducción de la proliferación (Schoen et al, 2004).
Asimismo, el arsénico se ha utilizado con fines terapéuticos desde hace mucho tiempo y
fue de los primeros agentes usados para tratar enfermedades infecciosas como la sífilis y
26 Introducción
la tripanosomiasis. Actualmente, el trióxido de arsénico (ATO), es el agente más activo en
el tratamiento de leucemia promielocítica aguda (APL) (Lengfelder et al, 2012).
Las múltiples consecuencias del arsénico en las vías celulares necesitan de estudios
mecanísticos para determinar qué acciones median los distintos efectos biológicos.
Conocer los mecanismos moleculares de resistencia a arsénico es crucial para prevenir la
tolerancia al metaloide de las células cancerosas y parásitos, así como para el desarrollo
de estrategias de biorremediación de las áreas contaminadas por arsénico.
4. Antecedentes: MAPKAP quinasas
El trabajo en nuestro laboratorio se centra en el estudio de las quinasas de S. pombe
homólogas a las quinasas dependientes de calcio y calmodulina de mamíferos. Dos de
ellas han sido previamente descritas como MAPKAP quinasas por nuestro grupo y otros,
involucrándolas en la regulación de la respuesta celular al estrés ambiental como
componentes de la ruta de la SAPK. Dada su relevancia en este trabajo, a continuación se
describen con mayor detalle esta familia de quinasas:
La familia de las MAPKAP quinasas en metazoos
Las MAPKAPKs son ser/thr quinasas que responden a estímulos extracelulares activadas
directamente por MAPKs. La familia de MAPKAPKs consta de 11 miembros activados ante
distintos estímulos y distintas MAPKs. En base a la homología de sus dominios quinasa,
pertenecen a la familia de las quinasas dependientes de calcio y Calmodulina (CAMK).
Todas ellas comparten un loop de activación similar, diana de fosforilación por sus
MAPKs. Tienen funciones biológicas diversas, como la regulación de nucleosomas y la
expresión génica, la estabilidad de mRNA y la traducción, la proliferación celular y la
supervivencia (revisado en (Cargnello y Roux, 2011). Se distinguen 5 subgrupos en función
de la homología de sus secuencias, que son: RSKs, MSKs, MNKs, MK2/3 y MK5, y cuyas
funciones principales se resumen en la figura 8.
MAPKAP quinasas en S. cerevisiae
En S. cerevisiae las quinasas Rck1 y Rck2 son sustratos de la MAPK Hog1 y Rck2 participa
en la respuesta a estrés osmótico (Bilsland-Marchesan et al, 2000). Ambas son necesarias
también para la resistencia al estrés oxidativo (Bilsland et al, 2004). Rck2 ha sido
involucrada en la modulación de la síntesis proteica mediante la fosforilación del factor
Ef2 (Teige et al, 2001) y en la reprogramación de ribosomas después del estrés oxidativo
(Swaminathan et al, 2006).
Introducción 27
MAPKAP quinasas en S. pombe
Srk1. Se halló como gen ortólogo a MK2 de mamíferos que se inducía en respuesta a
estrés de manera dependiente de Sty1. Se demostró además que Srk1 era fosforilada por
Sty1 y translocaba al núcleo en respuesta a estrés (Smith et al, 2002). Por otro lado, se ha
implicado a esta quinasa en el proceso de meiosis ya que el mutante de Srk1 entra más
rápidamente en meiosis que el control ante la deprivación de nitrógeno (Smith et al,
2002; Asp y Sunnerhagen, 2003). Se ha observado además que Srk1 se acumula en las
ascas zigóticas y se concentra en las esporas (Asp y Sunnerhagen, 2003).
Trabajos de nuestro laboratorio demostraron el papel de Srk1 en la regulación de la
progresión del ciclo celular (Lopez-Aviles et al, 2005)(figura 9).
Figura 8. Funciones biológicas y sustratos de las MAPKAP quinasas. Tras su activación las RSKs,
MSKs, MNKs y MK2/3/5 fosforilan diversos sustratos y regulan muchas respuestas celulares
(Cargnello y Roux, 2011).
P
Srk1
Cdc25PP
P P P PP
Rad24
Cdc13
Cdc25
Cdc2
P
G2 M
Cdc13
Cdc25
Cdc2
P
G2 M
Figura 9. Srk1 regula la transición G2/M. La quinasa Srk1 fosforila Cdc25 durante el crecimiento
vegetativo y en respuesta a estrés osmótico para inhibir la progresión del ciclo celular (Lopez-Aviles
et al, 2005).
28 Introducción
En respuesta a estrés osmótico, Sty1 fosforila a Srk1 induciendo la separación de ambas y
permitiendo que Srk1 ejerza su función fosforilando a su vez a la fosfatasa Cdc25. La
fosforilación de Cdc25 induce su unión a la proteína 14-3-3 Rad24 y el consiguiente
secuestro en el citoplasma, que impide su actividad sobre Cdc2 para promover la
transición G2/M. Así, las células quedan arrestadas dando tiempo para la adaptación a las
nuevas condiciones (Lopez-Aviles et al, 2005; Lopez-Aviles et al, 2008). Los últimos
resultados del grupo en el estudio de esta quinasa, la involucran también en la regulación
negativa de la vía de Sty1 (Eva Lambea, 2009), aunque el mecanismo de acción en este
proceso es aún desconocido.
Cmk2. Trabajos anteriores de nuestro laboratorio describieron la quinasa Cmk2. Por un
lado se observó que la sobreexpresión de la misma inducía un bloqueo en la fase G2 del
ciclo dependiente de Cdc2 y a la vez rescataba los defectos en el checkpoint de
replicación pero no de daño del DNA, sugiriendo que el bloqueo en G2 proporcionaría el
tiempo necesario para reparar las posibles alteraciones en la replicación (Alemany et al,
2002). Varios estudios han definido la localización subcelular de Cmk2, situándola en la
periferia (Alemany et al, 2002; Matsuyama et al, 2006) y en el septo (Asp y Sunnerhagen,
2003). En otro trabajo de nuestro grupo se observó que Cmk2 es esencial para la
supervivencia específicamente ante estrés oxidativo. En estas condiciones, la MAPK Sty1
interacciona con Cmk2 y la fosforila en su residuo 411 (Sanchez-Piris et al, 2002). Aunque
se ha sugerido que Cmk2 podría desempeñar un papel similar al de su ortólogo en S.
cerevisiae regulando la síntesis proteica en estas condiciones (Teige et al, 2001), no se ha
determinado aún su función específica en la respuesta a estrés oxidativo en S. pombe.
OBJETIVOS
Objetivos 31
Las MAPKAP quinasas Srk1 y Cmk2 han sido implicadas en las respuestas celulares al
estrés ambiental como componentes de la ruta de la SAPK Sty1. El propósito principal de
esta tesis es profundizar en la caracterización de su función en estas respuestas.
Objetivos capítulo I
Partiendo de las observaciones hechas en el trabajo de Eva Lambea (2009) que apuntan a
una función de Srk1 en la regulación negativa de la vía de Sty1, nos planteamos como
objetivo el estudio funcional de la quinasa Srk1 en la regulación de la actividad de Sty1 en
la respuesta a estrés osmótico. En concreto, nos propusimos:
- Diseccionar las posibles interacciones de Srk1 con los distintos elementos de la
vía SAPK.
- Determinar a través de qué mecanismo la quinasa Srk1 ejerce su función en la
regulación de la actividad de Sty1.
- Identificar otros posibles reguladores negativos de la vía.
Objetivos capítulo II
Aunque la MAPKAP quinasa Cmk2 fue previamente involucrada en la respuesta a estrés
oxidativo, su función específica en esta respuesta no se ha determinado aún. Así, el
objetivo principal de este capítulo ha consistido en caracterizar en mayor profundidad el
papel de Cmk2 en la respuesta a estrés oxidativo. Los objetivos concretos para el
abordaje de este objetivo general han sido:
- Determinar la especificidad de la función de Cmk2 ante distintos oxidantes.
- Investigar el papel de Cmk2 en la respuesta a arsenito mediante el análisis de
interacciones con otros elementos implicados en dicha respuesta.
RESULTADOS
CAPÍTULO I
Regulación de la MAPK Sty1 en la respuesta a estrés osmótico:
papel de la quinasa Srk1 y la proteína de unión a RNA Rnc1.
Resultados I 37
I.1 Srk1 juega un papel en la respuesta a estrés osmótico regulando la
actividad de la MAPK Sty1
Como se ha comentado anteriormente, la MAPKAP quinasa Srk1 ha sido objeto
importante de estudio en nuestro grupo y se ha involucrado en la regulación de la
progresión del ciclo celular y la respuesta a estrés. En trabajos anteriores, se demostró el
papel de Srk1 en la transición G2/M fosforilando a la fosfatasa Cdc25, produciendo un
arresto que da tiempo a las células a adaptarse a las nuevas condiciones (Lopez-Aviles et
al, 2005; Lopez-Aviles et al, 2008) (figura 9). Así, la deleción de srk1+ causa un defecto de
crecimiento en presencia de KCl. Y consecuentemente, la cepa cdc259A (con los 9
residuos de fosforilación por Srk1 mutados a alanina, no fosforilable) resulta también
sensible en estas condiciones. Sin embargo, el defecto de crecimiento que muestra la
deleción de srk1+ es mayor que el de cdc259A (figura 10, (Lopez-Aviles et al, 2008)),
indicando que la quinasa Srk1 debe jugar otro papel en la respuesta a estrés además del
ya descrito sobre Cdc25. En los últimos estudios del grupo se han encontrado evidencias
para un posible papel de Srk1 en la regulación de la activación de la MAPK Sty1 (Eva
Lambea, 2009).
López-Avilés, Lambea et al, 2008
Figura 10. Sensibilidad de cdc25-9A en presencia de KCl. Diluciones seriadas de cultivos en fase
exponencial de las cepas wt, Δsrk1, Δsty1, cdc25-9A, srk1-T463D, y srk1-T463A se plaquearon en
placas de medio rico suplementadas con 0.8M KCl. La formación de colonias se analizó después de
dos días de crecimiento a 30°C (Lopez-Aviles et al, 2008).
En primer lugar, se analizó la cinética de fosforilación de Sty1 en la respuesta a estrés
osmótico inducido con KCl en el mutante ∆srk1 mediante western blot. Observamos que
la deleción de srk1+ conlleva un defecto en la defosforilación de Sty1 después del estrés,
respecto a la cepa control (figura 11.A.). En el experimento complementario,
sobreexpresando Srk1 y tratando las células con KCl, observamos cómo la fosforilación de
38 Resultados I
Sty1 se inhibe en estas condiciones, corroborando un papel de Srk1 en la regulación de
esta fosforilación (figura 11.B.).
A.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 50 100
un
idad
es
rela
tiva
s
tiempo (min) 0,8M KCl
P-Sty1
wt
∆srk1
0 15 30 60 90 120 0 15 30 60 90 120
wt Δsrk1
0,8M KCl
P-Sty1
Cdc2
min
+ - + -B1
Control 0,8M KCl
pREP1srk1 en wt
P-Sty1
Sty1
Srk1HA
B.
Figura 11. Cinética de fosforilación de Sty1 inducida por KCl en ∆srk1. (A) Las cepas wt y Δsrk1 se
cultivaron en medio YES hasta la fase exponencial, se sometieron a 0,8M KCl y se recogieron células a
los tiempos indicados. (B) La cepa wt transformada con el plásmido pREP1srk1, se cultivó en EMM con
o sin tiamina (+/- B1) durante 20 horas. Se recogieron células sin tratar o bien tratadas 15 minutos con
0,8mM KCl. La fosforilación de Sty1 se detectó en ambos casos mediante western blot con el
anticuerpo anti-P-p38 y la fusión Srk1-HA con el anticuerpo anti-HA. Como control se utilizó el
anticuerpo anti-cdc2 (A) o anti-Hog1 para detectar los niveles totales de Sty1 (B).
I.2 La función de Srk1 sobre la fosforilación de Sty1 es independiente de su
función en el arresto del ciclo celular
Dado que la sobreexpresión de Srk1 causa un arresto del ciclo celular, quisimos examinar
si el efecto sobre la activación de Sty1 estaba relacionado o no con su función en este
arresto. Para ello, repetimos el experimento de sobreexpresión en la cepa cdc259A, en la
que a pesar de sobreexpresar Srk1, las células no pueden arrestar el ciclo celular (figura
12.A. (Lopez-Aviles et al, 2005). En este fondo genético, la sobreexpresión de Srk1 todavía
es capaz de inhibir la fosforilación de Sty1 tras el tratamiento con KCl (figura 12.B). Así,
podemos concluir que el papel de Srk1 en la regulación de la activación de Sty1 es
independiente de Cdc25 y de la regulación de la progresión del ciclo celular.
Resultados I 39
+ - + -B1
Control 0,8M KCl
pREP1srk1 en cdc259A
P-Sty1
Sty1
Srk1HA
- B1 +B1
pREP1srk1
López-Avilés et al, 2005
wt
cdc259A
B.A.
Figura 12. Sobreexpresión de Srk1 en cdc25-9A. (A) Fenotipo de la sobreexpresión de Srk1 (Lopez-
Aviles et al, 2005). (B) La cepa cdc25-9A transformada con el plásmido pREP1srk1, se cultivó en
EMM con sin tiamina (+/- B1) durante 20 horas. Se recogieron células sin tratar o bien tratadas 15
minutos con 0,8mM KCl. La fosforilación de Sty1 se detectó mediante western blot con el
anticuerpo anti-P-p38 y la fusión Srk1-HA con el anticuerpo anti-HA. Como control se utilizó el
anticuerpo anti-Hog1 para detectar los niveles totales de Sty1.
I.3 El residuo Tyr173, esencial para la actividad de la MAPK, no está
correctamente defosforilado en ∆srk1
La MAPK Sty1 se activa por la fosforilación de la MAPKK Wis1 en dos residuos: la treonina
171 y la tirosina 173. El anticuerpo anti-fosfo p38 utilizado en los experimentos anteriores
reconoce ambos residuos fosforilados, por lo que no podemos determinar la fosforilación
de qué residuo concreto está afectada en ∆srk1.
La fosforilación en el residuo de tirosina 173 es esencial para la actividad de Sty1 (Nguyen
y Shiozaki, 1999), así que quisimos analizar específicamente la fosforilación de este
residuo. Para ello, inmunoprecipitamos la proteína de fusión Sty1HA en la cepa control y
en la delecionada para srk1+ tratadas con KCl, y realizamos un western blot anti-fosfo
tirosina. Observamos que, efectivamente, el residuo de tirosina presenta un defecto de
defosforilación en ∆srk1 (figura 13).
Sin embargo, en el trabajo de la tesis doctoral de Eva Lambea (2009), se demostró que el
efecto de Srk1 sobre la fosforilación de Sty1 era independiente del de las tirosina
fosfatasas.
40 Resultados I
0 15 60 0 15 60
sty1HA sty1HAΔsrk1
0,8M KCl
IP α-HA P-tyr
P-Sty1
Sty1HA
min
Figura 13. Fosforilación del residuo tirosina 173 de Sty1. Las cepas sty1HA y sty1HA∆srk1 se
cultivaron en medio YES hasta la fase exponencial, se sometieron a 0,8M KCl y se recogieron
células a los tiempos indicados. Se obtuvieron extractos nativos y se immunoprecipitó Sty1HA con
el anticuerpo anti-HA fusionado a agarosa. Se detectó por western blot la tirosina fosforilada con
el anticuerpo anti-P-tirosina, los dos residuos thr 171 y tyr173 con el anti-P-p38, y como control se
detectaron los niveles totales de la fusión Sty1-HA con el anti-HA.
I.4 Srk1 no ejerce su función reguladora de Sty1 a través de la MAPKK Wis1
En el mismo trabajo (Eva Lambea, 2009), se observó que Srk1 era capaz de fosforilar a
Wis1 in vitro y se identificaron 5 residuos involucrados en dicha fosforilación. Dos de
estos residuos se encuentran en el dominio de unión entre Wis1 y Sty1 (Nguyen et al,
2002) y se hipotetizó que la fosforilación de Srk1 en estos residuos podría afectar dicha
unión e impedir la activación de Sty1 después de la respuesta a estrés. En el presente
trabajo nos planteamos analizar el posible papel de estas fosforilaciones in vivo, en la
respuesta a estrés osmótico. Si el efecto de Srk1 sobre la fosforilación de Sty1 tiene lugar
mediante su actividad sobre Wis1, entonces un mutante con los residuos de Wis1
identificados anteriormente mutados a alanina (no fosforilable) debería tener el mismo
fenotipo que la deleción de srk1+. Por el contrario, la mutación de ellos a ácido aspártico
o glutámico (fosfomiméticos) podría impedir la correcta activación de Sty1. Las primeras
aproximaciones fueron expresar estos mutantes bajo el control de la versión más
atenuada del promotor nmt, tanto transformando el plásmido, como integrándolo en el
genoma para evitar un exceso de copias. Con estos sistemas, los niveles de expresión de
Wis1 resultaron demasiado elevados, produciendo una hiperactivación de Sty1 respecto a
una cepa control. Por ello, decidimos integrar estos mutantes bajo su promotor
endógeno (ver apartado de materiales y métodos). Una vez construidos, procedimos a
analizar la sensibilidad de los mutantes de fosforilación de Wis1 (figura 14.A) en presencia
de KCl. Como se observa en la figura 14.B, ninguno de los mutantes presenta defectos de
crecimiento ante el estrés osmótico. Por otro lado, analizamos la cinética de fosforilación
de Sty1 por KCl en estas cepas mediante western blot. La mutación de los posibles
residuos de fosforilación no tiene efecto en la activación de Sty1 (figura 14.C). Estos
resultados demuestran que la fosforilación de Wis1 en estos residuos no es el mecanismo
por el cual Srk1 regula la activación de Sty1 después de la respuesta a estrés osmótico.
Resultados I 41
wis1
wis1-5A
wis1-ED
YES 0,8M KCl
T225S TS17 S96 S159 S226
S TDE
S TA A A AA
Wis1-5A
Wis1-ED
Wis1
NES Dominio de unión con Sty1 Región catalítica
C.
0 5 15 30 60 90
wis1 wis1-5A
0 5 15 30 60 90 0 5 15 30 60 90
wis1-ED
P-Sty1
Sty1
min
0,8M KCl
A.
B.
C.
Figura 14. Análisis del fenotipo de los mutantes de fosforilación de wis1+. (A) El esquema muestra
los distintos dominios de Wis1 e indica los residuos de fosforilación por Srk1 in vitro. Los residuos
en la región catalítica corresponden a los de fosforilación por la MAPKKK. (B) Viabilidad celular en
presencia de KCl. Las cepas wis1, wis1-5A y wis1-ED se cultivaron en medio YES hasta la fase
exponencial y se plaquearon diluciones que contenían 104,10
3, 10
2 y 10
1 células en placas de YES
suplementadas con 0,8M KCl. Las placas se incubaron a 30°C durante 3 días antes de ser
fotografiadas. (C) Cinética de fosforilación de Sty1. Las cepas wis1, wis1-5A y wis1-ED se cultivaron
en medio YES hasta la fase exponencial, se sometieron a 0,8M KCl y se recogieron células a los
tiempos indicados. La fosforilación de Sty1 se detectó mediante western blot con el anticuerpo anti-
P-p38. Como control se utilizó el anticuerpo anti-Hog1 para detectar los niveles totales de Sty1.
42 Resultados I
I.5 El efecto de Srk1 sobre la activación de Sty1 es independiente de la
respuesta transcripcional de Sty1/Atf1
El retraso en la defosforilación de Sty1 después del estrés en ∆srk1 podría ser
consecuencia de algún defecto en la respuesta adaptativa, por lo que la célula necesitaría
más tiempo para adaptarse. Dado que los cambios transcripcionales inducidos por Sty1 y
el factor de transcripción Atf1 representan la principal respuesta para la adaptación al
estrés, nos propusimos evaluar si Srk1 estaba involucrada en este proceso.
