CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS AVANZADOS DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD DE BIOTECNOLOGÍA E INGENIERÍA GENÉTICA DE PLANTAS DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA GENÉTICA

“Uso de genes involucrados en la inmunidad innata vegetal como estrategia para conferir resistencia ante bacterias fitopatógenas en jitomate (Solanum lycopersicum), por medio de ingeniería genética”

Tesis que presenta:

M.C. Marco Miguel Plancarte De la Torre

Para obtener el grado de Doctor en Ciencias en la especialidad de:

Biotecnología de plantas.

Director de tesis: Dr. Miguel Ángel Gómez Lim.

Irapuato, Guanajuato. Agosto de 2016.

[I]

Este trabajo fue realizado en el Laboratorio de

Biotecnología de Plantas y Microorganismos del

Departamento de Ingeniería Genética de la Unidad Irapuato

del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del

Instituto Politécnico Nacional, bajo la asesoría del Doctor

Miguel Ángel Gómez Lim.

[II]

Director de Tesis:

Dr. Miguel Ángel Gómez Lim.

Sinodales: Dr. John Paul Délano Frier. Dr. Víctor Olalde Portugal. Dra. Laila Pamela Partida Martínez.

Sinodal externo: Dr. Eugenio Martín Pérez Molphe-Balch.

[III]

AGRADECIMIENTOS

El trabajo presentado en esta Tesis no podría haber sido culminado

exitosamente sin la ayuda y colaboración de muchísimas personas muy valiosas que,

de alguna u otra manera, contribuyeron en algo al desarrollo del mismo y a mi

formación profesional y humana. A todos ustedes, todo mi reconocimiento y mi más

sincero agradecimiento.

A Dios, por permitirme llegar con salud a este punto de mi vida, y por poner

en mi camino a tantas personas maravillosas.

A mi familia, por su apoyo incondicional, por estar ahí siempre que los he

necesitado, por cobijarme con su cariño, por enseñarme que la familia es lo primero,

por tantos y tantos buenos momentos a lo largo de mi vida.

Al Dr. Miguel Ángel Gómez Lim, por abrirme las puertas de su laboratorio

desde hace 15 años para un verano científico, y de nuevo varios años después como

estudiante de doctorado. Por confiar en mí, por su guía y su apoyo a lo largo de todo

este tiempo.

A mis sinodales, la Dra. Laila Pamela Partida Martínez, el Dr. John Paul Délano

Frier y el Dr. Víctor Olalde Portugal. Por sus sabios consejos y observaciones, las

cuales ayudaron en mucho al enriquecimiento de este trabajo. Al Dr. Eugenio Pérez

Molphe-Balch, por toda su ayuda a mi formación académica al ser mi maestro en la

Carrera y en la Maestría, mi director de tesis en la Maestría y mi sinodal externo en

el Doctorado.

A Luis Jorge Saucedo Arias, José Luis Hernández Chávez y Brisia Alejandra

Aguilar Barragán, todos ellos auxiliares del laboratorio en diferentes puntos de mi

proyecto de Doctorado, por toda la ayuda y consejos técnicos brindados.

[IV]

A todo el personal del Cinvestav que, con su trabajo diario, nos facilitan la vida

a los estudiantes. A todas las secretarias, al personal de invernaderos, al de medios,

al de almacén y compras, al de mantenimiento, al de intendencia. De manera

especial a Dora Elia Anguiano Jaime por toda la ayuda y por ser un ejemplo de

eficiencia, a Leticia Chong y a Laura Camacho que siempre fueron muy serviciales, y

a Antonio Cisneros por su ayuda con las fotos y por su apoyo al Cineclub.

A mis amigos del Cinvestav, con los que he compartido tantos buenos

momentos y que se convirtieron en mi familia irapuatense. A los que aún siguen en

el Cinvestav pero también a los que ya han seguido su camino. A Nelly Vázquez, a

Margarita López, a Víctor Vázquez, a Lina Escobar, a Anny Vallejo, a Paco Castillo, a

Nancy Coconi, a Dennis Magaña, a Andrea Palmeros, a Diana Zavala, a Luis Miguel

Alfaro, a Rafa González, a Cristian López, a Eliana Valencia, a Fernando Suárez, a

Yardena García, a Uriel Rojas, a Laura Uribe, a Beto Medina, a Mayté Jiménez.

A todos aquellos con los que he convivido en diferentes grupos y actividades.

A los que formaron parte de los equipos de volley en los que estuve (Real-coholicos,

Mumzilla, Me hago Doctor y los Majos), a las chicas de las Rabiosas y Rabiozonas, a

los miembros anteriores y actuales del Cecig, y a los que me apoyaron con el

proyecto del Cineclub y me ayudaron a mantenerlo con vida.

A Kena, por aparecer en el momento oportuno, por atreverse, por correr el

riesgo, por ser como es, por quererme como soy. Por existir.

Finalmente quiero dar gracias al Conejo Nacional de Ciencia y Tecnología por

haberme apoyado con la beca doctoral 161889, la cual fue de gran ayuda para poder

llevar a su culminación este proyecto de investigación.

[V]

Dedicatorias…

Este trabajo está dedicado a mi familia.

A mis padres, Lupita y Ángel.

A ustedes les debo todo lo que soy, y sólo les

puedo pagar con mi eterno agradecimiento y amor.

A mis hermanos, Anilú y Ángel.

Mis primeros amigos, mis compañeros de infancia,

mis cómplices. Siempre estaré muy orgulloso de ustedes.

A mis sobrinas, Valeria y Carolina.

Una, un ejemplo de tenacidad y fortaleza; la otra, siempre

traviesa, alegre y cariñosa. Las dos, el amor fraternal.

A mis tías, Lula y Mela.

Pocas personas tienen la fortuna de crecer con tres mamás.

Yo la tuve.

[VI]

[VII]

ÍNDICE

COMITÉ DE SINODALES................................................................................. II

AGRADECIMIENTOS……………………………………………………………………………...... III

DEDICATORIAS…………………………………………………………………......................... V

ÍNDICE……………………………………………………………………………………................... VII

ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS……………………………………………………................ VIII

RESUMEN………………………………………………………………………………………........... X

ABSTRACT…………………………………………………………………………………................ XI

I. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………...................1

I.1 Las plantas y sus enfermedades……..………………………………………... 2

I.2 El sistema inmune innato vegetal……………………………………………… 8

I.3 El modelo de estudio y sus patógenos bacterianos…………………… 20

I.4 Inducción de resistencia a bacterias en cultivos por medio de

ingeniería genética…………………………..……………………………….... 29

I.5 Particularidades, innovaciones e hipótesis………………………………… 33

II. OBJETIVOS……………………………………………………………………………………………. 35

III. ESTRATEGIAS EXPERIMENTALES………………………………………………………….. 37

IV. RESULTADOS……………………………………………………………………………………….. 45

IV.1 Diseño de oligonucleótidos y aislamiento de los genes EFR,

BAK1 y FLS2….......................................................................... 45

IV.2 Clonación de los genes EFR, BAK1 y FLS2 en células de

Escherichia coli….............……................................................... 47

IV.3 Construcción del casete utilizado en la transformación

de plantas................................................................................ 48

IV.4 Transformación genética de jitomate……………………………………… 60

IV.5 Pruebas moleculares………………………………………………………………. 62

IV.6 Retos con bacterias fitopatógenas………………………………………….. 67

IV.7 Análisis por PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)……………….. 77

V. DISCUSIÓN…………………………………………………………………………………………… 79

VI. CONCLUSIONES…………………………………………………………………………………... 87

VII. PERSPECTIVAS……………………………………………………………………………………. 89

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………………………………………….. 93

[VIII]

ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS

Figura 1. Vector LJMS……………………………………………………………………………….. 39

Figura 2. Mapa de los genes EFR, BAK1 y FLS2……………………………………….... 45

Figura 3. Amplificación de los genes EFR, BAK1 y FLS2……………………………... 46

Figura 4. Genes BAK1, FLS2 y EFR clonados en E. coli…………………………....... 47

Figura 5. Enlazadores génicos…………………………………………………………………... 48

Figura 6. Plásmido pBlueScript SK (+)-Enlazador EUB-BAK1……………………... 51

Figura 7. Plásmido pBlueScript SK (+)-Enlazador BUF-FLS2……………………….. 52

Figura 8. Parches para añadir sitios de restricción al inicio y al final

de la construcción…………………………………………………………....... 54

Figura 9. Plásmido pJET1.2 conteniendo el gen EFR editado con BamHI…... 55

Figura 10. Plásmido pBlueScript SK (+) conteniendo el enlazador BUF

y el gen FLS2 editado con SalI………………………………………........ 56

Figura 11. Construcción completa del casete usado para la

transformación de las plantas…………………………………………..... 57

Figura 12. Análisis de mapeo por restricción del casete

EFR-UB-BAK1-UB-FLS2 clonado dentro del vector LJMS…….... 58

Figura 13. Proceso de transformación y regeneración de las plantas

de jitomate.............................................................................. 60

Figura 14. Ensayos de GUS en tejidos de jitomate………………………………….... 63

Figura 15. Germinación y desarrollo de plantas de jitomate F1-F4…………... 64

Figura 16. Evidencia molecular de la transformación de jitomate………….... 66

Figura 17. Cepas bacterianas utilizadas para los retos a las plantas

transgénicas….......................................................................... 67

Figura 18. Desarrollo de síntomas ante la infección con

P. syringae pv. syringae…........................................................ 69

Figura 19. Conteo de unidades formadoras de colonia para la infección

con Pseudomonas syringae pv. syringae…………………………..... 70

Figura 20. Desarrollo de síntomas ante la infección con

P. syringae pv. tomato….......................................................... 72

Figura 21. Conteo de unidades formadoras de colonia para la infección

con Pseudomonas syringae pv. tomato…………………………....... 73

Figura 22. Desarrollo de síntomas ante la infección con

Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis…………………. 75

[IX]

Figura 23. Conteo de unidades formadoras de colonia para la infección

con Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis…………...76

Figura 24. Análisis por PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) de las

líneas transgénicas de jitomate.................................................................... 78

Tabla 1. Detalles de la primera estrategia que se siguió para la

construcción del casete…………………………………………………….... 49

Tabla 2. Detalles de la segunda estrategia que se siguió para la

construcción del casete………………………………………………………. 50

Tabla 3. Detalles de la tercera estrategia que se siguió para la

construcción del casete…………………………………………………....... 53

Tabla 4. Detalles de la estrategia que se siguió para la construcción

final del casete dentro del vector LJMS……………………………….. 57

[X]

RESUMEN

Las enfermedades de las plantas exacerban el actual problema de hambruna

que azota a buena parte de la población mundial. Los recientes avances en genómica

y genética molecular de la patogénesis y de la resistencia del hospedero, dan

esperanzas de nuevas soluciones para muchas enfermedades importantes de los

cultivos. Para defenderse contra infecciones, las plantas responden a moléculas

básicas y características de los patógenos llamadas patrones moleculares asociados

a patógenos (PAMPs por sus siglas en inglés), lo que activa respuestas de inmunidad

basal conocidas como inmunidad activada por PAMP (PTI por sus siglas en inglés). Es

posible que la actividad de los receptores de reconocimiento de PAMPs se mantenga

después de su transferencia entre familias vegetales. El objetivo de este trabajo fue

transferir los genes EFR, FLS2 y BAK1, involucrados en el reconocimiento de PAMPs

y en la activación de la PTI en Arabidopsis, a plantas de jitomate (Solanum

lycopersicum L.), con el fin de generar una resistencia de amplio espectro y larga

duración contra patógenos bacterianos. Para lograrlo, tras probar diferentes

estrategias de ligación que resultaron fallidas utilizando diferentes vectores

comerciales como el pUC57, el pUC19 y el pBlueScript SK (+), finalmente se logró

construir un plásmido con un casete de locus sencillo con los genes antes

mencionados, utilizando el vector LJMS, el cual fue construido anteriormente en

nuestro laboratorio. Con dicho plásmido, se siguió una estrategia basada en la

transformación genética de plantas vía Agrobacterium tumefaciens, retando

posteriormente a las plantas transgénicas con bacterias patógenas. Logramos

producir plantas de jitomate F4 que mostraron un aumento de resistencia a las

bacterias, sin efectos considerables en detrimento de su productividad. Una línea en

particular mostró cerca del 40, 27 y 17% de la infección bacteriana comparada con

plantas silvestres no transgénicas cuando fueron infectadas con Pseudomonas

syringae pv. syringae, P. syringae pv. tomato y Clavibacter michiganensis subsp.

michiganensis respectivamente. Nuestros resultados sugieren que la expresión

heteróloga de múltiples genes involucrados en la PTI bajo el control de un solo

promotor puede ser usada para diseñar una resistencia de amplio espectro a

patógenos bacterianos en cultivos importantes.

[XI]

ABSTRACT

Plant diseases exacerbate the current problem of famine plaguing much of

the world's population. Recent advances in genomics and the molecular genetics of

host resistance and pathogenesis provide hope of finding novel solutions to many

important crop diseases. To defend against infections, plants respond to pathogen’s

basic and characteristic molecules called pathogen associated molecular patterns

(PAMPs), which activate basal immunity responses known as PAMP triggered

immunity (PTI). It is possible that the activity of PAMPs recognition receptors is

retained after their transfer between plant families. The objective of this work was

to transfer the EFR, FLS2, and BAK1 genes, involved in the recognition of PAMPs and

activation of PTI in Arabidopsis, into tomato plants (Solanum lycopersicum L.), with

the goal of generating a wide-range, long-lasting resistance against bacterial

pathogens. To reach that objective, after unsuccessfully trying different ligation

strategies using different commercial vectors such as pUC57, pUC19, and pBluescript

SK (+), we finally managed to construct a plasmid with a single locus cassette

containing the aforementioned genes, using the LJMS vector, which was built earlier

in our laboratory. With this plasmid, a strategy based on the genetic transformation

of plants via Agrobacterium tumefaciens was followed, subsequently challenging the

transgenic plants with pathogenic bacteria. We managed to produce transgenic F4

tomato plants that showed increased resistance to bacteria, with no significant

detrimental effects on productivity. One line in particular showed about 40, 27 and

17% of bacterial infection compared with wild-type non transgenic plants when

infected with Pseudomonas syringae pv. syringae, P. syringae pv. tomato and

Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, respectively. Our results suggest

that the heterologous expression of multiple PTI-involved genes under the control

of a single promoter could be used to engineer broad-spectrum disease resistance

to bacterial pathogens in important crops.

[XII]

- 1 -

I. INTRODUCCIÓN

Los parásitos y patógenos de plantas son una amenaza significativa y creciente

para la producción de cultivos en todo el mundo. Por lo tanto, el objetivo de producir

cultivos con resistencia duradera a un espectro de enfermedades, es un aspecto

importante en la investigación de plantas. En el pasado, la resistencia duradera a

enfermedades se ha buscado a través de métodos tradicionales de cultivo, o por la

aplicación generalizada de plaguicidas. Ningún enfoque ha producido resultados

duraderos.

La ingeniería genética de plantas ha abierto nuevas vías para modificar los

cultivos, y esto ofrece nuevas soluciones para resolver necesidades específicas. El

desarrollo de procedimientos en biología celular para regenerar plantas a partir de

células individuales o tejidos organizados y el descubrimiento de nuevas técnicas para

transferir genes a las células vegetales, han venido a cumplir el prerrequisito para el

uso práctico de la ingeniería genética en la modificación y mejora de los cultivos.

Para poder diseñar plantas con una mayor y más durable resistencia a

enfermedades utilizando las tecnologías transgénicas hay que abordar dos

cuestiones. En primer lugar, ¿qué gen o genes queremos expresar para mejorar la

resistencia a las enfermedades? Y en segundo lugar, ¿cómo se van a expresar estos

genes para que los rendimientos de los cultivos realmente se incrementen? Las

tecnologías emergentes están proporcionando una gran cantidad de genes

candidatos que podrían conducir a una mejor protección de los cultivos, a través de

la ingeniería genética.

La tecnología de transformación de plantas se ha convertido en una plataforma

adaptable para la mejora de cultivares, así como para el estudio de la función de los

genes en las plantas. Este éxito representa la culminación de años de esfuerzos en la

mejora de cultivo de tejidos, en las técnicas de transformación y en la ingeniería

genética. Los vectores y las metodologías de transformación de plantas se han

superado continuamente para aumentar la eficiencia de transformación y para lograr

la expresión estable de transgenes en las plantas.

- 2 -

I.1. Las plantas y sus enfermedades

Las enfermedades de las plantas

Las plantas no solamente constituyen la mayor parte del ambiente vivo de la

Tierra, ya sea en forma de hierbas, arbustos o árboles, sino que además, constituyen

también, de manera directa o indirecta gran parte de la dieta de la cual dependemos

los humanos y todos los demás animales. Incluso alimentos como la carne, la leche y

los huevos que nosotros y otros animales carnívoros consumimos, provienen de

animales que a su vez dependen de las plantas para su propia alimentación (Keen,

2000; Lucas, 2009). Las plantas son los organismos más complejos capaces de

convertir la energía de la luz solar en energía química utilizable, la cual almacenan en

moléculas de carbohidratos, proteínas y lípidos. Así pues, todos los animales,

incluyendo a los humanos, dependemos de estas sustancias vegetales para nuestra

supervivencia (Keen, 2000).

El grado de resistencia que presenta una planta contra el ataque de parásitos

y patógenos determina en cierta medida el crecimiento y rendimiento de la misma.

Ciertamente todos los factores que afectan la salud de una planta influyen en su

crecimiento y producción, disminuyendo así notablemente su rendimiento. Son

muchas las causas que ocasionan el crecimiento deficiente de las plantas y la

destrucción de cosechas, pero las más comunes son los fitopatógenos, el clima

desfavorable, las malezas y las plagas de insectos (Agrios, 2005).

Cuando una o varias de las funciones de una planta se ven alteradas, ya sea

por organismos patógenos o por determinadas condiciones del medio, algún tipo de

enfermedad se presentará en la misma. Son dos las causas principales de enfermedad

en las plantas: los organismos patógenos y los factores del ambiente físico. Los

procesos que caracterizan a una enfermedad pueden ser muy variados y dependerán,

en gran medida, tanto del agente causal de la enfermedad como de la planta misma.

En un principio, la reacción de la planta ante el agente que ocasiona su enfermedad

se concentra en la zona enferma, y es de naturaleza química e invisible a simple vista.

Sin embargo, poco tiempo después, la reacción se difunde y se producen cambios

histológicos que se hacen notables y constituyen los síntomas de la enfermedad

(Schaad et al., 2003).

Las células y los tejidos afectados de las plantas enfermas, comúnmente se

debilitan o destruyen a causa de los agentes que ocasionan la enfermedad. La

- 3 -

capacidad que tienen esas células y tejidos para llevar a cabo sus funciones normales,

disminuye o se anula por completo; como resultado, la planta muere o merma su

crecimiento (Goto, 2012). Los tipos de células o tejidos que son infectados

determinan el tipo de función fisiológica de la planta que será afectada. Así, la

infección de la raíz (por ejemplo, la pudrición), dificulta la absorción del agua y de los

nutrientes del suelo; la infección de los vasos del xilema (marchitamientos vasculares

y ciertos cánceres) interfiere con la translocación del agua y los minerales hasta la

parte superior de la planta; la infección del follaje (manchas foliares, tizones y

mosaicos), afecta la fotosíntesis; la infección de la corteza (cáncer cortical e

infecciones virales del floema), obstaculiza la translocación, hasta la parte inferior de

la planta, de los productos fotosintéticos; las infecciones florales (tizones bacterianos

y fungosos, e infecciones ocasionadas por virus, micoplasmas y hongos), interfieren

con la reproducción, y las infecciones del fruto (pudriciones), entorpecen la

reproducción y/ o el almacenamiento de las reservas alimenticias para la nueva planta

(Madden y Wheelis, 2003).

En contraste con lo anterior, hay otro grupo de enfermedades en las que las

células afectadas en vez de ser debilitadas o destruidas, son estimuladas para

dividirse con mayor rapidez (hiperplasia), o para crecer mucho más (hipertrofia), que

las células normales. Por lo general, las células hipertrofiadas o hiperplásicas dan

como resultado el desarrollo de órganos comúnmente no funcionales que se dividen

y crecen de manera anormal, así como la formación de sobrecrecimientos amorfos

sobre los órganos en apariencia normales. Las células y tejidos estimulados en exceso,

no sólo absorben muchos de los nutrientes disponibles en perjuicio de los tejidos

normales, sino también, debido a su crecimiento excesivo, pueden presionar a los

tejidos normales adyacentes dificultando las funciones fisiológicas de la planta

(Madden y Wheelis, 2003; Heitefuss y Williams, 2012). Por lo tanto, la enfermedad

en las plantas se define como el mal funcionamiento de las células y tejidos del

hospedero, debido al efecto continuo sobre éstos de un organismo patógeno o factor

ambiental, y que origina la aparición de los síntomas. La enfermedad es un estado

que implica cambios anormales en la forma, fisiología, integridad o comportamiento

de la planta. Dichos cambios conducen a la alteración parcial o muerte de la planta, o

de sus órganos (Madden y Wheelis, 2003).

Las plantas cultivadas se ven afectadas por un gran número de enfermedades.

Cada tipo de cultivo puede ser susceptible, en promedio, a más de cien

- 4 -

enfermedades. En cuanto a los organismos patógenos, el grado de especificidad varía,

desde los que pueden atacar solamente a una variedad de cultivo, hasta los que

pueden atacar a varias docenas o incluso a cientos de especies vegetales (Agrios,

2005).

