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Módulo 1.A Higiene

Parecería innecesario señalar la importancia que tiene el manejo sanitario de los alimentos. Se sabe bien que cada año ocurren miles de casos de infecciones, intoxicaciones o toxiinfecciones, transmitidas por ellos y que una proporción considerable tiene un desenlace fatal. Estos problemas de salud causan también pérdidas económicas por ausentismo e incremento en el costo de los servicios de atención médica. Todo esto sucede debido a que, a pesar de los esfuerzos desarrollados por las autoridades de los servicios de salud, todavía hay volúmenes considerables de productos alimenticios que llegan al consumidor contaminados a causa de un manejo deficiente. El saneamiento de los alimentos significa eliminar o controlar en forma efectiva los microorganismos presentes en ellos y en todo aquello con lo que entren en contacto. La presencia numerosa de bacterias indica que algo no se hizo bien al prepararlos o sea, que se manipularon deficientemente. Pero la higiene en su manejo depende no solamente de la legislación al respecto o del equipo utilizado. El papel que desempeñan quienes preparan y quienes sirven alimentos continuará siendo de gran responsabilidad, pues actúan directamente sobre el aparato digestivo de millones de consumidores. Ambos influyen decisivamente en el grado de salud pública de un país. La inocuidad de los alimentos, es producto de muchas acciones directas e indirectas, dentro de las cuales los aspectos relativos al manejo higiénico, así como el monitoreo a través del muestreo y análisis tanto de superficies vivas e inertes como del ambiente, son de suma importancia. La tendencia actual en la industria transformadora de los alimentos, es implementar planes y programas de análisis de riesgos y puntos críticos de control (siglas en inglés HACCP), y es requisito entrenar a los obreros en buenas prácticas de limpieza e higiene, e instruir un sistema de monitoreo para asegurarse de que se están siguiendo las instrucciones para reducir el riesgo de contaminación. El HACCP es un enfoque moderno cuya pretensión primaria consiste en eliminar de los alimentos los riesgos a la salud asociados a su consumo. Por lo tanto es de suma importancia el conocer metodologías analíticas adecuadas para efectuar (o bien solicitar a laboratorios de apoyo) el análisis de superficies inertes, vivas y medio ambiente y, con base en los resultados analíticos, conocer las condiciones de operación reales que prevalecen en la industria. El análisis de estos resultados permitirá mantener o bien emitir e implementar medidas correctivas oportunas cuya finalidad es la obtención de productos alimenticios dentro de estándares de calidad y seguridad alimentaria. A continuación se presenta el significado de algunos términos en el tema del manejo higiénico de los alimentos:

a. Contaminación cruzada: Proceso por el que los microorganismos son trasladados por medio de personas, equipos, materiales, de una zona sucia o contaminada a una zona limpia.

b. Contaminación: Es la presencia de cualquier material extraño en los productos alimenticios que origina que sean inadecuados para el consumo.

c. Control de calidad: Significa un procedimiento planificado y sistemático para tomar todas las acciones necesarias para prevenir que los alimentos sean adulterados

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dentro del significado de la legislación del país correspondiente. d. Higiene de los alimentos: Todas las medidas necesarias para garantizar la

inocuidad e higiene de los alimentos en todas las fases, desde su cultivo, producción o manufactura hasta su consumo final.

e. Higiene: Parte de la medicina que tiene por concepto la conservación de la salud y los medios para prever las enfermedades; limpieza es la primer regla de la Higiene.

f. Higiénico: Libre de niveles nocivos de microorganismos y contaminantes. g. Limpio: libre de suciedad visible. h. Saneamiento: Significa tratar adecuadamente las superficies de contacto con los

alimentos aplicando un proceso que sea efectivo para destruir las células vegetativas de los microorganismos de importancia en salud pública y para reducir substancialmente el número de otros microorganismos indeseables, sin afectar adversamente el producto o la seguridad del mismo para los consumidores.

i. Sanidad: Significa sano y consiste en conservar la calidad de los productos mediante métodos físicos (frío, calor), químicos (sal, ácidos, conservadores, etc.) manteniendo todas sus propiedades nutrimentales inalterables.

Referencias: Pascual, M. R & Calderón, V. (2000). Microbiología Alimentaria. Metodología analítica para alimentos y bebidas. 2ª. Ed. Diaz de Santos. Madrid, España. Marshall, R. T. (1992) Standard methods for the examination of Dairy Products. American Public Health Association. Copyright, Washington, D. C. (1972). Técnicas sanitarias en el manejo de los alimentos. ed. Pax-México. México, D. F. Harrigan, W. F. & Park, R. W. A. ((1991). Making safe food: A management guide for microbiological quality. Academic Press. U.K. Norma Oficial Mexicana NOM-093-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Prácticas de Higiene y Sanidad en la preparación de alimentos que se ofrecen en establecimientos fijos. Norma Mexicana NMX-F.605-NORMEX-2000. Alimentos Manejo Higiénico en el Servicio de Alimentos Preparados para la Obtención del Distintivo H. Norma Oficial Mexicana NOM-120-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Práctias de Higiene para el Proceso de alimentos, bebidas no alcohólicas y alcohólicas.

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Objetivos:

• Determinar microorganismos viables en superficies inertes y vivas/ambiente, con o sin tratamiento de higiene.

• Detectar la presencia de microorganismos indicadores de contaminación de los alimentos.

• Aplicar métodos de enumeración adecuados, según la superficie-ambiente que se vaya a analizar.

• Relacionar la estimación de la cifra de microorganismos presentes en la superficie/ambiente, con la calidad del producto procesado o manipulado, para concluir acerca de posibles efectos para la salud del consumidor.

• Explicar el efecto de sustancias desinfectantes utilizadas en los procesos de higiene de superficies.

• Comparar la efectividad de diferentes sustancias desinfectantes utilizadas en los procesos de higiene de superficies.

Ejercicio:

1. Con base en bibliografía, qué grupo o grupos de microorganismos se sugiere analizar en las superficies que estarán en contacto durante el proceso del alimento que se le asignó.

2. ¿Cuáles son los límites o especificaciones microbiológicas recomendadas en bibliografía especializada para considerar una superficie apta para manejar higiénicamente el alimento?

3. ¿Y para considerar un ambiente limpio para manejar higiénicamente el alimento?

4. ¿A qué nicho de consumidores se recomendaría la utilización de las sustancias desinfectantes y por qué?.