Por un lado, quisimos comprobar si la ausencia de Srk1 afectaba de algún modo a los
niveles de Atf1, por lo que analizamos la proteína de fusión Atf1-HA mediante western
blot en wt y ∆srk1 tras el tratamiento con KCl. Como se observa en la figura 15.A, la
deleción de srk1+ no produce ningún efecto en los niveles proteicos de Atf1-HA en
respuesta a estrés osmótico.
Por otro lado, analizamos por northern blot la expresión de la fosfatasa pyp2+, cuya
inducción depende de Sty1 y Atf1 y participa en el ciclo de retroalimentación negativa de
la vía. El mRNA de pyp2+ se induce correctamente en ∆srk1 (figura 15.B), lo que sugiere
que la respuesta transcripcional dependiente de Sty1/Atf1 no está afectada en el
mutante.
Finalmente, llevamos a cabo otra aproximación en la que sobreexpresamos Srk1 en ∆atf1
para comprobar si, en ausencia del factor de transcripción y por lo tanto sin la inducción
de los genes CESR, Srk1 era capaz de inhibir la fosforilación de Sty1 inducida por KCl.
Sorprendentemente, el efecto inhibitorio de Srk1 no depende de la presencia de Atf1, ni,
en principio, de la inducción de sus genes diana (figura 15.C).
+ - + -B1
Control 0,8M KCl
pREP1srk1 en ∆atf1
P-Sty1
Cdc2
Srk1HA
A.
B.
0 15 30 60 90 120 0 15 30 60 90 120
atf1HA atf1HAΔsrk1
Atf1HA
Tubulina
0,8M KCl
min
leu+
pyp2+
0 15 30 60 90 0 15 30 60 90
wt
0,6M KCl
∆srk1min
C.
Resultados I 43
Figura 15. Análisis de la posible interacción entre Atf1 y Srk1. (A) Niveles proteicos de Atf1 en
∆srk1. Las cepas atf1HA y atf1HA∆srk1 se cultivaron en medio YES hasta la fase exponencial, se
sometieron a 0,8M KCl y se recogieron células a los tiempos indicados. Se obtuvieron los extractos
celulares y la fusión Atf1-HA se detecto mediante western blot con el anticuerpo anti-HA. Para el
control de carga se utilizó el anticuerpo anti-tubulina. (B) Las cepas wt y ∆srk1 se cultivaron en
medio YES hasta la fase exponencial, se trataron con 0,6M KCl y se recogieron a los tiempos
indicados. Se procedió a la extracción de RNA y se detectaron mediante northern blot los niveles
de mRNA de pyp2+. Se utilizaron para la hibridación sondas marcadas con
32P para pyp2
+ y leu1
+
(como control de carga). (C) La cepa ∆atf1 transformada con el plásmido pREP1srk1, se cultivó en
EMM con o sin tiamina (+/- B1) durante 20 horas. Se recogieron células sin tratar o bien tratadas
15 minutos con 0,8mM KCl. La fosforilación de Sty1 se detectó mediante western blot con el
anticuerpo anti-P-p38 y la fusión Srk1-HA con el anticuerpo anti-HA. Como control se utilizó el
anticuerpo anti-Cdc2.
I.6 La proteína de unión a RNA Rnc1 participa en la respuesta a estrés
osmótico y es reguladora de la MAPK Sty1
Rnc1 es una proteína que presenta dominios KH de unión a RNA y se identificó como
regulador negativo de la vía de la MAPK Pmk1. Rnc1 estabiliza el mRNA de la fosfatasa
Pmp1 a través de la unión a su 3’ UTR. Además, se activa por la fosforilación de Pmk1,
constituyendo así un mecanismo de retroalimentación negativa de la vía (Sugiura et al,
2003) (figura 4). Dado que ya han sido descritos algunos elementos de interconexión
entre la vía de la SAPK y la de integridad celular, como las fosfatasas (Madrid et al, 2007),
nos planteamos evaluar si el regulador Rnc1 lo era también de Sty1 y representaba
entonces otro elemento de interconexión entre ambas vías.
En primer lugar, quisimos comprobar si Rnc1 estaba implicada en la respuesta a estrés
osmótico inducido con KCl. Para ello, realizamos un ensayo de sensibilidad en placa y
observamos cómo la deleción de rnc1+ causa un defecto de crecimiento en presencia de
KCl (figura 16), indicando que es necesario para la respuesta al estrés osmótico.
0,8M KClYES
wt
Δrnc1
Figura 16. Viabilidad de ∆rnc1 en presencia de KCl. Las cepas wt y ∆rnc1 se cultivaron en medio
YES hasta la fase exponencial y se plaquearon diluciones que contenían 104,10
3, 10
2 y 10
1 células
en placas de YES suplementadas con 0,8M KCl. Las placas se incubaron a 30°C durante 3 días antes
de ser fotografiadas.
A continuación, analizamos la cinética de fosforilación de Sty1 en la cepa ∆rnc1 por
western blot. Como muestra la figura 17.A, la deleción de rnc1+ produce también un
44 Resultados I
defecto de defosforilación de la MAPK Sty1 después del estrés. De acuerdo con este
resultado, la sobreexpresión de Rnc1 provoca la inhibición de la activación de Sty1
inducida por KCl (Figura 17.B). Estas observaciones apuntan a que Rnc1 debe ser un
regulador negativo de la MAPK Sty1.
Dado que el único sustrato conocido para Rnc1 es la fosfatasa dual Pmp1, quisimos
examinar su papel en la regulación de Sty1. Con este fin, analizamos la cinética de
fosforilación de Sty1 en respuesta a estrés osmótico en ∆pmp1. La ausencia de pmp1+ no
produce ningún efecto en la fosforilación de Sty1 tras el tratamiento con KCl respecto al
wt (figura 17.A). Complementariamente, la sobreexpresión de Rnc1 en ∆pmp1 sigue
inhibiendo la fosforilación de Sty1 inducida con KCl (figura 17.B). Estos resultados indican
que la función de Rnc1 en la regulación de Sty1 no depende de la fosfatasa Pmp1.
min
P-Sty1
Sty1
0,8M KCl
wt Δrnc1 Δpmp1
0 15 30 60 90 120 0 15 30 60 90 120 0 15 30 60 90 120
A.
+ - + -B1
Control 0,8M KCl
pREP1rnc1 en wt
P-Sty1
Sty1
Rnc1HA
P-Pmk1
+ - + -B1
Control 0,8M KCl
pREP1rnc1 en ∆pmp1
P-Sty1
Sty1
Rnc1HA
B. C.
Figura 17. Efecto de Rnc1 y Pmp1 en la fosforilación de Sty1. (A) Las cepas wt, Δrnc1 y ∆pmp1 se
cultivaron en medio YES hasta la fase exponencial, se sometieron a 0,8M KCl y se recogieron
células a los tiempos indicados. La fosforilación de Sty1 se detectó mediante western blot con el
anticuerpo anti-P-p38. Como control se utilizó el anticuerpo anti-Hog1 para detectar los niveles
totales de Sty1. (B) Las cepas wt y ∆pmp1 transformadas con el plásmido pREP1rnc1, se cultivaron
en EMM con (+B1) o sin (-B1) tiamina durante 20 horas. Se recogieron células sin tratar o bien
tratadas 15 minutos con 0,8mM KCl. La fosforilación de Sty1 se detectó mediante western blot con
el anticuerpo anti-P-p38 y la fusión Rnc1-HA con el anticuerpo anti-HA. Como control se utilizó el
anticuerpo anti-Hog1 para detectar los niveles totales de Sty1. En la cepa wt se detectó la
fosforilación de Pmk1 como control de actividad de Rnc1 utilizando el anticuerpo anti-P-Pmk1.
Resultados I 45
I.7 Las proteínas reguladoras de Sty1, Srk1 y Rnc1, tienen funciones
independientes en la respuesta a estrés osmótico
Dado que habíamos encontrado dos nuevas proteínas (Srk1 y Rnc1) involucradas en la
regulación negativa de Sty1, quisimos averiguar si existía una interacción genética entre
ambas.
+ - + -B1
Control 0,8M KCl
pREP1srk1 en ∆rnc1
P-Sty1
Sty1
Srk1HA
+ - + -B1
Control 0,8M KCl
pREP1rnc1 en ∆srk1
P-Sty1
Sty1
Rnc1HA
A.
B.
Andrés Núñez, Dr J. Cansado
Andrés Núñez, Dr J. Cansado
C.
Figura 18. Análisis de la posible interacción entre Srk1 y Rnc1. (A) Las cepas ∆rnc1 y ∆srk1
transformadas con los plásmidos pREP1srk1 y pREP1rnc1 respectivamente se cultivaron en EMM
con o sin tiamina (+/- B1) durante 20 horas. Se recogieron células sin tratar o bien tratadas 15
minutos con 0,8mM KCl. La fosforilación de Sty1 se detectó mediante western blot con el
anticuerpo anti-P-p38 y las fusiones Srk1-HA y Rnc1-HA con el anticuerpo anti-HA. Como control se
utilizó el anticuerpo anti-Hog1 para detectar los niveles totales de Sty1. (B) Viabilidad en presencia
de KCl de las cepas wt, ∆srk1, ∆rnc1 y ∆srk1∆rnc1. (C) Detección de los niveles de fosforilación de
Sty1 en presencia de KCl en las cepas wt, ∆srk1, ∆rnc1 y ∆srk1∆rnc1: Experimentos realizados por
Andrés Núñez, en el laboratorio del Dr José Cansado.
46 Resultados I
En primer lugar llevamos a cabo experimentos de sobreexpresión, en los que
sobreexpresamos una proteína en el fondo genético mutante para la otra. Observamos
que las dos siguen siendo capaces de inhibir la fosforilación de Sty1 inducida por KCl en
ausencia de la otra (figura 18.A), sugiriendo la independencia funcional de ambas
proteínas.
En el transcurso de esta tesis supimos que el grupo del Dr José Cansado, especialista en el
estudio de la vía de integridad celular, estaba también trabajando con la proteína Rnc1,
por lo que establecimos una colaboración con su laboratorio. En primer lugar, con los
experimentos realizados en su laboratorio corroboramos la independencia de ambos
genes mediante experimentos de epistasia. Por un lado, analizamos la sensibilidad al KCl
del doble mutante ∆srk1∆rnc1 y observamos que presenta un fenotipo aditivo respecto a
los mutantes simples (Figura 18.B). Además, los niveles de fosforilación de la MAPK Sty1
después del estrés osmótico resultan también superiores en el doble mutante ∆srk1∆rnc1
(figura 18.C), confirmando que ambos genes actúan en vías independientes.
I.8 Rnc1 regula los niveles de mRNA de varios componentes de la ruta de la
SAPK
Corroborada la independencia funcional de ambos genes, y todavía en colaboración con
el laboratorio del Dr José Cansado, nos centramos en el estudio de Rnc1 como regulador
de Sty1.
Dado que Rnc1 es una proteína de unión a RNA, nos propusimos examinar los niveles de
mRNA de algunos componentes de la vía de la SAPK. Mediante northern blot, observamos
un incremento de los niveles de mRNA en ∆rnc1 respecto al wt de pyp2+ y wis1
+ (figura
19.A) y pyp1+ y atf1
+ (comunicación personal del Dr José Cansado). Comprobamos
también los niveles proteicos de estos elementos mediante western blot y confirmamos
que, efectivamente, hay más cantidad de proteína de las fusiones Pyp1-myc, Pyp2-myc y
Atf1-HA6H en el mutante ∆rnc1 respecto al control (figura 19.B). Así pues Rnc1 regula, de
manera directa o indirecta, los niveles de mRNA de distintos elementos de la vía de SAPK.
Resultados I 47
0 15 30 60 90 0 15 30 60 90
wt ∆rnc1
leu+
pyp2+
0,6M KCl
0 15 30 60 90 0 15 30 60 90
wt ∆rnc1
leu+
wis1+
0,6M KCl
0 15 30 60 90 0 15 30 60 90
atf1HA atf1HA∆rnc1
0,6M KCl
Atf1HA
A.
B.
Andrés Núñez, Dr J. Cansado
C.
min min
min
Figura 19. Niveles de mRNA y de proteína de pyp2+, wis1
+ y atf1
+. (A) Las cepas wt y Δrnc1 se
cultivaron en medio YES hasta la fase exponencial, se sometieron a 0,6M KCl y se recogieron células
a los tiempos indicados. Se procedió a la extracción de RNA y se detectaron mediante northern blot
los niveles de mRNA de pyp2+
y wis1+. Se utilizaron para la hibridación sondas marcadas con
32P
para pyp2+, wis1
+ y leu1
+ (como control de carga). (B) Las cepas atf1HA6H y atf1HA6H∆rnc1 se
cultivaron en medio YES, se sometieron a 0,6M KCl y se recogieron células a los tiempos indicados.
La proteína de fusión Atf1-HA6H se purificó con una matriz de Ni2+
-NTA-agarosa (Quiagen) y se
detectó mediante western blot con el anticuerpo anti-HA. (C) Detección de los niveles proteicos de
Pyp1-myc y Pyp2-myc. Experimento realizado por Andrés Núñez, en el laboratorio del Dr José
Cansado.
CAPÍTULO II
Papel de Cmk2 en la respuesta a arsenito
Resultados II 51
II.1 Especificidad de Cmk2 en la respuesta a distintos estreses
Dada la elevada especificidad de las respuestas celulares a distintos oxidantes, ninguno
de ellos es representativo del “estrés oxidativo” general. Así, con la finalidad de
profundizar en la caracterización de Cmk2 en esta respuesta, en primer lugar estudiamos
la sensibilidad del mutante ∆cmk2 tanto a distintos agentes pro-oxidantes como al
choque térmico, debido a la estrecha relación existente entre ambos estreses. Para ello,
realizamos ensayos de viabilidad en placa en presencia de H2O2 y t-BOOH (peróxidos), de
cadmio (metal), arsenito (metaloide), y de diamida (un oxidante específico de tioles), y a
37°C (estrés por temperatura). Utilizamos las cepas ∆sty1, ∆atf1 y ∆pap1 como controles,
dado que ya estaba descrita su sensibilidad a algunos de estos agentes. Observamos que
la deleción de cmk2+ provoca un defecto de crecimiento en presencia de NaAsO2, CdCl2 y
diamida pero no de H2O2 o t-BOOH ni a 37°C (figura 20). La deleción de sty1+ sí produce
sensibilidad a todos los estreses, y excepto para el choque térmico, también la del factor
de transcripción pap1+, como ha sido anteriormente descrito. La deleción de atf1
+ causa
un defecto de crecimiento en presencia de t-BOOH y especialmente de diamida.
Curiosamente, en nuestras manos la viabilidad de ∆atf1 no se ve afectada por H2O2 a la
concentración indicada, como había sido previamente descrito (sí que observamos una
ligera sensibilidad de este mutante a concentraciones más elevadas (datos no
mostrados).
1mM H2O2
2mM diamida
37°C0,2mM t-BOOH
wt
∆cmk2
∆sty1
∆atf1
∆pap1
0,25 NaAsO2 20µM CdCl2
YES
30µM CdCl2
wt
∆cmk2
∆sty1
∆atf1
∆pap1
Figura 20. Viabilidad celular en presencia de distintos estreses. Las cepas wt, Δcmk2, ΔSty1, ∆atf1
y Δpap1 se cultivaron en medio YES hasta la fase exponencial y se plaquearon diluciones que
contenían 104,10
3, 10
2 y 10
1 células en placas de YES suplementadas con 1mM H2O2, 0,2mM t-
BOOH, y 0,25mM NaAsO2, 20µM y 30µM CdCl2 y 2mM Diamida. Salvo la placa sometida a estrés
térmico que se incubó a 37°C, el resto se incubaron a 30°C durante 3 días antes de ser
fotografiadas.
52 Resultados II
A continuación, procedimos a analizar la activación de Cmk2 tras el tratamiento con los
distintos agentes. Se había descrito previamente cómo la fosforilación de Cmk2 por la
MAPK Sty1 podía detectarse por western blot con un retraso de movilidad electroforética
dependiente de la MAPK Sty1 (Sanchez-Piris et al, 2002). Así, en este trabajo analizamos
la aparición del retraso electroforético de la proteína de fusión Cmk2-HA en respuesta a
los agentes a los cuales la deleción de cmk2+ había resultado sensible (arsenito, cadmio y
diamida). Tanto en presencia de arsenito como de cadmio se da un claro retraso en la
movilidad electroforética de Cmk2, mientras que éste no se da con diamida (figura 21.A,
izquierda). Por otro lado, se produce un aumento en los niveles proteicos totales de Cmk2
tras el tratamiento con los tres agentes. En ausencia de sty1+ observamos que,
efectivamente, no se da el retraso en la movilidad electroforética de Cmk2-HA, ni
tampoco el incremento en los niveles proteicos (figura 21.A, derecha). A continuación nos
preguntamos si el incremento en los niveles proteicos se debía a la inducción
transcripcional de cmk2+. Detectamos mediante northern blot los niveles de mRNA de
cmk2+ y no observamos variaciones tras el tratamiento con arsenito (figura 21.B). Así
pues, la inducción de los niveles proteicos de Cmk2 por estos agentes debe darse a través
de una regulación post-transcripcional y de manera dependiente de la presencia de la
MAPK Sty1.
A.
Cmk2-HA
Cdc2
cmk2HA
Cmk2-HA
Cdc2
cmk2HA∆sty1 0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
cmk2HA cmk2HA∆sty1
un
idad
es
rela
tiva
s
Cmk2-HA CtlAsCdDiamida
B.
cmk2+
leu1+
0 15 60
0,3mM NaAsO2
wt
Figura 21. Niveles de Cmk2. (A) Las cepas cmk2HA y cmk2HA∆sty1
se cultivaron en medio YES hasta la fase exponencial y se trataron
con 0,6mM NaAsO2, 0,5mM CdCl2 y 4mM diamida durante 15
minutos. Se obtuvieron los extractos celulares y la fusión Cmk2-HA
se detecto mediante western blot con el anticuerpo anti-HA. Para el
control de carga se utilizó el anticuerpo anti-Cdc2. El gráfico
muestra la cuantificación de los niveles de Cmk2HA relativizados al
control de carga. (B) La cepa wt se cultivó en medio YES hasta la
fase exponencial y se trató con 0,3mM NaAsO2. Se recogieron
muestras a los tiempos indicados, se procedió a la extracción de
RNA y se detectaron mediante northern blot los niveles de mRNA
de cmk2+. Se utilizaron para la hibridación sondas marcadas con
32P
para cmk2+ y leu1
+ (como control de carga).
Resultados II 53
Analizando con mayor detalle las sensibilidades del mutante ∆cmk2 a los distintos
agentes, se observa que el defecto de crecimiento en presencia de arsenito es
comparable al de los mutantes ∆sty1 y ∆pap1, resultando sensible incluso a
concentraciones más bajas (figura 22.A). Sin embargo, en el caso del cadmio y la diamida,
son necesarias concentraciones muy elevadas, a las que ya ∆sty1 y ∆pap1 no crecen en
absoluto, para observar un efecto en ∆cmk2 (figura 20). Ello sugiere que Cmk2 debe jugar
un papel específico para la resistencia a arsenito, además de uno común para la
respuesta a cadmio y diamida.
Para evaluar la respuesta al estrés agudo por arsenito, llevamos a cabo un seguimiento de
la densidad óptica de cultivos líquidos. El mutante ∆cmk2 presenta un crecimiento menor
en presencia de arsenito respecto al wt (figura 22.B). Cabe comentar que en condiciones
normales, ∆cmk2 muestra una velocidad de crecimiento (inferida a través de la medición
de la densidad óptica) superior a la del wt. Esta observación es consistente con la
implicación de esta quinasa en la regulación de la progresión del ciclo celular (Alemany et
al, 2002).
B.
wt
Δcmk2
Δsty1
Δpap1
YES 0,15 mM NaAsO2A.
