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Mejoramiento genético
MAS ( SelecciónAsistida por Marcadores)
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5- Mejoramiento genético
3- Diversidad
1° - Mutación
1960
2 ° - Recombinaciónnatural (ó dirigida)
4- Selección
- Variación
- Hibridación
MAS: ( SelecciónAsistida porMarcadores)
- Enzimas de restricción
- Recombinaciónartificial:
Ingeniería genética:
(Construcciones genéticas: ADN recombinante)
- Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR):
replicación “in vitro”
Biol. (Mgter) Laura Torres
- Genéticos
- Moleculares
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Gen de interés agronómico
Locus “marcador”
* Marcadores genéticos*
Biol. (Mgter) Laura Torres
Huellas……. Huellitas……
.
Marcador genético
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- Herencia mendeliana clásica- Polimórfico - Codominante - No epistático - Sin influencia ambiental
Características deseables de un marcador
Biol. (Mgter) Laura Torres
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Ingeniería Genética: (Recombinación Artificial)
Marcadores Genéticos y Moleculares
Biol. (Mgter) Laura Torres
Mejoramiento genético
Cruzamientos dirigidos….Hibridación, Recombinación …..y Selección
Hibridación con “sondas”
RFLPs
Amplificación por PCR
- Morfológicos
- Isoenzimáticos
Secuencias nucleotídicas “codificantes”
- Moleculares Secuencias nucleotídicas “codificantes” y “no codificantes”
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Cebada
sex1 1cM ms 9
sex1 ms 9
Y 5 cM ms1
Y ms1
MaízMarcadores Morfológicos
- loci de expresión temprana
Biol.(Mgter) Laura Torres. Fac. Cs. Agropecuarias. UNC
Loci marcador:Endosperma blanco Loci de interés:
Androesterilidad (ms1)
Loci marcador:Endosperma arrugado
Loci de interés:Androesterilidad (ms9)
Biol. (Mgter) Laura Torres
Mejoramiento genético
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Marcadores morfológicos: controlados por un solo loci y presentan expresión temprana
a) En Brassica:
Loci marcador: primera hoja vellosa
b) En maíz:
Loci marcador: raíz primaria ó coleoptilo púrpura
Loci con carácter de interés:
Haploidía
Biol. (Mgter) Laura Torres
Mejoramiento genético: SelecciónAsistida porMarcadores(MAS)
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Mapa genético(Marcadores morfológicos)
enanoalto
pubescenteliso
normal
moteadaonormal
necrosisnormal
Infloresc compInfl. simple
Lycopersicum esculentum (2n= 24)
Biol. (Mgter) Laura Torres
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Detección de marcadores
MetodologíaElectroforesisEquipoTecnología de los marcadores Interpretación de las combinaciones de bandasVentajas y desventajas
Tratamiento del material vegetal
Electroforesis en geles de almidón, de acrilamida ó capilar (cromatógrafos)
Tinción histoquímica, química, fluorocromos
Análisis de los patrones de bandas ó cromatogramasBiol. (Mgter) Laura Torres
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MARCADORES Isoenzimáticos :
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MARCADORES Isoenzimáticos :
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MARCADORES Isoenzimáticos :
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MARCADORES Isoenzimáticos :
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MARCADORES Isoenzimáticos :
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MARCADORES Isoenzimáticos :
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MARCADORES Isoenzimáticos :
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- Polimorfismo a nivel del producto génico (polipéptido o proteína)
MARCADORES Isoenzimáticos :
Biol.(Mgter) Laura Torres.
