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M.C. Productos Naturales y Alimentos
Métodos Instrumentales Modernos
Espectrometría de Masa
Dr. Raúl Salas Coronado
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Principios
El primer paso en el análisis espectrométrico de compuestos es la
producción de iones en fase gaseosa de los compuestos. Por ejmplo por
ionización de electrones
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Este ion molecular sufre normalmente fragmentaciones. Debido a esto
es un catión radical con un número impar de electrones y se puede
fragmentar para producir un radical y un ion con un número par de
electrones, o una molécula y un nuevo catión radical. Se debe enfatizar
en la diferencia importante entre esos dos tipos de iones y la necesidad
de escribirlos correctamente
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Ion par
Ion impar
Radical
Molécula
Espectro de masa del metanol por ionización
electrónica
Gráfica Tabla
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Datos de fragmentación presentados en
forma de gráfica o tabular
(a) Espectro de la fragmentación del metanol; (b) Representación no convencional del mismo espectro en forma de un diagrama circular: estadísticamente, para 321 iones formados, hay 100 de masa = 31 u (Da), 72 de masa 29, etc. Los diversos iones constituyen diferentes poblaciones; (c) Sección de una adquisición de alta resolución de un compuesto presentando dos iones con una relación m/z muy cercana (una debido a la pérdida de CO y la otra debido a la pérdida de C2H4).
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La mayoría de los iones positivos tienen una carga correspondiente a la pérdida
de sólo un electrón. Para moléculas grandes, se pueden obtener iones con carga
múltiple. Los iones se separan y detectan de acuerdo a la relación de masa/carga.
La carga total de los iones se representa generalmente por q, la carga de los
electrones por e y el número de cargas de los iones por z:
Generalmente en espectrometría de masa, la carga está indicada en múltiplos de
la carga elemental o carga de un electrón en valores absolutos (1 e = 1.602177 x
10-19 C) y la masa está indicada en unidades de masa atómica ( 1 u = 1.660540 x
10-27 kg). La relación de masa/carga (u/e) se mide en Thompson.
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y
Las masas
La diferencia en la masa promedio, nominal y monoisotópica puede ser de
hasta varios Da, dependiendo del número de átomos y su composición
isotópica. El tipo de masa determinada por espectrometría de masa depende de
la resolución y exactitud del analizador.
Consideremos como un ejemplo al CH3Cl. Los átomos de cloro son mezclas de
dos isótopos, cuyas masas exactas son 34.968 852 u y 36.965 903 u. Sus
abundancias relativas son 75.77 % y 24.23 %, respectivamente.
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Tabla de isótopos en orden de masa ascendente
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Ejemplo
La insulina humana, es una proteína que tiene la fórmula molecular
C257H383N65O77S6. La masa nominal de la insulina es 5801 u usando la masa
entera de los isótopos más abundantes de cada elemento, 12 u para el carbono, 1 u
para el hidrógeno, 14 u para el nitrógeno, 16 u para el oxígeno y 32 unidades para
el azufre. Su masa monoisotópica, 5803.6375 u se calcula usando las masas
exactas de los isótopos predominantes de cada elemento, tal como C = 12.0000 u,
H = 1.0079, N = 14.0031 u, O = 15.9949 u y S = 31.9721 u.
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Espectros de masa de patrones isotópicos
de dos alcanos
La masa monoisotópica es la masa más ligera de los patrones isotópicos, mientras que
la masa promedio, usada por los químicos en cálculos estequiométricos, es el valor
promedio balanceado de todas las masas observadas.
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Diagrama espectrómetro de masa
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Un espectrómetro de masa realiza los
siguientes procesos
1. Produce iones a partir de muestras en la fuente de ionización
2. Separa esos iones de acuerdo a su relación masa/carga en el analizador de
masa
3. Eventualmente, fragmenta los iones seleccionados y analiza los fragmentos
en un segundo analizador
4. Detecta los iones emergentes desde el último analizador y mide su
abundancia con el detector que convierte los iones en señales eléctricas
5. Procesa las señales del detector que son transmitidas a la computadora y
controla el instrumento a través de una retroalimentación.
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Camino libre de iones
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De acuerdo a la teoría cinética de los gases, el camino libre promedio L (en
metros) está dado por:
Donde k es la constante de Boltzmann, T es la temperatura (en K), p es la
presión (en Pa) y σ es la sección transversal de colisión (en m2); σ =•d2.
Donde d es la suma de los radios de la molécula estacionaria y el ion
colisionante (en m). De hecho, uno puede aproximar el camino libre promedio
de un ion bajo condiciones normales en un espectrómetro de masa (k = 1.38 x
10-21 JK-1, T ≈ 300 K, σ ≈ 45×10−20 m2)
Ecuaciones simplificadas para calcular el
camino libre de iones
P(Pa)
P(mTorr)
L(cm)
En un espectrómetro de masa, el camino libre promedio debe ser al menos de 1 m
y por lo tanto la presión máxima debe ser de 66 x 10-9 bar. En instrumentos que
usan fuentes de alto voltaje, la presión debe ser reducida adicionalmente para
prevenir las descargas. En contraste, algunos instrumentos basados en trampas
operan a presiones altas.