0,3
0,8
1,3
1,8
2,3
2,8
0 2 4 6
OD
tiempo (h)
Control
wt
Δcmk2
0,3
0,5
0,7
0,9
1,1
1,3
1,5
0 2 4 6
OD
tiempo (h)
0,6mM Na AsO2
wt
Δcmk2
Figura 22. Viabilidad del mutante ∆cmk2 en presencia de arsenito. (A) Las cepas wt, Δcmk2,
ΔSty1 y Δpap1 se cultivaron en medio YES hasta la fase exponencial y se plaquearon diluciones que
contenían 104,10
3, 10
2 y 10
1 células en placas de YES suplementadas con 0,15mM NaAsO2. (B) Las
cepas wt y Δcmk2 se cultivaron en medio YES hasta una ODλ595 de 0,3 y se determinó la densidad
óptica durante 6 horas en el cultivo tratado con 0,6mM NaAsO2 y en el control sin tratar.
La sensibilidad del mutante ∆cmk2 podría deberse a un efecto secundario de la deleción y
que la quinasa Cmk2 no jugase un papel específico en la respuesta a arsenito. Para
descartar esta posibilidad, realizamos un experimento de rescate transformando en las
cepas wt y ∆cmk2 el plásmido pREP41-cmk2HA+. Este plásmido expresa la fusión cmk2HA
54 Resultados II
bajo el control del promotor regulado por tiamina nmt41, que permite obtener unos
niveles lo más parecidos a los endógenos. Ambas cepas se cultivaron en medio mínimo
sin tiamina durante 17 horas y se sembraron en placas para evaluar la viabilidad en
presencia de arsenito. En la figura 23.A se muestra que la reintroducción de cmk2+ es
capaz de revertir la sensibilidad a arsenito del mutante ∆cmk2, confirmando que Cmk2 sí
debe jugar un papel específico en la respuesta al metaloide.
Por otro lado, con el fin de estudiar qué efecto tenía en la tolerancia al arsenito la
sobreexpresión de cmk2+, se utilizó el mismo plásmido anterior pero con la versión
fuerte del promotor (pREP1-cmk2HA+), para obtener niveles superiores de expresión. Con
este experimento observamos que la sobreexpresión de cmk2+ confiere resistencia al
arsenito en una cepa wt (figura 23.B), confirmando que probablemente Cmk2 juegue un
papel específico en la respuesta a este agente. Asimismo, la sobreexpresión de cmk2+
revierte la letalidad del mutante ∆sty1, lo que sugiere que el papel de Sty1 en la
respuesta a arsenito estaría, al menos en gran parte, mediado por Cmk2.
En conjunto, estos resultados indican que la quinasa Cmk2 tiene una función en la
respuesta a cadmio, arsenito y diamida (todos ellos agentes de elevada reactividad con
grupos sulfidrilo y que producen la depleción de glutatión), y que juega un papel más
relevante específicamente en la resistencia al arsenito.
wt pREP41
Δcmk2 pREP41
Δcmk2 pREP41cmk2
EMM 0,2mM NaAsO2A.
B.
Cdc2
Cmk2HA
pREP1
pREP1cmk2
pREP1
pREP1cmk2
EMM 0,2mM
NaAsO2
0,3mM
wt
Δsty1
Figura 23. Efecto de la sobreexpresión de Cmk2 en la tolerancia al arsenito. (A) Las cepas wt (1) y
Δcmk2 (2 y 3) transformadas con el plásmido pREP41cmk2-HA+(3) o con el plásmido vacío como
control (1 y 2), se cultivaron en EMM sin tiamina durante 17 horas y se plaquearon diluciones que
contenían 104,10
3, 10
2 y 10
1 células en placas de EMM suplementadas con 0,2mM NaAsO2. Al mismo
tiempo se recogieron células para la extracción de proteína y determinación mediante western blot
de los niveles proteicos de Cmk2HA, utilizando el anticuerpo anti-HA. Para el control de carga se usó
el anti-cdc2. (B) Las cepas wt y Δsty1 transformadas con el plásmido pREP1cmk2-HA+ o con el
plásmido vacío como control, se cultivaron en EMM sin tiamina durante 17 horas y se plaquearon
diluciones que contenían 104,10
3, 10
2 y 10
1 células en placas de EMM suplementadas con 0,2mM y
0,3mM NaAsO2. Las placas se incubaron a 30°C durante 3 días antes de ser fotografiadas.
Resultados II 55
II.2 Cmk2 afecta a la activación de Sty1 por arsenito
La activación de la MAPK Sty1 por fosforilación es esencial para la respuesta a un amplio
rango de insultos ambientales. Por ello, un defecto en esta activación conlleva problemas
de viabilidad en presencia de estos estreses. Así, quisimos comprobar si la activación de
Sty1 se daba correctamente en ∆cmk2 en respuesta a distintos agentes. Con tal fin,
analizamos mediante western blot la cinética de fosforilación de Sty1 de las cepas wt y
∆cmk2 en presencia de NaAsO2, CdCl2, diamida, H2O2 y a 42°C (figura 24.A).
0,6mM NaAsO2
0 15 30 60 90
wt Δcmk2
P-Sty1
Cdc2
0 15 30 60 90
A.
2mM H2O2
0 15 30 60 90
wt Δcmk2
P-Sty1
Cdc2
0 15 30 60 90
0,5mM CdCl2
0 15 30 60 90
wt Δcmk2
P-Sty1
Cdc2
0 15 30 60 90
42°C
0 15 30 60 90
wt Δcmk2
P-Sty1
Cdc2
0 15 30 60 90
2mM Diamida
0 15 30 60 90
wt Δcmk2
P-Sty1
Cdc2
0 15 30 60 90
P-Sty1
Cdc24mM 0,3mM
min min
minmin
min
17 20
pREP41cmk2HA
17 20
pREP41cmk2HA
pR
EP4
1
Control NaAsO2
P-Sty1
Cdc2
Cmk2HA
pR
EP4
1
B.
Figura 24. Efecto de cmk2+ en la cinética de
fosforilación de Sty1 en presencia de distintos
estreses. (A) Las cepas wt y Δcmk2 se cultivaron en
medio YES hasta la fase exponencial y se sometieron a
los estreses indicados. Se recogieron células a los
tiempos indicados. (B) Las cepas wt y Δcmk2
transformadas con el plásmido pREP41cmk-HA+ o con
el plásmido vacío como control, se cultivaron en EMM
sin tiamina durante 17 y 20 horas. Se recogieron sin
tratar o bien tratadas 15 minutos con 0,3mM NaAsO2.
(A y B) La fosforilación de Sty1 se detectó mediante
western blot con el anticuerpo anti-P-p38 y la fusión
Cmk2-HA con el anticuerpo anti-HA. Para el control de
carga se utilizó el anticuerpo anti-Cdc2.
56 Resultados II
Observamos que no existen diferencias en la cinética de fosforilación de Sty1 entre
ambas cepas tras el tratamiento con cadmio, peróxido de hidrógeno ni a 42°C
Sorprendentemente, no se observó fosforilación de Sty1 en presencia de diamida a esta
concentración, ni tampoco a concentraciones más elevadas, de 4mM, aunque la deleción
de sty1+ si es sensible a la presencia de diamida. La no fosforilación de Sty1 en presencia
de diamida es consistente con la no aparición del retraso electroforético de Cmk2 en
estas condiciones. La fosforilación de la MAPK sí que resultó estar afectada en respuesta
a arsenito en ∆cmk2, donde se encuentra incrementada. Este efecto se observa también
a concentraciones menores (desde 0,2mM (datos no mostrados)).
Complementariamente, nos planteamos evaluar el efecto que la sobreexpresión de cmk2+
tendría en la fosforilación de Sty1. Para ello se transformó la cepa wt con el plásmido
pREP41-cmk2HA+, y su control (vacío) y se cultivó en medio mínimo sin tiamina durante
17 y 20 horas. En ese momento se sometieron los cultivos a un estrés de 15 minutos con
0,3mM NaAsO2 y se cogieron muestras para detectar por western blot la fosforilación de
Sty1. En la figura 24.B se observa cómo el exceso de Cmk2 previene la fosforilación de
Sty1 por la presencia de arsenito.
La mayor fosforilación de la MAPK Sty1 en presencia de arsenito en ∆cmk2 podría sugerir
un defecto en la respuesta de adaptación. Para comprobar si la fosforilación observada se
traducía realmente en actividad, analizamos la respuesta transcripcional dependiente de
Sty1 y el factor de transcripción Atf1 para el caso del arsenito. Los niveles de mRNA de los
genes de la CESR pyp2+, ctt1
+ y gpx1
+ se detectaron por northern blot. Observamos por un
lado, que efectivamente se da una inducción de estos genes también en respuesta a
arsenito, y por el otro, que se encuentra incrementada en ∆cmk2 (figura 25.A). El
aumento en los niveles de mRNA se corresponde a la vez con un incremento en los
niveles proteicos (detectados por western blot en la figura 25.B). Como en el caso de la
fosforilación de Sty1, en el experimento de sobreexpresión observamos cómo los niveles
de mRNA de los genes diana de Sty1/Atf1 no se inducen tras el tratamiento con arsenito
(figura 25.C). Analizamos también la respuesta al estrés por cadmio, y en este caso, igual
que para la fosforilación de Sty1, no observamos diferencias en la inducción de estos
genes entre las cepas wt y ∆cmk2 (figura 25.D).
Así pues, en conjunto, estos datos indican que la activación de la MAPK Sty1, así como la
respuesta transcripcional que depende de ella, se encuentra incrementada en ∆cmk2
específicamente en respuesta a arsenito. A pesar de resultar también sensible a la
presencia de cadmio, la deleción de cmk2+ no tiene un efecto en la actividad de Sty1 en
estas condiciones. Además, estos resultados refuerzan la idea de que la transcripción
dependiente de Sty1 no debe jugar un papel muy relevante en la respuesta a arsenito
(como sugiere la no sensibilidad de ∆atf1 a este agente (figura 20)).
Resultados II 57
control NaAsO2
ctt1+
gpx1+
leu1+
C.
pyp2+
gpx1+
ctt1+
leu1+
wt Δcmk2
0 15 30 600 15 30 60
0,3mM NaAsO2
A.
min
0 15 30 60 90 120
pyp2myc pyp2myc Δcmk2
0 15 30 60 90 120
Pyp2myc
P-Sty1
Cdc2
0,3mM NaAsO2
B.
min
0
0,5
1
1,5
2
0 20 40 60
un
idad
es
rela
tiva
s
tiempo (min) 0,3mM NaAsO2
pyp2+
wt
Δcmk2
0
0,5
1
1,5
2
0 20 40 60
un
idad
es
rela
tiva
s
tiempo (min) 0,3mM NaAsO2
gpx1+
wt
Δcmk2
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 20 40 60
un
idad
es
rela
tiva
s
tiempo (min) 0,3mM NaAsO2
ctt1+
wt
Δcmk2
pyp2+
gpx1+
ctt1+
leu1+
minwt Δcmk2
0 15 600 15 60
D.
0,5mM CdCl2
Figura 25. Efecto de Cmk2 en la expresión de genes de la CESR Sty1-Atf1 dependientes. (A) Las cepas
wt y Δcmk2 se cultivaron en medio YES hasta la fase exponencial y se trataron con 0,3mM NaAsO2. A
los tiempos indicados se recogieron las células. Se procedió a la extracción de RNA para detectar
mediante northern blot los niveles de mRNA de los genes indicados. Se utilizaron para la hibridación
sondas marcadas con 32
P para pyp2+, gpx1
+, ctt1
+ y leu1
+ (como control de carga). Los gráficos
muestran la media de la cuantificación de los niveles de mRNA de pyp2+, gpx1
+ y ctt1
+ relativizados al
control de carga de dos experimentos independientes. (B) Las cepas pyp2myc y pyp2mycΔcmk2 se
cultivaron en medio YES hasta la fase exponencial y se trataron con 0,3mM NaAsO2. Se recogieron
células a los tiempos indicados y la fusión Pyp2-myc, la fosforilación de Sty1 y Cdc2 (control de carga)
se detectaron con los anticuerpos anti-myc, anti-P-p38 y anti-cdc2, respectivamente. (C) Las cepas wt
y Δcmk2 transformadas con el plásmido pREP41cmk2-HA+ o con el plásmido vacío como control, se
cultivaron en EMM sin tiamina durante 20 horas. Se recogieron sin tratar o bien tratadas 15 minutos
con 0,3mM NaAsO2 y se procesaron como en A. (D) Las cepas wt y Δcmk2 se cultivaron en medio YES
hasta la fase exponencial, se trataron con 0,5mM CdCl2 y se procesaron como en A.
58 Resultados II
II.3 La función de Cmk2 en la respuesta a arsenito es independiente de la de
Pap1
La transcripción dependiente de Atf1 no parece tener un papel importante en la
resistencia a arsenito, sin embargo, otro factor de transcripción, Pap1, ha sido
involucrado en la resistencia a este metaloide (Rodriguez-Gabriel y Russell, 2005) figura
20). Con la finalidad de investigar si la función de Cmk2 en la respuesta a arsenito podría
estar relacionada con la de Pap1, llevamos a cabo estudios de epistasia. La sensibilidad al
arsenito del doble mutante ∆cmk2∆pap1 se agrava drásticamente respecto a la de los
mutantes sencillos. El mismo experimento se realizó con el doble mutante ∆cmk2∆sty1, y
en este caso no observamos un aumento en la sensibilidad de ∆sty1 al delecionar cmk2+
(figura 26.A). Estos resultados indican que la función de Cmk2 ante el estrés por arsenito
es independiente de la de Pap1, pero forma parte de la misma vía que Sty1.
Por otra parte, nos preguntamos qué efecto tendría en la activación de Sty1 por arsenito
la deleción de pap1+ y la deleción simultánea de cmk2
+ en ésta. Para ello tratamos las
cepas con las deleciones sencillas y la doble con arsenito y analizamos la fosforilación de
Sty1 por western blot. El resultado nos muestra cómo, por un lado, la deleción de pap1+
también causa un incremento en la fosforilación de Sty1 y, por otro, que este incremento
se ve agravado en el doble mutante (figura 26.B). Otra vez los efectos de Pap1 y Cmk2 en
este fenotipo resultan aditivos, confirmando la independencia de ambas proteínas en la
respuesta a arsenito.
Además, procedimos a analizar la inducción transcripcional dependiente de Pap1 en
∆cmk2 mediante la detección de los niveles de mRNA de uno de sus genes diana, trr1+,
por northern blot. El resultado de la figura 26.C muestra cómo esta respuesta no se ve
afectada por la ausencia de Cmk2, y, si acaso, está también ligeramente aumentada. Estas
observaciones demuestran la independencia funcional de ambos genes y descartan que
Cmk2 pueda actuar en la vía de Pap1 en respuesta a arsenito.
Figura 26. Análisis de la interacción genética de cmk2+ y pap1
+. (A) Viabilidad celular en presencia
de NaAsO2. Las cepas wt, Δcmk2, ΔSty1, Δpap1, Δsty1Δcmk2 y Δpap1Δcmk2 se cultivaron en medio
YES hasta la fase exponencial y se plaquearon diluciones que contenían 104,10
3, 10
2 y 10
1 células en
placas de YES suplementadas con 0,1 y 0,2mM NaAsO2. Las placas se incubaron a 30°C durante 3
días antes de ser fotografiadas. (B) Fosforilación de Sty1. Las cepas wt, Δcmk2, Δpap1 y
Δpap1Δcmk2 se cultivaron en medio YES hasta la fase exponencial y se trataron con 0,3mM
NaAsO2. Se recogieron las células a los tiempos indicados y se detectó la fosforilación de Sty1, los
niveles totales de Sty1 y Cdc2 (control de carga) con los anticuerpos anti-P-p38, anti-Hog1 i anti-
Cdc2 respectivamente. El gráfico muestra la cuantificación de los niveles de fosforilación de Sty1
relativizados al control de carga de un experimento representativo. (C) Las cepas wt y Δcmk2 se
cultivaron en medio YES hasta la fase exponencial y se sometieron a 0,3mM NaAsO2. Se recogieron
células a los tiempos indicados. Tras la extracción de RNA, se llevó a cabo un northern blot
utilizando para la hibridación sondas marcadas con 32
P para trr1+ y leu1
+ (como control de carga).
En el gráfico se representa la media de la cuantificación de los niveles de trr1+ relativizados al
control de carga de dos experimentos independientes.
Resultados II 59
0
0,5
1
1,5
2
0 10 20 30
un
idad
es
rela
tiva
s
tiempo (min) 0,3mM NaAsO2
P-Sty1
wt
Δcmk2
Δpap1
Δcmk2Δpap1
A.
B.
NaAsO2
wt
Δcmk2
Δsty1
Δpap1
Δsty1Δcmk2
Δpap1Δcmk2
control 0,1mM 0,2mM
C.
0 15 30 0 15 30 0 15 30 0 15 30
wt Δcmk2 Δpap1
Δpap1
Δcmk2
P-Sty1
Cdc2
0,3mM NaAsO2
Sty1
min
trr1+
leu1+
0,3mM NaAsO2
wt Δcmk2
0 15 30 600 15 30 60min
0
0,5
1
1,5
2
0 20 40 60
un
idad
es
rela
tiva
s
tiempo (min) 0,3mM NaAsO2
trr1+
wt
Δcmk2
II.4 Papel del glutatión en la respuesta a arsenito y relación con Cmk2
Los mecanismos celulares de detoxificación de metales y metaloides como el arsenito
requieren en gran medida del antioxidante glutatión, que es necesario para: i) quelar y
transportar el metal a la vacuola (Ghosh et al, 1999); ii) proteger de la oxidación causada
por el metal, como principal tampón antioxidante de la célula (Grant, 2001) y; iii) unirse a
los grupos sulfidrilo reactivos presentes en las proteínas (glutationización),
protegiéndolos de la unión irreversible del metal (Pompella et al, 2003).
Un mecanismo de toxicidad de los metales es la depleción del glutatión (Stohs y Bagchi,
1995). Para hacer frente al daño provocado por arsenito, las células de S. cerevisiae
ajustan los niveles de glutatión induciendo la síntesis del mismo (Thorsen et al, 2007).
Así, nos planteamos abordar el estudio del papel del glutatión en la respuesta a arsenito
en S. pombe, y su posible relación con la quinasa Cmk2. En primer lugar, analizamos el
efecto de la adición de glutatión en la viabilidad celular en placas con arsenito. El
glutatión mejora el crecimiento del mutante ∆cmk2 en presencia de arsenito (figura
27.A). Con la finalidad de observar con mayor detalle este efecto, realizamos el
60 Resultados II
experimento en líquido midiendo la densidad óptica de cultivos wt y ∆cmk2 tratados con
arsenito, glutatión o ambos. El glutatión no afecta significativamente el crecimiento
normal de los cultivos. Por el contrario, sí que mejora el crecimiento en presencia de
arsenito tanto en ∆cmk2 como en wt (figura 27.B).
wt
Δcmk2
YES 50μg/ml GSH 0,2mM NaAsO2 NaAsO2+GSHA.
B.
C.
P-Sty1
cdc2
1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
basal H2O2 NaAsO2
wt Δcmk2
basal H2O2 NaAsO2
1: control 2: glutatión
0,3
0,8
1,3
1,8
2,3
2,8
0 2 4 6
OD
tiempo (h)
0,3mM NaAsO2
wt
wt + GSH
Δcmk2
Δcmk2 + GSH
0,3
0,8
1,3
1,8
2,3
2,8
0 2 4 6
OD
tiempo (h)
control
wt
wt + GSH
Δcmk2
Δcmk2 + GSH
0
0,5
1
1,5
2
2,5
ctl GSH ctl GSH
peróxido arsenito
un
idad
es
rela
tiva
s
P-Sty1
wt
Δcmk2
Figura 27. Efecto del glutatión. (A) Las cepas wt y Δcmk2 se cultivaron en medio YES hasta la fase
exponencial y se plaquearon diluciones que contenían 104,10
3, 10
2 y 10
1 células en placas de YES
suplementadas con 50µg/ml GSH y/o 0,2mM NaAsO2. Las placas se incubaron a 30°C durante 3 días
antes de ser fotografiadas. (B) Las cepas wt y Δcmk2 se cultivaron en medio YES hasta una ODλ595 de
0,3 y se determinó la densidad óptica durante 6 horas en el cultivo tratado con 50µg/ml GSH y/o
0,3mM NaAsO2. (C) Las cepas wt y Δcmk2 se cultivaron en medio YES suplementado o no con
50µg/ml GSH hasta la fase exponencial y se trataron 15 minutos con 1mM H2O2 y 0,3mM NaAsO2.
