martha patricia españa luna maestria
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UNIVERSIDAD DE COLIMA
MAESTRÍA EN CIENCIAS: ÁREA BlOTECNOLOGiA
CARACTERlZACIÓN ENZIMÁTICA DE AISLADOS DE BEAUVERIA bassiana(DEUTEROMYCOTINA: HYPHOMYCETES), Y SU VIRULENCIA SOBRE
Epilachna varivestis (COLEOPTERA: COCCINELLIDAE)
TESIS
Que para obtener el grado de
Maestro en Ciencias: Ama Biotecnologia
Presenta
MARTHA PATRICIA ESPAÑA LUNA
ASESORES:
DR. ROBERTO LEZAMA GUTIÉRREZDR. SERGIO HUGO SANCHEZ RODRÍGUEZ
Tecomán, Col. Méx. octubre de 2000
/I
Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias
C. MARTHA PATRICIA ESPAÑA LUNAALUMNO DEL POSGRADO DE LA FCBAPRESENTE.
En base a los dictámenes emitidos por los miembros de Cuerpo de revisión asignado por elConsejo Académico de la Facultad, así como los asesores, sobre su tesis titulada:“Caracterización enzimática de aislados de Beauveria bassiana (Deuteromycotina:Hyphomycetes) y su virulencia sobre Epilachna varivestis (Coleoptera: Coccinelidae”, mepermito informar a Ud., que habiendo cumplido con los requisitos académicos, así como deforma y fondo, se autoriza la impresión del mismo para ser presentada ante un jurado, conel fin de obtener el grado de Maestro en Ciencias, área Biotecnología.
Dicho trabajo fue realizado bajo la dirección de los Doctores Roberto Lezama Gutiérrez ySergio Hugo Sánchez Rodríguez de la Universidad de Colima y Universidad Autónoma deZacatecas, respectivamente.
Esta tesis fue revisada y autorizada por los Doctores Alfonso Pescador Rubio y OscarRebolledo Domínguez y la Maestro en Ciencias Edelmira Galindo Velasco, todos de laUniversidad de Colima.
ATENTAMENTE
c.c.p. Dr. Francisco 1. Le ord. Gral. de Docencia.c.c.p. Dra. Sara Griselda ovarrubias. Dir. Gral. de Posgrado.c.c.p. Dr. Carlos E. 1 Espinal. Del. Reg. No. 2c.c.p. Dr. Jaime Mo11 a. Coord. Posgrado en Biotecnologíac.c.p. CPT. Evelia Facio Vieyra. Srio. Admvo. FCBA.c.c.p. Archivo.c.c.p. Interesado.
“Por el saber compartido. Año 2000, sesenta aniversario de la Universidad de Colima”
Carretera Jiquilpan-Manzanib, km 260 I Tecomán, Colima, 28100, A.P. 36 I Telefax 01 (332) 4 42 37,4 46 42E-mail: [email protected]
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad de Colima, y particularmente a la Facultad de Ciencias Biológicas y
Agropecuarias, por permitirme realizar estudios de posgrado.
A la Universidad Autónoma de Zacatecas, por considerarme dentro de sus
programas de formación de recursos humanos.
Al Rector de la UAZ, Ing. Rogelio Cárdenas Hernández, quien depositó su confianza
y me brindó todo su apoyo para iniciar y poder concluir satisfactoriamente este paso
en mi formación académica.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por el apoyo financiero durante mis
estudios de maestría.
Al Centro Nacional de Referencia de Control Biológico de la Dirección General de
Sanidad Vegetal, por facilitar parte del material biológico para la ejecución de la
investigación.
A los Doctores Roberto Lezama Gutiérrez y Sergio Hugo Sánchez Rodríguez, por la
colaboración y asesoría durante la investigación y elaboración de ésta tesis.
A los profesores del posgrado, en especial a los revisores de éste documento por
sus atinadas observaciones y sugerencias; M.C. Edelmira Galindo Velasco, Dr.
Oscar Rebolledo Domínguez, Dr. Alfonso Pescador Rubio, Dr. Javier Farías Larios,
y Dr. Jaime Molina Ochoa.
Un agradecimiento muy especial al M.C. Julio Lozano Gutiérrez por su apoyo
durante mis estudios de maestría. Al Ing. José Hernández Martínez por sus
observaciones hechas a este documento. Al Ing. José Inocencio Jahuey Neria + por
su ayuda en el trabajo de investigación.
DEDICATORIA
A mis padres María Guadalupe y Manuel de Jesús por su apoyo y cariño
incondicional.
A mis hemanos; Lupe, Hilda, Manuel y Norma, por su comprensión y apoyo.
A mis sobrinos; Gerardo, Erika y Abraham, porque con ellos comparto este momento
importante de mi vida.
ÍNDICE
íNDICE DE CUADROS ............................................................................................... VI
íNDICE DE FIGURAS.. .............................................................................................. VII
RESUMEN .............................................................................................................. VIll
Abs t rac t ....................................................................................................................................................................................... IX
I.I INTRODUCCIóN.. ..................................................................................................... .1
II.ANTECEDENTES.. .................................................................................................. .6
2.1 El escarabajo mexicano del frijol Epilachna vativestis Mulsant .........................62.1 -1 Característias morfológicas de E. varivestis ...................... .................... .7
2.1 -2 Ciclo de vida y hábitos de E. varivestis ................................................. .8
2.1 -3 Con~ol de E. varivestis ........................................................................... .
2.2 Control biológico ............................................................................................... 10
2.3 El hongo entornopatógeno Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin................. 42.3.1 Cara&erísticas morfológicas de Be bassiana.. ........................................ 17
2.3.2 Cultivo de B. bassiana ............................................................................ 19
2.3.3 Antecedentes de control de 8. bassiana en coleópteros ....................... .20
2.3.4 Antecedentes de control de B. bassiana en otros insectos....................2 32.3.5 Factores que afectan a Be bassiana...................................................... .26
2.5.6 Identificación y caracterización de B. bassiana ..................................... .31
2.3.7 Modo de infección................................................................................... 34
2.3.7.1 Función de las enzimas durante la infección.................................. .37
2.4 Mecanismos de defensa de los insectos ........................................................ .42
III. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................ .45
3.1 Localización del experimento......................................................................... .45
3.2 Origen de 10s aislados en estudio .................................................................. .45
3.3 Producción del inóculo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
3.4 Cría de E. varivestis bajo condiciones de laboratorio......................................47
3.5 Evaluación de la virulencia de aislados de B. bassiana sobrelarvas y adultos de E. varivestis.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ., . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .48
3.6 Evaluación de la actividad enzimática de las lipasas de aislados de B.bassiana.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
3.7 Caracterización de aislados de B. bassiana con base en losperfiles de isoesterasas..................................................................................50
3.7-l Enfoque isoelectrico . ......................................................................................51
3.7.2 PAGE _ gradiente.......................................................................................52
3.7.3 Tinción de los geles. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
3.7.4 Secado de los geles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...................................................... 53
3.7.5 Análisis de los geles. . . . . . . . . . . . . . . ............................................................... 53
IV. RESULTADOS. . . . . . . . . . . . . . . . . ..-.................................................................................. 54
4.1 Evaluación de la virulencia de aislados de B. bassianasobre Ee varivestis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... . .._............................... 54
4.2 Tiempo letal medio de los aislados de B. bassiana sobreE. varivestis . . , . . . . . . . . . . . . . . .... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .55
4.3 Evaluación de la actividad enzimática de las lipasas de aislados
de B. bassiana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
4.4 Correlación de la actividad de las lipasas de los aislados de
8. bassiana con la virulencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..................... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . *5g
4.5 Caracterización de los aislados de B. bassiana con base en jos
perfiles de isoesterasas . . . . . . . ................................................................................60
V. DlSCUSlÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
VI. CONCLUSiÓn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
VI{. LITERATURA CITADA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
INDICE DE CUADROS
Cuadro Pag.
1.
2 .
3 .
4 .
5 .
6 .
7 .
8 .
Aislados de Beauveria bassiana y N. nleyi utilizados en esteestudio.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Análisis de varianza de los factores de virulencia de los aislados de 5.
bassiana (A), y susceptibilidad de los estados biológicos de E.arivestis (B). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Comparación de medias de los factores de virulencia de los aislados
de 5. bassiana (Factor A), y susceptibilidad de los estadios biológicosde E . varivestis (Factor B)... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Porcentajes de mortalidad de los estadios larvales y adultos de E.
varivestis por los aislados de .5. bassíana al día 20 después de lainoculación.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
TL50’s de aislados de B. bassiana sobre estadios larvales de E.varivestis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Análisis de varianza de actividad de las lipasas de los aislados de 5.bassiana.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Actividad lipasa (mm) y datos de virulencia de los aislados de 5.bassiana sobre E. varivestis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
lndice de Jaccard entre aislados de 5. bassiana y N. rileyi en geles dePAGE-gradiente y enfoque isoeléctrico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
46
54
55
56
56
58
59
64
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura
1.