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Ventajas
- Técnica consistente, reproducible y bajo costo- Co dominantes- Estudios de
diversidad parámetros poblacionales mapas genéticos
Desventajas
- Bajo número de sistemas de tinción para detectar enzimas- Análisis basado en el fenotipo- Inapropiados para MAS (ej: Tomate: el loci Mi controla la resistencia nemátodes está ligado al loci de la fosfatasa ácida
El loci para androesterilidadestá ligado a una fosfatasaBiol. (Mgter) Laura Torres
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- Genética de poblaciones - Conservación ex situde germoplasma- Evolución de especies cultivadas (evaluar la diversidad genética de las poblaciones locales de Allium sp, mediante isoenzimas)- Evaluación y caracterización de germoplasma (evaluar la diversidad genética y la estructura de una colección de base de Arachis spp)- Erosión genética- Flujo de genes - Estabilidad genética en bancos de germoplasma (evaluar la diversidad genética de las entradas de semilla de ….spp,conservadas y suministradas por jardines botánicos europeos
Aplicaciones
Biol. (Mgter) Laura Torres
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Ingeniería Genética: (Recombinación Artificial)
Marcadores
Biol. (Mgter) Laura Torres
Mejoramiento genético
Cruzamientos dirigidos….Hibridación, Recombinación …..y Selección
Hibridación con “sondas”:
RFLPs
Amplificación por PCR
- Morfológicos
- Isoenzimáticos
Secuencias nucleotídicas “codificantes”
- Moleculares Secuencias nucleotídicas
“no codificantes” y “codificantes”
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Biol. (Mgter) Laura Torres
Mejoramiento genético: Marcadores Moleculares
- Microsatélites ó SSR:
Simple Sequence Repeats
- CAPS:
Cleaved Amplified Polymorphic Sequence
- SCARs:
Sequence Characterised Amplified Region
- STSs:
Sequence-Tagged Sites
- ESTs:
Espressed Sequence Tags
- EST - SSRs:
Espressed Sequence Tags of SSRs
- SNPs:
Single Nucleotide Polymorphism
Información previa de la secuencia: NO
- RAPDs:
Random Amplified Polymorphic DNA
- RFLP:
Restriction Fragment Lenght Polymorphism
- AFLPs:
Amplified Fragment Lenght Polymorphism
- SAMPLs:
Selective Amplification of M icrosatellite Polymorphism
- ISSRs: Inter-Simple Sequence Repeats
- Minisatélites ó VNTRs
Información previa de la secuencia:
SI
Biol. (Mgter) Laura Torres
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Biol.(Mgter) Laura Torres.
Enzimas de restricción:
Digestión (ó corte) de la doble cadena de ADN
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Endonucleasas: enzimas de restricción
AluIArthrobacter luteus: AG´CT
TC´GA Sitio de restricción (palíndromo)
BamHIBacillus amyloliquefaciens: G´GATCC
CCTAG´GSitio de restricción (palíndromo)
Biol. (Mgter) Laura Torres
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Marcador molecular de tipo:
RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphisms)
1- Digestión
2- Electroforesis
3- Transferencia a un soporte sólido (membrana de nitrocelulosa)
4- Hibridación con “sondas marcadas”
5- Lavados
6- Revelado
Biol. (Mgter) Laura Torres
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1- Basados en la amplificación del ADN (PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa)
(Numerosos sistemas)
2- Basados en la digestión con endonucleasas (enzimas de restricción) :
RFLPs (Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricciòn)
*MARCADORES MOLECULARES - Polimorfismo genético a nivel del DNA
Biol.(Mgter) Laura Torres.
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Marcador molecular
RFLPs (RestrictionFragmentLenghtPolymorphisms)
Biol.(Mgter) Laura Torres.
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5’…ATAAAAAGTTATACTATTCCAAATGATTGTCCTGTGGTATGTAATTCTATTCCTCGTAAACCTAACTTATCTTTGATGTTTATTAGAGCAATATTAGTTATTATGTTAATTAAAGATTATAGTGAAATTAAAGAAACACCAATTTATCAGCAACAACTTGAATTAGAAGATCCTGCGCGCAACGCCTGTCTTGTAACTGATAGTGGAATTCGAACTGAGCTGCAAAATGAACCAGTTACTGTACCAGTAACTCTTCCAACTTTGCCGACTTTTTCAAGTCCTAAAAATTAATCCTGTTAATTCATGTCAATTACGCGATTGCATAAGATGAGTTGTTTTAATGGATAGTGAGCGCCACTATGAATATGGTTCGTATTCAAACTCTCATGGCATTGAATTTGATCCAAATCACCCTTACATTGATTTGATTAACGATGATTTCGATGAAAATGATTATCTTGATCTCGAGACGTTAAATCTTGAAGCTGATTATGATGATGTTGAAAGTTTAGCTCTTAGGCTTAAAAATGCTCCTGACTACACTACTGAGATATTCGAGAAAATAGATAGAATACCAAACTTTGCGAGTTACAGATACTTCAGATGAGTTTTATACTTTAAGTTCGATGTTAACCGAGCATATGCAATCAATAATTACATTGCTTCCCAGTATACTATGGCCAATGGTCAGTCAGTTAACCAAATCTAATGTATTTCAAGCTGCAGACGATGTTAATATTACTAATTATTGGCGTTTGATGGACAGAAGATGGGATTTTATCGATGAACAGTTGAGAGTTCAATTTATTTTTAGAGCTTATGACTTGCGAGCGTATCAAAACGAGCGTGTGTCTCAAATTCTTTCTAGCAGTTTATTATTTGCTGGATTAAATCTAAT
TGG……….3'
pb
900
692
208
secuencia de ADN de 900 pb
Eco RI : (1 sitio de corte)
GAATTC
- Enzima EcoRI
- Buffer
- H2O
Biol. (Mgter) Laura Torres
Enzimas de restricción
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Segregación Mendeliana de alelos marcadores de tipo molecular (Ej. RFLP, SSR)
Biol.(Mgter) Laura Torres.