5. ¿Qué medidas propone para disminuir la carga microbiana de un ambiente que ponga en riesgo la calidad higiénica del alimento?

6. Qué otras técnicas conoce para realizar el análisis de superficies? 7. Los resultados obtenidos ¿concuerdan con lo que usted esperaba? Explique.

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ANALISIS DE SUPERFICIES INERTES.

OBJETIVO.

Este procedimiento proporciona las reglas para la toma y análisis de superficies inertes por los métodos del hisopo, esponja, enjuague total y placa por contacto ó Rodac.

GENERALIDADES.

La higiene los alimentos implica una variedad de acciones, entre las cuales, el evitar la contaminación ocupa lugar relevante. Cada fuente de contaminación que puede actuar sobre los alimentos presenta sus propias peculiaridades y por ello requiere de métodos especiales para lograr su control. Así ocurre con el agua, los manipuladores, equipo, envases, superficies de trabajo, etc. En el caso del equipo, éste puede ser un vehículo pasivo de microorganismos, o puede constituirse en la base material sobre la cual, debido a un aseo deficiente, entren en actividad y lleguen a introducirse, por millares, en el alimento. La calidad sanitaria de los alimentos, depende de la materia prima utilizada en su preparación y de las condiciones higiénicas en que han sido elaborados, manejados y conservados, incluyendo todas las superficies que están en contacto con ellos. Dinero y esfuerzo invertido en una planta para seleccionar materias primas e instalar equipo costoso, pueden perderse si la limpieza y desinfección en general, y específicamente en los puntos críticos, no se realiza adecuadamente y/o si no se evalúa su eficiencia correctamente. Existen procesos de lavado y desinfección, que utilizan sustancias y condiciones de tratamiento propios para cada necesidad, en las distintas ramas de la industria de alimentos. Cuando las normas o recomendaciones para su aplicación se siguen con acierto, los resultados son claramente satisfactorios. El establecimiento de sistemas de higiene (lavado y sanitización) adecuados del equipo, debidamente programados y en manos de personal responsable y adiestrado, debieran ser una exigencia, motivo de supervisión especial, dentro de cada industria y por parte de la autoridad sanitaria competente. El laboratorio proporciona un valioso recurso que permite evaluar satisfactoriamente la eficiencia de estos procesos. Para evaluar la eficiencia de la limpieza y saneamiento de las superficies, se han desarrollado métodos y propuesto normas basadas en el número total de microorganismos por unidad de superficie. Existen muchos métodos para tal efecto, el recuento de microorganismos viables en el equipo tratado es sencillo y confiable, aunque necesariamente requiere de tiempo para disponer de los resultados. Los métodos pueden aplicarse ya sea para buscar microorganismos indicadores, o un género especial, cuando se trate de un problema particular. Existen varios procedimientos, dentro de los cuales describiremos los más usuales: PROCEDIMIENTO

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MÉTODO DEL HISOPO. Esta técnica se puede utilizar en superficies que sean regulares, lisas, pulidas. Consiste en frotar un aplicador de madera u otro material de algodón (hisopo) estéril, humedecido con la solución diluyente que recoge la flora microbiana en un área determinada para finalmente suspenderla en el diluyente. Siguiendo las instrucciones del método y contando con un valor normativo, es posible decidir sobre el nivel de contaminación que prevalece sobre una superficie. Hay que tomar en consideración la representatividad que ofrece este ensayo para sugerirlo a una planta o a un proceso particular.

PRUEBA LIMITE PERMITIDO

Mesofílicos aerobios < 400 UFC/cm2 o unidad Coliformes totales < 200 UFC/cm2 o unidad

Fuente: Norma Oficial Mexicana NOM-093-SSA1-1994. Prácticas de Higiene y Sanidad en la preparación de alimentos que se ofrecen en establecimientos fijos.

MATERIAL

• Tubos con tapón de rosca conteniendo 10,0 mL de solución diluyente. • Hisopos estériles en sobres de papel manila o tubos de ensayo. Se pueden

conseguir en forma comercial. • Plantillas de papel aluminio de 12,0 cm por lado con un cuadro de 5,0 x 5,0 cm

recontado en el centro y esterilizadas dentro de papel manila.

TOMA DE LA MUESTRA. Muestreo de superficies. Colocar la plantilla o bien delimitar un área aproximada de 5,0 x 5,0 cm ó 10,0 x 10,0 cm sobre la superficie que se va a muestrear. Sacar el hisopo asépticamente. Si la superficie está seca, humedecer el hisopo en la solución diluyente y presionar contra la pared del frasco o tubo con un movimiento de rotación para quitar el exceso de líquido, en caso contrario no es necesario hacer esto. Con el hisopo inclinado, frotar la superficie delimitada por la plantilla en 3 sentidos diferentes (horizontal, vertical y oblicuo). Regresar el hisopo al tubo o frasco y romper la parte que estuvo en contacto con los dedos. Este método también puede utilizarse para buscar patógenos, substituyendo la solución diluyente por el caldo de cultivo adecuado.

Muestreo de utensilios de comedor. Utilizar tubos con l0,0 mL. Tomar un hisopo, mojarlo en la solución diluyente y exprimir el exceso de líquido sobre la pared del tubo. Tomar la muestra del utensilio con el hisopo tratando de tomar de la superficie que está en contacto con el alimento o con la boca. Regresar el hisopo al tubo y romper la parte que estuvo en contacto con los dedos. Una vez tomada la muestra, se procede a hacer el recuento, por el método más adecuado, generalmente cuenta en placa, con los medios de cultivo recomendados para el grupo bajo estudio.

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CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

Superficies. Contar todas las colonias que se desarrollen en las cajas, hacer el cálculo de las colonias por mL, multiplicar por el volumen de diluyente empleado y dividirlo entre cm2 de la superficie. Los resultados se expresan como UFC/cm2. Utensilios de comedor. Hacer el cálculo del número de colonias por mL, multiplicar el volumen total de la solución diluyente de muestreo. Informar UFC/utensilio.

MÉTODO DE LA ESPONJA.