Aunque los hongos y los virus pueden ser considerados como los fitopatógenos

más importantes, algunas infecciones por fitopatógenos bacterianos también causan

pérdidas significativas en la agricultura. La fitopatogenicidad no es un rasgo muy

extendido entre las bacterias, ya que se pueden encontrar bacterias fitopatógenas

sólo en unos pocos géneros. Durante los últimos años, la investigación ha generado

una amplia información sobre los mecanismos moleculares por los cuales las

bacterias interactúan con su planta hospedera, pero este progreso en la comprensión

de las enfermedades bacterianas de las plantas se ha logrado principalmente para los

fitopatógenos gram negativos. Esto es debido al hecho de que la mayoría de las

bacterias fitopatógenas son precisamente gram negativas y, a menudo pertenecen a

géneros para los que los métodos y herramientas para un análisis molecular se

encuentran ya disponibles (Eichenlaub et al., 2006).

Pérdidas causadas por las enfermedades de las plantas

Las enfermedades vegetales son de vital importancia para los humanos,

debido a que estas dañan a las plantas y a los productos de las plantas de los cuales

los humanos dependen para su alimento, vestido, muebles, ambiente, y en muchos

casos incluso para su casa. Para millones de personas en todo el mundo que aún

dependen de su propia producción de plantas para sobrevivir, las enfermedades

vegetales pueden ser la diferencia entre una vida cómoda, y una vida perseguida por

el hambre o incluso de una muerte por inanición. Para los países en donde la comida

es abundante, las enfermedades vegetales son importantes principalmente porque

causan pérdidas económicas a los agricultores (Schaad et al., 2003; Horsfall y Cowling,

2012). Sin embargo, las enfermedades vegetales también ocasionan un incremento

de precios de los productos para los consumidores; algunas veces causan efectos

patológicos severos y directos para los humanos y animales que comen productos de

plantas enfermas (no tanto por el agente causal en sí, sino por productos tóxicos que

estos pueden producir, como por ejemplo las micotoxinas producidas por ciertos

hongos fitopatógenos), y en el intento de controlar las enfermedades, la gente libera

- 5 -

millones de kilogramos de pesticidas tóxicos que contaminan el agua y el ambiente

(Schaad et al., 2003; Goto, 2012).

Los tipos y cantidades de pérdidas causadas por las enfermedades vegetales

varían dependiendo de la planta o del producto vegetal, del patógeno, de la localidad,

del ambiente, de las medidas de control empleadas, y de la combinación de estos

factores. Las pérdidas pueden variar de muy ligeras hasta llegar al 100%. Las plantas

o productos vegetales pueden reducir su cantidad por enfermedad en el campo,

como de hecho es el caso con la mayoría de las enfermedades vegetales, o por

enfermedades durante el almacenamiento, como es el caso de las pudriciones de

frutos, verduras, granos y fibras almacenados (Brown y Ogle, 1997; Lucas, 2009). Con

frecuencia, pérdidas severas pueden ser ocasionadas por la reducción de la calidad

de los productos vegetales. Por ejemplo, mientras que las manchas, roñas y pústulas

en frutos, verduras o plantas ornamentales pueden tener poco efecto en la cantidad

producida, la calidad inferior del producto puede reducir tanto el valor de mercado,

que la producción no sea costeable o sea una pérdida total (Brown y Ogle, 1997).

Aunque las pérdidas directas en producción y calidad ocasionadas por las

enfermedades vegetales suelen a menudo considerarse como las más importantes,

existen también pérdidas financieras que pueden surgir de muchas maneras y que no

deben ser menospreciadas. Los agricultores pueden verse obligados a plantar una

variedad de planta específica que sea resistente a enfermedades, pero que no sea tan

productiva, o que sea más costosa o menos costeable comercialmente que otras

variedades. Pueden verse forzados a aplicar métodos de control para la enfermedad,

incurriendo así en una serie de gastos como pueden ser por maquinaria, químicos,

almacenes, mano de obra, etc. Otra fuente de pérdida económica puede venir del

incremento de costos de transporte al tener que proporcionar almacenaje y vehículos

con refrigeración. En muchas ocasiones las enfermedades de las plantas afectan la

vida de anaquel de un producto, obligando a los agricultores a vender sus cosechas

durante un período corto, cuando el producto abunda y su precio disminuye.

Igualmente puede ser necesaria una separación física de los productos vegetales

sanos y enfermos, esto para evitar la diseminación de la enfermedad, ocasionando

esto, un incremento en los costos por manejo (Agrios, 2005).

El costo de controlar las enfermedades vegetales, así como la productividad

perdida, son atribuibles en su mayor parte a los patógenos. Algunas enfermedades

vegetales pueden ser controladas casi completamente por uno u otro método,

- 6 -

resultando así en pérdidas financieras correspondientes sólo al costo del control.

Algunas veces sin embargo, este costo puede ser casi tan alto, o incluso más alto que

el que se espera obtener de la comercialización del cultivo, como es el caso de ciertas

enfermedades de granos pequeños. Para otras enfermedades aún no se conocen

medidas de control efectivas, y solo una combinación de prácticas de cultivo y el uso

de variedades con cierta resistencia hacen posible su cultivo (Schaad et al., 2003;

Heitefuss y Williams, 2012). Sin embargo, para la mayoría de las enfermedades

vegetales, mientras se siga contando con pesticidas químicos, habrá disponibilidad de

controles prácticos, aunque se incurra en algunas pérdidas a pesar de las medidas de

control tomadas. En estos casos, los beneficios del control aplicado son generalmente

mucho mayores que la combinación de las pérdidas directas por la enfermedad y las

pérdidas indirectas por los gastos de control (Schaad et al., 2003).

Control químico de enfermedades vegetales

A mediados de la década de 1950, los científicos se percataron de que existían

cepas de bacterias fitopatógenas que mostraban resistencia ante ciertos antibióticos,

asimismo, para 1963 se habían encontrado variedades de hongos fitopatógenos

resistentes a algunos fungicidas protectores. No obstante, fue hasta que se hizo

general el uso de fungicidas sistémicos en la década de 1970, que aparecieron nuevas

cepas/aislados de hongos fitopatógenos resistentes a fungicidas que habían probado

ser efectivos anteriormente. Este fenómeno propició el desarrollo de nuevas

estrategias para el control efectivo de las enfermedades vegetales mediante el uso

de fungicidas y bactericidas más efectivos. Algunas de las estrategias que se

desarrollaron a partir de esto son el uso de mezclas de fungicidas, alternando

diferentes sustancias en aplicaciones sucesivas, o aplicando primeramente un

compuesto de acción sistémica durante las etapas tempranas de la enfermedad y

posteriormente un compuesto de amplio espectro en las etapas tardías de la misma

(Agrios, 2005).

Desde hace mucho tiempo se ha sabido que los pesticidas químicos son

venenos tóxicos. En un inicio, el público asumió que los pesticidas eran tóxicos solo

contra los tipos de plagas para las que estaban destinados. Tanto los científicos como

los usuarios estaban seguros de que los animales y humanos no eran afectados por

los pesticidas, a menos de que fueran alimentados con ellos en grandes cantidades,

ya fuera accidental o intencionalmente. Por lo tanto, durante un largo tiempo, los

- 7 -

pesticidas se aplicaron libremente en campos, frutas, verduras, aguas estancadas, e

incluso directamente en animales y humanos para controlar insectos y enfermedades

que los afectaban. Cientos de pesticidas fueron producidos anualmente, y muchos de

los pesticidas más nuevos eran mucho más tóxicos que los anteriores. En otras

palabras, podían matar o dañar seriamente microbios, plagas, animales superiores y

humanos, a concentraciones mucho más bajas y mucho más rápido que los pesticidas

anteriores. Algunos de los pesticidas se descomponían en compuestos no tóxicos o

mucho menos tóxicos poco después de ser aplicados y de exponerse al aire, sol y

humedad. Otros, sin embargo, como el DDT y los hidrocarburos clorados, consistían

de moléculas persistentes que resistían la degradación y permanecían tóxicos por

muchos años o indefinidamente (Schaad et al., 2003).

Durante la década de 1950 hubo grupos de activistas que trataron de poner en

la agenda pública la preocupación concerniente al uso de pesticidas, sin embargo,

como los beneficios que proporcionaban estos para el control de insectos y de

enfermedades tanto vegetales como animales eran tan grandes, y como los

científicos e industriales de esa época aseguraban de manera contundente que el uso

de pesticidas no representaba ningún riesgo, dichas voces de alarma no llegaron al

oído del público general. Hoy en día, el uso de pesticidas se encuentra mucho más

restringido, y las personas que manejan productos tratados con pesticidas deben

seguir reglas muy estrictas. Esto ha hecho que, por un lado el uso de los pesticidas

sea cada vez más seguro, pero por el otro lado, que sea también cada vez más costoso

económicamente. Se prevé que en algún punto en el futuro habrá una carencia en el

suministro de pesticidas efectivos, esto ha propiciado que se redoblen los esfuerzos

para el desarrollo de métodos de control alternativos. Algunas posibles alternativas

son el control biológico mediante el uso de microorganismos antagonistas, el

mejoramiento de las antiguas prácticas de cultivo, así como el desarrollo de nuevas

prácticas. De particular interés por los beneficios que conllevan, son los nuevos

métodos de control que generan nuevas variedades de cultivos que ya llevan

incorporada la resistencia a enfermedades. Esto se puede lograr por métodos

convencionales o por medio de técnicas de ingeniería genética. Asimismo es posible

usar compuestos no tóxicos cuya función es activar las defensas naturales de la planta

(Agrios, 2005).

- 8 -

I.2. El sistema inmune innato vegetal

Como organismos sésiles, las plantas no pueden evitar ser confrontadas por

muchos patógenos a lo largo de su ciclo de vida. Las plantas han evolucionado

diferentes mecanismos de defensa. Uno de ellos son las barreras mecánicas no

específicas, como por ejemplo las paredes celulares rígidas y la cutícula cerosa en la

superficie foliar (Fu y Dong, 2013). Asimismo, las plantas también usan dos tipos de

barreras químicas: barreras preformadas y barreras inducidas. Los compuestos

químicos preformados pueden almacenarse en órganos o tejidos especializados

(p.ej., tricomas, glándulas de aceite o capas celulares epidérmicas), y son liberados

tras el ataque y subsiguiente daño mecánico causado por el patógeno. Las barreras

químicas inducidas se producen después de que se detecta el ataque de un patógeno

(Bednarek, 2009). Aun así, un pequeño número de patógenos logra evadir todas estas

defensas. En ese caso, se activa el bien adaptado sistema inmune innato de las plantas

(Walters, 2015).

Inmunidad innata vegetal

Los patógenos que logran evadir las primeras barreras inespecíficas son

confrontados por el sistema inmune innato vegetal. A diferencia de los animales, las

plantas no cuentan con células inmunes especializadas, ni con sistemas de inmunidad

adquirida. Aun así, cuentan con un sistema inmune innato de dos niveles bien

adaptado, que consiste de dos sistemas de percepción: la inmunidad activada por

PAMP (PTI, por sus siglas en inglés), y la inmunidad activada por efectores (ETI por sus

siglas en inglés) (Jones y Dangl, 2006).

Inmunidad activada por PAMP

Durante los últimos años, el reconocimiento de patrones moleculares ha

emergido como un proceso fundamental en la respuesta inmune, tanto de plantas

como de animales. Ambos poseen receptores de reconocimiento de patrones (PRRs,

por sus siglas en inglés), capaces de percibir firmas moleculares que identifican a

clases enteras de microbios (como la quitina para los hongos o los peptidoglucanos

para las bacterias), pero que están ausentes en el hospedero, lo que permite el

reconocimiento de lo “no propio”. Aunque convencionalmente son llamados

- 9 -

patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs, por sus siglas en inglés), los

patrones moleculares reconocidos por los PRRs típicamente están asociados con una

clase de microbios sin importar su patogenicidad; de hecho, los patrones pueden

estar ausentes o disfrazados en los miembros patógenos de alguna clase de

microbios. Por lo tanto, se les prefiere definir como patrones moleculares asociados

a microbios (MAMPs, por sus siglas en inglés). Señales similares pueden surgir de la

misma planta debido al daño causado por los microbios, en la forma de lo que

originalmente eran llamados inductores endógenos (Darvill y Albersheim, 1984), y

que ahora son descritos por los inmunólogos como patrones moleculares asociados

a daño (DAMPs, por sus siglas en inglés) (Lotze et al., 2007). La percepción de MAMPs

o DAMPs por los PRRs inicia una respuesta de defensa activa, llamada inmunidad

basal o PTI en plantas, e inmunidad innata en animales, la que se cree que mantiene

a raya a los patógenos no adaptados. Sin embargo, los patógenos microbianos bien

adaptados han encontrado maneras de romper esta primera línea de defensa activa.

En una especie de carrera armamentista, plantas y animales han evolucionado una

segunda línea de defensa: inmunidad adaptativa o adquirida en el caso de

vertebrados superiores, y resistencia basada en genes R, o ETI, en el caso de las

plantas (Boller y Felix, 2009).

Cuando los PRRs detectan algún MAMP, se activa una cascada de rutas de

señalización, lo que provoca la activación de mecanismos de defensa, y finalmente

lleva a la resistencia y en algunos casos, a una muerte celular programada y localizada

(Walters, 2015).

Receptores de reconocimiento de patrones

En el campo biomédico, la inmunología se ha enfocado de manera clásica en

la inmunidad adquirida o adaptada. Basándose en la combinación aleatoria de los

genes de inmunoglobulinas, y de los genes de los receptores de células T durante el

desarrollo de cada individuo, esta forma de inmunidad es capaz de formar un

repertorio casi ilimitado de sistemas de percepción para patógenos invasores. Sin

embargo, en años recientes la inmunidad innata ha recibido cada vez más atención.

Basándose en el reconocimiento de MAMP o DAMP por un número más bien limitado

de PRRs determinados desde la línea germinal, la inmunidad innata representa una

primera línea de defensa contra patógenos invasores, y también es un elemento clave

para el desarrollo de la inmunidad adaptativa (Akira et al., 2006). La inmunidad innata

- 10 -

es evolutivamente muy antigua, y los animales invertebrados dependen

completamente de esta forma de defensa (Alper et al., 2007). Las plantas también

dependen exclusivamente de mecanismos de inmunidad innata. Sin embargo,

cuentan con dos tipos de inmunidad adaptativa (Abramovitch et al., 2006).

Antiguamente estas dos formas de inmunidad eran llamadas resistencia basal

u horizontal, y resistencia vertical o basada en genes R; estas dos formas de

inmunidad ahora se dividen en PTI y ETI, que constituye una nueva terminología que

ha encontrado amplia aceptación (Chisholm et al., 2006).

La PTI (antiguamente llamada resistencia basal u horizontal), se basa en el

reconocimiento de MAMPs y DAMPs (que anteriormente eran denominados

inductores generales), por medio de PRRs (Boller, 1995). La PTI en plantas es muy

similar a la inmunidad innata en animales. El concepto de inmunidad innata en el

campo biomédico es congruente con el concepto de inductor propuesto desde hace

mucho para la defensa de plantas (Darvill y Albersheim, 1984). Como un buen

ejemplo de esta congruencia, la flagelina bacteriana es percibida como MAMP en las

plantas a través de dominios de repeticiones ricas en leucina (LRR, por sus siglas en

inglés), del receptor FLAGELLIN-SENSING 2 (FLS2) (Gómez-Gómez y Boller, 2000), y

por el receptor tipo Toll TLR5 en vertebrados (Hayashi et al., 2001). Los dos receptores

reconocen partes de la flagelina altamente conservadas, pero diferentes (Smith et al.,

2003), indicando que plantas y animales han evolucionado sus sistemas de

percepción de flagelina de manera independiente. De manera más general, se puede

decir que las similitudes en la inmunidad innata de plantas y animales se deben a un

caso de evolución convergente (Ausubel, 2005).

La ETI (antiguamente llamada resistencia vertical o basada en genes R), se basa

en la interacción altamente específica, directa o indirecta, de los efectores patógenos

con los productos de los genes R de las plantas, de acuerdo a la teoría del gen por gen

(Flor, 1971; Martin et al., 2003). Este evento de reconocimiento generalmente lleva a

un tipo vigoroso de reacción de defensa, llamado respuesta hipersensible,

caracterizada por una rápida muerte celular apoptótica acompañada, en ocasiones,

por necrosis local (Martin et al., 2003). En la mayoría de los casos, los genes de

resistencia codifican para proteínas de la clase NB-LRR, las cuales son proteínas

citoplásmicas con un sitio de unión nuclear (NB), además de una serie de LRRs (Caplan

et al., 2008).

- 11 -

La evidencia actual indica que la percepción de señales de peligro puede

ocurrir en tres formas: a través del reconocimiento de MAMPs, DAMPs o efectores.

Estas señales de peligro, al menos en su fase inicial, activan una respuesta de defensa

estereotípica común, ya sea que se origine de virus, bacterias, hongos u oomicetos.

Aunque similares en términos cualitativos, estas respuestas pueden ser diferentes en

términos cuantitativos y cinéticos, de acuerdo a las señales de peligro involucradas

en cada caso particular (Boller y Felix, 2009).

Resistencia sistémica

La percepción de señales de peligro ocurre en los alrededores inmediatos a la

herida o al sitio de invasión del patógeno. Aparte de las respuestas locales de defensa,

un ataque microbiano puede activar respuestas de defensa de manera sistémica. En

años recientes, dos tipos de resistencia sistémica han adquirido mucha atención: la

resistencia sistémica adquirida (SAR, por sus siglas en inglés), y la resistencia sistémica

inducida (ISR, por sus siglas en inglés) (Pieterse y Dicke, 2007). Estas respuestas

sistémicas son consecuencia de la percepción local de MAMPs, o de otras señales de

peligro en el sitio de invasión.

Pares de MAMP/ PRR caracterizados hasta el momento

El sistema de percepción de flagelina en plantas fue descubierto de manera

fortuita cuando se estudiaba el efecto de una preparación de la proteína harpina,

considerado un factor de virulencia de Pseudomonas, en células de jitomate. Se

demostró que la proteína que tenía la actividad inductora era la flagelina, y no la

harpina (Felix et al., 1999). Péptidos sintéticos que representan la parte más

conservada del extremo N de la flagelina bacteriana, como el péptido de 22

aminoácidos conocido como flg22, actúan como potentes inductores a

concentraciones subnanomolares en varias especies vegetales (Felix et al., 1999). En

Arabidopsis, flg22 también induce la formación de calosa, la acumulación de la

proteína de defensa PR1, y una fuerte inhibición del crecimiento de las plántulas

(Gómez-Gómez et al., 1999).

La sensibilidad a flg22 es compartida por miembros de todos los principales

grupos de plantas superiores, indicando que el PRR para este epítope de la flagelina

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bacteriana es evolutivamente antiguo. De hecho, se han encontrado ortólogos de

FLS2 con un alto grado de conservación en los genomas de todas las plantas

superiores analizadas hasta el momento. Se ha obtenido evidencia directa de la

funcionalidad receptora para flg22 de los ortólogos de FLS2 de jitomate (Robatzek et

al., 2007), y de tabaco (Hann y Rathjen, 2007). De manera interesante, el arroz tiene

un ortólogo de FLS2 bien conservado, el cual se ha demostrado que funciona como

receptor para flg22 por sobreexpresión en arroz, y por expresión heteróloga en

mutantes fls2 de Arabidopsis (Takai et al., 2008). En contraste, el musgo

Physcomitrella patens contiene muchas LRR-RKs en su genoma, pero no presenta un

ortólogo de FLS2 y no muestra respuesta a flg22 (Boller y Felix, 2009).

En una compilación de todas las cinasas tipo receptor (RLKs) de Arabidopsis,

agrupadas de acuerdo a las similitudes de los dominios de cinasa de proteínas, FLS2

pertenece a la familia LRR XII, la cual tiene diez miembros (Shiu y Bleecker, 2003). Los

ortólogos de FLS2 tienen una arquitectura altamente conservada, lo cual sugiere una

importancia funcional de las características conservadas. El dominio LRR extracelular

se encuentra flanqueado por dominios con motivos característicos de doble cisteína.

Estos dominios se conocen como el dominio LRR del extremo N (LRRNT), y el domino

LRR del extremo C (LRRCT), típicos de las proteínas LRR extracelulares (Liu et al.,

2008). El dominio LRRNT está particularmente bien conservado entre los ortólogos

de FLS2. Los ortólogos de FLS2 tienen 28 LRRs, con excepción de la variante del arroz,

la cual carece del LRR2. Se sabe por estudios de cristalografía, que los dominios LRR

forman una estructura solenoide altamente ordenada con forma de herradura, con

un esqueleto estructural que consiste de una -hélice y de residuos que conectan en

el lado convexo externo de la herradura, y una lámina- con la secuencia LxxLxLxxN

en el lado cóncavo interno, donde se cree que los residuos x expuestos al solvente

están involucrados en la unión del ligando (Bent y Mackey, 2007). Se ha identificado

que las posiciones x de los LRRs 9-15 son importantes para la función de FLS2. Dichas

posiciones x en la lámina- de los LRRs 12-14, muestran una conservación

particularmente alta en los ortólogos de FLS2 de 18 brasicáceas diferentes. En

contraste, cuando se comparan los dominios LRR de ocho ortólogos de FLS2 de

diferentes familias vegetales, la lámina- tiene aminoácidos conservados en las

posiciones x del LRR1 y los LRR22-28, pero no muestran una clara conservación en los

LRR2-22. También se encuentran posiciones altamente conservadas en el esqueleto

convexo, indicando que dicho esqueleto también puede ser funcionalmente

- 13 -

importante. Estas posiciones incluyen 17 sitios de N-glucosilación potenciales que

están parcial o completamente conservados (Boller y Felix, 2009).

La región del extremo C de FLS2 tiene todos los elementos estructurales de

una cinasa de proteínas de Ser/ Tre. Sin embargo, el bucle catalítico de FLS2 contiene

la secuencia CD en lugar de la normal RD. Esto puede ser una característica distintiva

de las cinasas PRR. Aunque las cinasas sin RD son infrecuentes en los genomas de

plantas y animales, 15 de las 18 cinasas receptoras identificadas como PRRs

pertenecen a la clase de cinasas de proteínas sin RD. El extremo C de FLS2 contiene

posiciones altamente conservadas más allá del dominio cinasa de la proteína,

indicando una función conservada (Boller y Felix, 2009).