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Ingeniería Genética: (Recombinación Artificial)
Marcadores Genéticos
Biol. (Mgter) Laura Torres
Mejoramiento genético
Cruzamientos dirigidos….Hibridación, Recombinación …..y Selección
Basados en hibridación con sondas: RFLPs
Basados en la amplificación por PCR
- Morfológicos
- Isoenzimáticos
Secuencias nucleotídicas “codificantes”
- Moleculares Secuencias nucleotídicas
“no codificantes” y “codificantes”
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Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Biol. (Mgter) Laura Torres
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Replicación “in vivo” del DNA
* Helicasa
* Proteínas de unión a cadena sencilla (SSBP)
* Topoisomerasa ADN girasa
* Iniciación de la síntesis
* ADN polimerasa III
* Primasa, ARN polimerasa
* ADN ligasa.
* Corrección : polimerasas I y III
Biol.(Mgter) Laura Torres.
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Replicación natural del ADN
Biol.(Mgter) Laura Torres.
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REPLICACIÓN NATURAL DEL DNA
Reacción en Cadena de la PolimerasaPCR….(Replicación “in vitro” de un fragmento de ADN ó ARN)
Biol. (Mgter) Laura Torres
Cebador
Biol. (Mgter) Laura Torres
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Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
NucleótidosAgua
Enzima Taq-polimerasa
Cebadores Buffer y Mg+ +
ADN molde
Muestra de tejido
Extracción de ADN
Termociclador
Millones de copias (10 6)de un fragmento de ADN
Electroforesis: visualización del fragmento de ADN amplificado a partir de los cebadores
Biol. (Mgter) Laura TorresBiol. (Mgter) Laura Torres
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Reacción en Cadena de la PolimerasaPCR (Polimerase Chain Reaction)
Biol. (Mgter) Laura Torres
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que, tras la amplificación, resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado
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Condiciones de amplificación del DNA
1º Etapa:Desnaturalización
94ºC 30s a 2 min
2º Etapa:Hibridación de cebadores
35-60 ºC 15-120seg
3º Etapa:Polimerización
68-72ºC 30-150seg
Etapas 1 a 3: 25-45 ciclos ó repeticiones
Polimerización Final:5min
68-72ºC
Desnaturalización Inicial:5min95ºC
Termociclador
Biol. (Mgter) Laura Torres
Mejoramiento genético: SelecciónAsistida porMarcadores(MAS)
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Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Biol.(Mgter) Laura Torres.
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Etapas para la reacción de PCR
Los pasos 2 a 4 se repiten 30-35 veces e incrementan más de 106 veces el fragmento de DNA de interés
Biol.(Mgter) Laura Torres.
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RAPDs(Random Amplified Polymorphic DNAs)
Base genética
Biol.(Mgter) Laura Torres.
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Base genética de marcadores tipo RAPDs
Biol.(Mgter) Laura Torres. Fac. Cs. Agropecuarias. UNC
-
+
Biol. (Mgter) Laura Torres
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Variedades de olivo : Frantoio y Oblonga ¿Sinonimia?
Electroforesis de marcadores RAPDs
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MARCADORES GENÉTICOS MOLECULARES “ BASADOS EN LA PCR
(Replicación “in vitro” del DNA )
5´- AT AT AT AT AT AT AT – 3´
Microsatélites (SSR: Single Sequence Repeat)
Cebador 1
Cebador 2
Cebador 3
Cebador 1
Cebador 2
Cebador 3
Región de longitud variable (microsatélite)
Región de secuencia conservada
Región de secuencia conservada
5´- GTC GTC GTC GTC GTC – 3´
5´- CGAT CGAT CGAT CGAT– 3´
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Mejoramiento genético: SelecciónAsistida porMarcadores(MAS)
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Base genética de marcadores tipo Microsatélite ó SSRs (Simple Sequence Repeats)
1 2 1 x 2
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Marcadores tipo SSRs (Microsatélites)
Dinucleótidos: (AT AT ATAT) – (AT)23
Trinucleótidos: ATC ATC ATC (ATC)16
Tetranucleótidos: ACGGACGG ACGG (ACGG)22
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-
+
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Sinonimia: electroforesis de marcadores tipo SSRs en las variedades de olivo Frantoio y Oblonga
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Fingerprinting: Variedad “Arbequina” de Olivo
oli 11 oli 12 oli 17 oli 22
1 2 3 4 1 2 3 4 M 1 2 3 4 1 2 3 4
MPM (pb)
500
400
300
200
100
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Fingerprinting (huella genética)
Autoincompatibilidad en cerezo Prunus avium L.