Esta técnica se puede aplicar eficientemente para tomar muestras de superficies en áreas grandes. Se utilizan esponjas estériles de espuma de poliuretano generalmente de 13,0 x 7,5 x 4,0 cm (o de dimensiones requeridas) y bolsas de plástico transparentes estériles de las dimensiones necesarias. Consiste en pasar la esponja sobre toda la superficie del equipo o utensilio que se va a muestrear pudiendo estimar de esta manera el contenido microbiano de toda la superficie y no únicamente de dimensiones limitadas. La bolsa de plástico se invierte a modo de guante sobre la mano del muestreado, haciendo que la parte interna pase a ser la externa y con la mano así protegida, se toma una esponja retirándola de la envoltura de papel manila. Se humedece la esponja con un poco de la solución diluyente estéril y se frota completamente toda la superficie que se va a muestrear. Terminando el muestreo, se vuelve la bolsa a su posición original quedando la esponja en su interior y se adiciona el resto del volumen de la solución diluyente a la bolsa que plástico que contiene la esponja y se homogeniza exprimiendo repetidamente la esponja. Esta suspensión será considerada como la muestra directa y a partir de ella se harán las diluciones necesarias. Las superficies y utensilios a muestrear pueden ser de forma y tamaño muy diverso, tales como, mesas, tablas de picar (tratando de llegar a las hendiduras y esquinas), utensilios de comedor (tomar muestra de la superficie del utensilio con excepción del mango, prestando atención a la parte interna como es el caso de los tenedores entre diente y diente), vasos, platos (tomar la superficie expuesta a los alimentos, incluyendo el borde que está en contacto con los labios del usuario), manos (la palma de la mano y parte interna y externa de cada uno de los dedos), etc.

MATERIAL

• Esponjas de poliuretano o de celulosa de dimensiones apropiadas a la superficie que se va a muestrear. Envueltas individualmente en papel manila y esterilizadas en autoclave a 121ºC por 30 min. Se pueden conseguir en forma comercial estériles. Bolsas Whirlpack con esponja.

• Frascos con tapa de rosca con 50,0 mL o 100,0 mL (o el volumen necesario).de solución diluyente estéril.

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• Bolsas de plástico estériles de la dimensión necesaria.

TOMA DE LA MUESTRA Sacar la esponja utilizando la bolsa invertida a manera de guante, humedecerla con la solución diluyente y frotar vigorosamente con la esponja el área de muestreo . Regresar la esponja a la bolsa de plástico y verter el resto del líquido diluyente. Cerrar la bolsa y homogenizar exprimiendo repetidamente la esponja.

CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Contar las colonias y calcular el número de UFC/mL multiplicar por el volumen del diluyente y reportar por unidad de superficie (cm2) o por utensilio.

MÉTODO DE PLACA POR CONTACTO, RODAC (Replicate Organism Detection and Counting).

Este método se recomienda para obtener datos cuantitativos en superficies planas e impermeables. Idealmente la placa se debe utilizar sobre superficies que han sido previamente saneadas y desinfectadas, ya que en lugares con un alto grado de contaminación, resultará un crecimiento masivo en las placas que dificultará los recuentos. En el caso de muestreo de superficies previamente tratadas con desinfectante, es necesario que se agregue al medio de cultivo un agente neutralizante adecuado, por ejemplo, lecitina para neutralizar compuestos cuaternarios de amonio, y polisorbato 80 para neutralizar desinfectantes fenólicos. En superficies en las que se sospeche que se encuentran un poco más contaminadas se deben tomar suficientes muestras para obtener datos representativos. La selección del sitio al azar permitirá comparaciones adicionales y eliminará posibles interferencias.

MATERIAL

• Las placas RODAC se pueden obtener en forma comercial. • Cuando se preparan en el laboratorio, deben vaciarse de 15,0 -16,0 mL de agar

para cuenta estándar en cajas de petri desechables. (El agar en la placa debe quedar ligeramente convexo en la superficie del centro, para poder hacer contacto adecuado con la superficie.

• Se pueden emplear medios de cultivo para determinar indicadores o bien patógenos.

TOMA DE MUESTRA

Quitar la tapa de plástico y presionar cuidadosamente el agar contra la superficie, mediante movimiento rotatorio uniforme, presionar sobre la parte de atrás de la placa para efectuar el contacto. Colocar de nuevo la tapa e incubar en posición invertida 24-48 h a 35+/-1ºC.

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CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Efectuar la lectura a las 24 h para prevenir crecimiento incontable, en caso de observar crecimiento pobre incubar 24 h más. Se cuentan las colonias y se informa el número por placa o por cm2, dividiendo el número de colonias, entre la superficie de contacto de la caja. Debido a que la interpretación es relativa, cada laboratorio o industria, deberá establecer sus propios valores que constituyen un área limpia. El Comité sobre contaminación microbiana de superficies de laboratorios de la APHA establece los siguientes límites:

No. colonias por placa Rodac Calidad 0-25 bien

25-50 regular 50 ó más pobre

MÉTODO DE ENJUAGUE TOTAL Este método se emplea para tomar muestras de objetos pequeños como son cucharas, tenedores, biberones, etc. o para el muestreo de superficies interiores de envases, botellas y bolsas de plástico, etc.

MATERIAL

• Frascos de boca ancha con 50,0 mL de solución diluyente, o con la cantidad necesaria según el tamaño del objeto que se va a muestrear.

• Bolsas de plástico estériles de tamaño adecuado al objeto que se va a muestrear.

TOMA DE MUESTRA Utensilios. Sumergir la superficie de los utensilios que estén en contacto con la boca (cucharas, tenedores, etc.) en frascos de boca ancha con la solución diluyente o bien, verter la solución dentro de una bolsa estéril, colocar el objeto que se va a muestrear, enjuagar perfectamente bien el objeto y regresar el líquido al frasco inicial.

Superficies interiores. Introducir en el envase o bolsa que se va a muestrear 10,0 mL o el volumen adecuado de solución diluyente. Enjuagar haciendo correr el líquido por toda la superficie, agitar bien. Regresar el contenido de los envases al frasco. CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

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Contar las colonias y expresar las UFC/utensilio o envase, tomando en cuenta el volumen del diluyente y si se efectuaron diluciones posteriores. ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS PARA LOS CUATRO MÉTODOS ANTERIORES. Transferir volúmenes de 1,0 mL y 0,1,0 mL o diluciones de la muestra a cajas de Petri marcadas con la clave, fecha, medio de cultivo y dilución inoculada. Agregar el medio de cultivo seleccionado: • Agar triptona extracto de levadura para cuenta de mesofílicos aerobios • Agar bilis rojo violeta para cuenta de organismos coliformes totales. Añadir una

doble capa del mismo medio de cultivo una vez solidificada la primera capa, para crear condiciones de anaerobiosis.