La actividad inductora del EF-Tu también fue descubierta de manera fortuita:

en experimentos control con extractos hervidos de una mutante flic- de Escherichia

coli carente de flagelina, se detectó una proteína adicional con fuerte actividad

inductora y se identificó como el factor de elongación EF-Tu, una de las proteínas más

abundantes y más conservadas en las bacterias (Kunze et al., 2004). Su actividad

MAMP fue asignada a su extremo N, ya que péptidos que corresponden al extremo N

acetilado de EF-Tu, llamados elf18 y elf26, activaron respuestas MAMP en Arabidopsis

a concentraciones subnanomolares (Kunze et al., 2004). La sensibilidad a elf18/ elf26

se encontró en varias especies de Brassicaceae pero no en los miembros de otras

familias analizadas, indicando que la percepción de EF-Tu como MAMP es una

innovación en Brassciaceae (Kunze et al., 2004).

La expresión transitoria del gen EFR en Nicotiana benthamiana, una planta que

carece de un sistema endógeno de percepción de EF-Tu, le confirió sensibilidad a

elf18/ elf26, demostrando directamente que EFR es el PRR de EF-Tu (Zipfel et al.,

2006) y, por lo tanto, que los elementos río abajo de la activación de PRRs se

encuentran conservados en Arabidopsis y Nicotiana (Boller y Felix, 2009).

La proteína EFR tiene una estructura similar a FLS2 y también pertenece a la

familia LRR-RK XII de las RLK, pero contiene 21 LRRs en lugar de 28 (Shiu y Bleecker,

2003). Seis genes dentro de esta familia, incluyendo a EFR, están muy cercanamente

emparentados con respecto al dominio cinasa. De manera interesante, el homólogo

más similar a EFR con respecto al dominio de cinasa de proteínas, carece de todos los

LRRs y su función es desconocida. Los otros cinco tienen 21 LRRs, como en el caso de

EFR, y es posible que funcionen como receptores con ligandos desconocidos (Boller y

Felix, 2009).

- 14 -

Debido a que la percepción de EF-Tu está restringida a la familia Brassicaceae

(Zipfel et al., 2006), no se espera que miembros de otras familias vegetales posean

un ortólogo de EFR. Sin embargo, los genomas tanto del álamo como del arroz,

contienen numerosos genes que codifican para LRR-RKs de arquitectura muy similar,

sugiriendo que podrían funcionar como PRRs para MAMPs aún no identificados. Un

posible ejemplo de esto lo representa el producto del muy estudiado gen Xa21 de

arroz, el cual confiere resistencia a cierto número de razas de Xanthomonas oryzae

pv. oryzae (Song et al., 1995). Aunque Xa21 ha sido designado como un gen R, puede

ser que de hecho represente a un PRR para un MAMP: el gen bacteriano cognado

AvrX21 que no codifica para uno de los inductores usuales. En cambio, parece estar

involucrado en la producción de una molécula sulfatada que es secretada y que

posiblemente actúa como una señal quórum de detección (Lee et al., 2006), una clase

de moléculas predestinadas a actuar como MAMPs.

Los homólogos de EFR contienen 21 LRRs flanqueadas por unos dominios

LRRNT y LRRCT bien conservados, con un par de cisteínas cada uno; el esqueleto

convexo que contiene la -hélice del dominio LRR tiene un patrón conservado de seis

sitios de N-glucosilación potenciales. Los motivos de lámina- muestran apenas algún

grado de conservación en sus posiciones x, como se esperaría de PRRs que reconocen

diferentes MAMPs, excepto por un potencial sitio de glucosilación parcialmente

conservado en LRR21. Sin embargo, LRR11 muestra una marcada anomalía

completamente conservada, con una extensión de cinco aminoácidos que contiene

un sitio de glucosilación insertado antes de la lámina-. Como en el caso de FLS2, la

familia EFR/ Xa21 pertenece a las cinasas sin RD (Dardick y Ronald, 2006), y su

extremo C contiene posiciones altamente conservadas (Boller y Felix, 2009).

Oligomerización de receptores - Interacción FLS2-BAK1 inducida por ligando

Ya se ha demostrado que FLS2 se asocia con la cinasa receptora LRR BAK1

(Heese et al., 2007). BAK1 es una cinasa de proteínas que pertenece a la familia LRR

II, la cual cuenta con 14 miembros (Shiu y Bleecker, 2003), y dentro de esa familia

pertenece al grupo de cinco cinasas relacionadas con la embriogénesis somática

(SERKs, por sus siglas en inglés).

FLS2 y BAK1 no se encuentran asociadas en células no estimuladas, pero

forman un complejo dentro de los primeros dos minutos después de ser tratadas con

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flg22 (Chinchilla et al., 2007). Esta interacción parece ser funcionalmente importante,

ya que las plantas de Arabidopsis que tienen una mutación bak1 muestran respuestas

a flg22 y elf18 fuertemente reducidas (Chinchilla et al., 2007). La respuesta residual

que aun presentan puede deberse a la sustitución de BAK1 en el complejo receptor

por otros miembros de la familia SERK. En N. benthamiana, el silenciamiento génico

inducido por virus, de un homólogo de BAK1/ SERK afecta las respuestas a la proteína

de choque frío bacteriana, a la flagelina y a la elicitina, pero no a la quitina (Heese et

al., 2007). Estos datos muestran que BAK1 y sus parientes funcionan como

correceptores, no sólo en la señalización de brasinólidos y en el desarrollo, sino

también en la señalización de MAMP y en la inmunidad innata (Boller y Felix, 2009).

Parientes cercanos de BAK1 existen no sólo en todas las angiospermas, sino

también en el musgo P. patens, con un grado asombroso de homología. Ambos

dominios LRRNT y LRRCT están casi perfectamente conservados, con la sorprendente

excepción de que BAK1 y SERK4 carecen del LRRCT. Los cuatro LRRs tienen dos sitios

de glucosilación conservados y posiciones x altamente conservadas en sus laminas-.

El dominio cinasa pertenece a las cinasas RD (Dardick y Ronald, 2006). El extremo C

muestra un sorprendente grado de conservación: todos tienen los cuatro

aminoácidos SGPR en el extremo C, como en la mayoría de los miembros de la familia

LRR II. En adición a esto, SERK1/ SERK2 y los dos homólogos del musgo tienen siete

aminoácidos conservados justo antes de la secuencia SGPR. También de manera

sorprendente, BAK1 y SERK4 tienen una secuencia diferente en estas posiciones. De

acuerdo a las bases de datos de etiquetas de secuencia expresadas (EST) de plantas,

homólogos de SERK con el extremo C casi idéntico al de SERK1/ SERK2 se presentan

en todos los grupos de plantas superiores, mientras que el extremo de BAK1/ SERK4

es único de la familia Brassicaceae (Boller y Felix, 2009). La presencia de la familia

SERK en Physcomitrella (el cual no presenta homólogos de BRI1, FLS2 o EFR), indica

una función ancestral como correceptor con receptores desconocidos. Parece ser que

BAK1 y SERK4 representan una variante que ha evolucionado apenas recientemente

en la familia Brassicaceae, y que pueden tener funciones especiales; de manera

interesante, dobles mutantes bak1/ serk4 son letales en la etapa de plántula

(Chinchilla et al., 2007).

La dimerización de receptores juega un papel esencial en la señalización de

MAMP en animales. Un estudio cristalográfico ha demostrado que los receptores de

MAMP, TLR1 y TLR2, forman un heterodímero bajo estimulación con un lipopéptido

- 16 -

triacilado. Parece ser que esta interacción extracelular mueve los dominios TIR

intracelulares a una proximidad cercana para iniciar la señalización intracelular (Jin et

al., 2007). De manera similar, el receptor tipo Toll TLR3 homodimeriza después de la

unión de ARN de doble cadena, y una vez más, se cree que esta dimerización provoca

una interacción de los dominios TIR intracelulares para iniciar la señalización (Liu et

al., 2008).

La señalización por flagelina en las plantas puede seguir una ruta similar,

aunque ligeramente diferente, ya que flg22 no se une a BAK1 (Chinchilla et al., 2007).

En células no estimuladas, FLS2 y BAK1 pueden estar presentes, como en el caso de

TLR1 y TLR2 (Jin et al., 2007), pero no forman un complejo fuerte. Tras la unión de

flg22, el dominio LRR de FLS2 cambia su conformación, permitiéndole formar un

heterodímero con BAK1 para así formar un complejo en estrecha unión. La

interacción de los ectodominios de FLS2 y BAK1 también lleva a que entren en

contacto los dominios de cinasa intracelulares, permitiendo así el inicio de la

señalización intracelular, muy probablemente por eventos de transfosforilación

(Boller y Felix, 2009).

Percepción de efectores intracelulares por proteínas NB-LRR

Los patógenos bacterianos exitosos han evolucionado contramedidas para

evadir la PTI, al introducir efectores directamente al citoplasma de la planta,

frecuentemente por medio de sistemas de secreción tipo tres (TTSS, por sus siglas en

inglés) (Abramovitch et al., 2006). Dichos efectores son típicos de patógenos

individuales bien adaptados y no están presentes en los microbios en general. Por lo

tanto, son estos efectores los que representan a los PAMPs en un sentido más

verdadero, y son buenos blancos para la eficiente percepción de patógenos

específicos por parte del hospedero. De hecho, las plantas han evolucionado sistemas

de percepción para reconocer la presencia de efectores y para activar la ETI (Jones y

Dangl, 2006). Los receptores vegetales involucrados en la ETI son los productos de los

genes R, y la mayor parte de ellos se encuentran dentro de la gran familia de proteínas

con sitio de unión a nucleótidos-LRR, o NB-LRR, la cual contiene 149 miembros en

Arabidopsis. Algunos de estos receptores, como los productos de los clásicos genes R

del lino, reconocen efectores del patógeno correspondiente, como ha sido

demostrado con estudios de interacción proteína-proteína (Ellis et al., 2007). Sin

embargo, es más común que las NB-LRRs parezcan actuar como guardianas de

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proteínas importantes del hospedero, para asegurar la presencia y función correctas

de la proteína protegida. De modo que perciben alteraciones o ausencias de la

proteína protegida como una señal para inducir la ETI (Jones y Dangl, 2006). El modelo

de la proteína guardiana es muy similar al concepto de los DAMPs, de acuerdo al cual

el daño inducido por lo patógenos a las proteínas del hospedero es reconocido como

un patrón molecular para activar una respuesta inmune (Lotze et al., 2007).

De manera interesante, el sistema inmune innato de los mamíferos contiene

una clase de proteínas estructuralmente similares, llamadas NACHT-LRRs, las cuales

reconocen MAMPs y DAMPs intracelulares (Caplan et al., 2008). Aunque similares en

estructura y función, estas proteínas parecen haber evolucionado de manera

independiente en los reinos animal y vegetal (Caplan et al., 2008).

Efectores bacterianos y señalización MAMP

Las bacterias fitopatógenas generalmente usan el TTSS para introducir

proteínas efectoras directamente al citoplasma de la planta. Se ha demostrado que

muchos de estos efectores suprimen la PTI (Abramovitch et al., 2006). AvrPto y

AvrPtoB son dos receptores de P. syringae DC3000 sin relación de secuencia, los

cuales interrumpen la señalización de flg22 un paso río arriba de la MAPK cinasa

cinasa (MAPKKK), la cual se encuentra en la cima de la cascada de MAPK (He et al.,

2006). Debido a que el producto de Pto es una cinasa de proteínas, y debido a que

ambos efectores se asocian físicamente con Pto (Xing et al., 2007), una hipótesis

plausible sería que su blanco en plantas susceptibles fuera el dominio cinasa de los

PRRs. De hecho, AvrPto interactúa con FLS2 y EFR cuando es sobreexpresada en

protoplastos de Arabidopsis (Xiang et al., 2008). Sin embargo, bajo expresión más

débil de AvrPto, anticuerpos contra AvrPto sólo coinmunoprecipitan a BAK1 y no a

FLS2 (Shan et al., 2008). De manera interesante, tanto AvrPto como AvrPtoB inhiben

la interacción FLS2-BAK1 inducida por flg22, y por lo tanto parece ser que el blanco

es BAK1 como un correceptor integrativo, en vez de varios PRRs diferentes. Ambos

efectores también inhiben la señalización inducida por la percepción de quitina (Shan

et al., 2008), la cual no depende de BAK1 (Heese et al., 2007). Por lo tanto, es probable

que estos efectores tengan blancos adicionales, tal vez otros miembros de la familia

de las cinasas receptoras de embriogénesis somática (SERK), actuando como

correceptores, o una cinasa río abajo desconocida involucrada en la señalización de

MAMP (Boller y Felix, 2009).

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La evidencia genética demuestra directamente la importancia de la percepción

de MAMPs en ciertas interacciones planta-patógeno. De modo que plantas

comprometidas en la percepción de flagelina, como mutantes fls2 de Arabidopsis, o

N. benthamiana silenciada en la expresión de FLS2, son más susceptibles a P. syringae

DC3000 (Hann y Rathjen, 2007). Igualmente, las mutantes efr son más susceptibles a

la transformación con Agrobacterium tumefaciens, lo cual indica que la interacción

del receptor de superficie EFR con su ligando EF-Tu, el cual normalmente reside en el

citoplasma de la bacteria, juega un papel biológico en la resistencia parcial de

Arabidopsis contra la enfermedad de la agalla de la corona (Zipfel et al., 2006).

Sin embargo, es de esperar que la pérdida de un solo PRR no afecte de manera

grave la viabilidad de una planta. Por ejemplo, al menos dos ecotipos de Arabidopsis,

Ws-0 y Cvi-0, poseen genes FLS2 no funcionales por mutaciones del codón de paro.

Estos ecotipos pueden sobrevivir en un sentido evolutivo, debido a que cuentan con

otros PRRs que detectan infecciones bacterianas. De hecho, los sistemas de

percepción de MAMP parecen ser altamente redundantes en las plantas, en otras

palabras, una clase dada de microbios es percibida a través de muchos PRRs. Por

ejemplo, Arabidopsis puede reconocer bacterias a través de sistemas de percepción

de flagelina, de EF-Tu, de lipopolisacáridos, de peptidoglucanos, y probablemente de

otros MAMPs. En paralelo, los patógenos han evolucionado conjuntos de efectores

para inhibir en diferentes puntos la señalización de defensa en los hospederos. Esta

forma de redundancia ha hecho que sea difícil revelar la función de virulencia de los

efectores (Abramovitch et al., 2006). De hecho, debido a que algunos de estos

efectores pueden también representar blancos para los sistemas de reconocimiento

del hospedero, y activar la ETI, por muchos años fueron agrupados en la confusa

categoría de factores de avirulencia (Boller y Feix, 2009).

Aunque los modelos actuales que tratan de explicar la PTI/ ETI postulan dos

formas diferentes de inmunidad innata vegetal, la mayor parte de la evidencia indica

que solo existe una forma. La PTI y la ETI han coexistido desde el comienzo de la

evolución de las plantas con semilla. Mecanismos de percepción similares a los de PTI

se encuentran presentes tanto en gimnospermas como en angiospermas, así como

también los genes que codifican para NB-LRRs (McDowell y Simon, 2008). Así pues,

es plausible suponer que la inmunidad innata efectiva en plantas, como ocurre con la

inmunidad innata de vertebrados, sea mediada a través de un único principio global,

que es la percepción de señales de peligro (Lotze et al., 2007). Lo que podría ser

- 19 -

categorizado por un observador científico como MAMPs, DAMPs y efectores, para la

planta podrían parecer como una sóla y la misma señal que indica una situación de

peligro. Mientras que esta fase inicial de la respuesta inmune parece no discriminar

entre diferentes tipos de amenazas, puede ocurrir una modulación en base a tipos

más específicos de señales en etapas posteriores de las interacciones planta-

patógeno (Boller y Felix, 2009).

De hecho, los datos de expresión génica indican que existe un considerable

traslape entre las respuestas de defensa inducidas por MAMPs, efectores e

inductores endógenos (Wise et al., 2007). Así mismo, en sus respuestas de defensa,

las plantas no parecen discriminar entre MAMPs o DAMPs y efectores originados de

bacterias, hongos u oomicetos. Más bien, la percepción de todos estos tipos de

señales parece activar el mismo programa estereotípico de defensa, aunque con

diferencias cinéticas y cuantitativas en la inducción. En este sentido, la respuesta

inducida por efectores a menudo parece ser más fuerte y más duradera que la

respuesta inducida por MAMPs o DAMPs (Wise et al., 2007). Además, la respuesta a

efectores típicamente resulta en una respuesta hipersensible, mientras que MAMPs

o DAMPs normalmente no causan muerte celular. Sin embargo, esto no es una regla

general ya que algunos MAMPs sí inducen una respuesta hipersensible (Takemoto et

al., 2005), mientras que algunos genes de resistencia proveen protección sin

respuesta hipersensible (Lee et al., 2006).

Para resumir, el sistema inmune innato vegetal se basa en tres pilares, y todos

ellos pueden ser considerados bajo la idea del reconocimiento de patrones que

representan peligro. Aún queda por dilucidar como la señalización a través de

MAMPs, DAMPs endógenos y efectores, converge en una respuesta estereotípica de

defensa.

- 20 -

I.3. El modelo de estudio y sus patógenos bacterianos

Modelo de estudio: jitomate

El jitomate cultivado (Solanum lycopersicum Mill.), es un cultivo que ha

alcanzado gran prominencia y popularidad en los tres siglos pasados. Su versatilidad

en forma fresca o procesada y su adaptabilidad, han sido factores clave en su uso

rápidamente generalizado. La producción y el consumo mundial del jitomate se han

incrementado dramáticamente en las últimas décadas. A pesar de la importancia

nutricional del jitomate como fuente de vitaminas A y C, su consumo per cápita es

aproximadamente cuatro veces más alto en países desarrollados que en los que están

en vías de desarrollo. Sigue siendo un cultivo menor con un estatus de lujo en muchas

áreas del mundo, y existen oportunidades substanciales para incrementar sus

contribuciones a la nutrición y bienestar humanos (Tigchelaar, 1991).

El jitomate y sus parientes cercanos tienen su centro de origen en una región

montañosa, estrecha y alargada, de los Andes en Perú, Ecuador y Chile. Aunado a

esto, parientes distintivos del jitomate cultivado son parte de la flora nativa y única

de las islas Galápagos (Rick, 1978).

La domesticación y el cultivo del jitomate fuera de su centro de origen parecen

haber ocurrido primeramente en las antiguas civilizaciones de México. El nombre

tomate/ jitomate viene del náhuatl y variantes de este nombre han seguido al

jitomate en su distribución a lo largo del mundo. Una gran diversidad de formas

cultivadas de jitomate aún pueden ser encontradas en estos primeros centros de

domesticación (Tigchelaar, 1991).

Las formas cultivadas del jitomate son diploides (2x = 2n = 24), de

autopolinización. Son plantas herbáceas perennes, cultivadas casi universalmente

como cultivos anuales. Comúnmente se clasifica como un cultivo de hortaliza suave,

de temporada cálida, con una temperatura media óptima de crecimiento en el rango

de 21-23°C. El crecimiento y el desarrollo se detienen virtualmente a temperaturas

por debajo de los 10°C (Rick, 1978).

La flor del jitomate es perfecta, con partes masculinas y femeninas funcionales.

Las variedades cultivadas forman un estrecho cono de anteras protectoras que

rodean al estigma, lo que conduce predominantemente a la autofecundación.

Después de la polinización y la fecundación, el crecimiento del fruto ocurre a través

- 21 -

de división celular seguida de alargamiento celular. Varias flores (usualmente de

cuatro a ocho), nacen en cada inflorescencia compuesta, y una sóla planta

indeterminada puede producir, bajo condiciones de invernadero, hasta 20 o más

inflorescencias sucesivas durante su ciclo de cultivo. El período de tiempo de la

polinización a la madurez del fruto varía de menos de 6 semanas hasta más de 10

semanas, dependiendo de la variedad y las temperaturas. La semilla del jitomate es

fisiológicamente madura cuando la madurez del fruto se ha completado (Rick, 1978).

Un fruto de jitomate consiste en 94-95% de agua; el 5-6% restante es una

mezcla compleja de constituyentes predominantemente orgánicos, los cuales le dan

al fruto su sabor y textura característicos. Azucares libres y ácidos orgánicos son los

determinantes principales del sabor del jitomate. Sin embargo, la textura del fruto y

otros constituyentes orgánicos complejos también parecen contribuir al sabor típico

del jitomate. El ambiente de crecimiento puede influenciar de manera muy marcada

la tasa de crecimiento, así como el rendimiento y la calidad del fruto (Taylor, 1986).

Los esfuerzos en el mejoramiento del jitomate de las últimas décadas han

resultado en cultivares adaptados para una variedad de ambientes, métodos de

producción y usos alimenticios. Un aspecto principal de estos esfuerzos ha sido el

desarrollo de cultivares resistentes a enfermedades del jitomate prevalentes. Los

parientes silvestres del jitomate cultivado han proporcionado con frecuencia la única

fuente inicial de resistencia a estas enfermedades (Tigchelaar, 1991).