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Métodos de ionización molecular en
espectrometría de masa Tipo de ionización Agente ionizante Presión Usos
Ionización electrónica (EI)
Electrones con
energía de 20 a
110 eV
10-4 – 10-6 torr
Fragmentación
extensiva, permite
determinación de
estructura; GC/MS
Ionización química (CI) Iones gaseosos 1 torr Determinación de masa
molecular; GC/MS
Ionización por desorción
(DI)
10-5 – 10-6 torr
Bombardeo de átomos
rápido (FAB)
Argón energético
u otros átomos
neutros
Masa molecular y estructura
de compuestos no volátiles
de masa alta en fase
condensada
Desorción por láser (LDI)
y asistida por matriz
(MALDI)
Fotones
energéticos
Ionización por
electroespray (ES)
Campo eléctrico;
iones en solución
Presión atmosférica o
ligeramente reducida
HPLC/MS y CE/MS
Ionización química a
presión atmosférica
Descarga de
corona; iones
gaseosos
Presión atmosférica HPLC/MS
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Ionización electrónica
Diagrama esquemático de una fuente de ionización electrónica típica (EI). Las muestras pueden entrar a la
fuente a través de una columna capilar de GC, una sonda caliente
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Imán colimador
Placa focalizadora de
iones (-V)
Placa extractora (-V)
Colector (+V)
A analizador de masa
Filamento de
tungsteno-renio
Apertura de electrones
Salida de la columna capilar
(Fuera del plano de la diapositiva)
(Cuando está presente, ocasiona que los
electrones sigan una trayectoria
helicoidal)
Repulsor (+V)
Los electrones adquieren energía por
una diferencia de potencial (voltaje).
1 eV = 23 kcal
La energía de ionización de una
molécula está en el orden de 1-5 eV
Tipos de reacciones de ionización
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Iones detectados por MS-EI positiva se muestran en negritas
Energía vs longitud de onda
Cada electrón está asociado a una onda cuya longitud de onda está dado por:
Donde m es su masa, su velocidad y h es la constante de Planck. Esta
longitud de onda es 2.7 Å para una energía cinética de 20 eV y 1.4 Å para 70
eV
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Número de iones producidos como una
función de la energía del electrón
Un máximo aparece en alrededor de 70 eV.
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Núm
ero
de iones
pro
duci
dos
por
cm d
e c
amin
o lib
re d
e
iones
y por
mm
Hg
de p
resi
ón
Energía de los electrones (eV)
Número de iones producidos
A un potencial de aceleración y a una temperatura constante, el número de
iones I producidos por unidad de tiempo en un volumen V relaciona a la
presión p y a la corriente de electrones i a través de la ecuación siguiente,
donde N es una constante de proporcionalidad:
Esta ecuación muestra que la presión está directamente relacionada con la
corriente de iones resultante. Esto permite sea usada en mediciones
cuantitativas.
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I = NpiV
Dos espectros de -lactama
Mientras la intensidad relativa del ion molecular es más grande a energías de
ionización más bajas, su intensidad absoluta, es menor.
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Ionización Electrónica vs Ionización
Química
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Ionización Química (CI)
A diferencia de la (EI), en la cual las moléculas son ionizadas a través de las
interacciones con electrones de energía alta, la CI depende de colisiones de
iones y moléculas. En CI de iones positivos la muestra es ionizada por la
reacción con iones generados dentro de un gran exceso de un gas reactivo de
masa molecular baja tal como el metano (como CH5+), isobutano [(CH3)3C
+], o
amoniaco (NH4+), a una presión de alrededor de 1 torr.
Algunos iones de gases reactivos se forman por reacciones ion/molécula:
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Otros se forman por descomposición unimolecular del M+•, por ejemplo:
Otros gases reactivos
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Espectro de masa del metacrilato de
butilo
Ionización electrónica
Ionización con metano
Inoización con
isobutano
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Formación de aductos en ionización
química con isobutano
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Compuesto puro
Mezcla de dos
compuestos con masas de
261 y 270. Ellos
corresponden a la pérdida
de HCN y H2O,
respectivamente
Ionización química por transferencia de
carga
Gases raros, nitrógeno, monóxido de carbono y otros gases con potencial de
ionización alto reaccionan por intercambio de carga:
Se obtiene un catión radical, como en EI, pero con un contenido de energía más
pequeño. Consecuentemente, se observa una menor fragmentación. En la práctica,
esos gases no se usan con frecuencia.