2.
3.
4.
5 .
6.
7.
Pag.
Estrategia de los hongos entornopatógenos para la penetración através de Ia cutícula de los insectos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
Tendencia de la mortalidad de larvas de primer estadio de E.
vativestis, dada por el tiempo letal medio obtenido con el aisladoBbCo1 de Be bassiana (5.79 días) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
Tendencia de la mortalidad de larvas de segundo estadio de E.
varivestis, dada por el tiempo letal medio obtenido con el aisladoBbCOl de B bassiana (lo.59 días) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
Actividad enzimática de lipasas (en mm de diámetro de halo) de los
aislados BbCOl, BbZl, BbD2 y BbCR de B. bassiana............................ 59
Correlación entre actividad lipasa y virulencia de los aislados BbCOl,BbZl, BbD2 y BbCR de 8. bassiana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 0
Gradiente de poliacrilamida, teñido con azul de comassie (A) y con salazul base RR (B) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
Gradiente de pH por enfoque isoeléctrico, teñido con azul de comassie(A) y con sal azul RR (B). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
CARACTERIZACIÓN ENZIMÁTICA DE AISLADOS DE Beauveria, bassiana
(DEUTEROMYCOTINA: HYPHOMYCETES), Y SU VIRULENCIA SOBRE Epilachna
vativesfis (COLEOPTERA: COCCINELLIDAE).
RESUMEN
El control del “escarabajo mexicano del frijol” Epilachna varivestis Mulsant ha
dependido principalmente de los químicos; sin embargo, sus efectos nocivos a la
salud pública y al ambiente obligan a la búsqueda de alternativas al uso de estos
productos, Beauvetia bassiana (Balsamo) Vuillemin es un hongo que se reporta
como un buen agente de control biológico para coleopteros; por lo tanto, su uso
podría ayudar en el control de esta plaga; sin embargo, su virulencia, sobre este
insecto, no ha sido consistentemente probada; por lo cual el objetivo del estudio fue
determinar la actividad lipasa, la virulencia y el perfil de isoesterasas de los aislados
BbD2, BbCR, BbCO1 y BbZl. Se realizaron bioensayos de patogenicidad B bassiana
E. varivestis; la actividad lipasa fue determinada por un halo alrededor de la colonia,
y las técnicas PAGE - gradiente y Enfoque isoeléctrico fueron utilizadas para
identificar polimorfismo en isoesterasas. Los valores de TL50 fueron de 5 a más de 14
días. El aislado más patogénico (BbCOl) produjo mayor actividad lipasa. Los perfiles
de isoesterasas fueron diferentes para cada aislado, se detectó un total de ll
bandas. Los resultados soportan la hipótesis que B bassiana puede ser un agente de
control biológico, para el primer instar larval. Se recomienda continuar con la
evaluación y caracterización de aislados para el control de E. vativestis.
Palabras clave: Epilachna varivestis; Beauvria bassiana; Patogenicidad; Actividadlipasa; Isoesterasa. I
ENZIMATIC CHARACTERIZATION OF Beauveria bassiana (DEUTEROMYCOTINA:
HYPHOMYCETES) ISOLATES ANO THEIR VIRULENCE TOWARD THE MEXICAN
BEAN BEETLE Epilachna varivestis (COLEOPTERA: COCCINELLIDAE).
ABSTRACT
The control of the “mexican bean beetle” Epilachna varivesfis Mulsant mainly relies
on applicatíons of chemical insectiúdes; however, their detrimental effects on’ the
environment and human health force to the search for altematives to these
chemicals. Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin is being developed as a
inundative control agent of beetles, it has potential as a biocontrol agent of this pest,
however its virulence on this pest has not been consistently proved. The aim of this
study was to determine lipase activity, the virulence, and the isoesterases profiles of
the isolates BbD2, BbCR, BbCO1 and BbZl. Bioassays were performed to assess
the virulence against E. varivestis; lipasa activity was determined by the formation of
a halo around the colony; and the gradient - PAGE, and the Isoelectrofocusing
techniques were used to identify polymorphism of isoesterases among the isolates.
LT50 values ranged from 5 days to > 14 days. The most pathogenic isolate (BbCOl)
produced more lipase actìvity than nonpathogenic isolates. The isoesterases profiles
were different, a total of 11 bands was detected. More isolates should be examined
for their virulence against E. varivestis. The results soport the hypothesìs of B
bassiana can be a biological control agent to the first larval instar. More isolates
should be examined for these characteristics and their virulence against E. varivestïs.
Key Words: Epilachna varivestis; Beauvetia bassiana; lipase activity; pathogenicity;isoesterase. *
1. INTRODUCCIÓN
En los ecosistemas naturales como en los agrícolas, los Insectos herbívoros y los
agentes patógenos tienen un impacto significativo sobre la productividad vegetal
(Matson et al., 1997). Un total de 65,000 especies de plagas en plantas cultivadas en
campo y productos almacenados, ocasionan pérdidas de aproximadamente el 40%
de la cosecha anual en el mundo (Perrin, 1997).
El control de plagas se efectúa principalmente a través del uso de plaguicidas
químicos; se estima que 5 millones de toneladas de productos químicos son
aplicados anualmente en el mundo (Matson et al., 1997); sin embargo, se reporta
que afectan a organismos benéficos y presentan efectos adversos en los mamíferos
incluyendo al hombre (Cook et al., 1996). Del mismo modo, su uso trae
consecuencias locales como la disminución de la fertilidad del suelo, reducción de la
biodiversidad, y los insectos crean resistencia a los plaguicidas; contaminan aguas
subterráneas, ríos y lagos, con consecuencias globales negativas, sobre la atmósfera
y el clima (Matson et al., 1997; Stuart et al., 1997), así como en la salud humana
(Hajek y St Leger, 1994; Pedigo, 1996).
En América latina y Africa, algunas especies de insectos conocidos como
escarabajos, chicharritas y larvas, causan daño a las plantas de frijol Phaseolus spp.
(Leguminosae) (Graham y Ranallì, 1997). La defoliación ocasionada por estos
insectos reduce el potencial fotosintético y por lo tanto, el rendimiento; en la soya se
reporta una reducción en la cosecha de hasta el 38% (Haile ef al., 1998).
La especie conocida‘como ‘conchuela del frijol” o “escarabajo mexicano del frijol”,
Epilachna varivestis Mulsant (Coleoptera:Coccinellidae), es capaz de reducir hasta el
70% del área foliar de las plantas (Peterson et al., 1998) y ocasionar daño económico
en los primeros meses del ciclo agrícola; se reporta que el mayor daño ocurre
durante las etapas fenológicas de floración y llenado de la vaina (McPherson et al.,
1996). Algunos autores mencionan a E. varivestis como la plaga más importante
en los cultivos de frijol y soya (Gannon y Bach, 1996; Underwood, 1998).
El uso de los plaguicidas químicos disminuye las poblaciones de E varivestis en
los cultivos de frijol y soya, sin embargo; debido a las consecuencias que éstos
productos ocasionan en el ambiente y el hombre, las estrategias de control han
cambiado y pocos insecticidas son recomendados para su uso en programas de
manejo integrado de este insecto (Kogan y Tumipseed, 1987).
El Manejo Integrado de Plagas (MIP) es una combinación armoniosa de las
medidas disponibles de control de plagas, que minimiza el uso de insecticidas
químicos (Kaaya, 1994; Királiy, 1996), integra el uso de plantas resistentes, control
cultural, control biológico y deja el uso de los plaguicidas como ultima alternativa
(Matson et a/., 1997).
Los efectos ambientales por la contaminación de los plaguicidas químicos
sintéticos, obligan a buscar alternativas seguras, como el desarrollo de agentes de
control biológico (Hajek y St. Leger, 1994; Pedigo, 1996). Se reporta que los
insectos plaga pueden ser controlados a través del uso de enemigos naturales;
éstos son vertebrados e invertebrados y entornopatógenos como nematodos,
virus, bacterias, protozoarios y hongos (Cook et al., 1996; Mills y Getz, 1996).
En el control biológico de E. varivestis, se reportan varios depredadores, entre los
que destacan los hemìpteros (Legaspi y O’Neil, 1993), y el parasitoide Pediobius
foveolafus Crawford; no obstante, los depredadores no consumen lo suficiente
para reducir la población de la plaga; además de que no se ha logrado el
establecimiento del parasitoides en zonas donde han sido introducido (Hooker y
Barrows, 1992).
Los hongos entornopatógenos son agentes de control biológico que tienen la
capacidad de infectar activamente una gran diversidad de insectos; están
ampliamente distribuidos en diferentes ecosistemas por lo que se pueden utilizar
7
para el control de plagas insectiles, son inocuos para animales de sangre caliente,
plantas y demás componentes del ecosistema y tienen la capacidad de desarrollar
epizootias en las poblaciones de insectos plaga (Jackson, 1997). Son
particularmente importantes para el control de coleópteros, debido a que las
enfermedades virales y bacterianas son raras entre los escarabajos (Hajek y St.