Enfermedades bacterianas del jitomate

El jitomate (Lycopersicon esculentum Mill.) es una de las principales hortalizas

que se cultivan en México, sin embargo, su producción se ve fuertemente amenazada

año tras año por el ataque de enfermedades de origen biótico. Las enfermedades

constituyen un factor limitante en la producción de jitomate en muchas partes del

mundo cuando no se utilizan cultivares con resistencia a varias de ellas. Existen

diversas enfermedades del jitomate con diferentes causas y etiologías, para cuyo

control se utilizan cultivares resistentes, así como medidas de exclusión, erradicación

y protección, en el contexto de un programa de control integrado (Jones et al., 2001;

Pernezny et al., 2003). Existen cerca de 200 enfermedades conocidas del jitomate, de

diversas causas y etiologías. El control de dichas enfermedades implica la resistencia

del huésped, la exclusión, erradicación y protección en un programa de manejo

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integrado de plagas. La resistencia implica el desarrollo y el uso de variedades que

impidan o dificulten la actividad del patógeno y que exploten las diferencias

genéticamente controladas en la susceptibilidad a la enfermedad en jitomate. Son

siete las principales enfermedades bacterianas que atacan al jitomate: la mancha

bacteriana, causada por Xanthomonas campestris pv. vesicatoria; la pudrición del

tallo bacteriana, causada por Erwinia carotovora subsp. carotovora; la marchitez

bacteriana, causada por Ralstonia solanacearum; la necrosis del haz vascular del

jitomate, causada por Pseudomonas corrugata; la mancha foliar, causada por P.

syringae pv. syringae; la mancha bacteriana, causada por P. syringae pv. tomato; y el

cáncer bacteriano, causado por Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis

(Pernezny et al., 2003).

A continuación se profundizará en estas tres últimas enfermedades por ser las

que directamente están involucradas en el trabajo aquí presentado.

Mancha foliar por P. syringae

La identificación correcta de las enfermedades conocidas en conjunto como

mancha foliar bacteriana de las plantas de jitomate, resulta difícil si el diagnóstico se

basa solamente en los síntomas. Los síntomas tempranos de la mayoría de las

manchas foliares bacterianas son la aparición de lesiones de consistencia húmeda,

con áreas necróticas bien definidas, las cuales pueden o no estar rodeadas por un

halo amarillo. El problema se complica por la diversidad de cultivares de jitomate y

de cepas bacterianas, las cuales pueden también afectar la expresión de los síntomas.

El diagnóstico correcto es crítico debido a que la mancha foliar por P. syringae es

relativamente inocua. Por lo general, se permite que las plantas que sólo presentan

mancha foliar por P. syringae mantengan su certificación de libres de enfermedad,

mientras que las plantas con mancha bacteriana son puestas bajo cuarentena (Bonn

y Gitaitis, 1987).

Los síntomas varían de pequeñas lesiones marrón sin halos, a lesiones casi

negras con brillantes halos amarillos parecidos a los de la mancha bacteriana. En

algunas ocasiones, el patógeno puede ser aislado de la necrosis marginal, de las áreas

con marchitez extendida y de tejidos que han sufrido de aparente daño por

congelación. Los síntomas son extremadamente difíciles de reproducir en

invernadero. El desarrollo de la enfermedad se favorece por alta humedad y por

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heridas. El desarrollo de síntomas es más severo en ciertos cultivares que en otros

(Gitaitis, 1991b).

El organismo causal es P. syringae pv. syringae, una bacteria no formadora de

esporas, gram negativa, aerobia y con forma de bacilo. Es fluorescente en medio King

B, y es positiva para producción de levano, induce reacción hipersensible en tabaco y

es negativa para oxidasa, dihidrolasa de arginina y pudrición suave de papa. Sin

embargo, estas pruebas no son útiles para separarla de P. syringae pv. tomato, con la

que es más comúnmente confundida. Los dos organismos pueden ser diferenciados

por sus perfiles de ácidos grasos. Aunque los dos perfiles son casi idénticos, P.

syringae pv. syringae contiene una cantidad importante de ácido -cis-9,10-metileno

hexadecanoico, el cual está ausente en P. syringae pv. tomato. El uso de eritriol,

sacarosa y DL-lactato como únicas fuentes de carbono por parte de P. syringae pv.

syringae, la separa de P. syringae pv. tomato y de P. viridiflava, las cuales no utilizan

todos los compuestos. La mayoría de las cepas aisladas de plantas de jitomate son

activas para nucleación de hielo, lo que también puede separar a este organismo de

P. syringae pv. tomato. La mayoría de las cepas recuperadas de jitomate producen

syringomicina, e inducen una reacción hipersensible en el garbanzo cultivar California

Blackeye #3 (Jones et al., 1986).

Las únicas fuentes conocidas de inóculo son otras plantas hospederas epífitas.

Las dos fuentes más comunes en los campos han sido el centeno, el cual es usado

como cultivo protector, en invierno, y los árboles de cerezo silvestres que se

encuentran a lo largo del borde de los campos de cultivo. Las áreas con un gran

número de árboles de cerezo han tenido cada año alta incidencia de mancha foliar

por P. syringae. P. syringae pv. syringae es un patógeno oportunista débil, encontrado

frecuentemente en heridas y como organismo secundario en infecciones mezcladas

con otros patógenos de mancha foliar (Gitaitis, 1991b).

Las aplicaciones débiles de bactericidas controlan adecuadamente esta

enfermedad. Aunque en la mayoría de los casos no existe daño económico y no son

necesarias medidas de control. Sin embargo, para asegurarse de que el problema es

mancha foliar por P. syringae se requiere una caracterización precisa y completa del

agente causal, para tomar las medidas necesarias en caso de que se trate de una

enfermedad que requiera de procedimientos de control más precisos (Gitaitis,

1991b).

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Mancha bacteriana

La mancha bacteriana y su agente causal fueron originalmente descritos e

identificados en Taiwán y Estados Unidos en 1933. Se trata de una enfermedad

cosmopolita, generalmente de baja prevalencia. La enfermedad se ve favorecida por

bajas temperaturas y condiciones de alta humedad. El manchado severo en el fruto

puede reducir el rendimiento de mercado. Ha habido un incremento en los reportes

de esta enfermedad en las últimas décadas (McCarter et al., 1983).

Los síntomas incluyen lesiones redondas de color marrón oscuro a negro en

los folíolos. El halo está ausente en las etapas tempranas, pero se desarrolla con el

tiempo. La lesión se extiende por toda la hoja, pero es más prominente en la

superficie abaxial. Las manchas se pueden juntar, matando grandes áreas de tejido.

También se ven afectados tallos, peciolos, pedúnculos, pedicelos y sépalos. Las

lesiones en estas partes de la planta son de ovaladas a alargadas. En el fruto se

desarrollan lesiones minúsculas o pecas, las cuales son oscuras y raramente más

grandes que 1 mm de diámetro. El tejido alrededor de cada mancha puede ser de un

verde más intenso que las áreas no afectadas. Las lesiones son ligeramente elevadas

o planas cuando se observan por primera vez. En algunos casos las manchas pueden

ser hundidas. Un halo verde oscuro se puede asociar con la mancha (Jones, 1991).

El organismo causal es P. syringae pv. tomato, el cual es un bacilo de 0.69-0.97

x 1.8-2.8 m, estrictamente aerobio, gram negativo. La bacteria produce un pigmento

verde difusible, el cual fluoresce cuando es expuesto a luz ultravioleta en medio King

B. Es negativa para la reacción de oxidasa y para dihidrolasa de arginina. El organismo

causa acumulación de polipectato de sodio a pH 4, es positivo para producción de

levano y para actividad -glucosidasa, utiliza D (-) tartrato pero no eritriol ni DL-

lactato como únicas fuentes de carbono, y produce una reacción hipersensible

cuando es infiltrado en tabaco a altas concentraciones (108 UFC/ ml) (McCarter et al.,

1983).

Esta bacteria se transmite por semilla. La importancia de la semilla para la

diseminación de la bacteria es especulativa, pero podría ayudar a explicar el reciente

incremento de reportes en todo el mundo. La bacteria se disemina por lluvia y por

maquinaria usada en el proceso de cultivo. En un número importante de estudios, P.

syringae pv. tomato sobrevivió en residuos de cultivo por un período extenso (hasta

30 semanas). Algunas especies de malezas son capaces de contener poblaciones de

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la bacteria tanto en la rizosfera como en el filoplano. La supervivencia de la bacteria

en suelo no tratado es de corto término (menos de 30 días). Tanto la alta humedad

como las bajas temperaturas (18-24°C), favorecen el desarrollo de la mancha

bacteriana (Jones, 1991).

Para controlar la enfermedad se evita plantar dos años consecutivos en el

mismo campo. Se producen plantas libres de enfermedad en lugares donde la

producción de jitomate es inexistente. El tratamiento de semillas debe ser un

procedimiento de rutina. Se deben mantener todos los campos de producción libres

de malezas. No deben colocarse pilas de desechos cerca de los campos de producción.

Se deben aplicar bactericidas apropiados cuando sea recomendado (Jones, 1991).

Cáncer bacteriano

El cáncer bacteriano del jitomate es una enfermedad seria que se presenta en

todo el mundo. Su presencia es esporádica, pero puede ser devastadora. El jitomate

en todos los tipos de cultivo es propenso a serias pérdidas. Sin embargo, la

enfermedad es especialmente severa en jitomates trasplantados o directos de semilla

que han sido recortados o podados. La enfermedad se observó por primera vez en

1909 en Michigan y originalmente se le llamó la enfermedad de los Grand Rapids.

Hasta 1927 se creía que la enfermedad estaba confinada al noreste de los Estados

Unidos. Después de esa fecha, se presentaron numerosos reportes de su presencia

en todas las regiones tomateras de los Estados Unidos, incluyendo los estados del sur

y del occidente, y las áreas de mayor producción de semilla (Gitaitits, 1991a).

Una característica general de las enfermedades causadas por Clavibacter es la

aparición de plantas asintomáticas con infecciones latentes. Dichas plantas pueden

ser una fuente de reinfección o de propagación de la enfermedad, especialmente si

se utilizan trasplantes (Frank, 1999).

Las semillas de tomate infectadas crecen y se desarrollan como plantas

contaminadas. La propagación de la enfermedad entre plantas individuales se

produce a través del agua (e.g., por salpicadura o riego), o por prácticas culturales

como la poda. Las bacterias infectan las plantas hospederas a través de las raíces o

heridas, a través de los estomas y otras aberturas naturales, e invaden los vasos del

xilema, seguido de una infección sistémica del hospedero. En condiciones naturales,

se necesita un largo período de latencia hasta que aparecen los primeros síntomas

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(Strider, 1969). En el campo, el primer síntoma de infección de C. michiganensis

subsp. michiganensis es la desecación en las puntas de los foliolos en las partes bajas

de la planta joven. Por lo general, la planta se deseca lentamente sin mostrar los

síntomas típicos de marchitamiento. En etapas posteriores, se presenta retraso en el

crecimiento, marchitamiento, decoloración vascular, desarrollo de chancros de tallo

abierto y lesiones en los frutos. Manchas de ‘ojo de pájaro’, relativamente pequeñas

y rodeadas por un halo blanco, se desarrollan en los frutos. Estos frutos a menudo no

logran desarrollarse y caen, o maduran de manera desigual (Eichenlaub et al., 2006).

El organismo causal es una bacteria aerobia, no formadora de esporas, no

acidorresistente. El género bacteriano Clavibacter pertenece a los actinomicetos

Gram-positivos (familia Microbacteriaceae) (Park et al., 1993). El género Clavibacter

consiste de una sola especie, C. michiganensis (Cm), que es fitopatógena y está

subdividida en cinco subespecies de acuerdo con su especificidad de hospedero. C.

michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) causa la marchitez bacteriana y cáncer del

jitomate (S. lycopersicum), que puede ser considerada como la enfermedad

bacteriana más importante del jitomate. Clavibacter se caracteriza por carecer de

motilidad, la presencia de D- y L-diaminobutirato en la pared celular, la menaquinona

MK-9, y las poliaminas espermina y espermidina (Altenburger et al., 1997).

Las subespecies son altamente específicas para su planta hospedera y unas

pocas especies de plantas estrechamente relacionadas. Cierto número de otras

especies/géneros del mismo género o familia pueden ser infectados artificialmente.

En algunas especies esto conduce al desarrollo de los síntomas de la enfermedad,

pero también son comunes infecciones sin síntomas visibles de la enfermedad y

ocurren incluso en las principales plantas hospederas (Eichenlaub et al., 2006).

Todas las subespecies de Clavibacter son patógenos de plantas vasculares que

causan infecciones sistémicas. Su principal hábitat es el fluido del xilema ligeramente

ácido y pobre en nutrientes. Después de la infección, Clavibacter se disemina en los

vasos del xilema. Clavibacter es biotrófica, y principalmente vive y se multiplica en el

interior de la planta hospedera. Sólo en etapas posteriores de la infección, Cmm deja

los vasos del xilema y entra en los tejidos circundantes después de la degradación de

las paredes celulares de la planta, lo que conduce a maceraciones tisulares (Baer y

Gudmestad, 1995). Esto parece ser causado por la producción de enzimas

degradadoras de la pared celular (por ejemplo, celulasas, poligalacturonasas,

xilanasas) (Beimen et al., 1992). Clavibacter es capaz de producir algunas hormonas

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vegetales. Por ejemplo, Cmm puede producir ácido indolacético (IAA). La vía utilizada

para la producción de IAA es desconocida. Tambén se desconoce si las fitohormonas

desempeñan un papel en el desarrollo de los síntomas, como sucede en el caso del

fitopatógeno relacionado Rhodococcus fascians. Sin embargo, la aparición de

síntomas como retraso de crecimiento en Medicago, y otros síntomas atípicos en

papa y maíz, sugieren cierta participación de ellas (Laurila et al., 2003).

Las fuentes de inóculo para esta enfermedad incluyen restos vegetales en el

suelo fuera de temporada, malezas hospederas, plantas voluntarias, estacas de

madera contaminadas y semillas. La diseminación secundaria puede ocurrir por

medio de salpicaduras de agua, equipo contaminado, y manos de trabajadores. La

enfermedad también se disemina por estacas de jitomate podadas y por transplantes

recortados. En las plantas de tomate en estacas, los síntomas del cáncer pueden ser

obvios, primeramente, en el tallo donde el hilo ha causado una abrasión. En los

transplantes recortados, el período de latencia puede ser de 3-6 semanas, lo cual crea

problemas en los programas de certificación de plantas que están basados en la

apariencia visual. Las plantas infectadas desde semilla pueden morir, no producir

frutos o no presentar síntomas. La diseminación secundaria a menudo resulta

solamente en síntomas foliares, manchas de ojo de pájaro en el fruto, o ambas. Sin

embargo, la diseminación secundaria por recorte en los campos de transplante

resulta en infección sistémica y muerte de la planta después de transplantada

(Gitaitis, 1991a).

El limpiado de semillas y de transplantes son los controles más importantes

que se pueden emplear. Las semillas deben ser probadas por un método aceptable y

confiable, capaz de analizar un gran número de las mismas. Un ejemplo es el lavado

de 10,000 semillas, donde la muestra concentrada se siembra en medio

semiselectivo. Las colonias sospechosas por su color y características de crecimiento,

pueden ser completamente identificadas rápidamente por sus perfiles de ácidos

grasos y su habilidad para inducir una reacción hipersensible en hojas de clavellina

(Mirabilis jalapa). La semilla debe ser tratada con ácido clorhídrico diluido, hipoclorito

de calcio o agua caliente para asegurar su desinfección. En operaciones de

invernadero, se debe usar suelo, mezcla de siembra y macetas esterilizadas. Las

herramientas de poda deben ser desinfectadas entre un uso y otro. Si se van a reusar

las estacas, deben ser lavadas con una solución de blanqueador al 1%. Si el cáncer

bacteriano ha estado presente en un campo, las plantas de jitomate deben ser

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incorporadas al suelo para fomentar la descomposición de los desechos. Se

recomienda la rotación de cultivos con una planta no hospedera (Gitaitis, 1991a).

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I.4. Inducción de resistencia a bacterias en cultivos por medio

de ingeniería genética

Antecedentes de la resistencia a bacterias en cultivos por ingeniería genética

Las enfermedades bacterianas son de gran importancia económica para

muchos cultivos. Las mayores pérdidas se presentan en cereales, verduras y frutas.

En la mayoría de los casos, las aplicaciones de agroquímicos protectores, cuando son

factibles, no son suficientes para controlar las enfermedades bacterianas. Más aún,

el uso de químicos está sujeto cada vez a mayores restricciones debido a su impacto

potencialmente dañino para el ambiente, y así, el control de las enfermedades

bacterianas a menudo está limitado a la profilaxis. Sin embargo, la existencia de

fuentes naturales de resistencia a enfermedades bacterianas, ha hecho posible la

selección de cierto número de variedades resistentes por medio de métodos

convencionales. Obviamente, la hibridación clásica está restringida a plantas de la

misma especie (o de especies cercanamente relacionadas), mientras que mecanismos

de resistencia potencialmente efectivos pueden existir en otras partes. Aunado a

esto, puede ser difícil y muy tardado introducir resistencia de especies silvestres en

cultivares comerciales. Sin embargo, las recientes mejoras en las técnicas de

transformación de plantas, y los progresos en el entendimiento de las interacciones

planta-patógeno, hacen posible el uso de la ingeniería genética para la creación

racional de plantas resistentes a enfermedades. A diferencia de los métodos clásicos,

la ingeniería genética permite la modificación o introducción de una o más

características de resistencia en variedades susceptibles. Hasta la fecha, se ha

dedicado menos esfuerzo a la creación de plantas transgénicas que sean resistentes

a las bacterias que a los hongos (Shah, 1997).

En los pocos casos reportados de manipulación genética de plantas para

conferir resistencia ante bacterias, ésta se ha conseguido siguiendo una de las

siguientes cuatro estrategias:

1) Produciendo proteínas antibacterianas de origen no vegetal. Algunos

ejemplos son: i) la transformación genética de tabaco con el gen de la proteína MB39

de la polilla de seda gigante, para conferirle resistencia parcial a P. syringae pv. tabaci

(Huang et al., 1997); ii) la transformación de papa con el gen de la lisozima del

bacteriófago T4, para conferirle resistencia parcial a Erwinia carotovora (Düring et al.,

1993); iii) la transformación de tabaco con el gen de la lactoferrina humana, para

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conferirle resistencia parcial a Ralstonia solanacearum (Mitra y Zhang, 1994); iv) la

transformación de papa con el gen de la taquiplesina del cangrejo herradura, para

conferirle resistencia parcial a E. carotovora (Allefs et al., 1996); v) la transformación

de papa con el gen de la lactonasa AiiA de Bacillus, para conferirle resistencia a E.

carotovora (Dong et al., 2001), y la transformación de tabaco con el gen del péptido

antimicrobiano D4E1 de la polilla de cecropia, para conferirle resistencia a

Agrobacterium tumefaciens y a Xanthomonas populi pv. populi (Mentag et al., 2003).

2) Inhibiendo la patogenicidad bacteriana o el efecto de los factores de

virulencia. Algunos ejemplos son: la transformación de tabaco con el gen de la

proteína de resistencia a tabtoxina de P. syringae pv. tabaci, para conferirle

resistencia a P. syringae (Anzai et al., 1989), y la transformación de frijol con el gen

de la ornitina carbamoiltransferasa de P. syringae pv. phaseolicola, para conferirle

resistencia al mismo (Herrera-Estrella y Simpson, 1995).

3) Potenciando las defensas naturales de la planta. Algunos ejemplos son: i) la

transformación de papa con el gen de la pectato liasa de E. carotovora, para conferirle

resistencia parcial a este patógeno (Wegener et al., 1996); ii) la transformación de

papa con el gen de la glucosa oxidasa de Aspergillus niger, para conferirle resistencia

parcial a E. carotovora (Wu et al., 1995); iii) la transformación de tabaco con el gen

de la tionina de cebada, para conferirle resistencia parcial a P. syringae pv. tabaci

(Carmona et al., 1993); iv) la transformación de arroz con el gen de la NB-LRR Xa21

de cultivares resistentes de arroz, para conferirle resistencia a X. oryzae pv. oryzae

(Wang et al., 2007); v) la transformación de jitomate con el gen de la proteína NB-LRR

Pto de Solanum pimpinellifolium, para conferirle resistencia a P. syringae pv. tomato

(Tang et al., 1999), y la transformación de A. thaliana con el gen de la proteína NB-

LRR NPR1 de A. thaliana, para conferirle resistencia a P. syringae (Cao et al., 1998).

4) Induciendo artificialmente la muerte celular programada en el sitio de

infección. Un ejemplo es la transformación de tabaco con el gen de la bacterio-opsina

de Halobacterium halobium, para conferirle resistencia a P. syringae pv. tabaci

(Mittler et al., 1995).

Uso de casetes multigénicos en ingeniería genética

La ingeniería genética de plantas de cultivo se ha convertido en una estrategia

importante para incrementar la producción agrícola y, al mismo tiempo, minimizar el

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uso de químicos y el impacto ambiental. Los enfoques actuales, típicamente implican

la manipulación de rasgos sencillos que sólo requieren una proteína transgénica. Sin

embargo, conforme se va intentando experimentar con rasgos más complejos, son

esenciales métodos que introduzcan múltiples proteínas fácilmente. Algunos

ejemplos actuales, incluyen el uso de plantas para producir anticuerpos expresando

tanto la cadena pesada como la ligera (Stoger et al., 2002), la generación de plantas

con resistencia tanto a herbicidas como a insectos (Wenzel, 2006), y la manipulación

de toda la ruta enzimática necesaria para la síntesis de vitamina A (Ye et al., 2000) o

de plásticos biodegradables (Nawrath et al., 1994).

Aunque la expresión de una proteína en plantas de cultivo es algo

relativamente sencillo, la expresión coordinada de múltiples proteínas a menudo es

difícil por varias razones. Típicamente, introducir cada gen requiere de varias rondas

individuales de transformación, una práctica que es costosa y a menudo está limitada

en muchos cultivos por el reducido número de marcadores de selección aceptables.

Posteriormente, la expresión balanceada se puede lograr llevando a cabo un

tamizado de los transformantes individuales para cada gen, para identificar aquellos

con niveles de expresión de proteínas comparables, y cruzando las plantas para

generar líneas que expresen los niveles correctos de ambos. Desafortunadamente,

mantener el rasgo complejo en subsecuentes proyectos de reproducción es un gran

reto debido a la segregación independiente de cada locus (Walker y Vierstra, 2007).

