Una nueva proteína de U2 snRNP de Una nueva proteína de U2 snRNP de levadura, Snu17p, es requerida para levadura, Snu17p, es requerida para el primer paso catalítico del el primer paso catalítico del splicing splicing y para la progresión del ensamblaje y para la progresión del ensamblaje

del spliceosomadel spliceosoma

Matías Blaustein, Diego Pafundo, Ignacio SchorMatías Blaustein, Diego Pafundo, Ignacio Schor

Gottschalk A., Bartels C., Neubauer G., Lührmann R., Gottschalk A., Bartels C., Neubauer G., Lührmann R., Fabrizio P.Fabrizio P.

Traído a ustedes por:Traído a ustedes por:

SpliceosomaSpliceosoma:

Asociación ordenada de 5 snRNAs (U1, U2, U4, U5 y U6) y proteínas.

• 7 proteínas Sm, comunes a todos los snRNPs

• Un set de proteínas Sm-like (Lsm)

• Otras

Secuencia de Secuencia de eventoseventos

Apareamientos y rearreglos entre los snRNAs Apareamientos y rearreglos entre los snRNAs y el pre-mRNAy el pre-mRNA

Muchas proteínas pueden estar involucradas en estos switches… Por ejemplo:

Prp28p Mediador potencial del switch U1 U6 del pre-mRNA

Tiene un dominio DEAD-box ATPasa.

¿Desenrrollamiento del duplex RNA-RNA?

Caracterización de las proteínas del Caracterización de las proteínas del spliceosoma:spliceosoma:

• genética (en levaduras)

• bioquímica (en varios sistemas)

Así se encontraron muchas proteínas en levaduras homólogas a las proteínas involucradas al splicing en

metazoos.

¿Qué pasa con la snRNP U2...?¿Qué pasa con la snRNP U2...?

• Se sabe poco del complejo de levaduras, porque es difícil de purificar.

• Se caracterizaron 9 proteínas de este complejo en humanos.

• Todas tienen homólogos en levaduras (por búsqueda de secuencias).

¿Qué se hace en este ¿Qué se hace en este paperpaper…?…?Caracterización de una nueva proteína asociada al splicing:

Snu17p

¿De dónde salió Snu17p?¿De dónde salió Snu17p?

Purificación parcial del tri-complejo snRNP [U4/U6.U5] por cromatografía de afinidad y gradiente de glicerol

Espectroscopía de masa

Búsqueda en base de datos

28 proteínas asociadas con el tri-complejo

[U4/U6.U5]Dos proteínas del factor asociado a

U2 snRNPs, SF3b.

¡Snu17p!

¿Qué podemos saber de ¿Qué podemos saber de Snu17p?Snu17p?

11Snu17p tiene un motivo de reconocimiento de RNA (RRM)Snu17p tiene un motivo de reconocimiento de RNA (RRM)

Búsqueda de homólogos con BLAST de proteínas

50% de identidad con los primeros 120 aa de varias proteínas con RRM.

Búsqueda TBLASTN en base de datos de EST humanos

36% de identidad y 53% de similitud con EST AA314241

p14 podría ser la verdadera ortóloga de p14 podría ser la verdadera ortóloga de Snu17p en humanos Snu17p en humanos

Este EST corresponde a una proteína llamada p14 que:

• tiene tamaño similar a Snu17p

• se encuentra asociada a U2 snRNP en humanos

¿Está Snu17p ¿Está Snu17p asociada con alguna asociada con alguna

SnRNP?SnRNP?

Generación de una cepa de levaduras que expresa Snu17p-tag en vez del gen endógeno

Preparación de extractos de splicing

Inmunoprecipitación con IgG-agarosa

Lavado con concentraciones crecientes de sales

Extracción de RNA y Northern blot

22

Snu17p es una proteína del snRNP U2Snu17p es una proteína del snRNP U2

¿Está Snu17p asociada con ¿Está Snu17p asociada con el spliceosoma durante el el spliceosoma durante el

splicingsplicing??

Extractos de splicing Pre-mRNAs de actina y de U3 marcados con 32P-UTP

Splicing in vitro

20´ 40´ 40´: inmunoprecipitación con IgG-agarosa

Electroforesis en gel desnaturalizante

Remoción:

33

Snu17p está asociada con el spliceosoma y en Snu17p está asociada con el spliceosoma y en particular con el catalíticamente activo durante el particular con el catalíticamente activo durante el

splicingsplicing in vitro in vitro

33

Snu17p está asociada con el spliceosoma y en Snu17p está asociada con el spliceosoma y en particular con el catalíticamente activodurante el particular con el catalíticamente activodurante el

splicingsplicing in vitro in vitro

33

Snu17p está asociada con el spliceosoma y en Snu17p está asociada con el spliceosoma y en particular con el catalíticamente activodurante el particular con el catalíticamente activodurante el

splicingsplicing in vitro in vitro

33

Snu17p está asociada con el spliceosoma y en Snu17p está asociada con el spliceosoma y en particular con el catalíticamente activodurante el particular con el catalíticamente activodurante el

splicingsplicing in vitro in vitro

¿Es esencial Snu17p para la ¿Es esencial Snu17p para la viabilidad celular?viabilidad celular?