La fosforilación de Sty1 se detecto por western blot con el anticuerpo anti-P-p38. Se usó como
control de carga anti-cdc2. El gráfico representa la media de la cuantificación de la fosforilación de
Sty1 relativizada al control de carga.
Por otro lado, decidimos analizar cómo influía el glutatión en la activación de la MAPK
Sty1 por arsenito. En la figura 27.C observamos que el tratamiento con glutatión previene
la activación de Sty1 por arsenito, pero no por H2O2, sugiriendo un papel relevante del
glutatión en la respuesta específica a arsenito. Para ∆cmk2 observamos un
Resultados II 61
comportamiento paralelo al del crecimiento: el glutatión reduce la activación de Sty1
también en el mutante pero no hasta los niveles que lo hace en el wt.
Estos resultados confirman la importancia del glutatión en la respuesta a arsenito, a pesar
de que no nos permiten concluir sobre una posible relación con Cmk2. No obstante, si
retomamos el resultado del primer apartado en el que la sobreexpresión de Cmk2
previene la activación de Sty1 por arsenito (figura 24.B) (como acabamos de ver que lo
hace el glutatión), podríamos plantearnos que Cmk2 regule los niveles de glutatión.
II.5 La función de Cmk2 en la respuesta a arsenito es independiente de la de
Zip1
La inducción de la síntesis de glutatión en respuesta a estrés ha sido descrita en S. pombe
para el caso del cadmio. En presencia de este metal, el factor de transcripción Zip1 se
estabiliza e induce la expresión de genes implicados en la síntesis del glutatión (figura 28).
En condiciones normales, la ubiquitinización de Zip1 induce su constante degradación en
el proteasoma de manera dependiente de Pof1. El cadmio induce la fosforilación y la
estabilización de Zip1, pero se desconocen los elementos implicados en esta regulación
(Harrison et al, 2005). El mutante de Zip1 es sensible también a arsenito pero no a
peróxido de hidrógeno (Rodriguez-Gabriel y Russell, 2005).
Figura 28. Vía de síntesis del glutatión en S. pombe. Las enzimas cuya inducción transcripcional
tras el tratamiento con cadmio es dependiente de Zip1 se encuentran subrayadas (Baudouin-
Cornu y Labarre, 2006).
62 Resultados II
Dado que este último comportamiento es paralelo al que en este trabajo hemos
observado para ∆cmk2 y que el glutatión rescata parcialmente la sensibilidad de ∆cmk2 a
arsenito (figura 27.A), decidimos evaluar la posible relación entre Cmk2 y Zip1.
En primer lugar, quisimos analizar la estabilización de Zip1 en respuesta arsenito y el
efecto que Cmk2 pudiera tener en ésta. Para ello, detectamos los niveles de la fusión
Zip1HA mediante western blot. Observamos, por un lado, que también ante el estrés por
arsenito se produce la estabilización de Zip1, como en el caso del cadmio. Por otro lado,
esta estabilización es mayor en ∆cmk2 que en wt tras el tratamiento con arsenito, aunque
la deleción de cmk2+ no afecta los niveles de Zip1 en condiciones normales (figura 29.A).
De acuerdo con la mayor presencia de Zip1 en el mutante, la expresión de dos de sus
genes diana implicados en la síntesis de glutatión (SPAC869.05c+, un transportador de
sulfato y cys2+, la cistationina γ-sintasa, (figura 28)) detectada por northern blot, resulta
también incrementada respecto al wt (figura 29.B). La inducción de estos genes es
totalmente dependiente de Zip1, porque no se aprecia su expresión en el mutante ∆zip1.
Como se ha mostrado anteriormente, la deleción de cmk2+
produce una mayor actividad
de la MAPK Sty1 en respuesta a arsenito (figuras 24 y 25). Puesto que se desconoce el
responsable de regular a Zip1 en respuesta a estrés, nos preguntamos si la mayor
activación de Zip1 en ∆cmk2 podría deberse al incremento observado en la fosforilación
de Sty1 en las mismas condiciones. Con tal fin, analizamos la inducción de los genes
diana de Zip1 en ∆sty1 y comprobamos que no se veía afectada (figura 29.B), indicando
que Sty1 no regula la actividad de Zip1 en respuesta a arsenito.
Por otro lado, nos planteamos estudiar si la ausencia de cmk2+ causaba el mismo efecto
en respuesta a cadmio. Repetimos los experimentos anteriores en presencia de cadmio y
observamos que en estas condiciones no había un incremento en la estabilización de Zip1
(figura 29.C) ni en la inducción de sus genes diana en ∆cmk2 (figura 29.D), sugiriendo otra
vez que el efecto de Cmk2 es específico de la respuesta a arsenito.
Finalmente, realizamos el experimento de epistasia con el mutante doble sup9+∆cmk2 (el
mutante sup9 presenta un STOP prematuro en zip1+ (Harrison et al, 2005)). Ensayamos la
sensibilidad en presencia de arsenito en placa y observamos que el mutante doble
presenta una sensibilidad agravada respecto a los sencillos, indicando la independencia
funcional de ambos genes en la respuesta a arsenito (figura 29.E).
En conjunto, estos resultados apuntan a que Cmk2 no actúa en la misma ruta que Zip1.
Además, aportan la evidencia de otra vía de respuesta a arsenito que también se
encuentra más activada en ∆cmk2, sugiriendo que estas células deben estar, de algún
modo, más sensibilizadas a la presencia de este metaloide.
Resultados II 63
A.
B.
E. 50μM 150μM 200μMYESNaAsO2
wt
ΔSty1
Δcmk2
sup9
sup9Δcmk2
0,3mM NaAsO2
zip1HAΔcmk2
0 15 30 60 90
zip1HA
Zip1HA
Cdc2
0 15 30 60 90min
SPAC869.05c+
cys2+
leu1+
wt Δsty1 Δcmk2
0 15 600 15 60
Δzip1
0 15 60
0,3mM NaAsO2
0 15 60min
0,5mM CdCl2
0 15 30 60 90
zip1HA
Zip1HA
Cdc2
0 15 30 60 90
zip1HAΔcmk2C.
min
D.
0,5mM CdCl2
wt Δcmk2
0 15 60 0 15 60
SPAC869.05c+
cys2+
leu1+
min
0
1
2
3
4
5
6
0 20 40 60
un
idad
es
rela
tiva
s
tiempo (min) 0,3mM NaAsO2
SPAC869.05c+
wt
Δcmk2
Δsty1
0
1
2
3
4
0 20 40 60
un
idad
es
rela
tiva
s
tiempo (min) 0,3mM NaAsO2
cys+
wt
Δcmk2
Δsty1
Figura 29. Análisis de la interacción genética de cmk2+ y zip1
+. (A y C) Efecto de cmk2
+ en los
niveles proteicos de Zip1. Las cepas zip1HA y zip1HAΔcmk2 se cultivaron en medio YES hasta la fase
exponencial, se trataron con 0,3mM NaAsO2 (A) o 0,5mM CdCl2 (C) y se recogieron células a los
tiempos indicados. Se detectó la fusión Zip1-HA con el anticuerpo anti-HA y se utilizó como control
de carga el anti-Cdc2. (B y D) Efecto de cmk2+ en la expresión de dianas de Zip1. Se cultivaron las
cepas wt, Δcmk2, Δzip1 y Δsty1 en medio YES hasta la fase exponencial, se trataron con 0,3mM
NaAsO2 (B) o 0,5mM CdCl2 (D) y se recogieron las células a los tiempos indicados. Se procedió a la
extracción de RNA para detectar mediante northern blot los niveles de mRNA de los genes
indicados. Se utilizaron para la hibridación sondas marcadas con 32
P para SPAC869.05c+, cys2
+ y
leu1+ (como control de carga). En los gráficos se representa el promedio de la cuantificación de los
niveles de SPAC869.05c+ y cys2
+ relativizados al control de carga de dos experimentos
independientes. (E) Viabilidad celular en presencia de NaAsO2. Las cepas wt, Δcmk2, Δsty1, sup9,
sup9Δcmk2 se cultivaron en medio YES hasta la fase exponencial y se plaquearon diluciones que
contenían 104,10
3, 10
2 y 10
1 células en placas de YES suplementadas con 50µM, 150µM y 200µM
NaAsO2. Las placas se incubaron a 30°C durante 3 días antes de ser fotografiadas
64 Resultados II
II.6 Posible efecto de Cmk2 en el transporte de arsenito
La ausencia de cmk2+ causa un incremento en la activación de Sty1, y una mayor
inducción de los efectores de Zip1 y quizá también de Pap1 en la respuesta específica a
arsenito. Estas observaciones nos llevaron a hipotetizar que el transporte de este
metaloide pudiera estar afectado en ∆cmk2. Una mayor entrada o una disminución de la
salida de arsenito de la célula que produjera un incremento en la concentración
intracelular del metaloide podría explicar la mayor activación de estas vías así como la
sensibilidad de ∆cmk2 en presencia de arsenito.
En S. pombe no se ha descrito ninguno de los elementos implicados en el transporte de
arsenito. El transporte de este metaloide a través de acuagliceroporinas se encuentra
conservado desde las células procariotas hasta las eucariotas superiores (figura 7). En S.
cerevisiae la acuagliceroporina Fps1 es la principal ruta de entrada de arsenito a la célula
(Wysocki et al, 2001) y se ha descrito que, en respuesta a arsenito, es regulada por la
MAPK Hog1 para impedir la entrada de dicho metaloide (Thorsen et al, 2006). Dada la
elevada similitud química entre el arsenito y el antimonito, las acuagliceroporinas son
capaces de transportar también este último.
Como primera aproximación para determinar si este proceso estaba regulado por Cmk2,
analizamos la respuesta de ∆cmk2 al estrés por antimonito, asumiendo que si el
transporte por la acuagliceroporina estuviese afectado, la presencia de antimonito
tendría el mismo efecto que la del arsenito. Así, por un lado testamos la sensibilidad en
placa en presencia de antimonito y observamos cómo efectivamente, ∆cmk2 presentaba
un defecto de crecimiento en estas condiciones (figura 30.A). Consistentemente, también
∆sty1 es sensible a la presencia de antimonito, y sin embargo ∆pap1 no lo es. Tampoco
∆atf1, igual que en el caso del arsenito y el cadmio.
wt
Δcmk2
Δsty1
Δatf1
Δpap1
YES 1mM SbCl3A. B.
0 15 30 60 0 15 30 60
wt Δcmk2
P-Sty1
Cdc2
1mM SbCl3
min
Figura 30. Respuesta a antimonio en Δcmk2. (A) Viabilidad celular en presencia de antimonito. Las
cepas wt, Δcmk2, ΔSty1, ∆atf1 y Δpap1 se cultivaron en medio YES hasta la fase exponencial y se
plaquearon diluciones que contenían 104,10
3, 10
2 y 10
1 células en placas de YES suplementadas con
1mM SbCl3. Las placas se incubaron a 30°C durante 3 días antes de ser fotografiadas. (B) La
fosforilación de Sty1 en las cepas wt y Δcmk2, tratadas con 1mM SbCl3 y recogidas a los tiempos
indicados, se detectó mediante western blot con el anticuerpo anti-P-p38. Para el control de carga
se utilizó el anti-cdc2.
Resultados II 65
Por otro lado, quisimos comprobar si la activación de Sty1 por antimonito se veía
incrementada en ∆cmk2, como esperaríamos si el transportador de los metaloides
estuviera afectado en este mutante. Detectamos la fosforilación de Sty1 por western blot
tras someter los cultivos a estrés por antimonito, y corroboramos que en ∆cmk2 estaba
incrementada (figura 30.B). Estos resultados son compatibles con la idea de una posible
desregulación del transporte de arsenito y antimonito en ausencia de Cmk2.
Ninguna acuagliceroporina ha sido identificada en S. pombe. En este trabajo, se buscó la
posible homóloga a Fps1 (de S. cerevisiae) y se ha hallado la pauta de lectura huérfana
SPAC977.17 como la putativa acuagliceroporina de S. pombe, (según la base de datos
HomoloGene). Haciendo uso del programa bioinformático de predicción de dominios
Pfam, comprobamos que ambas proteínas contenían el dominio MIP (Major Intrinsic
Protein) común a los canales con la propiedad de transportar agua y solutos neutros
pequeños. La base de datos Uniprot nos proporcionó la información de los fragmentos
transmembrana, citosólicos y extracelulares predichos para ambas secuencias. Con estos
datos elaboramos el esquema representativo de los dominios de SPAC977.17 y FPS1
(figura 31.A). El alineamiento de los dominios MIP de las dos proteínas, dio un 53% de
similitud (Pairwise Sequence Alignment).
Con el fin de determinar si SPAC977.17 realmente jugaba un papel en el transporte de
arsenito, analizamos el fenotipo que causaba la deleción de éste en presencia del
metaloide. La viabilidad del mutante no se vio afectada en presencia de arsenito (figura
31.B), al contrario que en S. cerevisiae, dónde la deleción de fps1+ confiere resistencia al
metaloide ya que impide su entrada a la célula. No obstante, en S. pombe a
concentraciones muy elevadas, ∆SPAC977.17 no sólo no es más resistente que el wt sino
que resulta más sensible. Las acuagliceroporinas son canales bidireccionales y ha sido
descrito también que pueden exportar los metaloides fuera de la célula (Maciaszczyk-
Dziubinska et al, 2010). La sensibilidad de ∆SPAC977.17 a elevadas concentraciones
sugiere que en estas condiciones pueda actuar como canal de salida de arsenito.
Por otro lado, si SPAC977.17 mediara la entrada de arsenito a la célula, en su ausencia, la
activación de Sty1 tras el tratamiento con arsenito debería ser menor. Así, analizamos la
fosforilación de Sty1 por western blot en ∆SPAC977.17 y observamos que efectivamente
ésta era menor (figura 31.C), confirmando que sí debe tratarse de una vía de entrada de
arsenito a la célula, aunque no de la única, pues a concentraciones muy elevadas, acaba
resultando sensible, probablemente por la entrada a través de otras vías.
Con el fin de investigar la posible relación entre el canal y la quinasa Cmk2, realizamos
experimentos de epistasia con el mutante doble ∆SPAC977.17∆cmk2. La deleción del
putativo transportador en ∆cmk2 no cambió la sensibilidad de éste en presencia de
arsenito (figura 31.B). El análisis de la activación de Sty1 en este mutante nos mostró
cómo el mutante doble presentaba un fenotipo intermedio entre el de los mutantes
66 Resultados II
sencillos (figura 31.C). En conjunto, estos datos apuntan a que el fenotipo de la ausencia
de Cmk2 no se debe a la regulación del putativo canal SPAC977.17.
A.
P-Sty1
B.
CitosólicoTransmembrana
ExtracelularDominio MIP
SPAC977.17 (S. pombe)
FPS1 (S. erevisiae)
C.
YES 0,2mM 0,4mM 0,8mM
wt
Δcmk2
ΔSAPC977.17
∆cmk2∆SPAC977.17
NaAsO2
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
un
idad
es
rela
tiva
s
P-Sty1
0 15 30 0 15 30 0 15 30 0 15 30
wt Δcmk2 Δ977.17Δ977.17
Δcmk2
Cdc2
0,3mM NaAsO2
min
Figura 31. Respuesta a arsenito en ∆SPAC977.17. (A) Esquema representativo de las proteínas
SPAC977.17 y Fps1. (B) Las cepas wt, Δcmk2, ∆SPAC977.17 y Δcmk2∆SPAC977.17 se cultivaron en
medio YES hasta la fase exponencial y se plaquearon diluciones que contenían 104,10
3, 10
2 y 10
1
células en placas de YES suplementadas con 0,2mM, 0,4mM y 0,8mM NaAsO2. Las placas se
incubaron a 30°C durante 3 días antes de ser fotografiadas. (C) Fosforilación de Sty1. Las cepas wt,
Δcmk2, ∆SPAC977.17 y Δcmk2∆SPAC977.17 se cultivaron en medio YES hasta la fase exponencial y
se trataron con 0,3mM NaAsO2. Se recogieron las células a los tiempos indicados y se detectó la
fosforilación de Sty1 y los niveles de Cdc2 (control de carga) con los anticuerpos anti-P-p38 i anti-
Cdc2 respectivamente. El gráfico muestra la cuantificación de los niveles de fosforilación de Sty1
relativizados al control de carga de un experimento representativo.
DISCUSIÓN
CAPÍTULO I
Regulación de la MAPK Sty1 en la respuesta a estrés osmótico:
papel de la quinasa Srk1 y la proteína de unión a RNA Rnc1
Discusión I 71
Las vías de señalización de las MAPKs son elementos esenciales de las células
eucariotas para la detección y la respuesta a cambios extracelulares. Las SAPKs (Stress
Activated Protein Kinases) son cruciales para la supervivencia ante condiciones adversas
que generan un estrés fisiológico. Unos sensores detectan los cambios externos y
transmiten el estímulo a las SAPKs, que activan un amplio rango de sustratos encargados
de efectuar una respuesta para la supervivencia y adaptación celular a las nuevas
condiciones. Esta respuesta comprende principalmente la reprogramación de la
expresión génica, así como la modulación de la progresión del ciclo celular. La regulación
de la duración y la magnitud de la activación de las MAPKs son fundamentales para una
respuesta apropiada, y resulta del balance entre la activación y la inhibición de éstas.
Alteraciones en este equilibrio son causa de enfermedades en humanos como la diabetes
y el cáncer. En S. pombe, Sty1 es la MAPK activada en respuesta a múltiples estreses
ambientales y su hiperactivación resulta letal. Los principales reguladores negativos de las
MAPKs son las fosfatasas que revierten la fosforilación de sus residuos activadores.
Resultados anteriores de nuestro grupo sugerían que la MAPKAP quinasa Srk1,
previamente involucrada en la regulación de la progresión del ciclo celular, podría estar
implicada en la regulación negativa de la MAPK Sty1. En este trabajo, hemos
diseccionado la vía de SAPK y descartado diversas vías de acción de Srk1 para llevar a
cabo esta nueva función.
Por otro lado, centrados en el estudio de la regulación negativa de la MAPK, en este
trabajo también hemos identificado otro elemento implicado en esta función, la proteína
de unión a RNA Rnc1. Hemos demostrado su implicación en la respuesta a estrés
osmótico y su papel modulando la fosforilación de Sty1 tras el tratamiento con KCl. Dado
que Rnc1 se aisló originalmente como sustrato de Pmk1, estos resultados representan un
nuevo ejemplo de interconexión entre dos vías de MAPKs.
I.1 Srk1 regula la fosforilación de la MAPK Sty1 después de la respuesta a
estrés osmótico
Tras la activación transitoria por la MAPKK Wis1, Sty1 desencadena la respuesta
adaptativa y vuelve a su estado basal de activación. Así, la cinética de fosforilación de
Sty1 durante el estrés inducido por KCl muestra un pico. Nuestros resultados muestran
cómo esta cinética se ve afectada en el mutante ∆srk1, presentando éste un defecto en la
defosforilación de la MAPK después del estrés. Asimismo, la sobreexpresión de Srk1
inhibe la fosforilación de Sty1 en presencia de KCl (figura 11). Ello sugiere que la quinasa
Srk1 tiene una función en la inhibición de Sty1 después de la respuesta a estrés.
Además hemos visto que esta nueva función de Srk1 es independiente de la previamente
descrita, en la regulación de la progresión del ciclo celular. La capacidad de Srk1 para
72 Discusión I
inhibir la fosforilación de Sty1 no depende de la fosforilación de Cdc25 ni del arresto del
ciclo (figura 12).