Es obvio que se necesitan nuevos enfoques para expresar más de una proteína

transgénica en plantas. Un enfoque promisorio es el uso de vectores basados en

ubiquitina para expresar dos o más proteínas (Hondred et al., 1999). Su potencial se

deriva del hecho de que la ubiquitina es sintetizada naturalmente como una fusión

de proteína, ya sea como una poliubiquitina, o como una ubiquitina unida al extremo

N de una proteína no relacionada (Smalle y Vierstra, 2004). Después de la traducción,

las fusiones son procesadas rápidamente y de manera precisa in vivo por enzimas

desubiquitinizantes (DUBs), las que liberan monómeros de ubiquitina de 76

aminoácidos y la proteína fusionada en forma libre y funcional (Wilkinson, 2000). Las

DUBs son específicas de ubiquitina y removerán casi cualquier polipéptido que esté

unido al extremo C de la ubiquitina, la excepción siendo las extensiones que llevan

prolina como primer residuo libre. Utilizando las DUBs, se ha logrado expresar una

variedad de proteínas transgénicamente como fusiones de ubiquitina, incluyendo

aquellas cuyos residuos del extremo N no son metionina (Hondred et al., 1999).

- 32 -

Dadas las necesidades actuales y futuras de manipular rasgos complejos en

plantas, el desarrollo de estrategias para expresar múltiples proteínas de manera

coordinada y estequiométrica es altamente beneficial. La aplicación de vectores

policistrónicos que expresen dos o más proteínas a partir de un solo ARN mensajero

es particularmente ventajosa, ya que minimiza el número de loci distribuidos

independientemente, mejora los patrones de expresión coordinada, reduce las

complicaciones del silenciamiento génico para loci individuales, y reduce los pasos de

transformación necesarios para manipular el genotipo deseado (de Felipe et al.,

2006).

La ingeniería genética de rasgos complejos en plantas de cultivo requiere, en

última instancia, de estrategias para coexpresar más de una proteína al mismo

tiempo.

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I.5. Particularidades, innovaciones e hipótesis

Este proyecto presenta algunas innovaciones en aspectos muy relevantes del

proceso de defensa contra patógenos en plantas, las cuales lo hacen un trabajo

original. A continuación se mencionan algunas de dichas innovaciones y la

importancia y repercusiones que tienen cada una de ellas.

1) El uso de MAMPs en vez del producto de genes R para generar la resistencia

contra bacterias. Tradicionalmente se ha optado por usar los productos de

genes R para generar resistencia en las plantas. Esto ha sido así porque,

antiguamente, se consideraba a los genes R como genes de resistencia cuyo

producto generaba resistencia ante microbios que poseían lo que antes se

conocía como genes de avirulencia. Actualmente se sabe que los genes de

avirulencia codifican, en realidad, para efectores cuya función es evadir el

reconocimiento del patógeno por parte de la planta, y que los genes R

codifican para receptores que reconocen a dichos efectores. El problema es

que estos efectores son específicos de razas o patovares concretos, y que al no

codificar para proteínas que sean esenciales para la supervivencia del

microbio, son fácilmente desechados o mutados por los mismos, evadiendo

así la resistencia generada por la expresión de los genes R. El optar por el uso

de MAMPs evita estos problemas, ya que los MAMPs están presentes no en

patovares concretos sino en todo un amplio grupo de microbios, y al ser

proteínas esenciales para la vida de los mismos, no se pueden deshacer

fácilmente de ellos para evadir la resistencia de la planta.

2) El transformar no solamente con un gen codificante de PRR. Al transformar las

plantas con dos genes codificantes de PRRs se les provee de la capacidad para

reconocer a un mayor número de patógenos bacterianos, además de que al

estar involucrados más genes en la resistencia, es más difícil que esta pueda

ser revertida por los patógenos.

3) El sobreexpresar el correceptor BAK1. Aunque las plantas de jitomate cuentan

con un ortólogo de BAK1, la sobreexpresión del mismo en las plantas

transgénicas también es importante, ya que se ha demostrado que dicha

proteína es el blanco al cual atacan algunos efectores bacterianos, tales como

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AvrPto/AvrPtoB de P. syringae pv. tomato DC3000, para eludir la inmunidad

innata.

4) El transformar con un casete multigénico. El transformar con un casete de

locus sencillo, que contiene los dos genes de PRRs y el gen del correceptor

BAK1, separados uno de otro por monómeros de ubiquitina, y bajo el control

de un mismo promotor, ofrece ventajas sobre la opción de cotransformaciones

independientes. Por un lado, al usar monómeros de ubiquitina se facilita el

procesamiento de las proteínas, ya que se usan proteasas endógenas. Por otro

lado, al estar controladas por un mismo promotor, se promueve la expresión

a niveles similares de todas las proteínas incluidas en el casete y se disminuye

el riesgo de silenciamiento postraduccional. Por último, al estar dentro de un

solo casete, se evitan los problemas de deriva génica que podrían distribuir de

manera independiente a los diferentes genes en subsiguientes generaciones.

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II. OBJETIVOS

Objetivo general

Generar resistencia antibacteriana en plantas de S. lycopersicum, mediante la

transformación genética con los genes heterólogos de Arabidopsis thaliana EFR, BAK1

y FLS2, codificantes de PRRs involucrados en la inmunidad innata vegetal.

Objetivos particulares

1. Aislar y clonar los genes EFR, FLS2 y BAK1 a partir de A. thaliana y generar la

construcción EFR-UB-BAK1-UB-FLS2.

2. Generar plantas de S. lycopersicum que lleven la construcción EFR-UB-BAK1-

UB-FLS2, vía A. tumefaciens.

3. Comprobar la integración de los transgenes en el genoma de las plantas

mediante pruebas histoquímicas y moleculares (GUS, PCR, RT-PCR).

4. Demostrar la resistencia antibacteriana en las plantas transgénicas por medio

de ensayos de inoculación con bacterias fitopatógenas.

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III. ESTRATEGIAS EXPERIMENTALES

Material vegetal

Se emplearon semillas de jitomate (S. lycopersicum, L.) cultivar TA234 donadas

por Steve Tanksley de la Universidad de Cornell. Se ha reportado que dicha variedad

presenta una de las más altas tasas de transformación y regeneración comparada con

otras líneas experimentales (Fillatti et al., 1987). Las semillas fueron conservadas a

4°C hasta su utilización.

Origen de los elementos componentes del vector empleado

Para la transformación de las plantas de jitomate en el presente trabajo, se

utilizó un vector construido a partir de los siguientes materiales (los pasos seguidos

para la construcción del vector se detallan en la sección de resultados):

- Vector LJMS (figura 1): Se trata de un vector para expresión en plantas, con

una versión potenciada del promotor constitutivo 35S del virus del mosaico de

la coliflor. Fue creado en nuestro laboratorio a partir del plásmido pCAMBIA-

2301.

- Gen EFR: Gen que codifica para el receptor (PRR) del factor de elongación Tu

bacteriano (EF-Tu). Aislado a partir de una biblioteca de cADN de A. thaliana

ecotipo Columbia, donada por el Dr. Stefan de Folter.

- Gen FLS2: Gen que codifica para el receptor (PRR) de la flagelina bacteriana.

Aislado a partir de una biblioteca de cADN referida anteriormente.

- Gen BAK1: Gen que codifica para la proteína BAK1, la cual funciona como

correceptor de los receptores EFR y FLS2. Aislado a partir de la biblioteca de

cADN referida anteriormente.

- Enlazador EFR-UB-BAK1: Monómero de ubiquitina de N. tabacum. La porción

terminal del gen EFR y la porción inicial del gen BAK1 se encuentran adjuntas

a ambos extremos del monómero de ubiquitina, esto para permitir su ligación

entre los dos genes mencionados. Este enlazador fue sintetizado por la casa

comercial Sigma-Aldrich.

- Enlazador BAK1-UB-FLS2: Monómero de ubiquitina de N. tabacum. La porción

terminal del gen BAK1 y la porción inicial del gen FLS2 se encuentran adjuntas

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a ambos extremos del monómero de ubiquitina, esto para permitir su ligación

entre los dos genes mencionados. Este enlazador fue sintetizado por la casa

comercial Sigma-Aldrich.

Los genes aislados a partir del cADN de A. thaliana se amplificaron por PCR

usando los siguientes oligonucleótidos: EFR: 5'-ATCGGGTACCATGAAGCTGTCCTTTT

CACTTG-3' y 5'-ATCGGCATGCCATAGTATGCATGTCCGTATTTAAC-3'; FLS2: 5'-ACTGGT

CGACATGAAGTTACTCTCAAAGAC-3' y 5'-ATCGGGATCCAACTTCTCGATCCTCGTTA

CG-3'; BAK1: 5'-ACTGTCTAGAATGGAACGAAGATTAATGATC-3' y 5'-ATCGCTCGAGTCT

TGGACCCGAGGGGTATTC-3', en donde los nucleótidos subrayados indican sitios de

restricción añadidos para el subsecuente clonado de los genes. Las condiciones de

amplificación por PCR que se emplearon fueron: 1 ciclo a 95°C durante 2 min, seguido

de 25 ciclos a 95°C por 45 s, 58°C por 45 s, 55°C por 30 s y 72°C por 90 s. Finalmente

un ciclo de 72°C por 5 min. Los productos de la amplificación fueron analizados en

geles de agarosa al 1.0% teñidos con bromuro de etidio.

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Figura 1. Vector LJMS. Mapa del vector LJMS, el cual es un vector de alta expresión en

plantas que fue construido en nuestro laboratorio a partir del vector pCAMBIA-2301. CaMV

35S promoter: promotor constitutivo 35S del virus del mosaico de la coliflor; GUS: gen de la

-glucuronidasa; NOS terminator: terminador y señal poli(A) de la nopalina sintasa; RB T-

DNA repeat: borde derecho del T-DNA del plásmido C58 de nopalina; ori: origen de

replicación de alto número de copias; KanR: gen de la aminoglucósido fosfotransferasa,

confiere resistencia a kanamicina; LB T-DNA repeat: borde izquierdo del T-DNA del plásmido

C58 de nopalina; NeoR/ KanR: gen de la aminoglucósido fosfotransferasa del transposón Tn5,

confiere resistencia a kanamicina; CaMV 35S promoter (enhanced): promotor 35S del virus

del mosaico de la coliflor con una región potenciadora duplicada; MCS: sitio de clonación

múltiple del plásmido pUC18/ 19; minimal CaMV 35S promoter: promotor 35S mínimo del

virus del mosaico de la coliflor.

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Transformación de bacterias

E. coli. Se empleó la cepa DH5, la cual fue transformada por electroporación

(Sambrook et al., 2002), en el sistema Micro Pulser de Bio-Rad siguiendo las

instrucciones del fabricante.

A. tumefaciens. Se empleó la cepa LBA-4404, la cual también fue transformada

por electroporación. La preparación de células electrocompetentes y el protocolo de

electroporación fue el reportado por Jhy-Jhu (1994). Las condiciones de

electroporación y los tipos de celda empleados fueron las descritas en el manual del

electoporador (Bio-Rad).

Transformación de plantas de jitomate

La metodología que se siguió para la transformación genética de jitomate fue

la que ya se tiene bien estandarizada en el laboratorio y que ha demostrado ser

efectiva en repetidas ocasiones (Gutiérrez-Ortega et al., 2005; Ramírez et al., 2007;

Carrillo-Landell et al., 2008; De la Rosa et al., 2009).

Ensayo histoquímico de la -glucuronidasa (GUS)

Para los ensayos de GUS con la -glucuronidasa, los tejidos fueron heridos

varias veces en ambas caras con una aguja de jeringa de 1 mL, posteriormente fueron

incubados en buffer de X-gluc (fosfato de sodio 100 mM pH 7.0, tritón X-100 0.1%,

ácido ascórbico 50 mM y 5-bromo-4-cloro-3-indolil --glucuronido (X-gluc) 1 mM).

Las muestras fueron incubadas toda la noche a 37°C en la oscuridad. Posteriormente

fueron clareadas, lavando en varias ocasiones con una solución de acetona: metanol

1: 3 vol/ vol, y preservadas en glicerol al 50%. Los ensayos de GUS se llevaron a cabo

en plantas de las generaciones F1-F4 de las líneas transgénicas generadas.

Extracción de ADN total para PCR y amplificación

El ADN genómico para PCR se extrajo de hojas jóvenes, utilizando el reactivo

Plant DNAzol (Invitrogen), y siguiendo el protocolo indicado por el fabricante. Se llevó

a cabo PCR en dichos ADN genómicos, usando los mismos oligonucleótidos que

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empleamos para amplificar los genes EFR, BAK1 y FLS2 de la biblioteca de cADN de A.

thaliana. Las condiciones de amplificación por PCR que se emplearon fueron: 1 ciclo

a 95°C durante 5 min, seguido de 30 ciclos a 95°C por 45 s, 55°C por 90 s y 72°C por

160 s. Finalmente, un ciclo de 72°C por 10 min. Los productos de la amplificación

fueron analizados en geles de agarosa al 1.0%, teñidos con bromuro de etidio.

Los tamaños que se esperaban obtener de la amplificación correspondieron a

los de los genes íntegros, es decir: 3,093 pb, para EFR; 1,845 pb, para BAK1, y 3,519

pb, para FLS2.

Extracción de ARN total para RT-PCR y amplificación

Se extrajo ARN total de hojas jóvenes, usando el reactivo PureLink Plant RNA

Reagent (Thermo Fisher Scientific), y se sintetizó cADN a partir del ARN extraído,

utilizando la enzima SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen). La PCR por

transcripción inversa (RT-PCR), fue llevada a cabo en el cADN usando los siguientes

oligonucleótidos: EFR: 5'-GGCGATTATAACCTCCACAG-3' y 5'-TACTGCTTCATCCGTTCTC

A-3'; FLS2: 5'-ACGCCTCTGATCTAATGGG-3' y 5'-GGATGACTCTGGTTCTCTTCG-3'; BAK1:

5'-TGACGCTACAAGTTCTGGAT-3' y 5'-ATGGCGGTGTAGGAGAGATA-3'; EF- 5’-TACTG

GTGGTTTTGAAGCTG-3’ y 5’-AACTTCCTTCACGATTTCATCATA-3’. Las condiciones de

amplificación por PCR que se emplearon fueron: 1 ciclo a 95°C durante 5 min, seguido

de 35 ciclos a 95°C por 45 s, 55°C por 45 s y 72°C por 30 s. Finalmente, un ciclo de

72°C por 10 min. Los productos de la amplificación fueron analizados en geles de

agarosa al 1.2%, teñidos con bromuro de etidio.

Los tamaños que se esperaban obtener de los fragmentos amplificados son los

siguientes: 162 pb, para EFR; 156 pb, para BAK1; 111 pb, para FLS2, y 246 pb para

EF-.

Preparación de los inóculos e inoculación de las plantas

Para los ensayos de los retos con patógenos bacterianos, se tomaron semillas

de la F1 a la F4 de las líneas transgénicas generadas, se germinaron, y se crecieron a

razón de una planta por maceta a 22°C, con un fotoperíodo de 16 h luz/ 8 h oscuridad.

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Se utilizaron dos patovares de Pseudomonas: P. syringae pv. syringae B728a

(donada por el Dr. José Abel López Buenfil del cepario del Servicio Nacional de

Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria -Senasica-, SAGARPA), y P. syringae pv.

tomato DC3000 (donada por el Dr. John Delano Frier del Cinvestav Irapuato). Ambas

bacterias fueron crecidas en medio manitol glutamato (MG) líquido (manitol 10 g/ L,

ácido L-glutamico 2 g/ L, KH2PO4 0.5 g/ L, NaCl 0.2 g/ L, MgSO4·7H2O 0.2 g/ L, pH 7.0),

a 28°C. Se tomaron 30 L del cultivo, se sembraron en medio MG con agar, y se

dejaron incubando a 28°C toda la noche. Posteriormente, se tomaron las cajas Petri

con los cultivos, y se añadieron 2 mL de buffer de fosfato estéril (PBS) (NaCl 137 mM,

KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 2 mM, pH 7.4), para resuspender la bacteria.

La bacteria resuspendida se pasó a un tubo Falcon de 50 mL, y se ajustó a 1 x 105

unidades formadoras de colonias (UFC)/ mL (DO600 = 0.0002), en PBS. Para la

inoculación, se utilizaron plantas de jitomate de tres semanas de edad, con tres a

cuatro hojas verdaderas. Las suspensiones bacterianas se infiltraron en las hojas con

una jeringa hipodérmica sin aguja. Como control, se inocularon plantas de la misma

manera pero con PBS en lugar de la suspensión bacteriana. En los días 2, 4, 6, 8 y 10

después de la infección, se monitoreó el crecimiento bacteriano dentro del tejido

foliar cortando foliolos infiltrados, y desinfectándolos superficialmente con agua

destilada estéril y etanol al 70%. Posteriormente se cortaron seis discos foliares (de

0.6 cm2 de diámetro), por muestra, se pesaron dentro de un tubo de 1.5 mL, y se

homogenizó el tejido con 2 volúmenes de PBS. A partir del tejido homogenizado se

hicieron 8 diluciones seriales 1: 10, y se sembraron 10 mL de cada dilución en medio

King B (KB) (peptona 20 g/ L, MgSO4·7H2O 1.5 g/ L, K2HPO4 1.5 g/ L, glicerina 15 mL/

L, pH 7.2), con 25 g/ ml de ácido nalidíxico a 28°C, toda la noche, para

posteriormente determinar el número de UFC/ mL. Cada experimento se repitió tres

veces, de manera independiente, en cada generación de plantas.

Para el caso de Clavibacter, se utilizó la cepa C. michiganensis subsp.

michiganensis, donada por la Dra. Laila Partida Martínez del Cinvestav Irapuato. La

preparación de los cultivos bacterianos y las inoculaciones, se llevaron a cabo como

lo describen Louws et al. (1998). La bacteria se creció en medio de caldo nutritivo y

extracto de levadura (NBY) líquido (caldo nutritivo 8 g/ L, extracto de levadura 2 g/ L,

K2HPO4 2 g/ L, KH2PO4 0.5 g/ L, glucosa 5 g/ L, pH 7.0), a 27°C por 48 h. Del cultivo se

tomaron 30 L y se sembraron en NBY con agar, a 27°C durante 48 a 72 h, hasta que

se observó la presencia de crecimiento bacteriano. Se tomó la caja Petri con el cultivo

bacteriano, y se le añadieron 2 mL de PBS para resuspender la bacteria. Se tomó 1 mL

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de la suspensión bacteriana, se transfirió a un tubo Falcon de 50 mL, y se ajustó con

PBS a 2 x 108 UFC/ mL (DO600 = 0.16). Para la inoculación, se utilizaron plantas de

jitomate de tres semanas de edad con tres a cuatro hojas verdaderas. Para

inocularlas, se inyectaron 20 L de la suspensión bacteriana en el tallo de la planta,

entre los dos cotiledones, y se cortó el pecíolo de la primera hoja verdadera con una

navaja humedecida en la suspensión bacteriana. Como control, se inocularon plantas

de la misma manera pero con PBS en lugar de la suspensión bacteriana. En los días

20, 25, 30, 35 y 40 después de la infección, se monitoreó el crecimiento bacteriano

dentro del tejido vegetal, cortando un segmento de tallo de 1 cm de longitud, a una

altura de 10 cm por arriba del sitio de inoculación. Cada segmento de tallo se pesó en

un tubo de 1.5 mL, y se homogenizó en dos volúmenes de PBS. La suspensión

resultante se sometió a 8 diluciones seriales 1: 10, de cada dilución se sembraron 10

L en NBY sin glucosa a 28°C por 3 días, para posteriormente determinar el número

de UFC/ mL. Cada experimento se repitió tres veces, de manera independiente, en

cada generación de plantas.

Análisis estadístico

Se llevó a cabo una prueba t de Student, tomando en cuenta el número de UFC

formadas por los patógenos bacterianos en cada línea transgénica, a los diferentes

días de medición.

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IV. RESULTADOS

IV.1. DISEÑO DE OLIGONUCLEÓTIDOS Y AISLAMIENTO DE LOS GENES EFR, BAK1 Y

FLS2

Como la intención de este proyecto era transferir a plantas de jitomate, la

capacidad de reconocimiento de bacterias que le confieren los genes EFR, BAK1 y FLS2

a A. thaliana, lo primero que se hizo fue buscar la secuencia de dichos genes en la

base de datos del GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). A partir de la

secuencia de cada gen, se diseñaron oligonucleótidos que hibridaran con los

extremos 5’ y 3’, añadiéndole a cada oligonucleótido una secuencia para crear un sitio

de restricción, el cual serviría para clonar los genes en las etapas subsiguientes de la

construcción del casete. En la figura 2 se muestran el mapa de los tres genes con los

sitios de restricción añadidos al inicio y al final de cada uno, además de algunos otros

sitios de restricción importantes para la construcción del casete.

Figura 2. Mapa de los genes EFR, BAK1 y FLS2. La figura superior corresponde al gen EFR, el

cual consta de 3,093 pares de bases; se señalan los sitios KpnI y SphI, añadidos en los

extremos del gen para su clonación, así como los sitios EcoRI y SpeI, los cuales fueron

importantes durante la construcción del casete. La figura del medio corresponde al gen

BAK1, el cual consta de 1,845 pares de bases; se señalan los sitios XbaI y XhoI, añadidos en

los extremos del gen para su clonación, así como los sitios BsaAI y SpeI, los cuales fueron

importantes durante la construcción del casete. La figura inferior corresponde al gen FLS2,

el cual consta de 3,519 pares de bases; se señalan los sitios SalI y BamHI, añadidos en los

extremos del gen para su clonación; así como los sitios BsrDI y PstI, los cuales fueron

importantes durante la construcción del casete.