Knockout de SNU17 en una línea diploide, reemplazando por el marcador HIS3

Luego de la esporulación, las 4 esporas son viables

Las dos esporas que llevan HIS3 tienen un crecimiento vegetativo 1,3 veces más lento que el wild

type a distintas temperaturas

¿Es requerido Snu17p para ¿Es requerido Snu17p para el el splicingsplicing??

Electroforesis en gel desnaturalizante

Primer extension

Extracción de RNA

4. A4. A

La deleción de Snu17p lleva a un La deleción de Snu17p lleva a un splicingsplicing del pre- del pre-mRNA defectivo mRNA defectivo in vivoin vivo

time

Extractos de splicing de cepas wt o snu17

Pre-mRNA de actina marcado con 32P-UTP

Splicing in vitro

Electroforesis en gel desnaturalizante

Remoción: 1´ 5´ 15´ 25´

GST-Snu17p

4. B4. B

La deleción de Snu17p lleva a la inhibición del La deleción de Snu17p lleva a la inhibición del splicingsplicing antes del primer paso catalítico antes del primer paso catalítico in vitroin vitro

¿Afecta la ausencia de Snu17p al ensamblaje del spliceosoma?

Pre-mRNA de actina marcado

+Extracto de levadura wt Extracto de levadura Snu17

Ensamblaje in vitro de spliceosomas (30°C)

Electroforesis en gel no Electroforesis en gel no desnaturalizantedesnaturalizante

Visualización de los complejos

0’ 10’ 20’

Heparina

5. A5. A

La ausencia de Snu17p produce La ausencia de Snu17p produce la acumulación de un complejo la acumulación de un complejo

inusual X.inusual X.

¿Cuál es la composición del ¿Cuál es la composición del complejo X?complejo X?

Extracto de levadura wt Extracto de levadura Snu17

Splicing in vitro con pre-mRNA de actina. Tratamientos:

•Mock

•Degradando U6 snRNA

•EDTA

Electroforesis no desnaturalizante

Hibridar con sondas de actina y de todos los snRNAs

0’ 5’ 20’Heparina

66

66

!!!!!!

La estructura de U2 snRNP se encuentra La estructura de U2 snRNP se encuentra comprometida en ausencia de Snu17pcomprometida en ausencia de Snu17p

66

!!!!!!

U1 snRNP es parte del complejo X, incluso U1 snRNP es parte del complejo X, incluso habiendo tratado con heparina.habiendo tratado con heparina.

66

66

66

U5 y U4 no se detectan bien U5 y U4 no se detectan bien por el método anterior...por el método anterior...

Extractos de splicing de cepas wt o snu17

Pre-mRNA de actina biotinilado

Splicing in vitro

5L

RNA total

120L

Heparina

Gradiente de glicerol

15 fracciones de la región 40S

Se purifica c/u por afinidad con

streptavidina-agarosaRNA purificado

Northern blot

77

Este experimento independiente refuerza la conclusión Este experimento independiente refuerza la conclusión de que el complejo X contiene todos los snRNPs de que el complejo X contiene todos los snRNPs

ConclusionesConclusiones

•Snu17p es llamada a partir de aquí ha ser tenida en cuenta como pilar de U2 y resulta ser claro componente del spliceosoma, al menos hasta el segundo paso catalítico del célebre y fundamental proceso de splicing.

•La falta de presencia de Snu17p trae aparejada una formidable reducción del splicing in vitro. La mentada reducción es debida directamente a la falta de presencia de Snu17p, ya sea porque Snu17p es parte activa del extraordinario proceso de splicing o bien porque es menester su presencia para la correcta conformación y funcionamiento de U2.

•In vivo, si bien la falta de presencia de Snu17p produce un fenotipo de crecimiento poco veloz y por demás evidentes defectos en el majestuoso fenómeno de splicing, el efecto es menos drástico. Esto bien puede explicarse por la estabilización de U2 en las condiciones predominantes en el entorno fisiológico aún en ausencia de esta antaño ignota proteína.

•La ausencia de Snu17p conlleva la formación de un ignominioso, lindante con lo impúdico complejo que alberga en su seno a U2, U6, U5 e incluso a los usualmente esquivos U4 y U1. Esto puede deberse a una conformación harto aberrante de U2 que no tiene a bien desplazar a U1. Snu17p recombinante revierte la formación del esotérico complejo X y restaura el magnánimo y fastuoso prodigio, conocido como splicing.

•Se puede colegir que la proteína p14 sería la contraparte funcional de Snu17p en el spliceosoma humano (por identidad, similar talla y porte y por permanecer asociado a U2).

•La falta de Snu17p, en marcado contraste con otras proteínas de U2, permite la acción y efecto de incorporar U2 al prespliceosoma y del tri-snRNP [U4/U6.U5] inhibiendo la progresión del ensamblaje antes de la liberación de U1 y luego de la incorporación del tri-snRNP. Notablemente, esto sentaría un hito para el perfeccionamiento de una herramienta idónea para el aislamiento de spliceosomas totalmente ensamblados, detenidos, congelados y acorralados antes del primer paso catalítico del excepcional mecanismo de splicing.

Fin