Sty1 se activa por la fosforilación de Wis1 en dos residuos: la tirosina 173 y la treonina
171. En este trabajo hemos observado que la quinasa Srk1 afecta la defosforilación del
residuo tirosina 173 (figura 13), que es esencial para la actividad de la MAPK (Nguyen y
Shiozaki, 1999) Sin embargo, los resultados de la tesis doctoral de Eva Lambea (2009),
apuntan a que la función de Srk1 no depende de las tirosina fosfatasas Pyp1 y Pyp2. No
obstante, la deleción simultánea de las dos fosfatasas no es viable, por lo que no es
posible realizar experimentos en ese fondo genético. Teniendo en cuenta que las
fosfatasas pueden tener papeles redundantes y compensar la ausencia de una de ellas,
no podemos estar absolutamente seguros de la independencia de Srk1 y las fosfatasas.
Podría ser que en los experimentos realizados con los mutantes sencillos (∆pyp1 o ∆pyp2)
la otra fosfatasa compensase la función de la delecionada.
Por otro lado, en estudios anteriores del grupo se observó que Srk1 era capaz de
fosforilar a Wis1 in vitro y se analizaron los residuos involucrados en dicha fosforilación
(Eva Lambea, 2009). La fosforilación de Wis1 en residuos distintos a los de activación por
las MAPKKK se había descrito anteriormente para el caso del choque térmico, siendo
además dependiente de la actividad de Sty1 (Shiozaki et al, 1998). Dos de los cinco
residuos identificados en nuestro grupo, se encuentran en el dominio de unión entre
Wis1 y Sty1 (Nguyen et al, 2002) y se hipotetizó que la fosforilación de Srk1 en estos
residuos podría afectar dicha unión e impedir la activación de Sty1 después de la
respuesta a estrés (Eva Lambea, 2009). Sin embargo, el estudio realizado en esta tesis del
papel de la posible fosforilación in vivo demuestra que la fosforilación de Wis1 por Srk1
no es la responsable de la función de la última en la regulación de Sty1. El análisis del
fenotipo de los mutantes de fosforilación de Wis1 (no fosforilable por Srk1 o
fosfomimético) ha mostrado que éstos no presentan ningún defecto de crecimiento en
presencia de KCl ni tienen afectada la defosforilación de Sty1 después del estrés (figura
14), como es el caso de ∆srk1. Así pues, aunque no podemos descartar que Srk1 fosforile
in vivo estos residuos de la MAPKK Wis1, sí podemos afirmar que esta fosforilación no es
relevante en condiciones de estrés osmótico ni para la regulación negativa de la MAPK
Sty1.
Si la respuesta adaptativa al estrés no se da correctamente, la célula puede necesitar más
tiempo para la adaptación. En este tiempo, la MAPK deberá seguir activa para impulsar
una respuesta hasta la completa adaptación. Si la quinasa Srk1 fuera necesaria para una
respuesta óptima ante el estrés osmótico, se explicaría que su deleción produjese un
retraso en la defosforilación de Sty1. El principal mecanismo para hacer frente al estrés es
la respuesta transcripcional dependiente de Sty1 y el factor de transcripción Atf1. En este
trabajo hemos visto que la ausencia de Srk1 no afecta los niveles proteicos de Atf1, ni la
Discusión I 73
inducción del mRNA de pyp2+, una diana transcripcional de Sty1/Atf1. Además, la
sobreexpresión de Srk1 es capaz de inhibir la fosforilación de Sty1 en ausencia de Atf1
(figura 15). Podemos afirmar entonces que la función de Srk1 en la regulación de Sty1 no
requiere de la transcripción mediada por Atf1. No obstante, podría ser que sí estuviera
involucrada en la respuesta transcripcional que se da de manera dependiente de Sty1
pero independiente de Atf1 (Chen et al, 2003). Las MAPKAP quinasas de metazoos han
sido ampliamente implicadas en la regulación de la expresión génica a distintos niveles
incluyendo la modulación de la transcripción, la estabilidad de mRNA y la traducción
(revisado en (Cargnello y Roux, 2011)).
La fosforilación de Sty1 por Wis1 induce su translocación al núcleo. La localización nuclear
de la MAPK es transitoria y correlaciona con su fosforilación. Las fosfatasas son
citoplasmáticas y cuando Sty1 es exportada del núcleo, éstas la defosforilan e impiden su
re-entrada. La ausencia de Srk1 produce un retraso en la salida del núcleo de Sty1
después del estrés osmótico (Eva Lambea, 2009). Este efecto se contempló como una
consecuencia de la mayor fosforilación de Sty1 en el mutante, ya que la sola fosforilación
de la MAPK es suficiente para inducir su translocación al núcleo (Gaits et al, 1998). De
hecho, en ausencia de las fosfatasas Pyp1 o Pyp2, junto con la mayor fosforilación de Sty1
se observa una mayor localización nuclear de la MAPK (Gaits y Russell, 1999).
Habiendo descartado en principio las fosfatasas y la correcta ejecución de la respuesta
transcripcional dependiente de Sty1/Atf1, para explicar la mayor fosforilación de Sty1 en
∆srk1 podríamos hipotetizar que Srk1 fuera necesaria para la desactivación de la vía
upstream de la MAPK. En este caso, en ausencia de la quinasa se produciría un defecto en
la inhibición del módulo de MAPKs, que seguiría activando a Sty1. No se ha descrito
ningún mecanismo en S. pombe para la inhibición de la MAPKK Wis1 ni de las MAPKKKs
Win1 y Wak1, pero sería lógico pensar que deben existir también elementos implicados
en su inhibición para la correcta desactivación de la vía. Una primera aproximación para
evaluar esta posibilidad sería el uso del mutante wis1DD (constitutivamente activo) que
haría la vía insensible a la activación por los elementos upstream Wis1, y ver qué efecto
tiene la deleción de srk1+ en esta situación. Si siguiéramos observando un aumento en la
fosforilación de Sty1, ello indicaría que la función de Srk1 no tendría lugar upstream Wis1.
Desafortunadamente, estos experimentos fueron realizados sin éxito en el transcurso de
esta tesis sin obtener ningún resultado concluyente.
Alternativamente, el retraso en la salida del núcleo de Sty1 en ∆srk1 podría no ser una
consecuencia de su mayor fosforilación, sino la causa. La inactivación de la exportina
Crm1, que media la salida del núcleo de Sty1, produce una acumulación nuclear de ésta,
pero también el incremento en su fosforilación, por hacerla inaccesible a las fosfatasas
(Gaits y Russell, 1999). Otro punto de regulación de la localización nuclear de Sty1 viene
dado por la presencia del factor de transcripción Atf1 en el núcleo. Éste es necesario para
74 Discusión I
la retención nuclear de la MAPK, y en su ausencia no se observa una acumulación nuclear
de Sty1 (Gaits et al, 1998). Del mismo modo que existe un mecanismo de “retención”
para mantener a Sty1 en el núcleo durante el tiempo necesario, es plausible que exista
otro de “liberación”, que permitiese su salida del núcleo una vez activada la respuesta
adaptativa. La hipotética participación de Srk1 en este último mecanismo explicaría la
retención de Sty1 en el núcleo en ∆srk1 y en consecuencia la mayor fosforilación de ésta
después del estrés (figura 32).
Srk1
Srk1
Sty1
Wis1
Pcr1 CESR
Atf1
P
P Sty1P
P
Pyp1 Pyp2
Ptc1 Ptc3
Sty1
P
PSty1
P
P
P
P
P
P
P P
Srk1P
?
Figura 32. Modelo hipotético del papel de Srk1 en la regulación de la MAPK Sty1.
I.2 La proteína de unión a RNA Rnc1
Rnc1 pertenece a la familia de proteínas de unión a RNA de tipo K, identificadas como
parte del complejo hnRNP (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein). Estas proteínas
contienen dominios KH (Siomi et al, 1993) que median la unión a RNA en motivos ricos en
citosinas (Thisted et al, 2001). Presentan además dominios de interacción con proteínas y
contienen múltiples sitios de fosforilación modificados ante distintos estímulos. Esta
familia de proteínas se ha implicado en diversos procesos que regulan la expresión génica
como la remodelación de la cromatina, la transcripción, el splicing y la estabilidad y
traducción de mRNA (revisado en (Bomsztyk et al, 2004).
Rnc1 fue identificada en S. pombe como regulador negativo de la MAPK Pmk1. La
activación de Rnc1 por la propia MAPK induce su unión a la región 3’UTR del mRNA de la
fosfatasa Pmp1, induciendo su estabilización (Sugiura et al, 2003) (figura 4). También en
eucariotas superiores ha sido descrito un mecanismo similar de regulación de la
estabilidad de mRNA de fosfatasas en las vías de MAPKs (Kuwano et al, 2008).
Discusión I 75
Centrados en el estudio de la regulación negativa de la MAPK Sty1, nos planteamos qué
papel podría tener Rnc1 en este proceso.
Rnc1, un nuevo componente en la respuesta a estrés osmótico
Rnc1 se aisló como supresor de la letalidad de la deleción de ppb1+ (la calcineurina) en
presencia de cloruro de magnesio. En estas condiciones, la deleción de ppb1+ conlleva
una hiperactivación de Pmk1, causante de la pérdida de viabilidad. Así, la sobreexpresión
de los inhibidores de la MAPK, rescata esta letalidad (Sugiura et al, 2002). En esta tesis,
nos preguntamos si Rnc1 era necesaria también para la respuesta al estrés osmótico
inducido con KCl. Los resultados muestran como la cepa delecionada para rnc1+ presenta
defectos de crecimiento en presencia de KCl, indicando que efectivamente debe tener
una función en la respuesta a este agente (figura 16).
Rnc1, regulador negativo de la SAPK
Como hemos comentado más arriba, centrados en el estudio de la regulación de Sty1,
quisimos averiguar si Rnc1 participaba también en este proceso. Nuestros resultados
indican que Rnc1 también estaría involucrada en esta regulación. El defecto observado en
la defosforilación de Sty1 después del estrés inducido por KCl en ausencia de rnc1+, junto
con la inhibición de la fosforilación que produce su sobreexpresión (figura 17), confirman
el papel de Rnc1 como regulador de la fosforilación de la MAPK Sty1.
Sólo se conoce una diana de Rnc1, el mRNA de pmp1+, la fosfatasa dual encargada de
defosforilar a Pmk1. Los resultados presentados en esta tesis, confirman que la fosfatasa
Pmp1 no actúa en la defosforilación de Sty1 (figura 17.A), como ya se había sugerido
anteriormente (Sugiura et al, 1998; Madrid et al, 2007). Al menos no en condiciones de
estrés osmótico. Además el efecto de Rnc1 en la inhibición de Sty1 no necesita de esta
fosfatasa (figura 17.B).
El ortólogo de Rnc1 en S. cerevisiae, Khd1, ha sido estudiado en mayor profundidad y se
han identificado sus mRNA diana mediante un análisis a nivel global del genoma. Khd1 se
asocia con cientos de mRNAs, que suponen más del 20% del transcriptoma de esta
levadura, sugiriendo su participación en múltiples procesos celulares (Hasegawa et al,
2008). Entre los mRNA dianas de Khd1, se encontraron los de los ortólogos de wis1+
(PBS2) y pyp1+ (PTP2). En esta tesis hemos analizado los niveles de expresión de distintos
componentes de la vía de la SAPK en el mutante ∆rnc1. Nuestros resultados muestran un
incremento en los niveles de mRNA y de proteína de Wis1, Pyp1, Pyp2 y Atf1 en ausencia
de Rnc1 (figura 19). Ello sería contradictorio con la función previamente descrita para
Rnc1, como estabilizador de mRNA (Sugiura et al, 2003). No obstante, ya hemos
comentado que las proteínas hnRNP K están involucradas en múltiples procesos celulares
y regulan la expresión génica a distintos niveles, tanto positiva como negativamente, en
76 Discusión I
función de los factores a los que se asocian (Bomsztyk et al, 2004). Estos autores
proponen un modelo para las proteínas hnRNP K en el cual éstas actúan como una
plataforma anclada al RNA para integrar las señales de distintas cascadas de quinasas
(figura 33).
Complejo de
la Proteína K
cascadas de quinasas
cambios extracelulares
RNA
Figura 33. Modelo propuesto para las proteínas
hnRNP K por (Bomsztyk et al, 2004). El complejo de
la proteína K unido al RNA integra las señales de múltiples cascadas quinasas para generar una respuesta.
¿Cómo el incremento en ∆rnc1 de los niveles de expresión de los componentes de la
SAPK podría explicar el defecto en la defosforilación de Sty1 después del estrés? Un
posible modelo basado en los resultados obtenidos en este trabajo sería el siguiente: los
niveles de mRNA de wis1+ disminuyen tras el tratamiento con estrés ((Chen et al, 2003) y
este trabajo (figura 19)). En ausencia de Rnc1, esta regulación se ve afectada y los niveles
de mRNA de wis1+ no se reducen correctamente. Esta no inhibición de la expresión de la
MAPKK activadora de Sty1 podría ser la responsable de la mayor fosforilación de la MAPK.
Como consecuencia del incremento en la activación de Sty1, los niveles de Atf1, Pyp1 y
Pyp2 (que dependen de la MAPK) se ven también incrementados en el mutante ∆rnc1
(figura 34). Así, hipotetizamos que la función de Rnc1 sería controlar los niveles de mRNA
de wis1+ (quizá mediando su desestabilización) para mantener la vía de la SAPK
controlada y evitar su hiperactivación. Ello pondría de manifiesto la importancia de la
regulación de los elementos upstream de la MAPK para la correcta modulación de la vía.
No obstante, sería necesario realizar diversas comprobaciones al respecto para poder
confirmar esta hipótesis.
Rnc1, elemento de cross-talk entre vías de MAPKs?
La interconexión entre la vía de SAPK y la de integridad celular ha sido comentada en la
introducción de esta tesis. La función de Sty1, a través de la activación transcripcional
dependiente de Atf1, es necesaria para la correcta desactivación de Pmk1 en condiciones
de estrés osmótico (Madrid et al, 2006). De hecho, las fosfatasas Pyp1, Pyp2 y Ptc1
inducidas por la vía de la SAPK, son responsables también de la defosforilación de Pmk1
en estas condiciones (Madrid et al, 2007). Pero no se ha descrito hasta el momento una
Discusión I 77
Wis1
Wak1 Win1
Mcs4
Pcr1
CESR
Sty1P
P
Pyp1 Pyp2
Ptc1 Ptc3
Atf1
?
?
KCl
Rnc1
Figura 34. Modelo sugerido para el papel de Rnc1 en la regulación de la MAPK Sty1.
interconexión en sentido contrario, es decir que la actividad de Pmk1 regule la vía de
Sty1. Nuestros resultados sugerirían que el de Rnc1 podría ser este caso, dado que fue
descrito como sustrato de Pmk1 y en esta tesis hemos visto que regula la actividad de la
vía de la SAPK. Sin embargo, la deleción de Pmk1 no afecta la fosforilación de Sty1 tras el
estrés osmótico (Madrid et al, 2006). Así pues, no puede ser Pmk1 quien regule a Rnc1 en
estas condiciones para modular la vía de Sty1.
Alternativamente, podría ser Sty1 la quinasa encargada de regular a Rnc1 en esta
situación. Del mismo modo que Atf1 puede ser también sustrato de Pmk1 en respuesta al
daño en la pared celular (Takada et al, 2007), Rnc1 sería otro efector común para ambas
MAPKs.
Otra posibilidad sería que la regulación de Rnc1 en estas condiciones se llevara a cabo por
un mecanismo alternativo. Las fosfatasas Pyp1 y Pyp2 actúan sobre Pmk1 inducidas por la
actividad de la SAPK, pero también por otro mecanismo independiente de Sty1 (Madrid et
al, 2007). Este podría ser también el caso de Rnc1. Así pues, serán necesarios más
experimentos para determinar qué elementos son los implicados en la regulación de
Rnc1.
78 Discusión I
En conjunto, los resultados de este capítulo aportan algunas evidencias de nuevos
mecanismos de regulación de la MAPK Sty1, y revelan la complejidad de este proceso.
Asimismo, destacan la posible regulación de los elementos situados upstream de la
MAPK, muy poco estudiados hasta el momento. Por otro lado, confirman la interconexión
existente entre las dos vías de Sty1 y Pmk1, aportando un nuevo elemento común, la
proteína de unión a RNA Rnc1.
CAPÍTULO II
Papel de Cmk2 en la respuesta a arsenito
Discusión II 81
Las variaciones en las condiciones ambientales como los cambios de osmolaridad o
temperatura o la presencia de substancias nocivas, pueden suponer un estrés fisiológico
para las células. Por ello, éstas han desarrollado mecanismos de adaptación para hacer
frente a las distintas situaciones adversas a las que se exponen continuamente. Las
cascadas de las SAPK (Stress Activated Protein Kinase) constituyen las principales rutas de
señalización implicadas en la transmisión de estos estímulos extracelulares para generar
una respuesta adaptativa frente a distintos estreses, y se encuentran altamente
conservadas en todos los eucariotas. En S. pombe, una sola vía de SAPK, la de Sty1,
responde a múltiples tipos de estrés. Cómo esta única MAPK es capaz de orquestar una
respuesta específica para cada estrés determinado es una cuestión aún lejos de ser
resuelta. Así, encontrar los elementos responsables de esta especificidad, es objetivo de
numerosos estudios.
En esta tesis nos planteamos como objetivo caracterizar el papel de la quinasa Cmk2,
previamente descrita como elemento de la vía de la SAPK, en la respuesta a estrés
oxidativo. Los resultados obtenidos demuestran su papel en la respuesta específica a
ciertos oxidantes, resultando especialmente relevante ante el estrés por arsenito.
II.1 Especificidad de Cmk2 en la respuesta a distintos oxidantes
Como se ha comentado en la introducción, mientras que las células presentan sistemas
de reparación y recuperación del daño causado durante el estrés oxidativo que son
comunes para distintos tipos de oxidantes, los mecanismos de defensa son específicos
para cada oxidante particular. Análisis globales del genoma de S. cerevisiae han revelado
la elevada especificidad de estas respuestas, sugiriendo que ningún oxidante es
representativo del “estrés oxidativo” general (Thorpe et al, 2004). En ese estudio se
identificaron un conjunto de funciones que proporcionan la primera línea de defensa
ante un oxidante particular. Éstas son altamente dependientes de la naturaleza del
mismo y su presencia es necesaria antes del tratamiento con dichos agentes. Sin
embargo, la reparación del daño ocasionado y la consiguiente adaptación depende
ampliamente de cambios transcripcionales, como la inducción de sistemas antioxidantes,
que se da independientemente de la naturaleza del oxidante.
Nuestros resultados muestran que la deleción de la MAPKAP quinasa cmk2+ causa
sensibilidad a arsenito, cadmio y diamida pero no a H2O2, t-BOOH ni al choque térmico
(figura 20). Así, Cmk2 tendría una función específica en la supervivencia ante agentes que
se caracterizan por su reactividad con los grupos sulfidrilo y por la depleción de glutatión
reducido (como lo son el cadmio, el arsenito y la diamida). Aunque estos agentes acaban
induciendo un estrés oxidativo por el aumento de ROS, Cmk2 no sería necesaria para
combatir estas especies nocivas, pues su ausencia no afecta la viabilidad celular en
82 Discusión II
presencia de peróxidos exógenos como el H2O2 o el t-BOOH. El choque térmico produce la
formación de ROS y en consecuencia induce también los sistemas de defensa
antioxidante (Davidson et al, 1996) y Cmk2 tampoco es esencial en estas condiciones. Por
lo tanto, descartamos que Cmk2 esté involucrada en los sistemas de detoxificación o
reparación del daño causado por las ROS.