- 46 -

Con los oligonucleótidos sintetizados, se llevó a cabo una PCR sobre una

muestra de cADN de A. thaliana y de esta manera se lograron aislar y amplificar los

tres genes. La banda amplificada en el caso del gen BAK1 fue suficientemente intensa.

Sin embargo, para los genes EFR y FLS2, las bandas amplificadas fueron tenues (figura

3, panel izquierdo). Por este motivo, se decidió recuperar y purificar el ADN de dichas

bandas y hacer una segunda PCR usando como molde dicho ADN. De esta manera se

logró obtener bandas intensas para los tres genes de interés (figura 3, panel derecho).

Esto permitió tener suficiente material para llevar a cabo los siguientes pasos en la

construcción del casete.

Figura 3. Amplificación de los genes EFR, BAK1 y FLS2. A partir de una muestra de cADN de

Arabidopsis thaliana, y utilizando los oligonucleótidos diseñados específicamente para cada

gen, se logró el aislamiento de los tres genes por medio de PCR. En el panel de la izquierda

se cargó cada gen por duplicado, en el carril central se corrió el marcador de peso molecular,

se indican los pesos moleculares de las bandas cercanas a los pesos de los genes

amplificados. En el panel de la derecha se muestran las bandas obtenidas tras la

reamplificación de los genes, a partir del ADN amplificado y recuperado previamente.

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IV.2. CLONACIÓN DE LOS GENES EFR, BAK1 Y FLS2 EN CÉLULAS DE E. coli

Se recuperó el ADN correspondiente a cada uno de los tres genes, y se utilizó

para su clonación en los vectores. Los genes BAK1 y FLS2 se clonaron de manera

independiente en el vector pBlueScript SK (+), utilizando los sitios XbaI y XhoI para el

caso de BAK1 (figura 4), y los sitios SalI y BamHI para el caso de FLS2 (figura 4). Ambos

vectores, conteniendo cada uno de los dos genes, fueron introducidos en células

electrocompetentes de E. coli DH5 mediante electroporación. También se intentó

la clonación del gen EFR dentro del vector pBlueScript SK (+). Sin embargo, ésta no se

logró tras varios intentos. Se buscó entonces otra estrategia para clonar este gen, y

se optó por utilizar el sistema CloneJET PCR Cloning Kit (Fermentas), el cual permite

clonar directamente un producto de PCR en el sito EcoRV dentro del vector pJET1.2.

De esta manera, se logró clonar el gen EFR (figura 4), y al igual que con los otros dos

genes, el vector conteniendo al gen fue introducido en células de E. coli DH5

mediante electroporación.

Figura 4. Genes BAK1, FLS2 y EFR clonados en E. coli. Los tres genes fueron clonados en

células electrocompetentes de E. coli DH5. En el caso de los genes BAK1 y FLS2, éstos fueron

clonados en el vector pBlueScript SK (+); en el caso de EFR, el gen fue clonado en el vector

pJET1.2.

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IV.3. CONSTRUCCIÓN DEL CASETE UTILIZADO EN LA TRANSFORMACIÓN DE

PLANTAS

Una vez que se tuvieron los tres genes clonados en E. coli, se realizó la

construcción del casete, para lo cual se sintetizaron dos enlazadores, uno que uniera

al gen EFR con el gen BAK1, y otro que uniera al gen BAK1 con el gen FLS2. Cada

enlazador contenía la secuencia de un monómero de ubiquitina de tabaco, el cual

está constituido por 228 pares de bases (pb), flanqueado por el extremo final de uno

de los genes que iba a unir y el extremo inicial del otro gen. Así pues, el enlazador que

serviría para unir los genes EFR y BAK1, estaba formado por la porción terminal de

341 pb del gen EFR a partir del sitio EcoRI, el monómero de ubiquitina de 228 pb, y el

fragmento inicial de 217 pb del gen BAK1 hasta el sitio BsaAI, dando un total de 786

pb (figura 5). Por su parte, el enlazador que serviría para unir los genes BAK1 y FLS2,

estaba formado por la porción terminal de 286 pb de BAK1 a partir del sitio SpeI, el

monómero de ubiquitina de 228 pb, y el fragmento inicial de 62 pb de FLS2 hasta el

sitio BsrDI, dando un total de 576 pb (figura 5).

Ambos enlazadores fueron proporcionados por la empresa que los sintetizó,

clonados en el sitio EcoRV del vector comercial pUC57 (figura 5).

Figura 5. Enlazadores génicos. Segmentos de ADN sintetizados para facilitar la ligación de

los genes EFR, BAK1 y FLS2. Cada enlazador está conformado por la porción final de uno de

los genes, un monómero de ubiquitina de tabaco (UB), y el fragmento inicial del segundo gen

a unir.

La primera estrategia que se siguió para intentar la construcción del casete

completo, fue la de ligar todos los fragmentos en un solo paso dentro del vector

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pUC57, para posteriormente transferir el casete completo al vector de expresión en

plantas LJMS. En la tabla 1 se muestran los detalles de los fragmentos que se

intentaron ligar con esta primera estrategia.

Tabla 1. Detalles de la primera estrategia que se siguió para la construcción del

casete. Se intentó ligar todos los fragmentos en un solo paso, usando a pUC57 como

vector. El tamaño total del casete sería de 8,931 pb, que sumados a las 2,687 pb del

pUC57, daban un total de 11,618 pb.

Elemento del casete Enzimas usadas

para su digestión

Tamaño del fragmento

obtenido (pb)

Vector pUC57 BamHI

KpnI 2,687

pJET1.2/ EFR KpnI

EcoRI 2,760

pUC57/ enlazador EFR-UB-BAK1 EcoRI

BsaAI 782

pBlueScript SK (+)/ BAK1 BsaAI

SpeI 1,350

pUC57/enlazador BAK1-UB-FLS2 SpeI

BsrDI 569

pBlueScript SK (+)/ FLS2 BsrDI

BamHI 3,470

Total: 11,618

No se tuvo éxito. Al momento de electroporar la reacción de ligación crecían

muchísimas colonias que, al ser analizadas, solamente contenían al vector pUC57

religado. Teniendo en cuenta estos resultados se optó por intentar una nueva

estrategia.

Viendo que el problema probablemente era la religación del vector, en la

segunda estrategia se intentó ligar nuevamente los cinco fragmentos en un solo paso,

pero usando en esta ocasión al plásmido pBlueScript SK (+) como vector de clonación.

En la tabla 2 se muestran los detalles de los fragmentos que se intentaron ligar con

esta segunda estrategia.

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Tabla 2. Detalles de la segunda estrategia que se siguió para la construcción del

casete. Se intentó ligar todos los fragmentos en un solo paso, usando a pBlueScript

SK (+) como vector. El tamaño total del casete sería de 8,931 pb, que sumados a las

2,896 pb del pBlueScript SK (+), daban un total de 11,827 pb.

Elemento del casete Enzimas usadas

para su digestión

Tamaño del fragmento

obtenido (pb)

Vector pBlueScript SK (+) BamHI

KpnI 2,896

pJET1.2/ EFR KpnI

EcoRI 2,760

pUC57/ enlazador EFR-UB-BAK1 EcoRI

BsaAI 782

pBlueScript SK (+)/ BAK1 BsaAI

SpeI 1,350

pUC57/enlazador BAK1-UB-FLS2 SpeI

BsrDI 569

pBlueScript SK (+)/ FLS2 BsrDI

BamHI 3,470

Total: 11,827

Con esta segunda estrategia se obtuvieron los mismos resultados negativos

que se habían obtenido con el vector pUC57. Al parecer, el plásmido pBlueScript SK

(+) también se estaba religando, lo cual impedía que se llevara a cabo exitosamente

la ligación de los 6 fragmentos.

Teniendo en cuenta estos resultados negativos, se abandonó la estrategia de

hacer la construcción del casete ligando todos los fragmentos en un solo paso, y se

optó por una nueva estrategia. En esta ocasión se intentó ligar, por un lado al gen

BAK1 con el enlazador EFR-UB-BAK1 dentro del vector pBlueScript SK (+), y por el otro,

al gen FLS2 con el enlazador BAK1-UB-FLS2 dentro del vector pBlueScript SK (+), para

posteriormente intentar añadir al gen EFR al casete.

El plásmido pBlueScript SK (+)-BAK1 (figura 4), fue digerido con BsaA1 y XhoI

para liberar un fragmento de 1,632 pb, que va del punto de unión con el enlazador

hasta el final del gen BAK1; el plásmido pUC57-enlazador EFR-UB-BAK1 (EUB) (figura

- 51 -

5), fue digerido con BsaAI y KpnI para liberar un fragmento de 1,386 pb, que incluye

la totalidad del enlazador EUB más un pequeño fragmento de 20 pb del vector pUC57.

Ambos fragmentos se ligaron y se clonaron entre los sitios KpnI y XhoI del vector

pBlueScript SK (+), dando como resultado el plásmido pBlueScript SK (+)-enlazador

EUB-BAK1 (figura 6).

Figura 6. Plásmido pBlueScript SK (+)-enlazador EUB-BAK1. Ligación del enlazador EFR-UB-

BAK1 con el gen BAK1. Nótese que el enlazador EUB se ligó incluyendo un pequeño

fragmento del vector pUC57 (en color negro), para incluir al sitio EcoRI, el cual se utilizaría

posteriormente para ligarlo al gen EFR.

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El plásmido pBlueScript SK (+)-FLS2 (figura 4), fue digerido con BsrDI y NotI para

liberar un fragmento de 3,487 pb, que va del punto de unión con el enlazador hasta

el final del gen FLS2; el plásmido pUC57-enlazador BAK1-UB-FLS2 (BUF) (figura 5), fue

digerido con BsrDI y EcoRI para liberar un fragmento de 605 pb, que incluye la

totalidad del enlazador BUF más un pequeño fragmento de 36 pb del vector pUC57.

Ambos fragmentos se ligaron y se clonaron entre los sitios NotI y EcoRI del vector

pBlueScript SK (+), dando como resultado el plásmido pBlueScript SK (+)-enlazador

BUF-FLS2 (figura 7).

Figura 7. Plásmido pBlueScript SK (+)-enlazador BUF-FLS2. Ligación del enlazador BAK1-UB-

FLS2 con el gen FLS2. Nótese que el enlazador BUF se ligó incluyendo un pequeño fragmento

del vector pUC57 (en color negro), para incluir al sitio SpeI, el cual se usaría posteriormente

para ligarlo al resto del casete.

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Posteriormente, y ya con los enlazadores ligados a uno de sus respectivos

genes, se intentó completar la construcción del casete ligando los fragmentos EUB-

BAK1, BUF-FLS2 y EFR, dentro del vector pUC19 para, posteriormente, transferir el

casete al vector de expresión en plantas LJMS. En la tabla 3 se muestran los detalles

de los fragmentos que se intentaron ligar con esta estrategia.

Tabla 3. Detalles de la tercera estrategia que se siguió para la construcción del casete.

Se intentó completar la construcción del casete, usando a pUC19 como vector. El

tamaño total del casete sería de 8,931 pb, que sumados a las 2,681 pb del pUC19,

daban un total de 11,612 pb.

Elemento del casete Enzimas usadas

para su digestión

Tamaño del fragmento

obtenido (pb)

Vector pUC19 BamHI

KpnI 2,681

pJET1.2/ EFR KpnI

EcoRI 2,760

pBlueScript SK (+)/enlazador

EUB-BAK1

EcoRI

SpeI 2,138

pBlueScript SK (+)/enlazador

BUF-FLS2

SpeI

BamHI 4,033

Total: 11,612

Después de varios intentos para completar la construcción del casete por

medio de esta estrategia, se pensó que la razón por la cual no se estaba llevando a

cabo la ligación era que los sitios KpnI y BamHI en el vector pUC19 se encuentran muy

cerca uno del otro, a tan solo 6 pb de distancia, lo que podría estar impidiendo que

las enzimas se anclaran al ADN para realizar los cortes y las ligaciones. Por este motivo

se decidió usar una estrategia más.

La nueva estrategia consistía en tratar de completar la construcción del casete

directamente dentro del vector de expresión en plantas LJMS. Sin embargo, los sitios

que permitirían llevar a cabo dicha ligación en ese vector eran BamHI y SalI, los cuales

no estaban presentes en los extremos del casete que se deseaba construir. De modo

que se mandaron sintetizar dos pequeños parches de ADN (figura 8), que

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correspondían a la parte inicial del primer gen del casete (EFR), con un sitio BamHI

añadido antes de este, y a la parte final del último gen del casete (FLS2), con un sitio

SalI añadido después de este.

Figura 8. Parches para añadir sitios de restricción al inicio y al final de la construcción. El

primer parche consiste en la parte inicial del gen EFR, desde su inicio hasta el sitio SpeI, con

un sitio BamHI (en rojo) añadido antes del inicio del gen. El segundo parche consiste en la

parte final del gen FLS2, desde el sitio PstI hasta el final del mismo, con un sitio SalI (en rojo)

añadido después del final del gen.

De manera que utilizando los parches de la figura 8, se sustituyó la parte inicial

del gen EFR en el plásmido pJET1.2-EFR (figura 4, panel inferior), mediante los sitios

KpnI y SpeI; y la parte final del gen FLS2 en el plásmido pBlueScript SK (+)-FLS2 (figura

4, panel central), mediante los sitios PstI y BamHI, dando como resultado los

plásmidos que se muestran en las figuras 9 y 10.

- 55 -

Figura 9. Plásmido pJET1.2 conteniendo el gen EFR editado con BamHI. Utilizando el parche

que se sintetizó, fue posible remplazar la parte inicial del gen EFR para incorporar un sitio

BamHI (en rojo), el cual sería utilizado para ligarlo en el vector LJMS.

- 56 -

Figura 10. Plásmido pBlueScript SK(+) conteniendo el enlazador BUF y el gen FLS2 editado

con SalI. Utilizando el parche sintetizado, fue posible remplazar la parte final del gen FLS2

para incorporar un sitio SalI (en rojo), el cual sería utilizado para ligarlo en el vector LJMS.

Finalmente, se procedió a construir el casete completo ligándolo directamente

dentro del vector LJMS. En la tabla 4 se detalla el origen de los elementos que se

utilizaron para la construcción del casete, así como las enzimas con las que fueron

cortados los fragmentos para su ligación.

- 57 -

Tabla 4. Detalles de la estrategia que se siguió para la construcción final del casete

dentro del vector LJMS. Se completó la construcción del casete, usando a LJMS como

el vector final de expresión en plantas. El tamaño total del casete fue de 8,931 pb,

que sumados a las 19,595 pb del LJMS, dieron un total de 28,526 pb.

Elemento del casete Enzimas usadas

para su digestión

Tamaño del fragmento

obtenido (pb)

Vector LJMS (figura 1) SalI

BamHI 19,595

pJET1.2/ EFR editado con BamHI

(figura 9)

BamHI

EcoRI 2,758

pBlueScript SK (+)/ enlazador

EUB-BAK1 (figura 6)

EcoRI

SpeI 2,138

pBlueScript SK (+)/ enlazador

BUF-FLS2 editado con SalI

(figura 10)

SpeI

SalI 4,035

Total: 28,526

De esta manera, quedó finalmente construido el casete completo con los

genes EFR, BAK1 y FLS2, en ese orden y separados cada uno de otro por un monómero

de ubiquitina de tabaco para facilitar el procesamiento del polipéptido traducido in

planta. El fragmento completo fue clonado dentro del vector de expresión en plantas

LJMS. En la figura 11 se muestra el aspecto de la construcción final.

Figura 11. Construcción completa del casete usado para la transformación de las plantas.

Los genes EFR, BAK1 y FLS2 quedaron clonados en ese orden dentro del vector de expresión

en plantas LJMS, separado uno de otro por un monómero de ubiquitina (UB) de tabaco. Se

señalan las enzimas utilizadas para la ligación de todos los fragmentos.

- 58 -

La construcción final fue comprobada mediante un análisis de mapeo por

restricción (figura 12), así como también por secuenciación de la misma.

Figura 12. Análisis de mapeo por restricción del casete EFR-UB-BAK1-UB-FLS2, clonado

dentro del vector LJMS. MPM: marcador de peso molecular correspondiente al ADN del

bacteriófago digerido con HindIII y EcoRI; 1: construcción digerida con HindIII, bandas

esperadas 20,827 pb, 3,235 pb, 1,437 pb, 1,336 pb, 1,015 pb, 288 pb, 224 pb y 164 pb; 2:

construcción digerida con XhoI, bandas esperadas 18,700 pb, 4,501 pb, 2,075 pb, 976 pb,

880 pb, 698 pb, 592 pb y 104 pb; 3: construcción digerida con EcoRI y BamHI, bandas

esperadas 20,409 pb, 5,355 pb y 2,762 pb; 4: construcción digerida con EcoRI y SalI, bandas

esperadas 22,357 pb, 5,355 pb y 814 pb; SD: construcción sin digerir.

- 59 -

La construcción completa fue electroporada en E. coli y una vez que se tuvo

comprobada la secuencia de la misma, se transfirió a A. tumefaciens LBA4404,

igualmente por electroporación.

- 60 -

IV.4. TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE JITOMATE

Se iniciaron los experimentos de transformación empleando la construcción

LJMS/EFR-UB-BAK1-UB-FLS2. Se obtuvieron brotes sanos y verdes, con una buena

velocidad de crecimiento (figura 13). La generación de brotes se dio en un promedio

de 4 a 5 semanas después de la transformación. Fue posible llevar a cabo una

selección visual del material posiblemente transformado ya que, en el subcultivo con

medio de enraizamiento, el material no transformado tendía a desarrollar gran

cantidad de raíces adventicias que no penetraban en el medio de cultivo, mientras

que el material transformado desarrollaba casi exclusivamente raíces no adventicias

que sí penetraban en el medio de cultivo (figura 13). Después de los primeros tres

subcultivos y cuando los brotes ya tenían desarrolladas algunas hojas, se realizaron

los ensayos de tinción de GUS (ver más adelante). Las plantas enraizadas y que

mostraban un resultado positivo en los ensayos de GUS fueron transferidas a suelo

en la cámara de crecimiento.

- 61 -

El fenotipo de las plantas transgénicas fue normal en todos los aspectos, salvo

ligeras alteraciones. Los frutos de las plantas transgénicas presentaban un menor

número de semillas en comparación con las plantas silvestres, en una relación

promedio de 7 a 10. Asimismo, las semillas de las plantas transgénicas tardaban más

tiempo en germinar; mientras que las semillas de las plantas silvestres germinaban

en promedio en 5-7 días, las de las plantas transgénicas lo hacían en un promedio de

9-12 días.

Figura 13. Proceso de transformación y regeneración de las plantas de jitomate. A:

explantes cotiledonarios 10 días después de la infección con A. tumefaciens, desarrollándose

en medio 2Z adicionado con kanamicina. B: plántula regenerada de jitomate de 40 días post

infección (dpi) en medio 1Z. Obsérvense las raíces adventicias que no entran en contacto con

el medio de cultivo, un indicio de que se trataba de una plántula no transgénica. C: plántula

regenerada de jitomate de 60 dpi en medio 1Z. Nótese que no presenta raíces adventicias

que estén fuera del medio de cultivo, un indicio de que se trataba de una plántula

transgénica. D: planta transgénica de jitomate 75 dpi, creciendo en suelo.

- 62 -

IV.5. PRUEBAS MOLECULARES

Ensayos de tinción de GUS en plantas de jitomate

Los ensayos histoquímicos de actividad de la -glucuronidasa, se realizaron

como parte de un segundo escrutinio para la selección de posibles plantas

transgénicas (el primer escrutinio fue la selección de las plántulas regeneradas en

presencia del antibiótico de selección). Dado el hecho de que, en el plásmido utilizado

para transformar las plantas de jitomate, tanto el gen GUS, como el casete que

contenía los genes de PRRs estaban bajo el control del promotor constitutivo 35S, se

esperaba poder monitorear eficientemente la actividad del gen GUS en cualquier

tejido y en cualquier etapa del desarrollo de las plantas. Para el escrutinio inicial de

las plantas, se tomaron pequeñas partes de tejido (raíz u hoja), y se tiñieron de

acuerdo al método ya mencionado (figura 14). Cabe mencionar que este parámetro

de selección resultó muy útil, al revelar la presencia de algunos brotes quiméricos, los

que evidentemente no son deseables cuando se busca generar plantas transformadas

de manera estable y homogénea. Al tener brotes quiméricos regenerados, las

regiones transformadas permiten el crecimiento del brote en el medio de cultivo que

contiene el antibiótico de selección, logrando escapar a este primer escrutinio como

si se tratara de un brote transformado homogéneamente. Es importante hacer notar

que la presencia de dichos brotes quiméricos fue mínima, ya que la gran mayoría de

los brotes regenerados resultaron estar transformados de manera homogénea. Una

vez que las plantas superaron el escrutinio de la tinción de GUS, y mostraron

evidencias claras de ser transformantes homogéneas y no quiméricas, fueron

transferidas a suelo donde continuaron su desarrollo hasta dar frutos, a los cuales se

les realizó la prueba de GUS una vez más (figura 14), para corroborar que se trataba

realmente de plantas transgénicas.

- 63 -

Figura 14. Ensayos de GUS en tejidos de jitomate para evaluar plantas transformadas. Fotografías

representativas en las que se muestran ensayos de tinción histoquímica de la -glucuronidasa/ X gluc

en hojas, raíces y frutos de jitomate transformado y no transformado. A y B: tinción en hojas de

plántulas jóvenes realizadas como un segundo escrutinio de las plantas transgénicas antes de ser

pasadas a suelo. Compárese una hoja positiva para GUS (A), contra una negativa (B). C y D: tinción

en raíces de plantas jóvenes, realizada al momento de ser pasadas del medio de cultivo in vitro al

suelo. Nótese la diferencia entre una raíz de una planta positiva (C) y de una negativa (D). E y F:

tinción en hojas de plantas adultas ya creciendo en suelo. Compárese la hoja de una planta silvestre

(E), contra la hoja de una planta transgénica (F). G-I: tinción en frutos inmaduros y maduros.