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Metano como gas reactivo
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Si el metano se introduce a la fuente de ionización, la primera reacción con los electrones
es una reacción clásica de Ionización Electrónica (EI):
El ion se fragmentará, principalmente a través de las reacciones siguientes:
Sin embargo, sobre todo, colisionará y reaccionará con otras moléculas de metano
produciendo:
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Otras reacciones ion-molécula con metano ocurrirán en la fuente de ionización, tal como:
Un ion C3H5+ se forma por las reacciones sucesivas siguientes:
Espectro del plasma de ionización del metano a 20 Pa
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La intensidad relativa depende de la presión en la fuente
Inte
nsi
dad
rela
tiva
Para M = hidrocarburos saturados
Para M = moléculas polares
Para M = cualquier tipo de moléculas
menos hidrocarburos saturados
Espectro del plasma de ionización de isobutano a 20 Pa
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Inte
nsi
dad
rela
tiva
Espectro de un plasma de ionización de
amoniaco a 20 Pa
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Inte
nsi
dad
rela
tiva
En este gas, el modo de ionización dependerá de la naturaleza de la muestra. Las moléculas
básicas, principalmente las aminas, se ionizarán a través de la transferencia de un protón:
Formación de iones negativos
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Todos los plasmas de CI contienen electrones de energía baja, emitidos ya sea
directamente desde el filamento pero desactivados a través de colisiones, o
principalmente desde las reacciones de ionización primaria las cuales producen dos
electrones de energía baja. La interacción de electrones con moléculas conduce a
iones negativos por tres mecanismos diferentes
Captura por resonancia asociativa se produce con electrones de 0-2 eV.
Captura por resonancia disociativa se produce con electrones de 0-15 eV
Captura por resonancia asociativa
Captura por resonancia disociativa
Producción de par de iones
Ionización de campo
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Un potencial eléctrico colocado a través de una aguja y una electrodo plano (placa). Las líneas
de equipotencialidad en el campo eléctrico resultante se centra alrededor de la punta de la
aguja, donde el campo eléctrico se hace muy grande.
En la práctica se utiliza un potencial de 5000 V con radios de 0.1 mm.
Espectros de masa de ionización de campo vs
ionización electrónica
La intensidad del campo eléctrico utilizado en éste método de ionización se produce
generalmente por una diferencia de potencial de 8-12 kV que se aplica entre un
filamento llamado el emisor un contra-electrodo localizado a unos pocos milímetros de
distancia.
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Ionización electrónica
Ionización de campo
Bombardeo de Átomos Rápidos y la espectrometría
de masa de iones secundarios en fase líquida
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1. Ionización del argón.
2. Entrada
3. Los iones argón intercambian carga con
átomos neutros, por lo que se transforman en
átomos de Ar rápidos.
4. Todas las especies iónicas son desviadas.
Solamente los átomos rápidos alcanzan la
muestra disuelta en glicerol.
5. Los iones expulsados desde la gota son
acelerados por un “pusher”, 6, y focalizados
por electrodos, 7, hacia el analizador 8.
Ionización por desorción con láser
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La ionización por desorción con láser (LDI) es un método eficiente para producir iones
gaseosos. Generalmente, un pulso de láser produce de 106 a 1010 W*cm-2 que es enfocado
sobre una superficie de muestra de 10-3-10-4 cm-2.
Debido a que las señales son muy cortas, se requieren analizadores de tiempo de vuelo
(TOF). La probabilidad de obtener un espectro de masa útil depende críticamente de las
propiedades físicas específicas del analito (por ejemplo, fotoabsorción, volatilidad, etc.)
Ionización por desorción láser asistida
con matriz (MALDI) MALDI se logra en dos etapas.
1. La muestra a ser analizada se disuelve en un disolvente conteniendo moléculas orgánicas en
solución, llamada la matriz. Esas moléculas deben absorber fuertemente a la longitud de
onda del láser.
2. La mezcla es deshidratada antes del análisis y cualquier disolvente líquido usado en la
preparación de la solución es removido. El resultado es un depósito de “solución sólida” de
cristales de matriz dopados con analito.
Las moléculas de analito quedan embebidas a través de toda la matriz, por lo que quedan
completamente aisladas las moléculas de analito unas de otras.
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Espectros de masas obtenidos con una fuentes
ionización MALDI
Espectro MALDI de un anticuerpo monoclonal (Izquierda) y de un polímero PMMA 7100
(Derecha)
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Algunos láseres comunes usados para MALDI
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Láser Nd:YAG (del inglés neodymium-doped yttrium aluminium garnet) es una
emisión láser en medio sólido que utiliza el dopaje con neodimio en cristales de
óxido de itrio y aluminio.
Er = Erbio
Algunas matrices para UV-MALDI
comunes
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