La diamida es un agente químico oxidante de tioles, con preferencia por los de menor
peso molecular, como el glutatión, disminuyendo rápidamente las reservas intracelulares
de éste y causando el desequilibrio en el estado redox de la célula. La sensibilidad de
∆cmk2 a este agente, como la de ∆sty1, no es muy acusada en comparación con la de
∆atf1 y ∆pap1 (figura 20). Además, sorprendentemente, Sty1 no se activa en presencia de
diamida (figura 24.A), al menos no por la fosforilación de Wis1 en los residuos Thr171 y
Tyr173 (que son los reconocidos específicamente por el anticuerpo anti-fosfo p38
utilizado). Consistentemente, tampoco se observa el retraso en la movilidad
electroforética de Cmk2-HA en el caso de la diamida (figura 21.A). Sin embargo sí que se
ha descrito la activación de Pmk1 en respuesta a diamida, y su deleción causa también un
defecto de crecimiento en estas condiciones (Madrid et al, 2006). En presencia de este
agente parecen jugar un papel esencial los factores de transcripción Atf1 y Pap1. La
actividad de Atf1 en respuesta a diamida no puede venir condicionada exclusivamente
por la MAPK Sty1 ya que la deleción de ésta última causa una sensibilidad menor que la
del factor de transcripción. Podría ser que la activación de Atf1 en estas condiciones
dependiera de la MAPK Pmk1, como ya se ha sugerido para el caso del daño en la pared
(Takada et al, 2007), o por ambas.
El mecanismo de toxicidad de metales y metaloides común al cadmio y al arsenito es, por
un lado, la reactividad con los grupos sulfidrilo de las proteínas, que afecta la función de
varias enzimas, perturbando procesos celulares fundamentales. Por otro lado, estos
agentes también inducen la formación de ROS que causa un estrés oxidativo, bien por la
inhibición de enzimas específicas o por la depleción de antioxidantes, bien por otros
mecanismos indirectos. Aunque cadmio y arsenito comparten estos mecanismos de
toxicidad, tienen otros específicos, que dependen de sus propiedades fisicoquímicas y sus
preferencias de ligando, por lo que la célula debe combatir esta toxicidad mediante
distintos sistemas (revisado en (Wysocki y Tamas, 2010). La ausencia de Cmk2 afecta el
crecimiento en presencia de ambos elementos, pero de manera mucho más acusada ante
el arsenito. A concentraciones de cadmio en las que tanto ∆sty1 como ∆pap1 presentan
una elevada sensibilidad, ∆cmk2 no muestra todavía diferencias respecto al wt (figura
20). Sin embargo, en el caso del arsenito el defecto de crecimiento de ∆cmk2 es
comparable al de ∆sty1 y ∆pap1 (Figura 22.A). Probablemente, Cmk2 juegue un papel
común en la respuesta a diamida, cadmio y arsenito, mientras que debe jugar otro papel
específico en la resistencia al último. Confirmando la especificidad de la función de Cmk2
en la respuesta a arsenito, la sobreexpresión de la quinasa confiere resistencia al
Discusión II 83
metaloide (figura 23.B), descartando que la sensibilidad de la deleción al estrés por
arsenito se pueda atribuir a un efecto secundario de la deleción (por ejemplo, a que la
deleción causara un debilitamiento general en la célula, o a que afectara vías o sistemas
de protección en paralelo con el metaloide).
II.2 Regulación de Cmk2
En el estudio anteriormente citado (Thorpe et al, 2004), se observó que no existe una
correlación entre la sensibilidad de la deleción y la inducción transcripcional de los genes
que proporcionan la primera protección ante un oxidante particular. Ello sugiere que
existen funciones constitutivas que deben estar presentes en la célula antes del estrés
para garantizar la supervivencia en estas condiciones.
De acuerdo con las observaciones anteriores, en esta tesis hemos comprobado que los
niveles de mRNA de cmk2+ no se inducen ante el tratamiento con arsenito (figura 21.B).
Previamente, se había descrito la fosforilación de Cmk2 por Sty1 en presencia de arsenito
(Sanchez-Piris et al, 2002). En este trabajo se ha observado que tanto en presencia de
cadmio como de arsenito se da dicha fosforilación y se produce además un aumento en
los niveles proteicos totales (figura 21.A). Dado que no se da un aumento en los niveles
de mRNA, el incremento de los niveles proteicos debe darse por regulación post-
transcripcional, quizá resultado de un aumento en la estabilidad proteica. Además Sty1 es
necesaria para que se produzca este incremento (figura 21.A).
Asumiendo que Sty1 regulase la estabilidad proteica de Cmk2 en estas condiciones, parte
de la sensibilidad de ∆sty1 estaría justificada por la falta de Cmk2, y por eso la
sobreexpresión de Cmk2 en este mutante recuperaría parcialmente su viabilidad (figura
23.B).
Por último, el experimento de epistasia realizado en esta tesis con el doble mutante
∆sty1∆cmk2 corrobora que ambas actúan en la misma vía en la respuesta a arsenito
(figura 26.A).
II.3 La ausencia de Cmk2 produce un aumento en la activación de Sty1 por
arsenito
Ante un amplio rango de estreses ambientales, la activación por fosforilación de la MAPK
Syt1 es esencial para la supervivencia, y cualquier defecto en esta activación conlleva una
pérdida de viabilidad en tales condiciones. La ausencia de Cmk2 provoca una sensibilidad
en presencia de arsenito, y sin embargo, la fosforilación activadora de Sty1 no sólo no se
encuentra afectada sino que está incrementada en ∆cmk2 (figura 24.A). Esta fosforilación
se corresponde con actividad de la MAPK, al menos sobre su sustrato Atf1, dado que
también la inducción de los genes dependientes de Sty1/Atf1 pyp2+, ctt1
+ y gpx1
+
aumenta en ausencia de Cmk2 (figura 25.A). Complementariamente al efecto de su
84 Discusión II
deleción, la sobreexpresión de Cmk2 impide la fosforilación de Sty1 por arsenito y
consiguientemente, la inducción de sus genes diana (figura 24.B y 25.B). Además, hemos
visto que el efecto de la ausencia de Cmk2 en la activación de la vía de Sty1 es exclusivo
de la respuesta a arsenito, pues tras el tratamiento con cadmio no existen diferencias en
la fosforilación de Sty1 ni en la inducción de los genes dependientes de Sty1/Atf1 entre
wt y ∆cmk2.
El ortólogo de Cmk2 en S. cerevisiae, RCK2, se ha involucrado en la regulación de la
síntesis proteica (Teige et al, 2001; Swaminathan et al, 2006) y se ha sugerido que Cmk2
podría desempeñar un papel en este proceso en S. pombe. Aún induciéndose
correctamente la transcripción de los genes de respuesta a estrés, podría ser que la
traducción de los tránscritos se encuentre afectada. No obstante, los niveles proteicos de
Pyp2, igual que los de su mRNA se encuentran también elevados en ∆cmk2 (figura 25.B),
descartando que Cmk2 afecte su traducción. Además, un mecanismo como la regulación
de la síntesis proteica, probablemente no podría explicar un efecto tan específico ante un
agente concreto.
Así, mientras la ausencia de Cmk2 sensibiliza las células a la presencia de arsenito
produciendo una pérdida de viabilidad y un incremento en la activación de la MAPK Sty1,
su sobreexpresión las insensibiliza, haciéndolas más resistentes incluso prescindiendo de
la activación de Sty1.
II.4 La función de Cmk2 en la respuesta a arsenito es independiente de la de
los factores Pap1 y Zip1, y la ausencia de la quinasa produce un aumento de
su activación
Los factores de transcripción Pap1 y Zip1 juegan un papel crucial en la respuesta a
metales y metaloides e inducen la transcripción de genes antioxidantes, de resistencia a
múltiples drogas y genes involucrados en la síntesis de glutatión. Ambos factores son
esenciales para la respuesta a arsenito, puesto que su deleción causa un defecto de
crecimiento en presencia del mismo (Rodriguez-Gabriel y Russell, 2005), aunque no se
había analizado hasta el momento su respuesta transcripcional en estas condiciones. En
este trabajo hemos visto que, efectivamente, sus genes diana también se inducen en
respuesta a arsenito (figura 26.C y 29.B). Asimismo, la estabilización de los niveles
proteicos de Zip1 que se da en respuesta a cadmio (Harrison et al, 2005) debe ser
también el mecanismo de regulación por arsenito (figura 29.A).
Sin embargo, los experimentos de epistasia realizados con los mutantes dobles
∆cmk2∆pap1 y ∆cmk2sup9 en esta tesis, demuestran que la función de Cmk2 en la
respuesta a arsenito es independiente del de los dos factores (figura 26.A y 29.E).
Además, la ausencia de Cmk2 causa también un incremento en la actividad de estas vías
tras el tratamiento con arsenito. La inducción del gen dependiente de Pap1 trr1+ se
Discusión II 85
encuentra ligeramente aumentada en ∆cmk2 tras el tratamiento con arsenito (figura
26.C). Asimismo, la estabilización de Zip1, como la inducción de sus genes diana cys2+ y
SPAC869.05c+ también es mayor en ∆cmk2 (figuras 29.A y 29.B). Otra vez, este efecto es
exclusivo del arsenito y reafirma que la deleción de cmk2+ sensibiliza a las células a la
presencia de este metaloide.
Cabe comentar que la deleción de sty1+ no produce un incremento en la inducción de los
genes dependientes de Zip1, como lo hace la de cmk2+. Ello sugeriría que Cmk2 tendría
una función independiente de Sty1. Como se ha comentado anteriormente, es probable
que Cmk2 tenga una función constitutiva y sea necesario que esté presente en la célula
antes del tratamiento con arsenito para garantizar la supervivencia. Esta función
constitutiva sería independiente de Sty1 y su pérdida (en células ∆cmk2) produciría el
aumento en la actividad de Zip1 a tiempos cortos, mientras que una vez transmitido el
estímulo y activada la MAPK Sty1, ésta debe reforzar la función de Cmk2.
II.5 El glutatión en la respuesta a arsenito
El glutatión es un elemento crucial en la defensa frente metales y metaloides, dada su
contribución a distintos niveles. Representa el principal tampón redox de la célula y por lo
tanto, la protege del estrés oxidativo inducido (Grant, 2001). Además, contribuye a
disminuir los niveles citosólicos del metal conjugándose con el mismo y permitiendo el
secuestro del complejo en la vacuola mediante transportadores de tipo ABC (Ghosh et al,
1999). Por último, ejerce la glutationización, evitando el daño irreversible de grupos
sulfidrilos de las proteínas resultado de la unión de los metales (Pompella et al, 2003).
La oxidación del glutatión por parte de metales y metaloides provoca la disminución de
esta defensa antioxidante y constituye uno de los mecanismos de toxicidad de estos
elementos (Stohs y Bagchi, 1995). Por eso, en respuesta a arsenito, se induce la síntesis
de glutatión para reajustar los niveles (Thorsen et al, 2007). Un defecto en la síntesis de
glutatión, o el impedimento de alguna de sus funciones causa problemas graves para la
supervivencia en presencia de metales y metaloides.
La función de Cmk2 en la respuesta a arsenito podría estar relacionada con alguno de
estos procesos. En esta tesis se ha descartado su papel en la inducción transcripcional de
las enzimas de síntesis de glutatión mediada por Zip1. Aún así, Cmk2 podría regular otros
niveles de esta síntesis. Si la falta de glutatión fuera el problema de ∆cmk2, añadir
glutatión exógeno, debería revertir su fenotipo de sensibilidad, y en parte, así sucede. En
placa, la presencia de glutatión rescata parcialmente la sensibilidad de ∆cmk2 por
arsenito (figura 27.A). El análisis del crecimiento en líquido en presencia del metaloide,
indica que el mutante recupera los niveles de crecimiento del wt cuando se añade
glutatión (figura 27.B). Sin embargo, añadir glutatión al wt supone también un
incremento de crecimiento, y prácticamente se iguala al del cultivo sin tratar con arsenito
86 Discusión II
(figura 27.B). Del mismo modo, el efecto del glutatión en la activación de la MAPK Sty1
por arsenito es paralelo en el wt y el ∆cmk2, produciendo una disminución de ésta (figura
27.C). Igual que la sobreexpresión de Cmk2, el suplementar con glutatión exógeno
produce un incremento de la viabilidad e inhibe la activación de Sty1 en presencia de
arsenito, lo que hace tentador sugerir una posible relación entre los niveles de Cmk2 y los
de glutatión.
No obstante, muy recientemente se ha publicado un trabajo en el que se describe cómo
las células de S. cerevisiae exportan y acumulan glutatión en el medio extracelular en
respuesta a arsenito (Thorsen et al, 2012). Este glutatión se conjuga con el arsenito del
medio para impedir su entrada a la célula y representa así un nuevo mecanismo de
defensa. Curiosamente, el glutatión extracelular no protege de la toxicidad por cadmio.
Teniendo en cuenta esta información, y asumiendo que un mecanismo parecido exista en
S. pombe, podríamos explicar el efecto del glutatión extracelular de los experimentos
anteriores por su conjugación con el arsenito en el medio impidiendo su entrada a la
célula. Esto equivaldría a una disminución de la concentración de arsenito “nocivo”
disponible, con el consiguiente aumento de la viabilidad celular, y disminución de la
activación de Sty1.
Por lo tanto, estos experimentos no nos permiten elaborar ninguna conclusión acerca de
la relación de Cmk2 con los niveles, el metabolismo o las funciones del glutatión. Para
obtener más información al respecto sería necesario medir los niveles de glutatión
intracelular y extracelular de las cepas wt y ∆cmk2, en condiciones basales y en respuesta
a arsenito. Ello nos permitiría comprobar si las células ∆cmk2 son capaces de acumular
suficientes niveles de glutatión en estas condiciones. Además, si en S. pombe se diese
también un exporte de glutatión al medio, podríamos determinar también si la quinasa
Cmk2 está implicada o no en este proceso. En caso afirmativo, podríamos explicar los
resultados anteriores en base a este mecanismo: la ausencia de Cmk2 provocaría un
defecto en el exporte de glutatión y por lo tanto un aumento en la disponibilidad de
arsenito que puede entrar en las células, que explicaría la mayor sensibilidad de éstas a la
presencia de arsenito, así como la activación de Sty1, Pap1 y Zip1 incrementada.
Complementariamente, la sobreexpresión de Cmk2 provocaría una exportación masiva
de GSH que al conjugarse en el medio con el arsenito impediría su entrada en las células,
y produciría entonces el aumento de la viabilidad de éstas en presencia del metaloide.
Asimismo, dados los bajos niveles de arsenito que entrarían a la célula, casi no se
apreciaría activación de Sty1.
Sin embargo, resultados preliminares sugieren que la función de Cmk2 en la resistencia a
arsenito no requiere de la síntesis de glutatión. En este experimento, se observa que el
butilsulfóxido (BSO), un inhibidor de la γ-glutamilcisteína sintetasa (enzima clave en la
síntesis de glutatión), no impide que la sobreexpresión de Cmk2 produzca un aumento en
Discusión II 87
la resistencia a arsenito, sugiriendo que el papel de la quinasa en esta respuesta no está
relacionado con la síntesis de glutatión (figura 35).
control BSO As As + BSO
pREP1
pREP1cmk2
Figura 35. Efecto del BSO en la sobreexpresión de Cmk2. La cepas wt transformada con el
plásmido pREP41cmk2-HA+ o con el plásmido vacío como control, se cultivó en EMM sin tiamina
durante 17 horas y se plaquearon diluciones que contenían 104,10
3, 10
2 y 10
1 células en placas de
EMM suplementadas con 0,2mM NaAsO2, 5mM BSO o ambos. Las placas se incubaron a 30°C
durante 3 días antes de ser fotografiadas.
II.6 Cmk2 y la regulación de los niveles intracelulares de arsénico
Las células regulan los niveles de arsenito intracelulares para evadir su toxicidad bien por
la inhibición de los transportadores que median su entrada, bien estimulando los de
salida, o bien secuestrándolo en la vacuola. La regulación del transporte representa uno
de los sistemas más eficientes para la tolerancia a metales y metaloides.
Unos niveles intracelulares de arsenito incrementados en ∆cmk2 explicarían la
sensibilización que presentan estas células al metaloide y la especificidad del efecto para
el arsenito en concreto, pues los sistemas de transporte son específicos para cada metal o
metaloide. Los estudios de localización realizados en otros trabajos, han situado a Cmk2
en la periferia celular (Alemany et al, 2002; Matsuyama et al, 2006), lo que sería
consistente con un posible papel regulando transportadores de metaloides en la
membrana, bien inhibiendo su entrada, bien estimulando su exportación.
La entrada a las células de un compuesto altamente tóxico como el arsenito sólo puede
tener lugar gracias a su mimetismo molecular, a través de transportadores que se han
desarrollado para la asimilación de iones esenciales y nutrientes. En solución acuosa a pH
fisiológico, el arsenito existe mayoritariamente en forma trihidroxilada no cargada, la cual
se asemeja estructuralmente al glicerol. Así, todos los organismos, desde las bacterias
hasta los humanos, acumulan arsenito a través de las acuagliceroporinas, una familia
ubicua de proteínas de membrana perteneciente a las MIP (Major Intrinsic Proteins) y que
son permeables al glicerol (figura 7). Las acuagliceroporinas son canales bidireccionales,
por lo que median también la salida de los metaloides de la célula contribuyendo a su
tolerancia en ciertas condiciones.
En S. pombe no se ha descrito ninguna acuagliceroporina ni ningún otro elemento de
transporte de membrana de arsenito. Sin embargo, ha sido estudiada en profundidad la
acuagliceroporina de S. cerevisiae, Fps1, que es la principal ruta de entrada de arsenito a
la célula (Wysocki et al, 2001), y se ha descrito también su carácter bidireccional,
88 Discusión II
permitiendo su salida (Maciaszczyk-Dziubinska et al, 2010). Su función fisiológica es la
regulación de los niveles de glicerol intracelulares en respuesta a cambios de la
osmolaridad del medio (Tamas et al, 1999). La deleción de la acuagliceroporina confiere
resistencia a arsenito por impedir su entrada a la célula. En presencia del metaloide, la
MAPK Hog1 (homóloga a Sty1) regula negativamente este transportador para impedir la
entrada de arsenito (Thorsen et al, 2006).
Dada la elevada similitud química entre el arsenito y el antimonito, las acuagliceroporinas
son capaces de internalizar ambos metaloides. En esta tesis, hemos comprobado que la
deleción de cmk2+ tiene el mismo efecto en la respuesta a antimonito que el observado
para arsenito, produciendo una disminución de la viabilidad celular en su presencia, así
como el incremento de la activación de la MAPK Sty1 (figura 30). La reproducción del
fenotipo de ∆cmk2 en presencia de antimonito podría indicar que Cmk2 regule el
transporte de estos metaloides. Curiosamente el factor de transcripción Pap1, necesario
para la respuesta a arsenito, no lo es para el caso del antimonito.
Como se ha explicado en el apartado de los resultados, en esta tesis hemos hallado por
homología una putativa acuagliceroporina en S. pombe, SPAC977.17, con dominio MIP.
Sin embargo, el análisis del fenotipo de su deleción indica que, aunque sí debe
representar una vía de entrada de arsenito a la célula (inferido por la menor activación de
la MAPK Sty1 que se da por arsenito en ausencia del canal), no debe tratarse de la única
ni la principal, ya que a dosis elevadas del metaloide su deleción no produce un aumento
de la resistencia a arsenito. El hecho de que a estas concentraciones ∆SPAC977.17 resulte
sensible apunta además a que pueda tener un papel en la salida del metaloide de la
célula. Respecto a Cmk2, parece descartado que el papel de ésta en la respuesta a
arsenito tenga lugar a través de esta acuagliceroporina. Si Cmk2 inhibiera el canal para
impedir la entrada del arsenito, entonces, la deleción simultánea de ambos genes debería
rescatar la sensibilidad de ∆cmk2, hecho que no sucede. Si por el contrario, Cmk2
estimulase la salida del metaloide por este canal y fuera la no estimulación en ausencia
de Cmk2 la causante de la pérdida de viabilidad, entonces la deleción del canal debería
también resultar sensible en las condiciones a las que sí lo es ∆cmk2. Así todo, teniendo
en cuenta que puede tratarse de un canal bidireccional, y ser objeto de una regulación
compleja, habría que realizar más experimentos para concluir sobre la relación entre
Cmk2 y la putativa acuagliceroporina SPAC977.17.