• Agar papa dextrosa acidificado para cuenta de hongos y levaduras. Acidificar a un pH de 3.5 +/- 0,1 con ácido tartárico estéril a 10,0% (aproximadamente 1,4 mL de ácido tartárico por cada 100,0 mL del medio).

SUPERFICIES Contar todas las colonias que se desarrollen en las cajas, hacer el cálculo de las colonias por mL, multiplicar por el volumen de diluyente empleado y dividirlo entre los cm2 de la superficie. Los resultados se expresan en UFC/cm2. EJEMPLO Si se tomó la muestra de 4 superficies de 25,0 cm2 c/u en un volumen de 10,0 mL de diluyente, multiplicar el número de colonias x 10 y dividir el resultado entre 100 para obtener las UFC/cm2. UTENSILIOS DE COMEDOR Hacer el cálculo del número de colonias por mL, multiplicar el volumen total de la solución diluyente de muestreo y sacar promedio dividiendo entre el número de utensilios muestreados para informar UFC/utensilio.

BIBLIOGRAFIA

� Manual of Food Quality Control. 12. Quality assurance in the food control microbiological laboratory. FAO. Rome, 1991.

� Manual de prácticas. Curso: Toma y manejo de muestras para análisis bacteriológico. Laboratorio Nacional de Salud Pública. México 1992.

� Standard methods for the examination of dairy products. APHA. 16 th. 1992. � Procedimiento para el examen microbiológico de superficies y utensilios. Secretaría

de Salud. Laboratorio Nacional de Salud Pública. México 1990.

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Medios de Cultivo Agua Peptonada Peptona 1,0 g Cloruro de sodio 8,5 g Agua destilada 1,0 L Disolver los componentes de la formulación en un litro de agua y ajustar la solución a pH de 7,0, con solución de hidróxido de sodio 1,0 N; distribuir en matraces o tubos, de acuerdo a los requerimientos de la técnica y esterilizar a 121°C±1°C durante 15 minutos. Después de la esterilización, los volúmenes y el pH de la solución deben ser iguales a los iniciales. Bilis rojo violeta, agar Peptona de carne 7,0 g Extracto de levadura 3,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Lactosa 10,0 g Mezcla de sales biliares 1,5 g Rojo neutro 0,03 g Cristal violeta 0,002 g Agar 13,0 g Agua destilada 1,0 L Humectar perfectamente los ingredientes del medio en 750,0 mL de agua, posteriormente ajustar el pH a 7,4±0.1 y esterilizar en condiciones suaves: 30 minutos en baño de vapor. No esterilizar en caso de usarlo al momento. Principio de acción La bilis de buey que contiene una mezcla de sales biliares y que se encuentra en el medio, inhibe el desarrollo de bacterias Gram positivas, permitiendo el desarrollo de bacterias coliformes cuyo Gram es negativo. Las sales biliares se presentan como derivados del ácido cólico y desoxicólico, su estructura química básica es la del ciclo pentano perhidrofenantreno. Métodos Estándar para, agar Peptona de caseína 5,0 g Extracto de levadura 2,5 g Dextrosa 1,0 g Agar 15,0 g

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Agua destilada 1,0 L Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada, calentar hasta ebullición para disolver por completo y ajustar el pH a 7,0 ± 0,2 a 25°C. Distribuir en tubos de ensayo con tapón de rosca o en un matraz, después esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 45-50°C y vaciar en cajas Petri. Puede volverse a fundir una sola vez cuando se necesite. Principio de acción La peptona de caseína proporciona aminoácidos y otras sustancias nitrogenadas complejas necesarias para el crecimiento bacteriano. El extracto de levadura proporciona vitaminas del complejo B y la dextrosa es utilizada por los microorganismos como la fuente de carbono y energía. Es un medio general por lo que no contiene inhibidores. Papa dextrosa agar Infusión de papa, (a partir de 200g de papa) 4,0 g Dextrosa 20,0 g Agar 15,0 g Agua destilada 1,0 L Se suspenden los ingredientes en el agua destilada, permitiendo la humectación de los polvos, para evitar la formación de grumos que son difíciles de disgregar, calentar el medio hasta ebullición y finalmente esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar el medio de cultivo en baño de agua hasta 45°C±1°C, después acidificar a un pH de 3,5 ± 0,1, con ácido tartárico al 10% previamente esterilizado (1.4 mL de ácido tartárico por cada 100,0 mL de medio de cultivo). Después de adicionar el ácido tartárico al medio de cultivo, medir el pH con un potenciómetro. Principio de acción A partir de los hidratos de carbono contenidos en la infusión de papa, se observa que éstos favorecen el crecimiento de hongos y levaduras, al igual que a otras bacterias, sin embargo se le confiere selectividad al medio para que desarrollen los hongos y las levaduras, acidificando el medio con una polución de ácido tartárico al 10%, adicionando a cada litro de medio de cultivo 14,0 mL del ácido.

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ANALISIS DE SUPERFICIES VIVAS.

OBJETIVO

Monitorear las manos del personal que realice manipulaciones en cualquier punto de la cadena de transformación de los alimentos.

MATERIAL

METODO DEL HISOPO

• Tubos con tapón de rosca conteniendo 10,0 mL de solución diluyente. • Hisopos estériles en sobres de papel manila o tubos de ensayo. Se pueden

conseguir en forma comercial.

PROCEDIMIENTO

a) METODO DEL HISOPO.

Esta técnica se puede utilizar en superficies que sean regulares, lisas, pulidas. Consiste en frotar un aplicador de madera u otro material de algodón (hisopo) estéril, humedecido con la solución diluyente que recoge la flora microbiana en un área determinada para finalmente suspenderla en el diluyente. Siguiendo las instrucciones del método y contando con el siguiente valor normativo, NOM-093-SSA1-1993. Prácticas de higiene y sanidad en la preparación de alimentos que se ofrecen en establecimientos fijos. a) Manos de personal Cuenta total de Mesofílicos aerobios < 3 000 UFC/manos < 1 500 UFC/mano Cuenta de coliformes totales < 10 UFC/manos < 5 UFC/mano es posible decidir sobre el nivel de contaminación que prevalece sobre las manos del operario. Tomar un hisopo y sumergirlo en la solución diluyente retirando el exceso de líquido. Limpiar bien la superficie de la palma de la mano, así como la superficie interna de dedos y uñas. Repetir la operación tomando muestra de la otra mano. Regresar el hisopo nuevamente al tubo y romper la parte que estuvo en contacto con los dedos. Transferir volúmenes de 1,0 mL y 0,1,0 mL o diluciones de la muestra a cajas de Petri marcadas con la clave, fecha, medio de cultivo y dilución inoculada. Agregar el medio de cultivo seleccionado: • Agar triptona extracto de levadura para cuenta de mesofílicos aerobios • Agar bilis rojo violeta para cuenta de organismos coliformes totales. Añadir doble

capa del mismo medio de cultivo una vez solidificada la primer capa.