Compárese el fruto inmaduro de una planta silvestre (G), contra el fruto inmaduro de una planta

transgénica (I). En el fruto maduro de la planta transgénica se observa tinción de GUS más tenue

debido a la presencia de licopeno (H).

- 64 -

De esta manera, se lograron obtener cuatro líneas independientes de plantas

transgénicas, las cuales se permitió que se desarrollaran hasta que dieran frutos,

cuyas semillas se germinaron directamente en tierra (figura 15). Con las plantas

germinadas de dichas semillas se repitió el proceso, y así se siguió sucesivamente

hasta obtener plantas de la cuarta generación (F4). Es importante mencionar que, al

total de plantas de cada generación que germinaban y crecían, se escrutaban

nuevamente mediante el ensayo de GUS. De manera interesante, el porcentaje de

plantas que resultaron ser positivas para dicho ensayo, aumentó sucesivamente en

cada generación, de tal manera que en la F1 el 85% de las plantas germinadas

resultaron positivas, en la F2 fue un 91%, en la F3 un 94% y en la F4 un 97%. Esto es

importante, ya que indicó que los transgenes realmente se habían integrado al

genoma de las plantas, que se estaban heredando de manera estable y que las líneas

de plantas transgénicas estaban tendiendo hacia la homocigosidad.

- 65 -

Análisis por PCR de las líneas transgénicas de jitomate

Una vez que las plantas regeneradas habían sido analizadas por selección en

cultivo y por ensayos de GUS, el siguiente escrutinio para la comprobación de la

integración de los transgenes, consistió en la realización de análisis por PCR.

Siguiendo los protocolos y usando los mismos oligonucleótidos que se utilizaron para

aislar y amplificar los genes EFR, BAK1 y FLS2 originalmente a partir de una biblioteca

de cADN de A. thaliana, se realizaron amplificaciones empleando ADN de hojas

jóvenes de las diferentes líneas de plantas transgénicas de la F1 a la F4. Tras la

realización de los ensayos pertinentes, bandas del tamaño esperado aparecieron en

las plantas de jitomate transgénicas (figura 16). Se obtuvieron consistentemente

bandas amplificadas de los tamaños esperados en todos los casos. Es importante

mencionar que, cuando se llevó a cabo el análisis por PCR usando ADN de plantas no

transgénicas, los oligonucleótidos específicos para los genes FLS2 y BAK1 amplificaron

una banda del tamaño correspondiente, esto se debe a que la planta de jitomate

posee ortólogos para dichos genes, y que el grado de identidad es tal, que permite la

amplificación de los mismos utilizando los oligonucleótidos diseñados para amplificar

los genes de Arabidopsis. Sin embargo, para el caso del gen EFR, el cual es exclusivo

de la familia Brassicaceae, no se obtuvo ninguna banda amplificada en las plantas no

transgénicas (figura 16).

Figura 15. Germinación y desarrollo de plantas transgénicas de jitomate F1-F4. Fotografías

representativas, en las que se muestran los diferentes estadios del desarrollo de las

diferentes generaciones de las líneas transgénicas de jitomate. A: plántula de la F1 de la línea

transgénica 4, a los 6 días de edad, desarrollándose en la cámara de crecimiento. B: plántula

de la F2 de la línea transgénica 11, a los 10 días de edad, desarrollándose en la cámara de

crecimiento. C: fruto maduro de la F2 de la línea transgénica 7, desarrollándose in planta en

el invernadero. D: lote de la F3 de la línea transgénica 3, a los 25 días de edad,

desarrollándose en la cámara de crecimiento. E: planta de la F4 de la línea transgénica 7, a

los 85 días de edad, desarrollándose en invernadero.

- 66 -

Figura 16. Evidencia molecular de la transformación de jitomate con el casete de genes de

resistencia. Resultados representativos de PCR en los que se muestran amplificaciones

específicas de los genes EFR, FLS2 y BAK1, a partir de ADN genómico total, aislado de plantas

transgénicas de jitomate. Tinción de bromuro de etidio de un gel de agarosa en el que se

muestran los productos de amplificación por PCR de tres diferentes líneas transgénicas de

plantas de jitomate de la generación F3, y de una línea no transgénica (NT). En el caso de la

línea no transgénica se observa amplificación de los genes FLS2 y BAK1, como resultado de

la presencia de genes endógenos ortólogos en el genoma del jitomate. Como marcador de

peso molecular (MPM), se utilizó ADN del bacteriófago digerido con HindIII y EcoRI.

- 67 -

IV.6. RETOS CON BACTERIAS FITOPATÓGENAS

Una vez que se comprobó, a través del crecimiento y desarrollo en el medio de

selección, de los ensayos histoquímicos de GUS, y del análisis molecular por PCR, que

las líneas de plantas generadas eran realmente transgénicas, se realizó el reto con

bacterias fitopatógenas para comprobar la resistencia adquirida por la expresión de

los transgenes. Se utilizaron tres patovares de bacterias fitopatógenas para los retos:

P. syringae pv. syringae B728a, P. syringae pv. tomato DC3000 y C. michiganensis

subsp. michiganensis (figura 17).

Figura 17. Cepas bacterianas utilizadas para los retos a las plantas transgénicas. Fotografías

de las diferentes cepas de bacterias usadas para los retos, creciendo in vitro sobre medios

de cultivo. A: cultivo de Pseudomonas syringae pv. syringae B728a creciendo en medio King

B. B: cultivo de P. syringae pv. tomato DC3000 creciendo en medio King B y visto bajo

exposición a luz UV, emitiendo fluorescencia. C: cultivo de Clavibacter michiganensis subsp.

michiganensis creciendo en medio NBY.

Para cada cepa bacteriana probada, se usaron plantas jóvenes de jitomate de

las diferentes generaciones de cada una de las líneas transgénicas generadas. La

preparación de los inóculos y la inoculación de las plantas, se llevaron a cabo como

se describe en la sección de Métodos.

- 68 -

Retos con P. syringae pv. syringae

A los 10 días después de haber realizado la infección, la diferencia en el

desarrollo de síntomas entre las plantas no transgénicas y las diferentes líneas de

plantas transgénicas era muy notable. Los síntomas se manifestaron principalmente

como manchas cloróticas alrededor de los sitios de infección, volviéndose necróticas

con el paso del tiempo. De las cuatro líneas de plantas transgénicas generadas, una

(línea 3), mostró un desarrollo de síntomas severo, casi comparable con los de las

plantas no transgénicas. Las líneas 4 y 11 mostraron un desarrollo de síntomas

ligeramente menor (sobre todo en la línea 11). La línea 7, sin embargo, mostró un

desarrollo de síntomas muy ligero y apenas perceptible, siendo esta línea la que

mejores resultados demostró (figura 18).

Figura 18. Desarrollo de síntomas ante la infección con P. syringae pv. syringae. Fotografías

representativas del desarrollo de síntomas, 10 días después de la infección con P. syringae

pv. syringae, en las diferentes líneas transgénicas, en plantas de la F2. A: planta no

transgénica. B: planta de la línea 3. C: planta de la línea 4. D: planta de la línea 7. E: planta

de la línea 11. F: planta no transgénica utilizada como control, inoculada con PBS sin bacteria.

- 69 -

- 70 -

A los 2, 4, 6, 8 y 10 días después de realizada la infección, se realizaron conteos

bacterianos como se detalla en el apartado de estrategias experimentales. En los días

2 y 4, los conteos bacterianos no mostraron diferencia significativa entre las líneas

transgénicas y la no transgénica. Sin embargo, a partir del día 6 se comenzaron a

observar ligeras diferencias entre las diferentes líneas, haciéndose éstas más notorias

y estadísticamente significativas a partir del día 8. Coincidiendo con lo registrado

visualmente mediante el desarrollo de síntomas, la línea 3 mostró un crecimiento

bacteriano comparable con la línea no transgénica. En el día 4, las líneas 4 y 11

mostraron un crecimiento bacteriano similar entre ellas dos, y menor a la línea 3 y a

la no transgénica. Sin embargo, para el día 8 el conteo de bacterias entre las líneas 4

y 11 fue estadísticamente diferente, siendo ligeramente menor para esta última. La

línea 7 mostró diferencia estadísticamente significativa desde el día 8, alcanzando en

el día 10 únicamente el 40% del crecimiento bacteriano que presentó la línea no

transgénica (figura 19).

Figura 19. Conteo de unidades formadoras de colonia (UFC) a través del tiempo en diferentes

plantas transgénicas de jitomate retadas con Pseudomonas syringae pv. syringae. Se muestra

el número de UFC, en plantas de la F3 de las diferentes líneas transgénicas de jitomate (indicadas

mediante barras con diferentes tonos de gris, excepto las barras blancas que representan plantas

control, [WT]), después de la infección con P. syringae pv. syringae. Las barras representan el

promedio ± el error estándar de la media. Las barras con la misma letra no son significativamente

diferentes (t de Student, P < 0.05).

- 71 -

Retos con Pseudomonas syringae pv. tomato

Al igual que como había sucedido con P. syringae pv. syringae, a los 10 días

después de haber realizado la infección con P. syringae pv. tomato, la diferencia en

el desarrollo de síntomas entre las plantas no transgénicas y las diferentes líneas de

planas transgénicas era muy notable. Igualmente, los síntomas se manifestaron

principalmente como manchas cloróticas alrededor de los sitios de infección,

volviéndose necróticas con el paso del tiempo. De las cuatro líneas de plantas

transgénicas generadas, una vez más, la línea 3 mostró un desarrollo de síntomas

severo, casi comparable con los de las plantas no transgénicas. Las líneas 4 y 11

mostraron un desarrollo de síntomas ligeramente menor. La línea 7 volvió a mostrar

un desarrollo de síntomas muy ligero y apenas perceptible, siendo esta línea, una vez

más, la que mejores resultados mostró (figura 20).

- 72 -

Figura 20. Desarrollo de síntomas ante la infección con P. syringae pv. tomato. Fotografías

representativas del desarrollo de síntomas, 10 días después de la infección con P. syringae

pv. tomato, en las diferentes líneas transgénicas en plantas de la F2. A: planta no transgénica.

B: planta de la línea 3. C: planta de la línea 4. D: planta de la línea 7. E: planta de la línea 11.

F: planta no transgénica utilizada como control, inoculada con PBS sin bacteria.

A los 2, 4, 6, 8 y 10 días después de realizada la infección, se realizaron conteos

bacterianos como se detalla en el apartado de estrategias experimentales. En el día

2, los conteos bacterianos no mostraron diferencia significativa entre las líneas

- 73 -

transgénicas y la no transgénica. Sin embargo, a partir del día 4 se comenzaron a

observar diferencias significativas distinguiéndose tres grupos diferentes,

coincidiendo nuevamente con lo registrado visualmente por medio del desarrollo de

síntomas: la línea no transgénica y la línea 3 presentaron los niveles más altos de UFC,

las líneas 4 y 11 con niveles de UFC intermedios y similares entre ellas dos, y la línea

7 con el menor nivel de UFC. Pasados los días, las diferencias entre estos tres grupos

se fueron acentuando cada vez más, hasta el punto que para el día 10, la línea 7

presentaba solo cerca del 27% del crecimiento bacteriano que presentó la línea no

transgénica (figura 21).

Figura 21. Conteo de unidades formadoras de colonia (UFC) para la infección con

Pseudomonas syringae pv. tomato. Gráfica que representa el número de UFC, en plantas de

la F3 de las diferentes líneas transgénicas de jitomate (indicadas mediante barras con

diferentes tonos de gris, excepto las barras blancas que representan plantas control, [WT]),

después de la infección con P. syringae pv. tomato. Las barras representan el promedio ± el

error estándar de la media. Las barras con la misma letra no son significativamente

diferentes (t de Student, P < 0.05).

- 74 -

Retos con Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis

En el caso de las infecciones con C. michiganensis subsp. michiganensis, los

síntomas tardaron más días en manifestarse, comenzando a aparecer en promedio

en el día 25 después de la infección. Los síntomas se manifestaron, principalmente,

como necrosis marginal de las hojas, marchitamiento general de la planta y presencia

de cáncer en el tallo. El síntoma del ojo de pájaro en el fruto no se presentó en ningún

caso. Al igual que como había sucedido con las infecciones con Pseudomonas, se

observaron diferencias importantes con respecto a la manifestación de síntomas en

las diferentes líneas transgénicas, y en la línea no transgénica. Una vez más, la línea 3

mostró síntomas muy intensos, comparables con aquellos desarrollados en la línea

no transgénica. Las líneas 4 y 11 mostraron un desarrollo de síntomas moderado,

mientras que la línea 7 destacó de manera importante, al ser la que menos síntomas

desarrolló, como se puede apreciar en la figura 22.

Figura 22. Desarrollo de síntomas ante la infección con C. michiganensis subsp.

michiganensis. Fotografías representativas del desarrollo de síntomas 35 días después de la

infección en plantas de la F2 de la línea 7 y de la línea no transgénica. A-C, planta no

transgénica. A, aspecto global de la planta, observándose marchitamiento general. B, detalle

de una hoja, observándose la necrosis marginal. C, detalle del tallo, observándose el cáncer

en estado muy avanzado, al grado de abrir el tallo en parte importante de su longitud. D-F,

planta de la línea 7. D, aspecto global de la planta; se alcanza a apreciar un marchitamiento

muy leve. E, detalle de una hoja; la necrosis marginal sólo se presenta en una parte localizada

de la hoja. F, detalle del tallo; sólo se aprecia una lesión muy localizada en el punto donde se

realizó la infección. G-I, planta control inoculada con PBS sin bacteria. G, aspecto global de

la planta; no se observa marchitamiento alguno. H, detalle de una hoja; ausencia total de

necrosis marginal. I, detalle del tallo; sólo se observa un pequeño punto de lesión en el lugar

donde se hizo la inoculación.

- 75 -

- 76 -

A los 20, 25, 30, 35 y 40 días después de realizada la infección, se realizaron

conteos bacterianos como se detalla en el apartado de estrategias experimentales.

En el día 20, los conteos bacterianos no mostraron diferencia significativa entre las

líneas transgénicas y la no transgénica. Sin embargo, para el día 25 la línea 7 ya

mostraba un número de UFC significativamente menor que el resto de las líneas. Para

el día 30, las líneas 4 y 11 mostraban una disminución en el número de UFC con

respecto a la línea 3 y a la no transgénica. Sin embargo esta diferencia aún no fue

estadísticamente significativa. Para el día 35, la diferencia en el número de UFC entre

las líneas 4 y 11, y las líneas 3 y no transgénica, fue de importancia estadística,

mientras que la línea 7 presentó consistentemente un número de UFC

considerablemente inferior a todas las demás líneas. Para el día 40, fue muy clara la

existencia de tres grupos diferentes: por un lado, la línea no transgénica y la línea 3

con el mayor número de UFC, sin diferencias estadísticas entre ellas; las líneas 4 y 11

con un número intermedio de UFC, sin diferencias estadísticas entre ellas y por último

la línea 7 con tan sólo el 17% del crecimiento bacteriano que presentó la línea no

transgénica (figura 23).

- 77 -

IV.7. ANÁLISIS POR PCR CON TRANSCRIPTASA INVERSA (RT-PCR)

Una vez culminados los experimentos de reto a las plantas transgénicas con

bacterias fitopatógenas, se decidió llevar a cabo un análisis por PCR con transcriptasa

inversa (RT-PCR), en un intento por tratar de explicar los diferentes grados de

resistencia observados en las figuras anteriores, ya sea por la apreciación visual de la

sintomatología, o el conteo de UFC en las distintas líneas de plantas transgénicas.

Empleando hojas de plantas jóvenes de la F4 de las diferentes líneas

transgénicas, se realizaron extracciones de ARN total. Los ARN fueron empleados

para la realización de ensayos de RT-PCR, con el propósito de detectar los niveles de

acumulación de transcrito de los transgenes, utilizando al gen endógeno del jitomate

EF-a, correspondiente a un factor de transcripción, como control para la comparación

de los niveles de transcripción de los transgenes (figura 24).

En el caso de los genes BAK1 y FLS2, como era de esperarse por los resultados

del análisis de PCR realizado anteriormente, se amplificó una banda incluso en la línea

no transgénica, debida a la presencia de los genes ortólogos en las plantas de

jitomate. Sin embargo, claramente se puede apreciar que la banda es más intensa en

las líneas transgénicas, especialmente en la línea 7 (figura 24), indicando una mayor

acumulación de los transcritos de estos genes, como resultado de la sobreexpresión

de los mismos. Por otro lado, en el caso del gen EFR no se amplificó ninguna banda

en la línea no transgénica, indicando la ausencia total de este gen en el genoma del

jitomate. Como era de esperarse, en todas las líneas transgénicas analizadas se

amplificó una banda correspondiente a este gen. Sin embargo, y coincidiendo con los

resultados vistos mediante la sintomatología de las plantas y el conteo de las UFC, la

línea 3 fue la que presentó la menor acumulación de transcrito, mientras que la línea

7 presentó la mayor acumulación del mismo (figura 24).

Figura 23. Conteo de unidades formadoras de colonia para la infección con Clavibacter

michiganensis subsp. michiganensis. Gráfica que representa el número de unidades

formadoras de colonia (UFC), en plantas de la F3 de las diferentes líneas transgénicas de

jitomate (indicadas mediante barras con diferentes tonos de gris, excepto las barras blancas que

representan plantas control, [WT]), después de la infección con C. michiganensis subsp.

michiganensis. Las barras representan el promedio ± el error estándar de la media. Las barras

con la misma letra no son significativamente diferentes (t de Student, P < 0.05).

- 78 -

Figura 24. Análisis por PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) de las líneas transgénicas de

jitomate. Se analizó la acumulación de transcritos de los transgenes BAK1, EFR y FLS2. La RT-

PCR control, realizada con el gen endógeno de jitomate EF-a, indica una carga similar en los

carriles. NT: línea no transgénica; L3: línea 3; L4: línea 4; L7: línea 7; L11: línea 11.

- 79 -

V. DISCUSIÓN

La mayor parte de los proyectos de ingeniería genética enfocados a conferir

resistencia a enfermedades en cultivos importantes, se ha enfocado a las

enfermedades ocasionadas por factores ambientales, virus y hongos. Son pocos los

trabajos desarrollados con el fin de conferir resistencia a enfermedades bacterianas

por medio de ingeniería genética. Así pues, el presente trabajo representa un aporte

importante en dicho aspecto, ya que presenta algunas particularidades de interés

científico. Por un lado, en este proyecto se ha optado por utilizar el sistema inmune

innato de las plantas para conferir la resistencia. Es decir, se utilizaron los genes

codificantes de ciertos PRRs que detectan MAMPs presentes en un amplio rango de

bacterias, en vez de utilizar los clásicos genes R, que hasta hace poco se habían venido

utilizando como única forma de conferir resistencia ante microorganismos. Por otro

lado, se optó por utilizar dos genes codificantes de PRRs y un tercer gen codificante

de un correceptor de dichos PRRs con el fin de que la resistencia generada sea de

mayor espectro y más duradera. Asimismo, otra peculiaridad del presente trabajo fue

la utilización de un casete multigénico, que aprovechó el sistema de procesamiento

de proteínas por medio de ubiquitina, presente de manera endógena en todas las

plantas superiores. A continuación, se discutirán más a fondo algunas

particularidades de la estrategia experimental, así como la relevancia que podrían

tener los resultados aquí presentados en el desarrollo futuro de proyectos de este

tipo.

La resistencia específica generada por la acción de genes importantes, es el

tipo de resistencia más fácil de incorporar en programas de mejoramiento tradicional,

y usualmente se considera como un tipo de resistencia de gen por gen.

Desafortunadamente, para el caso de muchos patógenos, este tipo de resistencia

cualitativa a menudo no es duradera, debido a que los patógenos mutan

rápidamente. Por este motivo, en los últimos años se ha puesto mayor atención en la

acumulación de genes importantes de resistencia en plantas de cultivo. Muchas

publicaciones han reportado que para las enfermedades bacterianas, tales como el

tizón, se puede lograr una mayor resistencia de amplio espectro apilando más de dos

genes de resistencia bacteriana en una sola línea, cuando se compara con líneas que

solo tienen un gen de resistencia (Suh et al., 2009). El apilamiento de genes es muy

- 80 -

difícil de conseguir mediante métodos convencionales de mejoramiento, debido a los

efectos de dominancia y epistasis de los genes que gobiernan la resistencia a

enfermedades y por la inevitable pérdida de caracteres valiosos durante el proceso

(Suh et al., 2013). Por esta razón, en este trabajo se eligió utilizar a la ingeniería

genética para el apilamiento de los genes.

Es importante hacer notar que, aunque existen reportes previos de plantas

transformadas con un gen codificante de PRR (Chinchilla et al., 2006; Lacombe et al.,

2010), esta es la primera vez que se transforman plantas con un casete multigénico

que incluye dos genes codificantes de PRRs (EFR y FLS2), además de un gen que

codifica para un correceptor de los mismos (BAK1). De esta manera se buscó que la

resistencia generada fuera más difícil de superar por los patógenos y, por lo tanto,

más duradera. Es un hecho bien conocido que cuando la resistencia de una planta a

cierto patógeno, depende de un sólo gen, es rápidamente superada por el patógeno

al seleccionar especímenes mutantes, recombinantes o inmigrantes que estén mejor

adaptados a la variedad resistente.

La transformación genética del jitomate es un procedimiento de rutina en

nuestro laboratorio y está bien estandarizado (Gutiérrez-Ortega et al., 2005; Ramírez

et al., 2007), y para el presente estudio se utilizaron cinco evidencias para verificar la

naturaleza transgénica de las plantas: 1) el crecimiento y desarrollo de las mismas en

el medio de selección con antibiótico; 2) los ensayos colorimétricos de expresión de

GUS; 3) la detección de los transgenes por amplificación con PCR, utilizando

oligonucleótidos específicos; 4) la detección de los niveles de transcrito de los

transgenes por medio de RT-PCR, y 5) la resistencia contra infecciones de bacterias

fitopatógenas como resultado de la expresión de los transgenes.