Leger, 1994).
Para seleccionar un hongo entornopatógeno, con el fin de utilizarse como
bioinsecticida dentro de un programa de MIP en el control de E. varivestis, es
importante identificar las características de virulencia contra el insecto plaga (Varela
y Morales, 1996); además de conocer la variabilidad bioquímica y la biofísica, para
seleccionar el aislado con las mejores características de uso (Sosa et al., 1994;
Hajek y St. Leger, 1994).
El hongo Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin (Deuteromycotina: Hyphomycetes)
es un patógeno que infecta más de 700 especies de insectos (Barbercheck y Kaya,
1990), entre los más importantes incluye especies del orden Coleoptera (Feng et al.,
1994). Se tiene conocimiento que los diferentes aislados de esta especie presentan
diferencias en su virulencia sobre un insecto plaga (Bing y Lewis, 1991), así como
en sus características fisiológicas y producción de enzimas (Bidochka y
Khachatourians, 1990; Feng y Johnson, 1990; Havukkala et a/., 1993; Sosa et al.,
1994). Además, los aislados generalmente tienden a ser más virulentos a su
hospedero original, o especies cercanamente relacionadas (Feng et al., 1994).
Está demostrado que la actividad entornopatógena de los hongos depende de su
equipamiento enzimático; ya que para la penetración de la cutícula del insecto plaga,
requiere de la acción de enzimas hidrolíticas, como: proteasas, lipasas y quitinasas
que degradan los componentes cuticulares importantes y proporcionan nutrientes
para el hongo (Feng et al., 1994; Hegedus y Khachatourians, 1995).
Del mismo modo, se reporta que los niveles de enzimas específicas tienen
relación con los parámetros de virulencia (Gupta et a/., 1994; Hajek y St. Leger,
1994). Esta variación está relacionada con la actividad enzimática del hongo
durante los procesos de germinación de la espora, crecimiento de la hifa y
penetración de ésta a la cutícula (Bidochka y Khachatourians, 1990; Lecuona et
al., 1997).
En el hongo 8. bassiana, la virulencia también esta relacionada con la actividad
enzimática (Samsináková et al., 1971; Bidochka y Khachatourians, 1990), aunque
se sabe que no es el único factor que determina la virulencia (Champlin et al.,
1981). Las lipasas y proteasas actúan antes que las quitina-s, por lo que, la
quitina no puede ser degradada, hasta que las proteínas y lípidos externos son
removidos, razón por la cual la producción secuencial de enzimas puede ser
interpretada como una estrategias de ataque del hongo al insecto (Bidochka et al.,
1997).
En el proceso de penetración del hongo en el insecto, la primera barrera a la que
se enfrenta es a la superficie lípida de la epicutícula; las lipasas son importantes
en este proceso, y la incapacidad de los hongos para degradar los Iípidos modifica
la virulencia (St Leger, 1993; Bidochka y Khachatourians, 1994; Hegedus y
Khachatourians, 1995).
El estudio de la variación de las isoesterasas se utiliza como un indicador de la
diversidad genética de diferentes especies de hongos (Riba ef al., 1986;
Poprawski et al., 1988; Mugnai et a/., 1989; Riba et al., 1989; Tigano-Milani et al.,
1990; St. Leger et a/., 1992; Rakotonirainy et a/., 1994; Varela y Morales, 1996),
asimismo, se usa para distinguir entre aislados o especies de un mismo origen y
aislados exóticos introducidos a un ecosistema nuevo (Rakotonirainy et al., 1994;
Castrillo y Brooks., 1998), así como para conocer la capacidad potencial de un
aislado en su adaptabilidad ecológica (Riba et al., 1986).
Hasta la fecha no se conoce la virulencia de B. bassiana sobre larvas y adultos de E.
vativestis; del mismo modo, no se han caracterizado aislados con el fin de evaluarlos
en este insecto. En el presente trabajo se planteó la hipótesis que el hongo
entomopatógeno B. bassiana es virulento al escarabajo mexicano del frijol E.
vativestis y que esta virulencia esta relacionada con la actividad enzimática de las
lipasas. Asimismo, que los perfiles de ìsoesterasas varían entre aislados.
Para dar respuesta a esta hipótesis, se plantea el siguiente objetivo:
Objetivo general:
Evaluar la virulencia de aislados del hongo entornopatógeno Beauveria bassiana
sobre el escarabajo mexicano del frijol Epilachna variestisis, la actividad enzimática
de las lipasas y los perfiles de isoesterasas.
Objetivos particulares:
l.- Evaluar la virulencia de diferentes aislados de B. bassiana sobre larvas y adultos
de E. varivestis, bajo condiciones controladas.
2.- Evaluar la actividad enzimática de las lipasas entre diferentes aislados de B.
bassiana.
3.- Caracterizar los aislados de B. bassiana con base en los perfiles de isoesterasas.
II. ANTECEDENTES
2.1 El escarabajo mexicano del frijol Epilachna varivesfis Mulsant
La ‘conchuela’ o “escarabajo mexicano del frijol” E. varivesfis es originaria de
América Central (Coll y Bottreell, 1994), del sudeste de México (Tumipseed y Kogan,
1976). Aunque Pedigo (1998), menciona que su origen es la región semárida del
sudeste de Estados Unidos con un rango natural dentro y en los alrededores de
México.
En menos de un siglo, ha extendido su distribución desde América Central a Canadá
(Fan ef al., 1992). Sin embargo, a partir de 1993 esta plaga se detectó en Nagano y
Yamanashi, Japón atacando cultivos de leguminosas, donde los adultös pueden
sobrevivir el invierno (Fujiyama et al., 1998).
Este insecto es específico de leguminosas (Underwood, 1998), es la plaga más
importante del cultivo del frijol Phaseolus spp. (Fan ef al., 1992; Coll y Bottreell,
1994; Gannon y Bach, 1996), y la soya G. max (L.) Merril (Nagarajan et al., 1994;
Gannon y Bach, 1996; Underwood, 1998). El cultivo del haba Vicia faba L., también
es hospedero de E. varivestis en todo el medio oeste y este de los Estados Unidos
(Pedigo, 1996).
Las larvas y adultos se alimentan de las hojas, generalmente por el envés, dejando
tiras angostas y paralelas de hoja intacta entre ellas, dando a la planta una
apariencia característica descamada como de encaje, hasta ocasionar la muerte de
la hoja, y posteriormente de la planta (Nolting y Edwards, 1989).
Este insecto daña significativamente la producción al reducir la tasa fotosintética en
las hojas en plantas cultivadas de soya y frijol, ocasionando hasta un 70% en la
reducción de área foliar, debido a que sus hábitos alimenticios son físicamente
diferentes a los ocasionados por otros defoliadores (Peterson ef al., 1998).
En Indiana, el mayor daño es producido por la segunda generación, que comienza en
los últimos días del mes de julio y los primeros de agosto. La defoliación ocasionada
por E. varivestis ocurre en todas las etapas de crecimiento del cultivo (Nolting y
Edwards, 1989). Esta plaga ocasionalmente puede causar pérdidas económicas en
epocas tempranas de la temporada, pero el potencial mayor de daño ocurre desde el
tiempo de la floración al llenado de la vaina (McPherson et al., 1996).
Además, E. varivesfís transmite el virus “mosaico del chícharo de vaca” en frijol
(Borrar et al., 1989), retiene el virus del mosaico sureño del frijol (VMSF) por 4 días
después de 24 horas de adquisición en hojas de frijol infectadas, y pierden su
habilidad de transmisión en 4 días Wang ef al., 1994). Transmite los virus SBMV
(Mosaico del frijol del sudeste) y BPMV (Moteado de la vaina del frijol), en el cultivo
del frijol variedad Negro Valentina (Field ef al., 1994).
2.1.1 Características morfológicas de E. varivestis
El adulto de 15. varivestis es de color amarillo a café cobrizo, con 8 puntos negros en
cada élitro. Las larvas son amarillas, de forma oval y convexas, con espinas
bifurcadas de puntas negras en el cuerpo, cuando están completamente
desarrolladas miden 0.8 cm de largo y 0.4 cm de ancho (Borror et al., 1989). Los
huevos miden poco más de 1 mm de largo, son de color amarillo anaranjado y
adheridos en su extremo en grupos de 50 o más, la pupa es lisa, de color amarillo
anaranjado y redondeada en el frente (Pedigo, 1996).
2.1.2 Ciclo de vida y hábitos de E. varivestis
Este insecto pasa el invierno en estado adulto, en el suelo entre las hojas, y otras
basuras, algunas veces en grupo, especialmente en terrenos cercanos a los campos
en que se cultivó el frijol (Pedigo, 1996).
En primavera, los adultos emergen de la hibernación para alimentarse y ovipositar
(Nagarajan et al., 1994; Coll y Bottreell, 1994). Después de alimentarse una o dos
semanas de plantas de frijol, los adultos depositan los huevos en el envés de las
hojas, para eclosionar en 7 días aproximadamente (Pedigo, 1996).