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CÁLCULO Y EXPRESION DE RESULTADOS METODO DEL HISOPO Superficie de manos Calcular el número de colonias por mano o manos, multiplicando por el volumen de diluyente empleado y dividirlo entre 2 en el caso de haber muestreado ambas manos. Reportar como UFC/superficie de mano. BIBLIOGRAFIA Procedimiento para el Examen Microbiológico de Superficies y Utensilios. Secretaria de Salud. Dirección General de Epidemiología. Laboratorio Nacional de Salud Pública. México 1990

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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE UN DESINFECTANTE

INTRODUCCION La eliminación adecuada de los microorganismos constituye una fase importante en la higiene de las plantas que elaboran alimentos, esto se puede considerar como uno de los problemas principales en la presencia de enfermedad para los consumidores, en donde el alimento es el vehículo del microorganismo patógeno. Las superficies contaminadas, los utensilios y el equipo mal saneado, constituyen una fuente importante de microorganismos patógenos para los alimentos, por lo que es necesaria la utilización de algunos desinfectantes en estas fuentes de contaminación. La utilización de sustancias como desinfectantes sobre los microorganismos patógenos es de gran interés, el conocer el metabolismo microbiano para entender los mecanismos de acción de los desinfectantes y sus implicaciones prácticas, ha dado lugar a mucha información a fin de desarrollar un concepto más claro, sobre todo de la acción de los desinfectantes más comúnmente utilizados en la Microbiología de los Alimentos. 1.- Mecanismos de acción de los desinfectantes comúnmente usados en la industria alimentaria. La reacción de los desinfectantes con los constituyentes celulares puede involucrar reacciones de óxido-reducción, hidrólisis, formación de sales, transposición con algunos grupos como los de las proteínas, adsorción en la interface, etc., lo anterior puede suceder en partes fundamentales de los microorganismos: lesión a la membrana celular, lesión al núcleo, a los genes y en consecuencia inhibición de las enzimas. 2.- Lesión a la membrana celular: Algunos desinfectantes, como compuestos nitrogenados, fosforados, y los detergentes rompen la barrera osmótica permitiendo la salida de los componentes celulares metabólicamente activos, destruyendo con esto a los microorganismos. Otros desinfectantes como el peróxido de hidrógeno o los compuestos halogenados ejercen su acción antimicrobiana al reaccionar con los compuestos de la membrana citoplasmática. 3.- Lesión al núcleo y a los genes: Algunos agentes tienen afinidad particular por los núcleos o genes de las células microbianas, por ej. Se tiene a los colorantes básicos, como el cristal violeta, los cuales reaccionan con los ácidos nucleicos de las nucleoproteínas quizás para la formación de sales. Los desinfectantes que presentan metales pesados reaccionan con los grupos sulfhidrilo (-SH) de las nucleoproteínas inhibiendo la acción enzimática, interrumpiendo con esto el crecimiento microbiano. Cualquier lesión en los genes se traduce en inhibición de las enzimas que los regulan. Los compuestos como desinfectantes que inhiben a las enzimas se encuentran en el ácido nitroso el cual desamina a ciertas bases del DNA, como a la adenina a la que convierte en hipoxantina, la citosina en uracilo y la guanina en xantina. En este grupo están algunos agentes alquilantes como el óxido de etileno, etilenmetasulfónico y las mostazas nitrogenadas, los cuales actúan por la alquilación de uno o más de los átomos de nitrógeno de las bases del ácido desoxirribonucleico (DNA), causando anomalías en el apareamiento de las bases en la hélice del DNA y también la pérdida posiblemente de una de las bases. Otro grupo de antimicrobianos que reacciona con el DNA y que lo hacen intercalándose entre los pares de las bases son el bromuro de etilo y la proflavina. Los desinfectantes del cloro, iodo y las sales cuaternarias de amonio son los más comúnmente utilizados en la industria de alimentos, presentando ventajas y

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desventajas sobre su utilización. A continuación se mencionan algunas de ellas de los tres grupos de desinfectantes.

DESINFECTANTES VENTAJAS DESVENTAJAS

HIPOCLORITO (oxidación de enzimas esenciales

- Barato - Fáciles de aplicar en

pequeñas cantidades - Se usa en

concentración de 10 ppm

- Tiempo de exposición corto (2 min 100 ppm)

- Actúa contra esporas - Compatible con

detergentes aniónicos

- Es corrosivo - Se inactiva por materia

orgánica - Deja olor y sabor

desagradable

IODOFOROS (inactivación de proteínas por iodinación)

- Se usa en contracción de 200 ppm

- No presenta olor ni sabor

- No mancha - No son irritantes - Tienen cualidades

humectantes y de penetración

- Actúa sobre bacterias, hongos y virus

- Esta incorporado a un detergente tensoactivo aniónico no iónico o catiónico

- No actúan contra esporas bacterianas

- Más claro que el hipoclorito.