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MPM (pb)
200
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M
Electroforesis en gel de agarosa 3%
1- Empeltre de referencia(CSIC, España);
2- Empeltre LP;
3- Manzanilla de referencia(CSIC, España);
4-Manzanilla EC;
5- Manzanilla 4S;
6- Manzanilla gigante 4S;
7- Picual de referencia;
8- Nevadillo EC;
9- Nevadillo 4S;
M: 100 pb. DNA ladder (Sigma).
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IAS oli 12
IAS oli 17
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Análisis de diversidad
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Mejoramiento genético:
SelecciónAsistida porMarcadores(MAS)
Plantas con genotipo aa
Selección: plantas homocigotas m/m”
Análisis por PCR: cebadores para el loci M/ m
Extracción de ADN
Loci A/a(genotipo de interés: aa).
LocimarcadorM/m
Genotipo mm Mm MM mm MM
Cebador
Cebador
M m
A a
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Peritaje forense
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Electroforesis capilar: resolución de marcadores microsatélites (SSRs): tamaño en pares de bases
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1000750
1 2 3 4 5 6 7
870 pb
M M1 M2 M3 M4 TE TS
Detección del agente causal del “maize bushy stunt”
Microfotografía electrónica de fitoplasmas
Planta sintomática de maíz
CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequence
1- Amplificación por PCR
2- Digestión con enzimas de restricción
3- Electroforesis
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HaeIII RsaI
Figura 1. RFLP analysis of 1.2-kb PCR products (R16F2/R16R2 primers) of 16S rRNA genedigested with HaeIII (A) y RsaI (B) restriction enzymes S, 100 bp.ladder (Promega), fragment size (bp) from
Regiones genómicas evolutivamente conservadas
AluI
Figura 3. AluI restriction profile of a phytoplasmal tuf gene fragment amplified with primer pair fTufAy/rTufAy . Phytoplasma strain abreviations : AAY (American aster yellows), ACLLcba, ACLLctes y ACLLjun (Argentinian catharanthus little leaf), ChamAY (Chamomilla aster yellows), MBS (Maize bushy stunt) y DauAY (Daucus aster yellows). S, 100 bp ladder (Promega).
Taxonomía y filogenia de Fitoplasmas
Regiones genómicas mas variables
CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequence
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NlaIII
RsaI
Tsp509I
TaqI
MseI
(CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequence
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AY1 (16SrI-B)
Maryland aster yellows (16SrI-B)
SAY (16SrI-B)
MBS (16SrI-B)
PRIVC (16SrI-B)
AV2192 (16SrI-L)
IOWB (16SrI-N)
OAY (Ca. Phytoplasma ateris)
PaWB (16SrI-D)
AVUT (16SrI-M)
RapePh (16SrI-C)
Valeriana rrnA (16SrI-M)
ACLLcbaI
ACLLctes
ACLLcbaII
ChamAY
Soybean purple stem (16SrI-O)
SPS (16SrI-O)
ChLL (16SrI-Q)
Valeriana rrnB (16SrI-M)
Alfalfa stunt (16SrI-B)
THP Ca. Phytoplasma licopersicy
STRAWBERY multiplier (16SrI-K)
BBS3 (16SrI-E)
Blueberry stunt (16SrI-E)
Carrot proliferation (16SrI-A)
Oat proliferation (16SrI-A)
HYDP (16SrI-A)
BB (16SrI-A)
STRAWBERY phylloid fruit (16SrI-R)
CPh rrnA (16SrI-C)
KVG (16SrI-C)
CPh rrnB (16SrI-C)
KVE (16SrI-C)
ACLR AY 16SrI-F
CVB (16SrI-F)
MPV
JHP (Ca. Phytoplasma japonicum)
AusGY (Ca. Phytoplasma australiense)
Stolbur
A laidlawi
A palmae
96
81
69
100
100
99
74
63
48
95
65
90
73
72
65
59
57
55
42
10036
2238
17
32
21
6
3
0 .001
Figura 6. Phylogenetic tree constructed by the neighbour-joining method of 16S rRNA gene sequences from 31 phytoplasmas 16SrI -aster yellows representative subgroups strains, other related 16Sr phytoplasmas groups, and A. palmae y A. laidlawi as the outgroup. The numbers on the branches are bootsatrap (confidence) values. GenBank accessions numbers of phytoplasmal 16S rRNA gene sequences: AY1 (Maryland aster yellows) AF322644; SAY (Severe aster yellows) M86340; MBS (Maize bushy stunt) AY265208 ; PRIVC (Primose virescence) AY265210; AV2192 (Aster yellows phytoplasma) AY180957; IOWB (Ipomea obscura witche´s -broom) AY265205; OAY (Ca. Phytoplasma asteris) M30790; PaWB (Paulownia witche´s -broom) AY265206; AVUT (Aster yellows phytoplasma) AY265209, *, strains sequenced in this study. Bar represents 1 substitution in
1000 nt.