Existen cuatro estadios larvales, con duración aproximada de 6 días cada uno
(dependiendo de la temperatura). Cuando se completa el desarrollo, las larvas pegan
la parte posterior de sus cuerpos al envés de las hojas no dañadas del frijol o de otras
plantas, frecuentemente reuniéndose en grupos. La pupa se abre paso fuera de la
envoltura larvaria juntándola al final de la punta del abdomen, la cual permanece
cubierta con esta piel arrugada y espinosa. La pupación ocurre y termina en 7 días
aproximadamente (Pedigo, 1996).
Cuando el adulto emerge, puede poner huevos para la segunda generación a las dos
semanas siguientes. El tiempo que tarda este insecto para pasar de huevo a adulto es i
de un mes en promedio. Pueden haber de una a cuatro generaciones al año,
dependiendo de la latitud y temperatura (Pedigo, 1996). En Mariland este insecto es
divoltino (Coll y Bottreell, 1994).
2.1.3 Control de E. varivestis
El control químico generalmente ha logrado una disminución efectiva y económica de
los insectos plaga de la soya que rebasan los umbrales de daño económico. Sin
embargo, las estrategias del control químico han cambiado, en la actualidad, pocos
insecticidas selectivos son recomendados para su uso en programas de Manejo
Integrado de Plagas (MIP) de este cultivo, y la adopción de estas recomendaciones
deben contribuir en la preservación de los enemigos naturales en los ecosistemas
(Kogan y Turnípseed, 1987).
En el control genético, los trícomas de las hojas influyen fuertemente sobre la
mortalidad de las pupas, las variedades con hojas pubescentes son menos
preferidas por la mayoría de las plagas, la pubescencia de las hojas de soya’
beneficia el control del escarabajo mexicano del frijol; la longitud y oríentación de los
trícomas pueden ser más importantes que la densidad en proporcionar resistencia al
ataque de E. varivestis (Gannon y Bach, 1996).
En el control biológico de E. varivestis, se han reportado 10 especies de dípteros
parasitoides y 14 especies de depredadores. En los primeros meses de la
temporada, los depredadores pueden reducir las poblaciones de larvas y huevecillos
(Tumipseed y Kogan, 1976).
Coll y Bottreell (1994), reportan las siguientes especies depredadoras de E.
varivesris: L o s c o c c í n é l i d o s Coleomegilla maculata (DeGeer), Hippodamia
convergens G. y Coccinella septempunctata L.; las chinches Podsus maculiventris
(Say), Orius insidiosus (Say), Geocoris punctipes (Say), Nabis roseípennís Reuter,
N. americoferus y arañas. Legaspi y O’Neil (1993), mencionan que P. maculivenfris
es un depredador importante al consumir un promedio constante de 0.4 adultos de E.
vativesfis al día.
Algunos de estos depredadores consumen relativamente pocas larvas del
escarabajo, por lo que no afectan significativamente la densidad poblacional de la
plaga. Por ejemplo, un adulto de C. maculafa consume dos larvas del primer instar al
día, mientras que un adulto de N. roseipennis sólo una larva del primer instar (Coll y
Bottreell, 1994).
La avispita Pediobius foveolafus Crawford de la familia Eulophidae es un
superparásito de E. vativestis (Hooker y Barrows, 1992) la avispita Tefrastichus ’
ovulorum, un parasitoide de huevecillo, y la mosca Paradexodes epilachnae originaria
de México, que fue introducida a los Estados Unidos, sin embargo no logró
establecerse (Turnipseed y Kogan, 1976).
En Japón, el hongo entornopatógeno Beauvetia brongnialfii reduce las poblaciones
de E. varivestis en forma natural (Fujiyama et al., 1996). Adultos muertos colectados
en localidades de Maryland, fueron examinados para identificar al agente causal, y se
encontró a Rickettsiella-like sp. en el intestino medio, tráquea, músculo, y tejido
hipodérmico, además de encontrar virus en músculo, tráquea e hipodermis (Adams et
al., 1997).
2.2 Control biológico
El “control biológico clásico” es típicamente definido como el proceso mediante el cual
se controla plagas no nativas con especies importadas, frecuentemente antagonistas
del lugar de origen de la plaga (Myers ef al., 1994; Simberloff y Stiling, 1996). El
término ‘control biológico neoclásico” es cuando se introduce un antagonista de una
especie nativa (Simberloff y Stiling, 1996).
La mayoría, si no es que todas las especies de insectos son depredadas, o sirven
como hospederos para otras formas de vida. Esta diversidad de enemigos naturales
de insectos incluye vertebrados, otros invertebrados, nematodos, microorganismos, y
quizá los más importantes son los insectos mismos. Los enemigos naturales pueden
funcionar como parásitos, depredadores, o patógenos (Pedigo, 1996).
Los atributos deseables de los enemigos naturales incluyen: especificidad de
hospedero, sincronía con la plaga, habilidad para reproducirse rápidamente cuando la
plaga lo hace, la necesidad de matar sólo pocos individuos plaga para completar el
10
ciclo de vida del enemigo, y una alta tasa de capacidad de búsqueda de presas u
hospederos (Murdoch y Briggs, 1996). Los agentes microbianos entornopatógenos
son selectivos y presentan mínimo impacto ambiental (Lacey y Goettel, 1995).
El desarrollo y disponibilidad comercial de nematodos entornopatógenos de las
familias Steinemematidae y Heterortiabditidae amplía las opciones de control de
insectos, especialmente de aquellos estados que habitan en el suelo (Lacey y
Goettel, 1995).
El control microbiano debe ser utilizado como un componente en programas de MIP
con mayor énfasis en alargar la permanencia de la solución (Lacey y Goettel, 1995).
Aunque los microorganismos introducidos no siempre proporcionarán una solución
inmediata, contribuyen significativamente en las estrategias de manejo de plagas
cuando las condiciones son propicias para desarrollar epizootias naturales. Los
insecticidas microbianos pueden ser usados como alternativa a los químicos, por lo
que tienen un futuro brillante (Lacey y Goettel, 1995). ’
El resultado de epizootias naturales de hongos y virus frecuentemente evita el
requerimiento de intervenciones adicionales de control. Avances importantes en el
conocimiento de la genética de los Baculovirus y la subsecuente manipulación de
genes han incrementado su virulencia y utilidad. Los hongos continuamente ofrecen
las únicas opciones de control microbiano contra insectos fitófagos succionadores,
aunque estos tienen gran potencial para su desarrollo como agentes de control -
microbiano, sólo pocos han sido usados en escala operacional (Lacey y Goettel,
1 9 9 5 ) .
Sin embargo, estos microorganismos también presentan características que pueden
ser ventajas o desventajas, debido principalmente a que son organismos vivos,
pueden dispersarse, y si sobreviven a las nuevas condiciones se pueden establecer
en la región en que fueron introducidos. Muchos programas de control biológico
implican nuevas asociaciones de hospederos y enemigos, y frecuentemente
conllevan al uso de nuevos hospederos por especies previamente consideradas
monófagas u oligófagas (Simberloff y Stiling, 1996).
Existen otros factores que limitan el uso potencial de los entornopatógenos,
incluyendo el desarrollo de resistencia. Si los insecticidas microbianos son usados
como reemplazadores de los plaguicidas químicos, entonces eventualmente estos
agentes estarán en la misma situación que los químicos, particularmente con
respecto a la resistencia (Lacey y Goettel, 1995).
Existen numerosas ventajas en el uso de los hongos como agentes de control
biológico, la capacidad de infectar y matar al hospedero es ciertamente el más
importante. Las esporas son capaces de germinar y penetrar la cutícula del insecto, y
no siempre se encuentran con mecanismos de defensa del hospedero. Sus
propulsores infectivos, son generalmente más estables que los producidos por las
bacterias, y la disponibilidad de numerosas especies para el control de diversas
plagas es una de sus grandes ventajas (Jackson, 1997).
Existen más de 700 especies de hongos entornopatógenos (Feng et aI., 1994; Hajek y
St. Leger, 1994). Pedigo (1996) menciona que son más de 750 especies de hongos
entornopatógenos conocidos. Además, Parker et al. (1997), citan la necesidad de
realizar más evaluaciones de los efectos de los hongos entornopatógenos en
diferentes artrópodos.
En los últimos años, ha surgido gran interés en el uso de los hongos
entornopatógenos como agentes de control biológico y un avance significativo en el
desarrollo y manufacturación de estos agentes, con innovaciones biotecnológicas a
futuro (Khachatourians, 1986).