La observación de que la deleción de la acuagliceroporina en S. pombe no confiere
resistencia a la presencia de arsenito, como lo hace Fps1 en S. cerevisiae, sugiere que no
es un mecanismo mayoritario de entrada de los metaloides a la célula. Además de a
través de las acuagliceroporinas, se ha descrito que la entrada de arsenito (y antimonito)
puede darse por transportadores de hexosas en S. cerevisiae (Liu et al, 2004) (figura 36).
Así, la adición de glucosa al medio resulta en la inhibición de la entrada de arsenito a la
célula debido a la competición de ambos por el transportador. Y al contrario, en ausencia
Discusión II 89
Figura 36. Esquema de las rutas de transporte de arsénico. (A) En una célula de S. cerevisiae y (B)
En una célula de mamífero (Maciaszczyk-Dziubinska et al, 2012).
de glucosa, las células acumulan mayores niveles de arsenito intracelulares. La absorción
de arsénico a través de los transportadores de glucosa se ha descrito también en células
de mamífero (Liu et al, 2006). Además, se ha involucrado a la CamKII (homóloga de Cmk2)
en la inhibición de la captación de glucosa después de la estimulación por insulina en
células musculares (Illario et al, 2009). Si Cmk2 estuviera implicada en el proceso de
inhibición de los transportadores de glucosa, la ausencia de la quinasa produciría un
aumento de la absorción de glucosa, consistente con la mayor tasa de proliferación que
presentan estas células (figura 22.B). Además, en presencia de arsenito la no inhibición de
estos transportadores provocaría una mayor entrada del metaloide que explicaría el
fenotipo de sensibilidad de ∆cmk2 y la mayor activación de distintas vías de respuesta a
arsenito en este mutante.
Aparte de la entrada, otro mecanismo de regulación de los niveles intracelulares de
arsenito en el que podría estar involucrada Cmk2, es el de salida. Se ha descrito la
existencia de sistemas de detoxificación de arsenito, transportando activamente el
metaloide fuera de la célula (figura 36). Es el caso de la familia de transportadores de
Acr3 (de Arsenical resistance 3) presente en bacterias, hongos y eucariotas inferiores, con
la excepción de S. pombe, que no presenta en su genoma ningún homólogo
perteneciente a dicha familia. En los eucariotas que no presentan estos transportadores,
la detoxificación de arsenito y antimonito depende del secuestro del metaloide con
glutatión o fitoquelatinas y la translocación de los complejos bien a la vacuola bien fuera
de la célula mediante transportadores de tipo ABC.
En S. pombe el transportador Hmt1 ha sido el único involucrado en el transporte de
metales y metaloides hasta el momento. Hmt1 es el responsable de secuestrar los
complejos de cadmio conjugado con fitoquelatinas a la vacuola (Ortiz et al, 1995). Sin
90 Discusión II
embargo no juega un papel en la resistencia a arsenito ni antimonito (Preveral et al,
2009).
Dada la localización periférica de Cmk2, sería más probable que regulase un
transportador con la misma situación y no uno vacuolar. En el genoma de S. pombe,
existen 11 genes codificantes para proteínas de la familia ABC, dos de los cuales se
localizan en la membrana plasmática (Iwaki et al, 2006): Pmd1, involucrado en la
exportación de Leptomicina B (Nishi et al, 1992); y Bfr1, que confiere resistencia a la
Brefeldina A (Nagao et al, 1995). Pmd1 es homólogo al transportador presente en
humanos MDR1. La expresión de MDR1 se encuentra elevada en células de carcinoma
renal tras el tratamiento con arsenito y su sobreexpresión en la línea celular del epitelio
hepático de rata se ha asociado con el desarrollo de la tolerancia al metaloide (Liu et al,
2001). Además, el ratón KO para MDR1 es más sensible que el WT y acumula niveles
superiores de arsénico en sus tejidos (Liu et al, 2002a). Tampoco cabría descartar un
posible papel de Cmk2 en la regulación de Pmd1 en la respuesta a arsenito.
Por último, como se ha comentado en el apartado anterior, otra manera de regular los
niveles intracelulares de arsenito evitando su entrada en la célula es su conjugación con
glutatión en el medio extracelular. El glutatión es activamente exportado por las células
de S. cerevisiae (Thorsen et al, 2012) en presencia de arsenito. Este proceso se ha descrito
también en células hepáticas de rata, donde tras el tratamiento con arsenito se produce
un aumento de la exportación de glutatión que es necesario para estabilizar los
complejos As(GS)3 en la bilis para su excreción (Kobayashi et al, 2005). El exporte de
glutatión es mediado por las proteínas de la familia MRP (Multidrug Resistant associated
Proteins) (Ballatori et al, 2009). Regulando la exportación de glutatión positivamente,
Cmk2 contribuiría a la resistencia a arsenito, disminuyendo los niveles intracelulares del
metaloide. Aunque, como hemos explicado más arriba, los resultados preliminares nos
indicaron la independencia de Cmk2 de la síntesis de glutatión para ejercer su función
protectora (figura 35), podría ser que el glutatión que se exporta en estas condiciones no
sea de nueva síntesis, sino una reserva celular.
Actualmente, nuestros experimentos se centran en la medición del contenido de arsénico
intracelular tras la exposición al metaloide, mediante un equipo de ICP-MS (Inductively
Coupled Plasma Mass Spectrometry) en colaboración con el grupo dirigido por la Dra
Roser Rubio del Departamento de Química Analítica, experto en la determinación de
arsénico en alimentos. La comparación de los niveles de arsénico acumulados en una
cepa wt respecto al mutante ∆cmk2 nos permitirá confirmar si la quinasa Cmk2 está
involucrada en la regulación de los niveles intracelulares de arsenito.
En conjunto, los resultados de este capítulo, demuestran la importancia de Cmk2 en la
respuesta a estrés por arsenito. Por un lado, indican que Cmk2 juega un papel específico
ante la presencia de arsenito y no de otros oxidantes, aunque debe tener también una
Discusión II 91
función común para la respuesta a cadmio, diamida y arsenito. El papel de Cmk2 en la
resistencia a arsenito forma parte de la vía de la SAPK, según confirman los experimentos
de epistasia realizados. Sin embargo, la función de la quinasa Cmk2 es independiente de
la de los factores de transcripción Pap1 y Zip1, previamente involucrados en esta
respuesta. Además, tampoco parece estar relacionada con la síntesis de glutatión. La
ausencia de Cmk2 sensibiliza a las células a la presencia de arsenito causando una mayor
activación de las vías de respuesta a este metaloide así como una disminución de la
viabilidad celular. Por ello, hipotetizamos que esta quinasa pueda tener una función
regulando los niveles intracelulares de arsenito. Aparentemente, hemos descartado una
relación con la putativa acuagliceroporina SPAC977.17, una vía de entrada del metaloide
común desde las células procariotas hasta las eucariotas superiores. No obstante, Cmk2
podría regular los niveles intracelulares de arsénico bien modulando los transportadores
de hexosas para impedir la entrada del metaloide, bien estimulando algún transportador
de tipo ABC como Pmd1, o bien facilitando la exportación de glutatión al medio exterior,
para quelar el arsénico extracelular e impedir su entrada (figura 37).
La investigación de los mecanismos que regulan la concentración intracelular de arsénico
y antimonio es crucial para entender los mecanismos de tolerancia a estos agentes. Dada
la aplicación de los metaloides en terapias médicas, este conocimiento puede usarse para
sensibilizar las células cancerosas al trióxido de arsénico durante el tratamiento de la
leucemia promielocítica aguda, o al parásito en el tratamiento con antimonio de la
leishmaniosis. Además, puede servir también para incrementar la acumulación de
arsénico en organismos utilizados para la biorremediación o reducir la asimilación del
metaloide en cultivos para el consumo.
Cmk2
Sty1
As (III)
As (III)
As (III)As (III)
??
?
?Pap1
Zip1
GSH
GSH
As (GS)3
?
Figura 37. Modelo propuesto para la hipotética función de Cmk2 en la respuesta a arsenito.
CONCLUSIONES
Conclusiones 95
Capítulo I
1. Srk1 es necesaria para la correcta defosforilación de Sty1 después del estrés osmótico.
2. La función de Srk1 en la regulación de la fosforilación de Sty1 es independiente de su
función en el arresto del ciclo celular.
3. La fosforilación de la MAPKK Wis1 no es el mecanismo a través del cual Srk1 participa
en la regulación de la fosforilación de Sty1.
4. Srk1 no es necesaria para la correcta inducción transcripcional de Sty1/Atf1 en
respuesta a estrés osmótico y ésta no es necesaria para la función reguladora de Srk1.
5. La proteína de unión a RNA Rnc1 es necesaria para la correcta supervivencia al estrés
osmótico inducido por KCl.
6. Rnc1 es necesario para la correcta defosforilación de Sty1 después del estrés osmótico.
7. Rnc1 regula negativamente los niveles de mRNA de distintos elementos de la vía de la
SAPK.
8. Srk1 y Rnc1 tienen funciones independientes en la respuesta a estrés osmótico.
Capítulo II
1. La quinasa Cmk2 es necesaria para la supervivencia en presencia de los agentes con
elevada reactividad con grupos sulfidrilo y que causan la depleción del glutatión cadmio,
diamida y arsenito.
2. Cmk2 se fosforila de manera dependiente de la MAPK Sty1 en respuesta a cadmio y
arsenito pero no diamida, condición en la cual tampoco la MAPK Sty1 se fosforila.
3. Los niveles proteicos de Cmk2 se inducen tras el tratamiento con arsenito, cadmio y
diamida y la presencia de Sty1 es necesaria para este incremento, regulado
postranscripcionalmente.
4. Cmk2 es esencial para la respuesta a arsenito y su sobreexpresión rescata parcialmente
la letalidad de la deleción de sty1+.
5. La función de Cmk2 en la respuesta a arsenito es independiente de la de los factores
Pap1 y Zip1, pero forma parte de la misma vía de Sty1.
5. Cmk2 afecta a la activación de Sty1, Pap1 y Zip1 en respuesta a arsenito pero no a
cadmio, causando su deleción un aumento en la inducción de sus dianas
transcripcionales.
6. Cmk2 es necesaria para la supervivencia en presencia de antimonito.
7. Cmk2 también afecta la activación de Sty1 en respuesta a antimonito.
8. En S. pombe, SPAC977.17 es homólogo a la acuagliceroporina Fps1 de S. cerevisiae,
pero no es la principal ruta de entrada de arsenito a la célula.
9. A elevadas concentraciones de arsenito SPAC977.17 podría jugar un papel en la salida
de arsenito de la célula.
10. El fenotipo que causa la ausencia de Cmk2 en presencia de arsenito no depende de la
presencia del canal SPAC977.17.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales y Métodos 99
1. Cepas y plásmidos
Las cepas empleadas en la realización del capítulo I de esta tesis y sus genotipos se
recogen en la tabla 1.
Las cepas atf1-HA∆srk1 y ∆rnc1∆srk1 se obtuvieron por cruce genético entre los mutantes
simples y selección de los recombinantes con ambas mutaciones en medios selectivos
para los marcadores correspondientes. El mutante atf1-HA∆rnc1 se obtuvo por
integración del fragmento lineal derivado del casete pFA6a-kanMX6 según el protocolo
indicado (Bahler et al, 1998) en la cepa atf1-HA. En todos los casos, los mutantes se
comprobaron mediante PCR de colonia.
Las cepas wis1-HA, wis15A-HA y wis1TE/SD-HA tienen el gen de wis1 wt o con las
mutaciones 5A (cuyas serinas 17, 96, 159 y 226 y la treonina 225 están mutadas a alanina)
o ED (cuya treonina 225 está substituida por ácido glutámico y la serina 226 por ácido
aspártico) integrado en su locus endógeno del genoma y fusionado al epítopo HA. Se
obtuvieron por integración del producto de una PCR de fusión según el protocolo
indicado (Szewczyk et al, 2006). En primer lugar se amplificaron por separado los
siguientes tres fragmentos (figura 38.A): i) el gen wis1+ wt/5A/TE-SD ; ii) un fragmento del
terminador de wis1+; y iii) el cassette pFA6a-3HA-kanMX6. Una vez purificados, se llevó a
cabo la PCR de fusión con los tres fragmentos utilizando los oligonucleótidos externos
(figura 38.B) y el producto se integró en una cepa wt (figura 38.C).
wis1 fwd wis1 rv
wis1 wt/5A/ED
wis1 wt/5A/ED
wis1
term
term
pFA6a-3HA-kanMX6
pFA6a-3HA-kanMX6
wis1 pFA6a fwd wis1 pFA6a rv
STOP
wis1 term
wis1 term fwd/rv
wis1 fwdpFA6a-3HA-kanMX6
wis1 wt/5A/ED term
wis1 term
i)
ii)
iii)
A. B.
C.
Figura 38. Proceso de construcción de los mutantes de fosforilación de Wis1
Para los experimentos de sobreexpresión, se ha utilizado el plásmido pREP3X (Forsburg,
1993) derivado de la serie de vectores de expresión pREP/pRIP (Maundrell, 1990). Se
caracteriza por la presencia de: una secuencia de autoreplicación ars1; un marcador
capaz de complementar la auxotrofía de la cepa receptora (en el caso de este trabajo
LEU2 de S. cerevisiae que complementa las estirpes leu1-32); y del promotor, nmt1 (no
message in thiamine), que se regula negativamente por la presencia de tiamina en el
medio de cultivo. Existen tres versiones del promotor, las cuales contienen mutaciones
que provocan una disminución del nivel de expresión. En esta tesis hemos utilizado las
100 Materiales y Métodos
versiones nmt41 y nmt1 para conseguir niveles de expresión moderados y fuertes,
respectivamente. En el primer apartado se han utilizado los plásmidos detallados en la
tabla 2.
Tabla 1. Cepas utilizadas en el capítulo I
Tabla 2. Plásmidos empleados en el capítulo
Plásmido Dianas de inserción Procedencia
pREP1srk1-HA NdeI-NotI Estoc laboratorio
pREP1rnc1-HA NdeI-NotI Este trabajo
Las cepas empleadas en la realización del capítulo 2 de esta tesis y sus genotipos se
recogen en la tabla 3
Cepa Genotipo Procedencia
wt h- leu1-32 ura4-D18 Estoc laboratorio
wt h+
leu1-32 ura4-D18 Estoc laboratorio
∆sty1 h- sty1::ura4
+ leu1-32 ura4-D18 J. Millar
∆atf1 h- atf1::ura4
+ leu1-32 ura4-D18 J. Millar
∆srk1 (kanr) h
- srk1::kanMX6 leu1-32 ura4-D18 Estoc laboratorio
∆srk1 (ura+) h
- srk1::ura4
+ leu1-32 ura4-D18 Estoc laboratorio
cdc259A h- cdc259A leu1-32
San-Segundo
Piwnica-Worms
wis1-HA h- wis1-HA:kanMX6 leu1-32 ura4-D18 Este trabajo
wis15A-HA h- wis15A-HA:kanMX6 leu1-32 ura4-D18 Este trabajo
wis1ED-HA h- wis1ED-HA:kanMX6 leu1-32 ura4-D18 Este trabajo
sty1-HA h- sty1-3HA6his:ura4
+ leu1-32 ura4-D18 J. Millar
sty1-HA ∆srk1 h- sty1-3HA6his:ura4
+ srk1::kanMX6 leu1-32 ura4-D18 Estoc laboratorio
atf1-HA6H h- atf1-3HA6his:ura4
+ leu1-32 ura4-D18 J. Millar
atf1-HA6H ∆srk1 h- atf1-3HA6his:ura4
+ srk1::kanMX6 leu1-32 ura4-D18 Este trabajo
∆∆∆∆rnc1 h+ rnc1::kanMX6
+ leu1-32 ura4-D18 colección Bioneer
∆pmp1 h+ pmp1::kanMX6 leu1-32 ura4-D18 colección Bioneer
∆∆∆∆rnc1∆∆∆∆srk1 h+ rnc1::kanMX6
+ srk1::ura4
+ leu1-32 ura4-D18 Este trabajo
atf1-HA6H ∆rnc1 h- atf1-3HA6his:ura4
+ rnc1::kanMX6 leu1-32 ura4-D18 Este trabajo
Materiales y Métodos 101
Las cepas ∆cmk2(hygr) y sup9∆cmk2 se obtuvieron por integración del fragmento lineal
derivado del casete pFA6a-hphMX6 (Sato et al, 2005) según el protocolo descrito (Bahler
et al, 1998). El resto de dobles mutantes construidos en este trabajo se obtuvieron por
cruce de los mutantes simples y selección de los recombinantes con ambas mutaciones
en medios selectivos cuando se trata de distintos marcadores. En todos los casos se
comprobaron mediante PCR de colonia.
Los plásmidos utilizados para la sobreexpresión de Cmk2 se detallan en la tabla 4.
Tabla 3. Cepas empleadas en el capítulo II
Cepa Genotipo Procedencia
wt h- leu1-32 ura4-D18 Estoc laboratorio
wt h+
leu1-32 ura4-D18 Estoc laboratorio
∆sty1 h- sty1::ura4+ leu1-32 ura4-D18 J. Millar
∆atf1 h- atf1::ura4+ leu1-32 ura4-D18 J. Millar
∆pap1 h- pap1::ura4+ leu1-32 ura4-D18 J.Millar
∆cmk2 (ura4+) h- cmk2::ura4
+ leu1-32 ura4-D18 V. Alemany
∆cmk2 (hygr) h
- cmk2::hygMX6 leu1-32 ura4-D18 Este trabajo
cmk2-HA h- cmk2-HA6his:leu2 leu1-32 ura4-D18 M. Sánchez-Piris
cmk2-HA6his ∆sty1 sty1::ura4+ cmk2-HA6his:leu2 leu1-32 ura4-D18 M. Sánchez-Piris
pyp2-myc h- pyp2-12myc:ura4+ leu1-32 ura4-D18 P. Russell
pyp2-myc ∆cmk2 h- pyp2-12myc:ura4+ cmk2::ura4 leu1-32 ura4-D18 Este trabajo
∆sty1∆cmk2 h- sty1::ura4
+ cmk2::ura4
+ leu1-32 ura4-D18 Este trabajo
∆pap1∆cmk2 h- pap1::ura4
+cmk2::ura4
+ leu1-32 ura4-D18 Este trabajo
zip1-HA h+zip1-3HA:kanMX6 leu1-32 ura4-D18 T. Toda
zip1-HA ∆cmk2 h+zip1-3HA:kanMX6 cmk2::ura4
+ leu1-32 ura4-D18 Este trabajo
∆zip1 h+ zip1::kanMX6 leu1-32 ura4-d18 T. Toda
sup9 h- sup9 T. Toda
sup9∆cmk2 h- sup9 cmk2::hygMX6 leu1-32 ura4-D18 Este trabajo
∆SPAC977.17 h+ SPAC977.17::kanMX6 leu1-32 ura4-D18 Colección Bioneer
∆SPAC977.17∆cmk2 h+ SPAC977.17::kanMX6 cmk2::ura4
+ leu1-32 ura4-D18 Este trabajo
Tabla 4. Plásmidos empleados en el capítulo II
Plásmido Dianas de inserción Procedencia
pREP41cmk2-HA NdeI-NotI M. Sánchez-Piris
pREP1cmk2-HA NdeI-NotI M. Sánchez-Piris
102 Materiales y Métodos
2. Técnicas de genética molecular
Obtención de DNA
El DNA genómico utilizado como molde para las reacciones de amplificación de DNA de
colonia, bien para la comprobación de genotipos bien para el subsiguiente clonaje, se
obtuvo lisando la pared celular en la solución: 2,5 mg/ml de Zimoliasa 20T (Seikagaku),
1,2M Sorbitol, 100mM fosfato de sodio, pH 7,4 durante 15 minutos a 37°C.
La extracción de DNA plasmídico procedente de E. coli se hizo empleando el kit
NucleoSpin plasmid QuickPure de Macherey-Nagel.