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Análisis filogenético
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Marcador SCARS
Sequence Characterized Amplified Regions
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En tomate:Marcador asociado a resistencia a Verticillium (loci Ve/ve).
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SNPs (SingleNucleotidePolimorphism)
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AFLPs RFLPs RAPDs SSRs (Microsatélites)
Ensayo de de detección
Rápido Lento Rápido Rápido
Reproducibilidad Alta Alta Baja Alta
Tipo de marcador Co-dominante ó dominante*
Co-dominante Dominante Co-dominante
Información sobre la secuencia
No No No Si
* según el análisis se realice mediante softwere o visualmente
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1: valor mas bajo5: valor mas altoDom: dominanciaCod: codominancia
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Utilidad de los marcadores genéticos y moleculares1- Fingerprinting (huella genética: Identidad)
2- Conservación y Uso de Recursos Genéticos:
- Construcción de colecciones nucleares (bancos de germoplasma)
- Relaciones filogenéticas
- Identificación de germoplasma elite
3- Mapas Genéticos
3- Diversidad y Estructura Genética:
- Nivel de heterocigosidad
- Frecuencias génicas y genotípicas
4- Diagnóstico: salud humana, animal, fitopatología
6- Agroindustria
7- Peritajes forenses
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Mejoramiento genético
7- Conocimiento y Uso del Sistema Reproductivo:
- Grado de alogamia.
- Sistema de incompatibilidad.
- Identificación temprana del sexo del organismo.
8- MAS (Selección Asistida por Marcadores):
Resistencias a factores bióticos yabióticos
- Grado de introgresión
- Desarrollo de líneas puras.
- Protección legal: obtenciones de genotipos de propagación agámica . Mejora de caracteres cuantitativos (QTLs: Quantitative trait loci
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Métodos de selección: (detección de genotipos superiores)
Convencional Vs ¿…?
Asistida por marcadores (MAS)
Costo - beneficio
-Fácil identificación de fenotipos segregantes
- Esquemas de retrocruzamientos: observación visual de fenotipos a campo y análisis de tejidos en laboratorio.
- Expresión tardía del carácter de interés.
- Proyecto privado o público? Tiempo de retorno.
- Costo de implementación: en disminución.
- Efectividad: en incremento. Influenciada por factores ambientales y epigenéticos.
- Esquemas de retrocruzamientos: rápida y certera identificación de individuos con el genoma recurrente.
↑ grado de precisión
↑ tasa de progreso
↓ tiempo de obtención del producto.
- MAS no es la “LA” solución …….
Convencional
y ¿…?Asistida por marcadores (MAS) Mayor evidencia empírica
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Empresas biotecnológicas
Agricultura:
Caracterización de genotipos
Diagnóstico de patógenos
Análisis del control genético de caracteres cuanti y cualitativos
Mejora genética
Identificar MM ligados a caracteres de interés
Retrocruzamientos asistidos por MM
Cadena Agro-alimentaria:cuantificación y seguimiento de materia prima en productos elaborados
Cs. Biológicas:
Desarrollos tecnológicos para detección de variaciones cuanticualitativas de ADN y proteínas
Empresas producción y servicios agropecuarios
Empresas de servicios para industria agro-alimentaria
Perspectiva de los Marcadores Moleculares
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