Los Deuteromycetes comprenden un gran número de entornopatógenos incluyendo
géneros con amplia distribución geográfica (Beauveria y Mefarhizium), así como
los que están distribuidos principalmente en regiones tropicales y subtropicales
(Gibellula e Hymenosfilbe). Muchas especies tienen un amplio rango de hospederos
y son patogénicos a diferentes órdenes de insectos como: Lepidoptera, Coleoptera o
Hemiptera. Los hongos mejor conocidos son Beauvetia bassiana y Metarhizium
anisopliae, los cuales, junto con otros Deuteromycetes, tiene gran potencial como
agentes de control biológico de plagas (Zimmermann, 1986). Son particularmente
importantes para el control del Orden Coleoptera, debido a que las enfermedades
virales y bacterianas son raras entre los escarabajos. Estos microorganismos están
asociados con los insectos en diferentes hábitats, incluyendo; agua, suelo, y lugares
aéreos (Hajek y St. Leger, 1994).
Los hongos entomopatbgenos ofrecen un potencial para el control de insectos plaga,
pero su introducción dentro del ambiente demanda un cuidado y enfoque
responsable, particularmente si los hongos no. son endémicos al área (Bidochka et
al., 1995).
Los hongos son potencialmente los más versátiles entornopatógenos, algunos :
*producen toxinas, lo que los provee de un potencial para dañar rápidamente, pero
generalmente son patógenos de acción lenta. Muchos tienen amplio rango de
hospederos, infectan diferentes estados, son virulentos y frecuentemente causan
epizootias naturales (Fuxa, 1987).
Recientemente varios micoinsecticidas han entrado al mercado, sin embargo, de las
700 especies de hongos entornopatógenos actualmente conocidos, sólo 10 especies
han sido desarrollados para el control, y el potencial de los hongos entornopatógenos
no ha sido abordado en su totalidad (Hajek y St. Leger, 1994).
Los hongos tienen-algunas ventajas únicas entre los entornopatógenos; son capaces
de infectar a través del integumento del hospedero, por lo que la ingestión del
microorganismo es innecesaria (Leathers y Gupta, 1993; Hajek y St. Leger, 1994).
Los hongos en el suelo están sujetos al parasitismo y depredación por diversos
elementos de la micro- y mesofauna, incluyendo otros hongos (micoparásitos), virus
(micovirus), bacterias, actinomycetos, protozoarios, ácaros, nematodos, colembolos,
escarabajos, anélidos, y otros (Rosenheim, 1998). Además pueden perder su
virulencia durante la reproducción en medios- -de cultivo; uno de los métodos más
comúnmente usados para recuperar la virulencia perdida es pasar el hongo
entornopatógeno a través de insectos hospederos vivos (Hayden ef al., 1992;
Steinkraus ef al., 1991).
Es necesario encontrar métodos confiables para detectar la persistencia y
propagación del hongo introducido. Las deficiencias en las técnicas de detección
microbiano tradicionales, han ocasionado la iniciativa de investigar dentro de
métodos moleculares con la selectividad y sensibilidad requeridos para distinguir
cepas no nativas de poblaciones nativas (Bidochka et al., 1995).
Steenberg et al. (1995), mencionan la necesidad de realizar estudios para evaluar Ia
importancia d e los hongos entornopatógenos en el desarrollo de poblaciones de
escarabajos depredadores, incluyendo infecciones fúngicas de insectos durante la
temporada y la frecuencia de las epizootias. Asimismo, se debería dar atención
especial a las infecciones fúngicas de larvas y pupas. También, se deben considerar
el impacto de la movilidad de los depredadores en la dispersión del inóculo de los
sitios de hibernación a los campo de cultivo.
2.3 El hongo entornopatógeno Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin
El hongo hyphomycete, Beauveria basiiana (Balsamo) Vuillemin es un patógeno que
infecta naturalmente numerosos insectos (Barbercheck y Kaya, 1990; Harrison et al.,
1993; Sosa et al., 1994). Es considerado como una de las especies más promisorias
por su potencial como agente de biocontrol de insectos (Leathers y Gupta, 1993;
Feng et al., 1994).
Más de 700 especies de insectos pertenecientes a nueve ordenes, principalmente
Lepidoptera y Coleoptera han sido reportados como hospederos de 5. bassiana
(Barbercheck y Kaya, 1990; Feng et al., 1994). Sin embargo, este hongo también se
ha encontrado en los áfidos de los cereales -(Feng. -et. al., 1990; Feng y Johnson,
1990), chicharritas (Dorschner ef al., 1991) y chapulines (Khachatourians, 1992).
5. bassiana es el hongo más extensamente estudiado desde que fue reportado por
primera vez como un patógeno del gusano de seda Bombyx mori L., por Agostìno
Bassi en 1834 (Feng et al., 1994). Ha sido usado para el control de muchas plagas’
importantes en varios cultivos de todo el mundo y ha sido probada su virulencia
sobre diferentes insectos (Hajek et al., 1987; Anderson ef al., 1988; Feng y Johnson,
1990; Leathers y Gupta, 1993).
5. bassiana es un hongo de suelo, en donde encuentra las condiciones ambientales
favorables para las conidias (Gaugler et a/. , 1989; Bing y Lewis, 1991). Puede
presentarse en residuos de plantas, y en el tejido vegetal de la planta de maíz (Bing y
Lewis, 1991; 1992).
En el cultivo de la soya en Argentina y Brasil, este hongo regula poblaciones de
diferentes coleópteros de los géneros Diabrofica, Colapis, y Maecolapis. En Brasil se
presenta en altos niveles sobre poblaciones de Aracanfhus, una plaga importante del
cultivo del frijol (Sosa ef aI., 1994).
La colección de hongos entornopatógenos de la USDA-ARS contiene cerca de 100
aislados diferentes de 5. bassiana, algunos de los cuales han sido obtenidos de
Lepfinofaarsa decemlineata (Say), de escarabajos de la familia Coccinellidae, entre
otros insectos (Todorova et al., 1994).
.
En los últimos años 5. bassiana ha sido extensamente estudiado y usado en el
control de muchos insectos plaga en diversos cultivos en el mundo (Feng y Johnson,
1990). Recientemente, este hongo ha recibido especial atención para su uso en
campo como un micoinsecticida contra plagas importantes de la agricultura como la
catarinita de la papa L. decemlineata (Hajek ef al., 1987; Anderson et al., 1989).
-- Este patógeno infecta huevos, larvas-(Lezama et al., 1996), ninfas,. püpas o adultos,
la infección puede ocurrir después de la germinación de la espora dentro de los
intestinos del hospedero o en la superficie de la cutícula. La susceptibilidad de la larva
disminuye con el aumento en los estadios larvales, aunque los primeros estadios
larvales pueden ser capaces de superar la infección mediante la eliminación del
integumento, antes de que la hifa penetre al hemocele (Hare y Andreadis, 1983).
En caso de no ocasionar la muerte por la enfermedad, el hongo B. bassiana puede
tener efectos secundarios en sus hospederos. Por ejemplo, las dosis de B. bassiana
cercana a la DLs -(Dosis Letal media) reduce el potencial reproductivo de Sitona
lineafus (L.); la fertilidad y fecundidad de Chilo suppressalis (Walker) al sobrevivir a la
infección; así como el desarrollo de los huevecillos de las chicharritas en plantas de i
arroz (Feng et al., 1994).
Los problemas que actualmente limitan el éxito de la implementación de B. bassiana
en el control de la catarinita de la papa son relacionados a su producción, formulación
y sensitividad a las condiciones ambientales extremas (Anderson et a/. 1988).
8. bassiana es ccmpatible con la mayoría de los insecticidas, siempre y cuando éstos
no contengan solventes a base de xyleno (Anderson y Roberts, 1983). Los
insecticidas abamectin, triflumuron, y thuringiensin son compatibles con B. bassiana
(Andersen et al., 1989).
Este hongo afecta el desarrollo de los nematodos entornopatógenos Steinernema
feltiae y Heterorhabdítis helíothidis cuando se aplica 48 horas antes de los
nematodos. Las poblaciones naturales de nematodos y B. bassiana se adaptan a los
climas de origen, y sus preferencias a temperaturas diferentes pueden ser los
mecanismos por los cuales 6. bassiana y los nematodos evitan infectar un mismo
hospedero (Barbercheck y Kaya, 1990).
Se pueden obtener mejores resultados en el control del gusano Spodoptera exigua
(Hübner), al realizar liberaciones inundativas de nematodos entornopatógenos donde
está presente 6. bassiana, que, realizar las aplicaciones de nematodos solos
(Barbercheck y Kaya, 1991).
Es necesario realizar más investigaciones para obtener éxito en el uso de B.
bassiana en regiones áridas. Las aplicaciones deberían ser cronológicas para una
mejor aproximación a las condiciones del laboratorio. También se debe investigar el
uso posible de diferentes formulaciones con retenedores de humedad, los cuales
aumentan la capacidad de infección, así como la selección de cepas mejor
adaptadas a altas temperaturas y bajas condiciones de humedad (Dorschner et al.,
1991).
Para B. bassiana la competencia y depredación influyen en la persistencia del hongo
en el suelo. Es necesario un trabajo adicional para a los enemigos naturales de
mayor importancia ecológica para los hongos entornopatógenos (Rosenheim, 1998).