Fue posible generar varias líneas de plantas transgénicas de jitomate, de las

cuales, se seleccionaron cuatro que mostraron actividad del gen GUS en todos los

tejidos analizados (hojas, frutos y raíces). Se extrajo ADN total de tejido foliar de las

cuatro líneas de plantas transgénicas, y usando dicho ADN como templado, se

llevaron a cabo pruebas de PCR para determinar si los transgenes estaban presentes.

El gen EFR amplificó en las líneas transgénicas, pero no en la no transgénica (NT). Esto

era de esperar, ya que la planta de jitomate no cuenta con un ortólogo para dicho

gen. Sin embargo, los genes FLS2 y BAK1 amplificaron no sólo en las líneas

transgénicas, sino también en la NT, indicando que los ortólogos del jitomate para

- 81 -

dichos genes, son lo suficientemente similares a los de Arabidopsis, como para poder

ser amplificados utilizando el mismo par de oligonucleótidos.

Se permitió que las cuatro líneas transgénicas de jitomate se autopolinizaran

para originar las generaciones F1 a F4. En cada generación de planta, se llevaron a

cabo ensayos de GUS y amplificaciones de los genes por PCR. Cada generación

consecutiva mostró un incremento en el porcentaje de ensayos GUS positivos, lo cual

indica que los transgenes se integraron en el genoma de las plantas y que se

heredaban de manera estable, y que de esta forma, las líneas transgénicas de

jitomate estaban tendiendo hacia la homocigosidad con respecto a los transgenes.

Se decidió transformar a las plantas con un vector que contenía un sólo casete,

en el cual los tres genes estaban separados uno de otro por un enlazador consistente

de un monómero de ubiquitina de tabaco, y bajo el control de un mismo promotor

constitutivo 35S. La razón de este enfoque se basó en las varias ventajas que confiere.

En primer lugar, el uso de un sólo promotor hace posible la expresión coordinada y

equimolar de las diferentes proteínas (Walker y Vierstra, 2007). En segundo lugar, la

ubiquitina es procesada rápida y adecuadamente in vivo por las enzimas

desubiquitinizantes, las cuales liberan formas libres y funcionales de las proteínas

previamente unidas a estos enlazadores. En tercer lugar, al usar un solo promotor, se

reduce la posibilidad de silenciamiento de los transgenes, lo cual podría ser un

problema si se empleara más de un promotor.

Es importante hacer notar que aunque la PTI parece estar conservada a todo

lo largo del reino vegetal y de las muchas similitudes observadas a lo largo del mismo,

existen diferencias en la naturaleza de las respuestas de PTI entre las diferentes

especies de plantas (Nguyen et al., 2010). Esto es lo que hace posible que, al transferir

los PRRs entre familias vegetales, se puedan conferir nuevas capacidades de

resistencia contra bacterias. De hecho, ya se ha demostrado que los principales genes

de resistencia retienen su función cuando son transferidos entre especies vegetales.

Por ejemplo, la expresión de EFR en el tabaco silvestre N. benthamiana, que

normalmente no es responsivo a EF-Tu, resultó en el reconocimiento del efector elf18

y en la activación de las defensas basales típicas (Zipfel et al., 2006). Más aún, plantas

transgénicas de la familia Solanaceae, que se manipularon genéticamente para

expresar el gen EFR, mostraron una resistencia significativamente más alta a

múltiples bacterias patógenas (Lacombe et al., 2010).

- 82 -

La flagelina, que constituye el bloque constructor del flagelo de las bacterias

verdaderas, es reconocida en casi todas las especies vegetales por FLS2, su receptor

propuesto. Sin embargo, el dominio que es reconocido dentro de la flagelina no es

necesariamente el mismo para todas las especies de plantas. Por ejemplo, es sabido

que la sensibilidad a diferentes péptidos de esta proteína varía entre miembros tanto

de la familia Brassicaceae como de la Solanaceae que son capaces de percibir la

fagelina (Robatzek et al., 2007). En este sentido, se han aislado receptores FLS2 de

jitomate, tabaco y arroz (Robatzek et al., 2007) y todos ellos muestran altos niveles

de identidad a nivel de aminoácidos con respecto al receptor FLS2 de Arabidopsis y

también median la percepción de flagelina. Sin embargo, enfoques computacionales

y filogenéticos han indicado que estos receptores emplean diferentes aminoácidos

para la unión del ligando (Boller y Felix, 2009; Albert et al., 2010). Considerando lo

anterior, se decidió expresar en plantas de jitomate el receptor FLS2 de Arabidopsis,

esperando que esto le conferiría a las plantas, un sitio adicional de reconocimiento a

un epítope de la flagelina.

Retar a las plantas transgénicas con bacterias fitopatógenas, es el método

establecido para probar la resistencia o susceptibilidad de un genotipo vegetal dado

a un patovar específico (Zhao et al., 2003). Por ello, se decidió retar a las líneas

transgénicas con P. syringae pv. syringae, P. syringae pv. tomato y C. michiganensis

subsp. michiganensis, ya que estas bacterias son patógenos importantes del jitomate

y se tienen bien caracterizadas en el laboratorio.

Como se esperaba, algunas de las líneas transgénicas mostraron resistencia

contra las infecciones bacterianas, aun cuando el inóculo utilizado para los retos

contenía una concentración de bacteria mucho más alta que la que puede

presentarse en una infección natural. La línea 7 fue particularmente resistente a la

infección con P. syringae pv. syringae y P. syringae pv. tomato, ya que mostró cerca

del 40 y 27% respectivamente, del número de UFC detectadas en la línea NT a los 10

días después de la infección (ddi). Dichas diferencias en el número de UFC también

se vieron reflejadas en la apariencia general de las plantas, ya que los síntomas de

enfermedad en las plantas de la línea 7 fueron mucho menos severos que aquellos

presentes en las plantas NT.

Normalmente el jitomate es susceptible a infecciones por P. syringae pv.

tomato, ya que varios aislados de esta bacteria muestran polimorfismos de

aminoácidos dentro de la flagelina, lo cual enmascara su reconocimiento por el

- 83 -

jitomate (Cai et al., 2011). Estudios previos han mostrado que la expresión en

jitomate del receptor FLS2 de Arabidopsis, es suficiente para transferirle el sistema

de percepción de flagelina de Arabidopsis (Chinchilla et al., 2006). Esto es importante,

ya que algunos estudios han sugerido que el receptor FLS2 de Arabidopsis posee una

capacidad de reconocimiento más amplia que la que se había anticipado inicialmente.

Por ejemplo, péptidos derivados de la proteína Ax21 de X. oryzae pv. oryzae, activan

la inmunidad mediada por FLS2 en Arabidopsis, aun cuando el receptor FLS2 de arroz

parece no percibir a la proteína Ax21, ni a sus péptidos derivados. Esto es, las plantas

de arroz que carecen del receptor XA21 (pero que aún llevan el receptor FLS2 de

arroz), no responden con una resistencia medible a los péptidos derivados de Ax21

(Danna et al., 2011). Esto puede ser una posible explicación a la resistencia a

Pseudomonas observada en las líneas transgénicas de jitomate en el presente

estudio, ya que la expresión heteróloga del receptor FLS2 de Arabidopsis

posiblemente activó la inmunidad vegetal al reconocer, no sólo a flg22, sino a otro(s)

MAMP de Pseudomonas.

Una evidencia adicional que apoya estos resultados es que las mutantes fls2

de Arabidopsis, muestran una potenciada susceptibilidad a P. syringae pv. tomato

DC3000 (Zipfel et al., 2006), demostrando que el receptor FLS2 de Arabidopsis, de

alguna forma, percibe un MAMP de P. syringae pv. tomato, activando así la

inmunidad vegetal. Con los resultados del presente trabajo, se hipotetiza que la

mayor parte de la resistencia a Pseudomonas mostrada por las plantas transgénicas

de jitomate, fue debida a la expresión del receptor FLS2 de Arabidopsis, y no a la del

receptor EFR, ya que se ha reportado con anterioridad que la flagelina de P. syringae

es más activa desencadenando la PTI mediada por FLS2 en Arabidopsis, en

comparación con la flagelina de A. tumefaciens o de Sinorhizobium meliloti (Felix et

al., 1999). Más aún, la proteína EF-Tu de P. syringae pv. tomato DC3000, es mucho

menos activa desencadenando la PTI en Arabidopsis que lo que lo es la proteína EF-

Tu de Agrobacterium (Kunze et al., 2004).

Es importante hacer notar que aunque las plantas transgénicas mostraron

niveles de crecimiento bacteriano y de síntomas de enfermedad reducidos, hubo un

menor grado de infección, pero aún detectable, aún en la línea 7 que fue la que

mostró los mejores resultados. Esto indica que la resistencia conferida no fue

absoluta. Una posible explicación para este comportamiento puede ser la presencia

de los efectores AvrPto/ AvrPtoB en P. syringae pv. tomato DC3000, los cuales son

- 84 -

conocidos por ser fuertes supresores de la PTI (He et al., 2006). De hecho, se ha

demostrado que, cuando son introducidos a niveles naturales por P. syringae pv.

tomato, AvrPto y AvrPtoB atacan a BAK1 y bloquean la formación de los complejos

MAMP-receptor inducida por ligandos, impidiendo así, de manera efectiva, la

iniciación de múltiples señalizaciones por MAMP (Shan et al., 2008). Por lo tanto, la

transformación de plantas de jitomate con un gen BAK1 de Arabidopsis, aun cuando

el jitomate posee un ortólogo endógeno (Peng y Kaloshian, 2014), podría haber

resultado en la sobreexpresión de la RLK BAK1, lo cual podría haber contrarrestado el

ataque de los efectores AvrPto/ AvrPtoB, y así permitir la formación de los complejos

MAMP-receptor, a pesar de la presencia de dichos efectores.

El mismo patrón se observó para las infecciones con C. michiganensis subsp.

michiganensis, a pesar de que, igualmente a lo realizado con Pseudomonas, se usaron

inóculos mucho más concentrados que los que la planta podría encontrar en la

naturaleza. A pesar de ello algunas de las líneas transgénicas mostraron cierto grado

de resistencia a la bacteria. Una vez más, los mejores resultados se encontraron en

plantas de la línea 7, la cual sólo presentó cerca del 17% del número de UFC de C.

michiganensis, comparada con las que presentaron las plantas de jitomate NT a 40

ddi. El decremento en el número de UFC también se vio reflejado en la apariencia

general de las plantas, especialmente en las de la línea 7, en las que los síntomas del

cáncer bacteriano fueron mucho más leves que los de las plantas NT.

Debido a que Clavibacter se caracteriza por no presentar movilidad y, por lo

tanto, no tener estructuras flagelares, es posible hipotetizar que la resistencia

mostrada por las líneas de jitomate transgénicas en el presente estudio, no se debió

a la expresión heteróloga del gen FLS2 de Arabidopsis, sino más bien a la expresión

del gen EFR de Arabidopsis. El MAMP reconocido por el receptor EFR es el factor de

traducción procariótico EF-Tu, el cual es la proteína más abundante y una de las más

conservadas en células bacterianas (Walters, 2015). A pesar de esto, la percepción

del EF-Tu bacteriano se encuentra únicamente en miembros de la familia

Brassicaceae, ya que todas las plantas no pertenecientes a esta familia que han sido

analizadas hasta ahora, incluyendo a algunas solanáceas, han sido incapaces de

mostrar la característica ráfaga de especies reactivas de oxígeno que se activa cuando

las plantas que tienen este receptor son retadas con EF-Tu, o con su péptido inductor

activo (elf18) (Zipfel et al., 2006). Esto indica que, al expresar el receptor EFR en una

solanácea (como el jitomate en este caso), se confiere a la planta una herramienta

- 85 -

novedosa para reconocer patógenos potenciales, y para activar su inmunidad basal

para combatirlos, y tener así, una mayor habilidad para resistir enfermedades

bacterianas, como ha sido demostrado con los resultados de este estudio.

Con el fin de encontrar una explicación a las diferencias en los niveles de

resistencia mostrados por las diferentes líneas transgénicas, se sintetizó cADN a partir

de ARN total extraído de hojas jóvenes. Utilizando dicho cADN, se realizó un análisis

por RT-PCR para identificar los niveles de acumulación de transcrito de los transgenes.

Aunque la acumulación del transcrito de los genes FLS2 y BAK1 fue detectable en las

plantas NT (debido a los genes ortólogos del jitomate), las líneas 4 y 11, pero

especialmente la línea 7, mostraron una mayor acumulación de transcrito, indicando

una sobreexpresión de dichos genes como resultado de la expresión heteróloga bajo

el control de un promotor constitutivo de los genes de Arabidopsis.

La línea 3 no mostró una mayor acumulación de transcritos comparada con las

plantas NT. Dicho resultado explica en cierta medida la falta de resistencia a las

infecciones bacterianas que mostró esta línea. No obstante, la línea 3 mostró

acumulación de transcrito del gen EFR (si bien fue poca), indicando que las plantas de

la línea 3 eran de hecho transgénicas, pero sin una expresión óptima de los

transgenes. Como era de esperarse, las plantas NT no mostraron ninguna

acumulación de transcrito para el gen EFR, ya que este gen está restringido a las

plantas de la familia Brassicaceae (Zipfel et al., 2006). A su vez, la línea 7 mostró la

mayor acumulación de estos transcritos, lo que sugiere una explicación plausible a la

mayor resistencia a patógenos bacterianos mostrada por las plantas de esta línea, las

cuales tuvieron los conteos más bajos de UFC y mostraron los síntomas de infección

más leves.

- 86 -

- 87 -

VI. CONCLUSIONES

Se construyó el plásmido LJMS/EFR-UB-BAK1-UB-FLS2, usando como base el

vector de expresión en plantas LJMS, el cual contiene una versión potenciada del

promotor constitutivo 35S, proveniente del virus del mosaico de la coliflor. Además,

el vector contine el gen de la aminoglucósido fosfotransferasa del transposón Tn5, el

cual confiere resistencia a kanamicina y del gen de la -glucuronidasa, como gen

reportero. Dicho plásmido contiene, además, el casete multigénico EFR-UB-BAK1-UB-

FLS2, el cual porta los genes EFR y FLS2 de Arabidopsis thaliana, que codifican para

receptores de reconocimiento de patrones, y el gen BAK1, que codifica para un

correceptor de dichos receptores, también proveniente de A. thaliana. En dicho

casete, cada uno de estos tres genes está unido al gen contiguo por un mónomero de

ubiquitina de tabaco.

Con el plásmido mencionado en el párrafo anterior, se transformaron plantas

de jitomate de manera estable. La transformación de las plantas se llevó a cabo por

medio de A. tumefaciens, utilizando cotiledones de plantas jóvenes como explantes.

Se lograron generar 4 líneas transgénicas de jitomate. La naturaleza

transgénica de dichas líneas se comprobó por medio de 5 evidencias: 1) el crecimiento

y desarrollo de las plántulas en medio de selección con antibiótico; 2) la respuesta

colorimétrica positiva de los tejidos analizados al ensayo histoquímico de GUS; 3) la

detección de los transgenes por medio de PCR; 4) la resistencia a infecciones de

bacterias fitopatógenas, y 5) la detección por medio de RT-PCR, de los niveles de

transcrito de los transgenes.

Se permitió que cada línea transgénica se autopolinizara para producir las

generaciones F1 a F4. En cada generación, se repitieron las pruebas para verificar la

naturaleza transgénica de las plantas y comprobar así, que los transgenes se habían

incorporado al genoma de las plantas y se heredaban de manera estable.

Se retaron a las 4 líneas transgénicas con infecciones de las bacterias

fitopatógenas de jitomate P. syringae pv. syringae, P. syringae pv. tomato y C.

michiganensis subsp. michiganensis. Los niveles de resistencia o susceptibilidad se

determinaron por apreciación visual del desarrollo de síntomas, y por conteos de

unidades formadoras de colonias en los tejidos infectados.

- 88 -

De las 4 líneas transgénicas, una (la línea 3), no mostró prácticamente ningún

nivel de resistencia ante las infecciones bacterianas, al compararla con las plantas no

transgénicas. Las línea 4 y 11 mostraron una resistencia moderada, mientras que la

línea 7 fue la que presentó el mayor grado de resistencia ante las infecciones.

Los análisis por RT-PCR mostraron que la línea 3, si bien era transgénica,

presentaba los niveles más bajos de acumulación de transcrito, mientras que las

líneas 4 y 11 mostraban un nivel intermedio de acumulación, y la línea 7 presentaba

la máxima acumulación de transcrito de los transgenes. Estos resultados coincidieron

con lo observado por medio de la sintomatología y de los conteos bacterianos, y

ayudaron a explicar los diferentes grados de resistencia registrados en las distintas

líneas transgénicas.

Analizados de manera conjunta, los resultados anteriores sugieren que existe

una clara correlación entre la expresión de los transgenes y el grado de resistencia a

las infecciones de bacterias fitopatógenas. Los análisis por RT-PCR revelaron que una

mayor acumulación de transcrito de los transgenes se correspondía claramente con

un mayor nivel de resistencia en las diferentes líneas de plantas transgénicas. Así

pues, es posible afirmar con cierto grado de certeza, que la resistencia a las

infecciones bacterianas mostrada por las plantas transgénicas, se debe a la expresión

heteróloga de los genes de Arabidopsis thaliana, EFR, FLS2 y BAK1, involucrados en la

inmunidad innata en dicha planta.

- 89 -

VII. PERSPECTIVAS

El crecimiento desmedido de la población mundial en las últimas décadas ha

ocasionado que la demanda de alimentos sea cada vez mayor. Prácticamente todos

los cultivos de importancia alimenticia son atacados por enfermedades bacterianas

que, en ocasiones, pueden llegar a ocasionar grandes pérdidas, no sólo económicas

sino también alimenticias.

La tecnología desarrollada en el presente trabajo ofrece una interesante gama

de perspectivas para posibles aplicaciones en el futuro. Debido a que la estrategia

usada en este proyecto para generar resistencia contra bacterias, se basa en el

reconocimiento de patrones moleculares que son esenciales para la supervivencia de

los microorganismos, y que están presentes no en grupo específico de bacterias, sino

en un amplio rango de ellas. Es plausible suponer que la resistencia que se generó en

las plantas de jitomate es efectiva, no sólo contra las tres especies de bacterias

fitopatógenas analizadas en el estudio, sino también contra otras bacterias que

causan enfermedades en el jitomate, tales como Ralstonia solanacearum, E.

carotovora, X. campestris pv. vesicatoria y P. corrugata.

Más aun, como los sucesos moleculares que suceden río abajo después del

reconocimiento MAMP-PRR, y que son los responsables de la activación de las

defensas y, en última instancia, de la resistencia de la planta, están conservados en

prácticamente todas las plantas superiores, y como el sistema endógeno de

procesamiento de polipéptidos por medio de ubiquitinas y enzimas

desubiqutinizantes también se encuentra presente en todas las especies vegetales,

es de esperar que la transformación de otras plantas con el casete multigénico

desarrollado en este trabajo tenga como resultado la generación de resistencia

antibacteriana en dichas plantas.

Así pues, se propone que esta tecnología puede ser fácilmente transferible a

otros cultivos de importancia agrícola que son afectados de manera importante por

enfermedades bacterianas. El único prerrequisito necesario, sería que los protocolos

para la transformación genética de dichas plantas, ya fuera por medio de A.

tumefaciens o por otros métodos, estuvieran ya desarrollados de antemano.

- 90 -

Sin embargo, hay que tener en cuenta que, ya que los receptores PRR

reconocen patrones moleculares conservados en un amplio rango de

microorganismos, los cuales no necesariamente han de ser patógenos, es posible que

la resistencia generada por medio de esta tecnología, también tenga algunos efectos

en detrimento de microorganismos benéficos para la planta. Sería necesario pues,

llevar a cabo estudios en este sentido, con el fin de poder tomar las medidas

necesarias para evitar que la actividad de los microorganismos benéficos sea

afectada.

Es importante hacer notar que el proyecto descrito en el presente documento

no culmina aquí, sino que aún quedan algunos experimentos y análisis por realizar,

los cuales complementarán el estudio y ayudarán a explicar de una manera más

detallada los resultados aquí presentados.

Entre los experimentos que se planean llevar a cabo en un futuro próximo

están:

1. Determinar el número de copias de los transgenes por medio de PCR

cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR), en las diferentes líneas

transgénicas. Esto nos permitirá establecer, de manera más precisa y

directa, la relación que exista entre los niveles de expresión de los

transgenes y el grado de resistencia a las infecciones bacterianas.

2. Medir los niveles de acumulación de proteínas de los transgenes por

medio de inmunoensayos. Esto complementará los resultados del

análisis por qRT-PCR, y nos dará una mejor idea de la importancia del

papel que juegan los receptores EFR, FLS2 y el correceptor BAK1 en la

inmunidad de las plantas ante bacterias fitopatógenas.

3. Retar a las líneas de plantas transgénicas generadas con otras cepas de

bacterias patógenas de jitomate como las ya mencionadas

anteriormente: P. corrugata, E. carotovora, X. campestris pv.

vesicatoria y R. solanacearum. Esto permitirá demostrar de manera más

contundente que la resistencia bacteriana generada mediante la

expresión heteróloga de PRRs es de amplio espectro.

- 91 -

4. Transformar con el casete multigénico desarrollado, otras plantas de

interés agrícola que también sean atacadas por enfermedades de

origen bacteriano, y retarlas posteriormente con bacterias

fitopatógenas propias de cada planta, para comprobar que la

resistencia generada por los PRRs puede transferirse fácilmente a otras

especies vegetales.

- 92 -

- 93 -

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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