Los fragmentos de DNA separados en geles de agarosa, o directamente de reacciones de
amplificación o digestión, se purificaron con el kit NucleoSpin Extract de Macherey-Nagel.
Amplificación de DNA
Para las reacciones de amplificación de DNA, PCR (Polymerase Chain reaction), se utilizó:
10ng del DNA molde, 1 unidad de polimerasa (EcoTaq, Ecogene o High Fidelity, Roche
dependiendo del propósito de la amplificación), 0,2µM oligonucleótidos (Sigma), 0,2mM
desoxirribonucleótidos, y 1,5 mM de cloruro de magnesio.
Las condiciones de amplificación se adaptaron en cada caso en función del tamaño del
fragmento de DNA a amplificar y la temperatura de fusión de los oligonucleótidos. La
desnaturalización se hico a 94°C durante 1 minuto. Las condiciones de hibridación
variaron entre 50 y 60°C y entre 30 segundos y un minuto. La polimerización se llevó a
cabo a 72°C entre 1 y 3 minutos.
Los oligonucleótidos empleados para la construcción de cepas o clonajes de esta tesis se
detallan en la tabla 5.
Clonaje
La digestión de fragmentos de DNA se llevó a cabo siguiendo las recomendaciones
especificadas por los suministradores de las enzimas de restricción (Invitrogen y
Fermentas). Las ligaciones se realizaron mezclando el DNA de vector plasmídico y de
inserto en una relación estequiométrica de 1:3 y no superando la cantidad de 300ng
entre ambos, empleando la DNA ligasa T4 (Promega). La incubación se hizo a 16°C O/N. El
producto de ligación se transformó en células competentes de E.coli. Para comprobar el
producto, se confirmó el patrón de digestión y finalmente se secuenció el inserto.
Materiales y Métodos 103
Tabla 5. Oligonucleótidos empleados para la construcción de cepas o clonajes
Nombre Secuencia
wis1 fwd 5’ ATG TCTTCTC CAAATAATCA ACCC 3’
wis1 rv 5’ GCTTCTTTTTTCACCTTTCTCTTTAAGAGCGCC 3’
wis1 pF6AtagC fwd 5’ GCAGATGTGGACATGGCTTCATGGGCAAAAGGCGCTCTTAAAGAGAA
AGGTGAAAAAAGAAGC CGGATCCCCGGGTTAATTAA 3’
wis1 pF6AtagC rv 5’GCACAAATGCAAAATAGCGTCGGTTCTGCTGAAACATAATTATGGATCACGTAATAGTC GAATTCGAGCTCGTTTAAAC 3’
wis1 term fwd 5’ CCCATGCGCATTGGTGTTTGTCTTTAATTTCGAATGC 3’
wis1 term rv 5’CACCATTGTAGGAAACAGGAGATCATAGTAGCTAAAACGACGGAGCCAGTCAACGA
AG 3’
cmk2 pFA6a fwd 5’GCAATATTACTGGAATGTGGTGAGCGTTGGCGTCAGCTATGCACCTACCCACAGCG
TATATCAATGCAACCGGATCCCCGGGTTAATTAA 3’
cmk2 pFA6a rv 5’ ACTCTAACCATCAGCTTGTAAACTGGAAGCTAGATTTGAGCCAAAAGG
AAGGATATAAAAGAAGGTTTGTGAATTCGAGCTCGTTTAAAC 3’
rnc1 Nde1 fwd 5’ CGCGCG CATATGGCTTACA ATCACTTCAG CATTCC 3’
rnc1 Not1 rv 5’CGCGCGGCGGCCGCTATGAGAACGACGATCTTTTTCCATTTCTAATTGC 3’
3. Condiciones de cultivo y transformaciones
S. pombe
Las células de S. pombe se cultivaron a 30°C en estufas en el caso de los medios sólidos o
en incubadores de agitación orbital (180 r.p.m.) en caso de los medios líquidos. En los
experimentos realizados con células en fase exponencial se utilizaron cultivos de
densidad óptica a 595nm entre 0,6 y 0,8.
La composición de los medios (elaborados según (Moreno et al, 1991)) se detalla a
continuación:
YES (Yeast Extract with Supplements). Medio rico utilizado rutinariamente para el
crecimiento vegetativo.
0,5% (w/v) extracto de levadura
3% (w/v) glucosa
225 mg/l de los aminoácidos L-adenina, L-histidina, L-leucina, L-lisina y uracilo en
forma de hidrocloruro.
Se suplementó con geneticina (G418, Calbiochem) o higromicina B (Roche) a una
concentración final de 100 mg/ml para la selección de cepas transformadas con el casete
de resistencia a uno u otro antibiótico.
104 Materiales y Métodos
EMM (Edinburgh Minimal Medium). Medio mínimo empleado para seleccionar las
cepas según su auxotrofía, como medio de selección en las transformaciones y para el
crecimiento de cepas con plásmidos.
0,3% hidrógeno-ftalato de potasio
0,22% Na2HPO4
0,5% NH4Cl
2% glucosa
225 mg/l de los aminoácidos esenciales L-adenina, L-histidina, L-leucina o uracilo
según la auxotrofía de la cepa que se quiera seleccionar
Tras la esterilización en el autoclave de la disolución anterior, se añadieron las sales,
vitaminas y minerales preparadas en stocks concentrados y esterilizados previamente por
filtración:
- Vitaminas (1000X): 1 g/l ácido pantoténico, 10 g/l ácido nicotínico, 10 g/l inositol, 10
mg/l biotina
- Minerales (10000X): 5 g/l ácido bórico, 4 g/l MnSO4, 4 g/l ZnSO4 · 7H2O, 2 g/l FeCl2 · 6H2O,
0,4 g/l ácido molíbdico, 1 g/l KI, 0,4 g/l CuSO4 · 5H2O, 10 g/l ácido cítrico.
- Sales (50X): 52,5 g/l MgCl2 · 6H2O, 0,735 g/l CaCl2 · 2H2O, 50 g/l KCl, 2 g/l Na2SO4
Para reprimir el promotor nmt1, el medio se suplementó con tiamina (B1) a una
concentración final de 15µM.
ME (Malt Extract). Medio utilizado para la conjugación de cepas de diferente tipo
sexual.
3% extracto bacto-malt
225 mg/l de los aminoácidos L-adenina, L-histidina, L-leucina y uracilo en forma de
hidrocloruro
pH 5,5
SPA . Medio utilizado para la conjugación de cepas de diferente tipo sexual.
3 g/l KH2PO4
2% glucosa
vitaminas 1X
225 mg/l de los aminoácidos L-adenina, L-histidina, Lisina, L-leucina y uracilo en forma
de hidrocloruro.
En todos los casos, el medio sólido se obtuvo por adición de 20 g/l de agar (Pronadisa
1802.00).
Los experimentos de sobreexpresión se llevaron a cabo cultivando las células en medio
EMM líquido suplementado con 15µM tiamina para mantener el promotor reprimido. Al
alcanzar la fase exponencial, se recogieron las células por centrifugación y se lavaron en
Materiales y Métodos 105
EMM sin tiamina para eliminar la tiamina residual. A continuación se resuspendieron en
EMM y se incubaron durante las horas de sobreexpresión deseadas.
Transformación en S. pombe
El método seguido se basa en el uso de células hechas competentes mediante el
tratamiento con acetato de litio descrito en (Norbury y Moreno, 1997) (Norbury and
Moreno 1997).
Escherichia coli
La cepa DH5α de E. Coli se empleó como hospedadora para mantener y amplificar los
plásmidos utilizados. Se cultivó en medio LB a 37°C
LB
10 g/l triptona
5 g/l extracto de levadura
10 g/l NaCl
El medio sólido se obtuvo por adición de 20 g/l de agar.
Para seleccionar las células resistentes, este medio fue suplementado 50mg/l de
ampicilina (Sigma A9518).
Transformación en Escherichia coli
La transformación de DNA se realizó en la cepa de E. coli DH5α para la amplificación de
DNA plasmídico. El protocolo utilizado es el descrito por Kushner S (1978).
4. Ensayos de sensibilidad y tratamientos de estrés
Los ensayos de sensibilidad en placa se llevaron a cabo de la siguiente manera: las cepas
de interés se cultivaron en medio adecuado hasta la fase exponencial y se plaquearon 10
µl de diluciones que contenían 104,10
3, 10
2 y 10
1 células en placas de YES suplementadas
con el agente estresante deseado. Se incubaron a 30°C, durante 3 días antes de ser
fotografiadas.
Para el tratamiento de las células con distintos agentes, éstas se cultivaron en el medio
oportuno hasta la fase exponencial, momento en el que se sometieron al estrés.
Los agentes utilizados se detallan a continuación: arsenito (NaAsO2, stock a 30mM),
cadmio (CdCl2, stock a 5mM), cloruro y tartrato de antimonio (III) (SbCl3 y
C8H4K2O12Sb2·xH2O, stock a 30mM), todos ellos disueltos en H2OmQ. La diamida se
disolvió también en H2OmQ y se preparó de nuevo para cada experimento. Como el resto
106 Materiales y Métodos
de productos anteriores, el peróxido de hidrógeno (H2O2 30%) y el tert-butil
hidroperóxido (Luperox ®TBH 70%) se adquirieron de Sigma.
5. Análisis de proteínas
Extractos proteicos
Se recogieron 10ml de cultivo a ODλ595 de entre 0,6 y 0,8 por filtración con la rampa de
vacío (PALL corporation) y se resuspendieron en 1ml de ácido tricloroacético, TCA (Fluka)
al 20%. A continuación, se lavaron con 1M Tris-base (Trizma (Sigma), sin ajustar el pH) y
se resuspendieron en Tris pH6,8, SDS 2%. En el caso de la obtención de extractos nativos,
las células recogidas se resuspendieron en STOP buffer (150mM NaCl, 50mM NaF, 10mM
EDTA, 1mM NaN3) frío, se centrifugaron y se volvieron a resuspender en el tampón de
lisis (150mM NaCl, 50mM Tris-HCl pH 8, 5mM EDTA, 0,1% Tritón X-100, 10% Glicerol,
50mM NaF) con inhibidores de proteasas y de fosfatasas (1mM PMSF, 1mg/ml
Aprotinina, 1 mg/ml Leupeptina, 1mM Na2VO3) manteniendo siempre las muestras y
soluciones en frío. Para lisar las células mecánicamente se añadieron bolas de vidrio y se
sometieron a 3 pulsos de agitación a 6000 rpm en la FAST-PREPTM (FP120 BIO101
Thermo Electron Corporation) a 4°C. Se obtuvo el extracto total por centrifugación y
recogida del sobrenadante. La concentración de proteína se determinó por el método de
Lowry o Bradford para los extractos de TCA o los nativos, respectivamente.
Inmunoprecipitación
La inmunoprecipitación de proteínas con el epítopo HA se llevó a cabo con un anticuerpo
anti-HA fusionado a beads de agarosa (Monoclonal Anti-HA−Agarose anRbody, Sigma). En
un volumen de 300µl, se incubaron a 4°C toda la noche entre 500 y 1000µg de proteína y
30µl de beads anti-HA en el tampón de lisis descrito en el apartado anterior. Tras la
incubación, se realizaron tres lavados con tampón de lisis, se resuspendieron las beads en
15µl de tampón de muestra 2X (20mM fosfato sódico pH 7, 20% glicerol, 5% SDS, 0,1%
DTT, azul de bromofenol) y se hirvieron. Se cargó en el gel todo el volumen.
Electroforesis de proteínas
La separación de proteínas en función de su tamaño se realizó mediante la electroforesis
en geles desnaturalizantes de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE). Las muestras se prepararon
con los volúmenes necesarios para obtener la cantidad de proteína deseada (entre 15 y
50µg), se igualaron los volúmenes entres las distintas muestras y se añadió tampón de
muestras 4X (40mM fosfato sódico pH 7, 40% glicerol, 10% SDS, 0,2% DTT, azul de
Materiales y Métodos 107
bromofenol). Tras hervirlas durante 10 minutos, se cargaron en geles de poliacrilamida
(Protogel) de porcentajes comprendidos entre el 8 y el 12% en función del tamaño de la
proteína a resolver. La electroforesis se realizó a voltaje constante de entre 100V en el
tampón electrolito 25mM Tris-HCl, 192mM glicina, 0,1% SDS, pH 8,3.
Western blot
Las proteínas resueltas en el gel de poliacrilamida se transfirieron a una membrana de
nitrocelulosa (Bio-Rad) en un sistema de electrotransferencia (Bio-Rad) sumergido en
tampón 25mM Tris-HCl pH 8,3, 192mM glicina, 0,02% SDS, 20% etanol a 4°C, aplicando un
voltaje de entre 60 y 70V de 1 a 2horas en función del tamaño de la proteína de interés.
Tras la transferencia, la membrana se bloqueó con 5% de leche en polvo, o de BSA en el
caso de los anticuerpos de fosforilación, disuelta en TBS-tween 0,05%, en agitación
durante una hora a temperatura ambiente. A continuación se incubaron las membranas
con los anticuerpos primarios en las condiciones optimizadas para cada anticuerpo (tabla
6). Tras tres lavados de 10 minutos con TBS-Tween 0,05%, se incubaron las membranas
con el anticuerpo secundario durante 1hora a temperatura ambiente. Se retiró el exceso
de anticuerpo con otros tres lavados de TBS-tween y se aclaró con TBS para eliminar el
detergente.
Tabla 6. Anticuerpos primarios utilizados.
Para detectar la señal del anticuerpo, se trató la membrana con el sustrato pro-
porcionado por el sistema de detección EZ-ECL (Chemiluminescence Detection Kit for HRP,
de Biological Industries) y se captó la quimioluminiscencia en una película fotográfica (Fuji
Medical X-Ray filme, de Fujifilm).
Anticuerpo Origen Casa comercial Dilución condicones
Anti-Cdc2 Conejo, policlonal Upstate 1/1000 1,5h Ta
ambiente
Anti-HA (12CA5) Ratón, monoclonal Roche 1/2000 1,5h Ta ambiente
Anti-fosfo p38 Conejo, policlonal Cell Signalling 1/1000 O/N 4°C
Anti-Hog1 Conejo, monoclonal Santa Cruz 1/1000 1,5h Ta ambiente
Anti-myc 9E10 Ratón, monoclonal Upstate 1/2000 1,5h Ta ambiente
Anti-tubulina
Anti-fosfo tirosina Conejo Calbiochem 1/500 O/N 4°C
Anti- fosfo p44/42 Conejo, policlonal Cell Signalling 1/1000 O/N 4°C
Anti-HA fusionado
a agarosa Ratón, monoclonal Sigma 4mg/ml O/N 4°C
108 Materiales y Métodos
6. Análisis de RNA
Aislamiento de RNA
Se recogieron 50ml de cultivo en fase exponencial a ODλ595 de entre 0,6 y 0,8 tras el
tratamiento indicado en cada caso por centrifugación (2min a 3000r.p.m a 4°C) y se
realizó un lavado con agua fría. Se resuspendieron las células en 500µl de tampón HE
(50mM HEPES pH 7,9, 5mM EDTA, 100mM NaCl) y se lisaron las células mecánicamente
con bolas de vidrio mediante 3 pulsos de agitación a 4000 rpm en la FAST-PREPTM (FP120
BIO101 Thermo Electron Corporation) a 4 °C. Se recuperó el sobrenadante y se le añadió
200µl de 200mM HEPES pH 7,9, 10mM EDTA, 200mM NaCl, 2% SDS y 1000µg/ml de
proteinasa K (Roche). Se incubó 1 hora a 37°C y a continuación se añadió 1ml de
fenol:cloroformo:isoamílico (25:24:1) y se centrifugó (10 minutos, 10000r.p.m. a 4°C). Se
trasvasó la fase acuosa a otro tubo y se le añadió 0,1 volúmenes de 3M acetato sódico pH
5,5 y 2,5 volúmenes de etanol absoluto frío. Se dejó precipitar a -80°C toda la noche, se
lavó el precipitado con etanol 70%, se dejó secar y finalmente se resuspendió en agua mQ
estéril. La cuantificación del RNA se realizó con el equipo Nanodrop (Thermo Scientific).
Electroforesis de RNA
Las muestras se prepararon para cargar 10µg de RNA, igualando con agua los volúmenes
de las distintas muestras y se añadió el tampón de muestras (50% formamida, 6.6%
formaldehido, MOPS* 1X, 2% BPB). Se hirvieron 5 minutos a 65°C y se enfriaron
inmediatamente en hielo. A continuación se cargaron en un gel de agarosa (1.2% de
agarosa, 2,2% formaldehido, MOPS* 1X). La electroforesis se llevó a cabo en tampón
MOPS 1X, aplicando un voltaje de 85V durante 1,5 horas.
*MOPS 20X: 0,4M MOPS pH 7, 100mM NaOAc, 20mM EDTA
Northern blot
Tras la electroforesis se realizó un lavado del gel durante 5 minutos con agua, y 10
minutos con 10X SSC en agitación. El RNA resuelto en el gel de agarosa se transfirió por
capilaridad a un filtro de Nylon (Hybond-XL, Amersham Biosciences) en tampón 10X SSC*
y la membrana se fijó con luz UV a 120mJ (Stratalinker).
Las sondas de DNA se amplificaron por PCR (utilizando los oligonucleótidos de la tabla 7),
se marcaron radioactivamente utilizando el kit comercial Ready-To-Go DNA labelling
beads (-dCTP) (Amersham) y se purificaron con illustra MicroSpin G-50 (Healthcare)
siguiendo las instrucciones del fabricante en cada caso.
Los filtros de RNA fijados se incubaron 4h a 65°C en 15ml de la solución de pre-
hibridación (0,9M NaCl, 1% SDS, 50µg/ml ssDNA) en rotación. A continuación se
Materiales y Métodos 109
hibridaron a 65°C O/N en la solución de hibridación (0,9M NaCl, 0,1g/ml dextran
sulphate, 1% SDS, 50µg/ml ssDNA) a la que se añadió la sonda marcada previamente
desnaturalizada. Tras la hibridación, se realizaron los lavados de los filtros: tres de 10
minutos a temperatura ambiente con 2X SSC y 0,1%SDS, y dos lavados de 15 minutos a
65°C con 0,1X SSC y 0,1X SDS, en agitación.
Finalmente, se detectó la señal mediante la exposición a -80°C de películas fotográficas
(Kodak BioMax MS film, Sigma).
*SSC 20X: 3M NaCl, 300mM citrato sódico pH 7
Tabla 7. Oligonucleótidos utilizados para la amplificación de sondas.
Nombre Secuencia
cmk2 NdeI fwd
cmk2 SalI rv
5’ GCGCGCCATATGTCGATACTAGCGGGGTTTAAAACTTG 3’
5’ GCGCGCGTCGACTCAATTAACACGTTTAGCAGATCGCC 3’
ctt1 fwd
ctt1 rv
5’ CGTGGGTTCGCATTAAAGTT 3’
5’ CTTGCCATCGCCTTGGGCCT 3’
cys2 fwd
cys2 rv
5’ GCGCCTGGATGGTGGGAGC 3’
5’ TCGGGTTCAGGAGCACGGTCT 3’
gpx1 fwd
gpx1 rv
5’ TGTCAATACAGCGAGCAAATGTGGA 3’
5’ GCGTTCGATGACTTGACCTTGACG 3’
leu1 fwd
leu1 rv
5’ GATGCCTATGGAACCCCTTT 3’
5’ AGAAGCCTCACCTCCCAAAT 3’
pyp2 fwd
pyp2 rv
5’ GCGGAATACCCTGGATTTTC 3’
5’ GGGGCATTGCCTACGAT 3’
SPAC869.05c fwd
SPAC869.05c rv
5’ GCGCTTGGGGTTGGGTTCGT 3’
5’ACCACCGCGCTTCGTAAAGTGT 3’
trr1 fwd
trr1 rv
5’ GTCCCGCCGGCCATACTGC 3’
5’ CTTGCCATCGCCTTGGGCCT 3’
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