2.3.1 Características morfológicas de B. bassiana
El hongo B. bassiana puede producir tres tipos de espora: conidia aérea, conidia
sumergida y blastosporas. Las principales características de la espora son:
hidrofobia, encapsulación, y aglutinación por lecitinas específicas presentes en la
superficie de las conidias. La hidrofobicidad de las conidias aéreas y sumergidas es
similar, las blastosporas son menos hidrófobas que las anteriores. La hidrofobicidad
es importante en la adhesión de las esporas al cuerpo del hospedero. La aglutinación
es muy similar en las esporas aéreas y sumergidas, pero difiere en las blastosporas.
La viabilidad de las esporas aéreas y sumergidas permanece por más tiempo que en
las blastosporas (Hegedus et al., 1992).
Debido al modo de formación, las blastosporas de B. bassiana se consideran
funcionalmente idénticas a las células hifales y debido a esto son llamadas
adecuadamente “cuerpos . hifales’ (Rombach, 1989). Las características
macroscópicas de las colonias muestran amplia variación, por lo que no pueden ser
consideradas rasgos importantes de selección (Varela y Morales, 1996).
Bidochka et al. (1987), mencionan seis estados de desarrollo: (1) la deshinchazón de
la conidia, (ll) la hinchazón de la conidia, (III) la emergencia del tubo germinativo, (IV)
elongación del tubo germinativo y formación de la primer septa, (V) elongación polar y
bipolar (crecimiento) del micelio resultante e iniciación de las. blastosporas y, (VI)
división de las blastosporas.
El color de las colonias de aislados diferentes de 6. bassiana muestra una variación
amplia entre blanco y amarillo. El aspecto de las colonias es también una
característica variable (Varela y Morales, 1996). Existen diferencias en el color de las
colonias del hongo vistas a través del agar, varía de crema a morado pálido y rojo
púrpura. La coloración de rojo se cree que está relacionada con la producción de
oosporeina (Feng y Johnson, 1990).
Es probable que este pigmento no esté directamente relacionado con la virulencia, ya
que un aislado virulento no lo produce (Varela y Morales, 1996). Aislados con
coloración intensa son más patogénicos al pulgón ruso D. noxia que a la broca del
café Hipofhenemus hampei (Coleoptera: Scolytidae)( Feng y Johnson, 1990).
La capacidad de producir pigmentaciones de color rojo, amarillo y verde ha sido
usada como característica taxonómica en la clasificación de aislados de Beauveria
spp. (Hegedus y Khachatourians, 1995).
Las conidias de diferentes aislados de 6. bassiana, presentan tres rangos de medida
y dos tipos de forma: 5 2.5 uum (globosa), 2.6-3.75 um (globosa), y 4.9-5.0 x 2.5-3.0
um (elipsoidal) (Varela y Morales, 1996). La longitud es de 0.95 a 3.41 um (Sosa et
al., 1994). Son lisas y miden de 2 - 3 um de diámetro (Feng ef aI., 1994). El
polimorfismo coñidial en algunos aislados se debe a su variabilidad genética (Varela
y Morales, 1996).
2.3.2 Cultivo de B. bassiana
B bassiana se cultiva fácilmente en medios líquido y sólido, por ejemplo,
Saubouraud, POA (papa dextrosa agar). Las conidias aéreas se producen en medios
sólidos y su morfología e infectividad son similares de aquellos que emergen en la
superficie de los insectos muertos (Bidochka ef al., 1987). Las blastosporas se
pueden producir a partir de una célula madre depositada en levadura (Bidochka et
al., 1987; Rombach, 1989).
Las conidas son resistentes y el intento por producirlas en gran escala ha atraído la
atención de los investigadores. La produccicón masiva de conidias aéreas por
fermentación difásica, producción micelial vegetativo, por ejemplo, en gran cantidad
de cultivo líquido seguido por la conidiación superficial del micelio en un nutriente o
cargador inerte, es considerada una labor intensa e inadecuada por los procesos
convencionales de material fúngico en los fermentadores (Rombach, 1989).
El modo más reciente de conidiación sumergida incluye la producción de
blastosporas durante las primeras 48 horas de cultivo en caldo y la subsiguiente
formación de conidias seguida por la germinación de las blastosporas hasta la
conidiación (Feng et al., 1994).
La conidiación sumergida también se puede llevar a cabo por el cernimiento de las
conidias formadas en el caldo (Hegedus et al,. 1992). Este micro-ciclo en la
germinación no fue observado por Rombach (1989), quien estudió un aislado
diferente, y así se postula la probabilidad que la conidiación sumergida depende de la
naturaleza del aislado y de las condiciones fisiológicas usadas.
2.3.3 Antecedentes de control de B. bassiana en coleópteros
Los insectos del órden Coleoptera son los más comúnmente infectados por B.
bassiana (Feng y Johnson, 1990). Así, 16 géneros de coccinélidos depredadores han
sido reportados como hospederos de éste hongo entornopatógeno (Magalhies ef al.,
1988).
Dos cepas de B. bassiana produjeron diferentes grados de toxicidad en larvas de
Coleomegilla maculata, las larvas del coccinélido son susceptibles a todas las
concentraciones del hongo. Una de las cepas causó una mortalidad insignificante,
mientras que la más virulenta ocasionó hasta un 77.8% de mortalidad por contacto
(Todorova et al., 1994)
Este hongo es virulento a la catarina Hippodamia convergens Guérin-Méneville y
posiblemente también a otros coccinélidos. Sin embargo, es necesario realizar
investigaciones más avanzadas que determinen los efectos en laboratorio y en
campo, donde interactúan varias especies (James y Lighthart, 1994).
Este hongo reduce signiticativamente las poblaciones de larvas y adultos de la
catarina de la papa L. decemlineata (Anderson et al., 1988). En un experimento
realizado con aplicaciones en diferentes dosis (104, 3 x 104, y lo5 conidias/cm* de
área foliar) de B. bassiana, todas las larvas de éste escarabajo, mueren antes de
pupar (Fargues et al., 1994).
Las larvas de L. decemlineata, difieren en susceptibilidad a la infección natural por B.
bassiana (Todorova et al., 1994), éste hongo es un agente de control promisorio para
L. decemlineata dadas las experiencias en Francia, Polonia, Checoslovaquia y Rusia
(Hajek et al., 1987).
La aplicación de B. bassiana en el suelo reducen la emergencia de adultos de
Diabrotica undecimpunctata, y el daño a la raíz es menos severo en suelo tratado
con el hongo que en los suelos infestados con la plaga, sin tratamiento conidial
(Krueger y Roberts, 1997).
El crisomélido Cerotoma arcuata es susceptible a B. bassiana (Magalhaes et al.,
1988). El escarabajo Ceratosanthes hilariana Cogniaux (Coleoptera: Chrysomelidae),
es infectado por los hongos B. bassiana y M. anisophae (Daoust y Pereira, 1986).
Asimismo, f3. bassiana infecta a Cosmopolifes sordidus (Coleoptera: Curculionidae),
y M. h. sericeus en Florida, por lo que este hongo es un factor importante en la
mortalidad de los adultos de C. sordidus y M. h. sericeus en el sudeste de Florida.
Este hongo también infecta a C. sordidus y M. hemipterus en Puerto Rico, Cuba y
Brasil donde se considera un agente de control que ocurre en forma natural. La
mayoría de los picudos muertos infectados con B bassiana se encuentran adheridos
en la parte baja o caídos de la planta del plátano (Peña et a/., 1995).
B bassiana es patogénico al tercer estadio larval del picudo del plátano c. sordius,
causando mortalidades de 63-97% en los 35 días posteriores a la exposícíón de fas
esporas. Con la finalidad de infectar a la hembra durante la oviposición y a las larvas
al eclosionar los huevecillos, se pueden realizar aplicaciones de B bassiana durante
las oviposturas de la hembra de C. sordidus (Kaaya et al., 1993). El adulto de
Chalcodermus bimaculatus Fiedles (Coleoptera: Curculionidae), se considera menos
susceptible a B. bassiana que la larva (Quintela et al., 1990).
Las larvas y adultos del picudo del nogal pecanero Curculio caryae (Horn), son
infectados por B. bassiana, sin tomar en cuenta el lugar, tipo de suelo, o prácticas de
manejo de plagas (Harrison y Gardner, 1991). La virulencia de los hongos
entornopatógenos contra este picudo depende del modo de aplicación y el aislado del
hongo (Harrison et al., 1993).
B. bassiana ataca especies del curculiónido Sitona en Inglaterra (Poprawski et al.,
1988). Los aislados de 6. bassiana muestran diferentes grados de virulencia sobre las
larvas del picudo Curculio caryae (Horn) (Champlin et al., 1981).