- Se inactiva por materia orgánica

SALES CUATERNARIAS DE AMONIO (Tenso activo, rompe membrana celular, inactiva enzimas

- Estables en polvo seco o en pasta

- Sin olor - No es corrosivo - No es irritante de la piel - Tiene poder residual - Se usa en una

concertación de 200 ppm de NH4

- Es más activo en presencia de materia orgánica

- Es efectivo contra microorganismos Gram positivos y Gram negativos

- Actividad antibacteriana limitada

- No es efectivo contra esporas ni muchos virus

- Es neutralizado por jabones

- Pueden crecer microorganismos en él

- Deja película en superficies

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OBJETIVOS: Conocer la acción de los agentes destinados para la limpieza y desinfección de equipo, utensilios, superficies, etc., en una planta procesadora de alimentos. Evaluar la acción de los agentes destinados para lavado y/o desinfección de frutas y verduras. Conocer técnicas utilizadas para evaluar la eficiencia de los desinfectantes. Evaluar la acción de procesos de lavado y/o sanitización o combinación de ellos. PROCEDIMIENTO: Cortar la cantidad necesaria para efectuar evaluaciones de una verdura o fruta cruda sucia, lavada, desinfectada o combinaciones de estas condiciones. Aproximadamente 50,0 g. Utilizar coladera, tabla y un cuchillo limpio para realizar estas operaciones. 1. PRODUCTO SUCIO (sin lavar ni desinfectar) Tomar 10,0 g de la verdura o fruta cruda y sucia y colocar en un frasco de dilución con 90,0 mL de solución diluyente (dilución 10 –1) practicar diluciones hasta 10-4 o las que el técnico analista juzgue convenientes, en tubos con 9,0 mL de solución diluyente. Para cada dilución tomar alícuotas de 1,0 mL, depositar en tantas placas de petri como grupos de microorganismos se quiera determinar y verter el medio de cultivo fundido y enfriado según corresponda. Sugerido: Probar diluciones 10 –1 a10 –4 para la cuenta total de mesofílicos aerobios y 10 –1 a10 –3 para coliformes totales. 2. PRODUCTO LAVADO Depositar 10,0 g de la verdura o fruta cruda y sucia en una coladera y lavarla con una solución jabonosa preparada con detergente en polvo o líquido, enjuagar con suficiente agua del grifo y depositar los 10,0 g de la verdura o fruta (lavada) en un matraz con 90,0 mL de solución diluyente (dilución 10-1) y realizar diluciones hasta 10-3 o las diluciones que el técnico analista juzgue adecuadas, en tubos con 9,0 mL de solución diluyente. Para cada dilución tomar alícuotas de 1,0 mL, depositar en tantas placas de petri como grupos de microorganismos se requiera determinar y verter el medio de cultivo fundido y enfriado según corresponda. Sugerido: Probar diluciones 10 –1 a10 –3 para la cuenta total de mesofílicos aerobios y 10 –1 a10 –2 para coliformes totales. 3. PRODUCTO LAVADO Y DESINFECTADO Preparar un desinfectante comercial en cantidad y tiempo de acuerdo con las indicaciones del producto. Sumergir 10,0 g de la verdura o fruta cruda lavada. Procedimiento.- Escurrir la solución diluyente del matraz 10-1 de la verdura o fruta (producto lavado) del paso anterior. Sumergir en la solución desinfectante durante el tiempo indicado en el marbete del producto. Escurrir los 10,0 g (lavados y desinfectados) y adicionar nuevamente 90,0 mL de solución diluyente (diluyente 10-1) y realizar diluciones hasta 10-2 o las diluciones que el técnico analista juzgue adecuadas, en tubos con 9,0 mL de solución diluyente. Para cada dilución tomar alícuotas de 1,0 mL, depositar en tantas placas de petri como grupos de microorganismos se requiera determinar y verter el medio de cultivo fundido y enfriado según corresponda. Sugerido: Probar diluciones 10 –1 a10 –2 para la cuenta total de mesofílicos aerobios y 10 –1 para coliformes totales. PRODUCTO DESINFECTADO (sin lavar) Preparar el desinfectante comercial en cantidad y tiempo de acuerdo con las indicaciones del producto. Sumergir 10,0 g de la verdura o fruta cruda sucia. Procedimiento.- Sumergir 10,0 g de la verdura o fruta sucia en una solución desinfectante durante el tiempo indicado en el marbete del producto. Escurrir los 10,0

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g (desinfectados) y adicionar nuevamente 90,0 mL de solución diluyente (diluyente 10-

1) y realizar diluciones hasta 10-3 o las diluciones que el técnico analista juzgue adecuadas, en tubos con 9,0 mL de solución diluyente. Para cada dilución tomar alícuotas de 1,0 mL, depositar en tantas placas de petri como grupos de microorganismos se requiera determinar y verter el medio de cultivo fundido y enfriado según corresponda. Sugerido: Probar diluciones 10 –1 a10 –3 para la cuenta total de mesofílicos aerobios y 10 –1 a 10 –2 para coliformes totales. NOTA: En cada uno de los casos (sucia, lavada, desinfectada y/o lavada y desinfectada) se utilizarán las diluciones adecuadas según la experiencia del técnico analista, empleando los medios correspondientes para cada uno de los grupos estudiados, y además se pueden realizar las combinaciones que se requieran, es decir, evaluar el desinfectante sobre la superficie o el producto mismo, habiendo previamente lavado o no o las condiciones seleccionadas. INCUBACION Mesófilos aerobios-Agar cuenta estándar. Incubar a 35± 2/48 ± 2 h. Organismos coliformes totales-Agar bilis y rojo violeta. Añadir doble capa una vez solidificada la primera capa. Incubar a 35± 2 /24 ± 2 h. Hongos y levaduras – Agar papa dextrosa acidificado. Incubar a 26± 2/3-5 días. Incubar a la temperatura y tiempos señalados para cada uno de los grupos microbianos. INTERPRETACIÓN Al finalizar el tiempo de incubación, realizar los recuentos para obtener el % de reducción o efectividad. Interpretación: el producto debe cumplir con el valor de efectividad de 99,0 y 99.9% de reducción en el tiempo de contacto, dosis y bajo las recomendaciones descritas en el marbete de cada producto. EXPRESIÓN Y CÁLCULO DE RESULTADOS. Utilizar la siguiente fórmula para expresar el % de reducción en cada una de las etapas, sucia, lavada, desinfectada y/o lavada/desinfectada:

% de Reducción = 100 – B x 100 A

A = Cuenta inicial B = Cuenta final obtenida Ejemplo 1: Cuenta total de mesofílicos aerobios: Cuenta inicial (sucia) 90 x 104 UFC/g :Con solución desinfectante cuenta obtenida (desinfectada) 8 x 102 UFC/g

% de Reducción = 100 – 8 x 102 x 100 = 99.9 %

90 x 104 Ejemplo 2: Cuenta de grupo colfirme total:

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Cuenta inicial (sucia) 70 x 103 UFC/g Lavada y desinfectada: cuenta obtenida (lavada y desinfectada) 10 UFC/g

% de Reducción = 100 – 10 x 100 = 99.9 %

70 x 103 BIBLIOGRAFÍA Instituto Politécnico Nacional. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas.