En experimento realizado, los aislados de B bassiana fueron virulentos al picudo del
maiz almacenado, Sitophilus zeamais Motsch., en laboratorio, por lo que B. bassiana
es un agente potencial para el control microbiano de esta plaga (Adane et al., 1996).,
El adulto del escarabajo Alphitobius diaperinus (Panzer) (Coleoptera: Tenebrionidae)
es menos susceptible a la infección con B. bassiana que la larva. Algunas larvas
infectadas logran pupar y la esporulación ocurre en la pupa. Los adultos
generalmente repelen la infección, y la mortalidad no excede el 27% (Steinkraus et
al., 1991).
En muestreo realizado de escarabajos de las familias Carabidae y Staphylinidae, se
presentaron niveles de infección bajos (Carabidae: 7.6%, Staphylinidae: 7.0%), el
hongo 0. bassiana infectó hasta un 67% de la población del stafilínido Anotylus
rugosus y 37% del stafilínido Gyrohypnus angustatus. Este hongo predominó, ya que
fue colectado de las dos familias en todos los sitios de estudio (Steenberg et al.,
1995).
La mayoría de los aislados probados producen un bajo porcentaje de mortalidad
(menos de 25%) en un periodo de 10 días en la broca del café H. hampei
(Coleoptera: Scolytidae), lo anterior podría indicar una pérdida de la virulencia y la
necesidad de aumentarla a traves de la infección con hospederos de la misma
especie o una especie alternante (Varela y Morales, 1996).
Cuando B. bassiana es aislado de escarabajos del género Phyllophaga spp.,
(Coleoptera: Scarabaeidae) ocasiona un alto porcentaje de mortalidad en larvas del
mismo insecto. Este hongo es ligeramente infeccioso cuando se administra en el
alimento de las larvas; sin embargo, el hongo parece estar asociado más
específicamente còn el segundo y tercer estadio larval (Poprawski y Yule, 1991).
2.3.4 Antecedentes de control de B. bassiana en otros insectos
Los hongos B. bassiana y B. brogniartii son virulentos a Osttinia nubilalis y
Melolontha melolontha respectivamente (Lecuona et al., 1997). El hongo B. bassiana
puede persistir en la planta de maíz para proporcionar un control efectivo de 0.
nubilalis (Bing y Lewis, 1991; Lewis y Bing, 1991; Lewis et al., 1998).
f3. bassiana muestra diferentes capacidades de virulencia sobre “el gusano del elote”
Heliothis zea (Boddie) (Lepidoptera: Noctuídae) (Sandhu et a/. , 1993), y ‘el gusano
cogollero” Spodoptera exigua (Hung et al., 1993). En bioensayos realizados, los
aislamientos de B. bassiana presentan virulencia variable sobre S. frugiperda, con un
parasitismo entre 3 y 90% en huevos y 54 a 100% en larvas; el aislamiento más
sobresaliente presentó un TL50 de 3.1 y 2.8 días en huevos y larvas,
respectivamente, y una CL50 de 2.4 x 1 O3 conidias/ml (Lezama et al., 1996).
En el control de S. exigua, las liberaciones ínundativas de los nematodos
entornopatogénicos Steinernema carpocapsae y Heterorhabditis bacteriophora junto
con B. bassiana, se pueden obtener mejores resultados en el control de este gusano
que realizar las aplicaciones de nematodos solos (Barbercheck y Kaya, 1991).
El fango de hospederos de B. bassiana incluye a los lepidópteros; palomilla de la
cera Galletia mellonella, el cortador de la col Tiichoplusia ni (Gupta et al, 1994);
Pieris rapae (L.), P/ufe//a xylosfella (L.), Trichoplusia ni (Hübner) (Ignoffo et al., 1979),
y P/ute//a xylostella (Vandenberg et al., 1998a).
B. bassiana es efectivo contra el lepidóptero Malacosoma americanum, ya que
ocasiona la muerte de larvas en 4 días. En algunos casos, las larvas muestran signos
de enfermedad (inactividad y melanización de la cutícula) a las 6 horas de la
exposición a las esporas. Los niveles altos de susceptibilidad de M. americanum a
ciertas cepas de B. bassiana sugieren que este hongo es ideal para el biocontrol de
la plaga (Leathers y Gupta, 1993).
Los chapulines también son infectados por B. bassiana (Bidochka y Khachatourians,
1990; Johnson y Goettel, 1993; Goettel et al., 1995; Inglis et al., 1997b), ya que este
hongo reduce las poblaciones de diferentes especies de chapulines en forma natural
(Shah et al., 1994).
El chapulín Melanoplus sanguinipes es susceptible a varios hongos imperfectos,
incluyendo a B. bassiana (Khachatourians, 1992; Inglis et al., 1997c). Las ninfas de
este acrídido son altamente susceptibles a la infección por B. bassiana formuiado en
cebo, y la eficacia de la formulación depende del grado en que las ninfas contaminen
su superficie cuticular durante y en la ingestión del cebo (Inglis et al., 1993; Inglis et
al., 1996).
La mortalidad de M. sanguinipes está relacionada con la dosis ingerida de esporas
(54.3-60.0 mg por chapulín), las primeras muertes atribuidas a B. bassiana ocurren en
los días 6 y 7 en dosis de 1 .1 x 10’ y 5.4 x 1 O6 esporas por mililitro, mientras que las
dosis bajas de 1 .l x lo4 y 1.2 x 10’ ocasionan la muerte hasta los días 13 y 14
respectivamente (Jeffs et ai., 1997).
En bioensayos realizados sobre M. sanguinipes, las cepas de B. bassiana GK2016,
“tipo nativo” (virulento), y GK2051, presentaron un TL50 de 5.8 y 7.8 días
respectivamente, aunqua son sólo dos días de diferencia en el valor de TL50 la cepa
GK2051 consistentemente requiere 17 días para matar el 90% de la población y
nunca produce 100% de mortalidad, mientras que la cepa “tipo nativo” GK2016,
causó el 100% de muerte en 8-10 días (Kosir ef al., 1991).
El éxito de 5. bassiana contra chapulines en campo depende del desarrollo de las
estrategias bioracionales que superan la luz y la temperatura como limitantes del
hongo (Inglìs et aI., 1997a). Sin embargo, por la elevación de la temperatura de su
cuerpo, los chapulines pueden inhibir y/o prevenir las enfermedades causadas por 5.
bassiana y M. flavoviride, los efectos de la termoregulación son considerados más
inhibitorios para 5. bassiana que para M. flavoviride (Inglis et al., 1997c).
En ambiente controlado, la mezcla de conidias de 5. bassiana con arena como
substrato para oviposición causó una mortalidad extensiva por infección durante la
oviposición de las hembras de M. sanguinipes, en machos asociados y
subsecuentemente en la emergencia de las ninfas (Inglis et al., 1995b).
El hongo 5. bassiana es potencial para el control biológico de áfidos, en un
bioensayo realizado, con dosis de lo4 a l0 8 conidias/ml, el hongo exhibió un alto
nivel de virulencia sobre el pulgón Phorodon humuli (Schrank); así, se obtuvo una
CL50 de 1.37 x 10’ conidias/ml, y el TL50 se redujo en la medida del incremento de la
dosis conidial (Dorschner et a/., 1991). Asimismo, puede infectar al pulgón ruso
Diuraphis noxia (Homoptera: Aphididae), sin embargo, la virulencia de los aislados
varía mucho (Feng y Johnson, 1990).
En la mayoría de los casos 5. bassiana es más virulento que V. Lecanii cuando se
aplica sobre diferentes especies de áfidos (Homoptera:Aphididae) (Feng et al., 1990).
Asimismo, éste hongo produce un 7 7 % de mortalidad sobre ninfas de Empoasca
kraemeri (Homoptera: Cicadellídae) (Magalhaes et al., 1988).
5. bassiana es un agente potencial de control biológico de la hormiga de fuego,
Solenopsis invicta Buren (Himenoptera: Formicidae) (Siebeneìcher et al., 1992). Este
hongo tiene la capacidad de crecer, dispersarse, y esporular en nidos y suelos de la
hormiga de fuego (Pereira et al., 1993). Bajo condiciones de laboratorio, el
hongo 5. bassiana infecta poblaciones de S. invicta. La presencia o ausencia de
suelo no influye en la susceptibilidad de las hormigas al patógeno (Pereira y Stimac,
1992).
El hongo 5. bassiana también es un agente de control promisorio para la mosca
casera Musca domestica L en establos asperjados con conidias se detectó al hongo
en el 43 a 47% de adultos colectados (Watson et a/., 1996).
Este hongo puede ser aplicado en suelos forestales para el control de trips
Taeniothrips inconsequens (Uzel), plaga importante de los árboles, sin ocasionar
efectos negativos en la población natural de invertebrados de áreas forestales (Parker
et al., 1997). En un experimento realizado, se obtuvo un 24% de mortalidad en larvas
de trips del melón Thrips palmi tratadas con 5. bassiana (Castineiras et al., 1996).