Departamento de Microbiología. Manual de Laboratorio de Microbiología Sanitaria. Association of Official Analytical Chemist. (1995). Official Methods of Analysis. 16 th Ed. AOAC 960,09. Arlington, VA. Instituto Mexicano del Seguro Social. (1990). Actividades Antimicrobianas de Sanitizantes, Germicidas y Detergentes. México, D. F. Banwart G. S. (1979). Microbiología Básica de los alimentos. Ed. Bellaterra. España. Frobisher, Hinsdill, Crabtree, (1974). Fundamentals of Microbiology. Ed. W. B. Saunders Company. USA. Gamboa, H. J. & Vela, A. H. (1985). Mecanismo de acción de los desinfectantes comúnmente usados en las plantas de alimentos. Trabajo de Microbiología de alimentos. Laboratorio de M. Sanitaria. IPN: Reddrish, G. F. (1961). Antiseptics, Desinfectants, Fungicides, and Chemical and Physical sterilization. Lea and Febiger 2a. ed. USA.

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MONITOREO DEL MEDIO AMBIENTE.

OBJETIVO

El monitoreo e identificación de los microorganismos del ambiente permitirá conocerlos y probar que desinfectantes o germicidas pueden atacarlos para controlar las áreas, ya sean cuartos limpios, de preparación estériles o no estériles, y cualquier área de interés particular.

EQUIPO Y MATERIAL • Incubadora a diferentes temperaturas. • Microscopio. • Cuenta colonias. • 1 placa de agar cuenta estándar • 1 placa de agar bilis y rojo violeta • 1 placa de agar papa y dextrosa

PROCEDIMIENTO

NOTA: Medios de cultivo.- El medio de cultivo de donde se aíslan principalmente los microorganismos ambientales, es Agar Cuenta Estándar Tripticaseina. Se utiliza Agar Sabouraud o Agar Papa Dextrosa, para la investigación específica de hongos y levaduras, Agar BRV, para la investigación del Grupo Coliforme y agares selectivos y/o diferenciales para patógenos.

Técnica de sedimentación en placa.- Las placas con los medios de cultivo para monitoreo de los 3 grupos de microorganismos indicadores, se exponen al medio ambiente seleccionado, retirando la tapa de cada placa y colocando ésta boca abajo. Se sugiere colocar las placas con los medios de cultivo lo más cercanas entre sí, para que la calidad del medio ambiente monitoreado sea homogénea. Después de 15 minutos de exposición, las placas se tapan e incuban a 35 + 2 ºC/48 + 2 h. (bacterias) o 26 + 2 ºC / 3-5 días (hongos y levaduras). Considerar que el volumen de aire monitoreado tras exponer durante 15 minutos las placas con los medios de cultivo, equivale a 1 m3.

Efectuar el cómputo por placa de medio de cultivo utilizado para cada grupo microbiano. Reportar el cómputo de cada grupo microbiano en UFC/m3. Opcional: después de registrar características de desarrollo y morfología colonial, hacer un frotis (ver al mismo tiempo, consistencia de colonia, color, bordes, elevación, tamaño). Teñir con Gram y cuando sea necesario con otro colorante. Observar al microscopio.

Las observaciones microscópicas, identificarán si son microorganismos Gram positivos ó Gram negativos, a veces se observan mezclados de una sola colonia, cocos Gram negativos con bacilos de diferentes tamaños Gram positivos, negativos ó amorfos.

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LÍMITE MÁXIMO PERMITIDO EN MEDIO AMBIENTE

Prueba Límite permitido

Mesofílicos aerobios ≤ 15 UFC/m3 Coliformes totales 0 UFC/ m3

Hongos y levaduras

≤ 15 UFC/m3 (para la sumatoria de ambos cómputos)

Fuente: Standard Methods for the examination of Dairy Products.

BIBLIOGRAFIA

Manual of Food Quality Control. 12. Quality Assurance in the Food Control Microbiological Laboratory. FAO.- Rome, 1991. Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 16 th Ed. (1992). Robert T. Marshall, Ph D, Editor. APHA, Washington D. C. Garantía de Calidad de los Laboratorios de Microbiología Alimentaria. Organización Panamericana de la Salud. Organización Mundial de la Salud. Yolanda Ortega Dávalos. Fernando Quevedo. Copyright 1991. México, D. F.

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PRUEBA DEL RETO MICROBIANO.

OBJETIVO

El método se basa en determinar el porcentaje de reducción de un número determinado de microorganismos, cuando se pone en contacto con un germicida bajo condiciones de pruebas específicas.

MATERIAL

• Matraces Erlenmeyer de 250,0 mL, boca ancha con tapa de rosca. • Probetas graduadas. • Pipetas serológicas y bacteriológicas. • Tubos de ensayo sin labio de 20,0 x 150,0 mm. • Cajas Petri. • Frasco cuadrado de dilución de boca ancha con tapas de vinilo o baquelita. • Baño de agua controlado a 25 ºC. • Gradillas para los tubos • Asa de 4,0 mm de diámetro y de 5,0-7,0 cm de longitud con porta asa.

MICROORGANISMOS DE PRUEBA

Staphylococcus aureus ATCC 6538

Escherichia coli ATCC 11229

Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442-2

Nota.- Determinar su resistencia al fenol cada tres meses. La resistencia de E.coli debe ser similar a la de S.typhi con base en la sección 960,09 del AOAC (1995) y la de S.aureus equivalente a las especificadas para este microorganismo en la sección 960,09 del AOAC (1995) p.70-71.

PROCEDIMIENTO 1. Conservación y preparación de los microorganismos de prueba. Conservar las cepas del microorganismo, resembrándolas quincenalmente en tubos de 16,0 x 125,0 mm de agar nutritivo inclinado. Incubar a una temperatura de 35-37 ºC por un periodo de 20-24 horas. Posteriormente mantener los cultivos en refrigeración. Antes de realizar la prueba, efectuar 2 resiembras diarias consecutivas, incubando en las condiciones indicadas anteriormente. A partir de estos cultivos, resembrar 5 tubos de 22 x 175mm que contengan 12,0 mL de agar nutritivo inclinado e incubar bajo las condiciones antes señaladas. Recuperar

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el crecimiento de cada tubo con 1,5 mL de solución salina estéril 0,85 % y estandarizar la suspensión en condiciones asépticas al 9,0% de transmitancia a 580,0 nm ó 10,0% de transmitancia a 650,0nm para obtener un promedio de cuenta bacteriana de 10,2 x 109 UFC/mL. Verificar por cuenta en placa, conservando la suspensión original en refrigeración. 2. Preparación de la muestra. Usar el producto a la concentración señalada por el fabricante (directo o diluido). Medir exactamente y por duplicado 99,0 mL del producto o su dilución. Transferir a un matraz Erlenmeyer de 250,0 mL, estéril con tapón de rosca. Preparar otros 2 matraces con solución reguladora de fosfatos diluida estéril, los cuales se emplean para determinar el número inicial de microorganismos: (Matraz con 99,0 mL (solución reguladora de fosfatos) + 1,0 mL de cultivo estandarizado (10,2 x 109 UFC/mL= 75-125 x 106 UFC/mL) = Control “Cuenta Inicial”. 3. Inoculación. Agitar el matraz y suspender la agitación justamente antes de la inoculación para que en el momento de la misma, aún exista un movimiento residual y así facilitar la incorporación del inóculo. Inocular individualmente 1,0 mL de la suspensión del microorganismo en el centro y sobre la superficie del líquido, evitando tocar con la pipeta el cuello o las paredes del matraz durante la inoculación. Agitar y exactamente a los 30 segundos de la inoculación, transferir 1,0 mL del cultivo expuesto a 9 mL de la solución neutralizante; mezclar y transferir alicuotas de 1,0 mL y 0,1 a cajas petri estériles por dulicado agregar de 12,0-15,0 mL de medio agar para métodos estándar con neutralizador (C). Homogeneizar, solidificar, invertir e incubar las placas durante 48 horas a 35-37 ºC. 4. Determinación de la cuenta inicial. Transferir 1,0 mL de la suspensión microbiana (1,.2 x 109) a 99,0 mL de la solución amortiguadora de fosfatos diluida y efectuar una lectura de 580,0 nm esperando que dé 9,0 % y a 680,0 dé 10,0 % . Hacer las diluciones decimales necesarias para obtener placas que contengan entre 30 y 300 colonias por placa de la dilución inicial (1:100) hacer diluciones 1:99 (aprox.). Colocar alícuotas de 1,0 mL por duplicado de cada dilución en cajas de petri estériles y de la última dilución, transferir alícuotas de 1,0mL y 0,10 mL por duplicado. Agregar 12,0-15,0 mL de agar para métodos estándares solidificar. Invertir e incubar las placas 48 horas a 35-37ºC. Después del periodo de incubación de todas las placas (control de inóculo y del producto), contar las UFC y ver el por ciento de reducción del producto. Para que la prueba sea válida, el número de microorganismos en la suspensión del matraz 1:100, debe estar entre 75 y 125 x 106 UFC/mL. Para muestras que se analicen cada día, deben correrse paralelamente con un testigo del inóculo en igualdad de condiciones. 5. Interpretación. El producto debe cumplir con el valor de efectividad de 99,0 y 99.9,0 % de reducción a los 30 segundos de contacto.

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EXPRESIÓN DE RESULTADOS.

% de Reducción = 100 - B x 100 A En donde, A = Cuenta inicial B = Cuenta obtenida Ejemplo 1: S aureus Cuenta Inicial 90 x 106

En germicida A Cuenta Obtenida 8 x 102

% de reducción = 100 - 8 x 102 x 100 = 99,999% 90 x 106 Ejemplo 2: S.aureus Cuenta Inicial 90 x 106 En germicida B Cuenta Obtenida 8 x 103 % de reducción = 100 - 8 x 103 x 100 = 99,98% 90 x 106 Ejemplo 3: S. aureus Cuenta Inicial 110 x 106 En germicida B Cuenta Obtenida 50 x 104

% de reducción = 100 - 50 x 104 x 100 = 99,55% 110 x 106

BIBLIOGRAFÍA AOAC Official Methods of Analysis. 1995 Sección 960,09 16th Ed. p.70-71. Actividades Antimicrobianas de Sanitizantes, Germicidas y Detergentes IMSS-1990.

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MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES

Agar Nutritivo

Extracto de carne 3,0 g Peptona de gelatina 5,0 g Agar 15,0 g Agua destilada 1,0 L pH final 5,8 +/- 0,2

Métodos Estándar para, agar Peptona de caseína 5,0 g Extracto de levadura 2,5 g Dextrosa 1,0 g Agar 15,0 g Agua destilada 1,0 L Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada, calentar hasta ebullición para disolver por completo y ajustar el pH a 7,0 ± 0,2 a 25°C. Distribuir en tubos de ensayo con tapón de rosca o en un matraz, después esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 45-50°C y vaciar en cajas Petri. Puede volverse a fundir una sola vez cuando se necesite.

Medios de agar para cuenta estándar, con neutralizante. Igual que agar para métodos estándar, excepto que hay que adicionar 25,0 mL de solución neutralizante y preparar. Pesar y re suspender la cantidad de cada uno de los medios indicados por el fabricante para un litro de agua. Disolver por calentamiento hasta ebullición durante un minuto. Envasar de acuerdo a las necesidades y esterilizar a 121 ºC durante 15 minutos.

Solución neutralizante Azolecitano (lecitina de soya) 40,0 g Polisorbato 80 280,0 g Solución amortiguador de fosfatos 0,25 M 1,25 mL

Mezclar los ingredientes, disolverlos en agua destilada hasta obtener un volumen final de un litro; ajustar el pH a 7,2 y distribuir en porciones de 9,0 y 99,0 mL. Esterilizar a 121 ºC durante 15 minutos.

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Solución amortiguadora de Fosfatos 0,25 M.

Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4) Agua destilada. En un matraz volumétrico disolver el KH2PO4 en 500,0 mL de agua destilada ajustar el pH a 7,2 +/- 0,1 utilizando solución de NaOH 0,1 N. Llevar al aforo con agua destilada, mezclar y distribuir en porciones de 100 mL esterilizar a 121 ºC durante 15 minutos y conservar en refrigeración.

Solución amortiguadora de fosfatos diluida.

Tomar 1,25 mL de solución amortiguadora de fosfatos 0,25 M y transferirla a un matraz volumétrico de 1,0 L. Llevar al aforo con agua destilada. Mezclar y distribuir en tubos y matraces proporciones de 9,0 y 99,0 mL respectivamente esterilizar a 121 ºC durante 15 min.