2.3.5 Factores que afectan a B bassiana
Una variedad de factores abióticos y bióticos afectan la estabilidad y persistencia de
5. bassiana en el suelo (Lingg y Donaldson, 1981; Gaugler et al., 1989, Studdert et
al., 1990).
En los factores abióticos, la dispersión de los propágulos infectivos a un nuevo
hospedero representa una de las partes más peligrosas del ciclo de vida del hongo,
los procesos de producción, liberación, dispersión, germinación y sobrevivencia de
esporas, frecuentemente dependen de las condiciones ambientales (Hajek y St.
Leger, 1994). La radiación solar, temperatura, y la baja virulencia del patógeno hacia
el hospedero que se quiere controlar limitan la eficacia de 5. bassiana en el campo
(Inglis et al., 1997a; Inglis et al., 1997b).
Las conidias de B. bassiana son hialinas y el parámetro más importante que limita la
sobrevivencia de la conidia en los habitantes epigeales es la luz solar (Daoust y
Pereira, 1986; Inglis et al., 1995a; Inglis et a/., 1993). Las conidias mueren
rápidamente por la exposición a la luz solar y en particular por los rayos ultravioleta
que causan principalmente mutación en el ácido nucleico y/o fotoreacción, que los
lleva a la muerte celular (Inglis ef al., 1995a).
La sobrevivencia de las conidias en la superficie de las hojas, declina
logarítmicamente por la exposición al ambiente; este mismo fenómeno ocurre con la
población conidial sobre el integumento de los chapulines (Inglis et al., 1997a).
La sobrevivencia de las conidias en la parte más alta de la superficie de las hojas de
alfalfa y pastos es relativamente baja, en 4 días la población conidial disminuye en
más del 75%, en la parte media de la planta la persistencia de la conidia es de más
tiempo; en hojas de pasto la población conidial se reduce en más del 99% a los 16
días de exposición y de 28 a 85% en hojas de alfalfa (Inglis et al., 1993). En 28 días
se obtiene un 90% de viabilidad conidial perdida en hojas de alfalfa, sin embargo aún
se observa un gran número de conidias vivas (James y Lighthart, 1994).
La vida media de B. bassiana sobre el follaje de la soya es de menos de 24 horas
(Ignoffo et al., 1979), puede llegar a ocasionar hasta un 83% de mortalidad en larvas
de Spodopfera frugiperda y Heliofis zea el día de la aplicación, 44% al quinto día y 0
al décimo día (Gardner et al., 1977).
El rojo congo, la arcilla, y todos los abrillantadores probados proporcionan un grado
de protección de la radiación ultravioleta artificial a B. bassiana. La arcilla y el
abrillantador stilbene, Tinopal LPW, incrementan consistentemente la persistencia de
las conidias de B. bassiana en hojas de gramíneas (Inglis et al., 1995a).
La temperatura es uno de los factores principales que afectan el desarrollo de B.
bassiana. Este hongo presenta variación en las temperaturas óptimas, siendo de 25
y 28°C, exhibiendo crecimiento óptimo a temperaturas tan bajas de 20°C o tan altas
de 30°C. Sin embargo, el umbral máximo de temperatura es de 30 a 37°C, y la
temperatura mínima de 8°C (Fargues ef al., 1997).
La mayor mortalidad de Plutella xylosfella ocasionada por B bassiana se presenta a
una temperatura de 25°C, y disminuye a temperaturas más altas o más bajas, es
decir la temperatura óptima para este hongo es a 25°C, donde ocasiona la mayor
mortalidad en este lepidóptero (Vandenberg el al., 1998b).
En un ensayo realizado con ninfas del chapulín Melanoplus sanguinipes expuestas a
35°C, y tratadas con 5. bassiana, se observó una mayor mortalidad a 35 que a 40°C
(Inglis et al., 1997c). Sin embargo, las cepas mutantes de B. bassiana por su
sensibilidad al calor matan chapulines M. sanguinipes a temperatura de 20°C pero no
a 30°C o más (Hegedus y Khachatourians, 1996c).
Se menciona con frecuencia que la humedad relativa (HR) es el factor abiótico clave
en el potencial de los hongos. Usualmente, la germinación de la conidia ocurre en un
rango de HR de 90-100%. Sin embargo, se ha demostrado que las infecciones de
varios insectos hospederos son posibles a diversos niveles de HR. Las infecciones de
B bassiana sobre larvas del escarabajo negro del olmo Sco/ytus sco/ytus fueron
posibles a humedades relativas bajas (51%). Estos datos revelan que es necesario
distinguir entre HR atmosférica, HR macroambìental, y HR microambiental próxima
inmediata a la cutícula del insecto o la superficie de las hojas (Zimmermann, 1986).
Las condiciones de humedad o HR son de menor importancia, o incluso no la tienen
cuando el uso de. los hongos entomopatbgenos es contra insectos de suelos
cultivados. Excepto para los niveles superficiales, el micelio normalmente permanece
en el suelo en una atmósfera de cerca del 99% de HR (Zìmmermann, 1986).
Por otro lado, en el ambiente del suelo, al decremento en la sobrevivencia puede ser
causado por efectos fungistáticos (Hajek y St. Leger, 1994). Al parecer, existen
ciertos factores en el estiércol que durante la descomposición reducen la
sobrevivencia de B. bassiana (Rosin et al., 1996).
Los mejoradores del suelo benefician la sobrevivencia de las conidias en suelo
estéril, mientras que en el suelo no estéril son dettimentales debido a la estimulación
de la microflora (Lingg y Donaldson, 1981). Por otro lado, las prácticas culturales
influyen en la densidad de propágulos de hongos entornopatógenos en los
agroecosistemas, y la no-labranza favorece la prevalencia de los hongos en el suelo
(Sosa y Moscardi, 1994).
Para B. bassiana la competencia y la depredación parecen tener influencia en su
persistencia en el suelo. Son necesarios estudios adicionales para evaluar la
importancia de los depredadores en la ecología de los hongos entornopatógenos
(Rosenheim, 1998).
Los hongos entornopatógenos que se aplican contra insectos plaga; en la agricultura,
también pueden ser afectados por los agroquímicos, como los fungicidas,
insecticidas, o herbicidas (Zimmermann, 1986). B. bassiana puede ser usado en
mezcla con la mayoría de los insecticidas, siempre y cuando éstos no contengan
solventes a base de xyleno (Anderson y Roberts, 1983).
La susceptibilidad de los hongos a los fungicidas es variable, dado que el
ditiocarbamato derivado del zineb + oxicloruro de cobre, y mancozeb, inhiben
completamente la germinación de B. bassiana. Los fungicidas triadimefon, oxicloruro
de cobre, metalaxil, azufre, azufre + nitrothalisopropil y himexazol afectan a los
hongos. El impacto de los fungicidas en los hongos entornopatógenos es
aparentemente delicado, es necesario realizar estudios a gran escala, debido a que
los fungicidas podrían ser más dañinos a los hongos entornopatógenos cuando son
aplicados varias veces en un año (Majchrowicz y Poprawski, 1993).
Entre los factores bióticos, las plantas hospederas pueden interferir con los patógenos
fúngicos directa o indirectamente por su influencia en los insectos hospederos. LOS
insectos herbívoros tienen una relación compleja con sus plantas hospederas. La
variación entre plantas hospederas también puede afectar la relación entre herbivoros
y sus enemigos naturales. Las larvas de L. decemlineata desarrolladas en diferentes
especies de plantas hospederas en campo, difirieron en susceptibilidad a la infección
natural por B bassiana. Así, se observó como las larvas desarrolladas en
Lycopersicom esculentum fueron más susceptibles a la infección por B bassiana que
las desarrolladas en sus especies hospederas adecuadas (Hare y Andreadis, 1983).
El desarrollo de los patógenos fúngicos dentro de los hospederos, puede ser afectado
no sólo por las reacciones de inmunidad de los hospederos, sino también,
indirectamente por el alimento del hospedero (Hajek y St. Leger, 1994).
Los pocos estudios desarrollados in vitro, han demostrado que la adición de
glicoalcaloides a una diversidad de extractos de plantas inhiben el crecimiento de B.
bassiana. Adultos de la chinche Blissus leucopterus, inoculados con B. bassiana,
mostraron mayor mortalidad cuando se alimentaron de trigo, cebada, o dieta artificial
comparado con maíz o sorgo. Pocos cadáveres de las chinches alimentadas de maíz
o sorgo produjeron conidias. Lo anterior podría deberse al resultado de químicos
fungistáticos secundarios de las plantas (Hajek y St. Leger, 1994).
El antibiótico polyene nistatina reduce la formación de colonias, crecimiento y
desarrollo de conidióforas de B. bassiana, en concentraciones más bajas que los
alcaloides. La tomatina inhibe el crecimiento y formación de colonias en mayor grado
que la solanina, la cual presenta relativamente poco efecto sobre el hongo. Lo
anterior sugiere que la germinación de la conidia y el crecimiento hifal se inhibe
cuando un insecto consume follaje, conteniendo 0.100 mg/g (peso fresco) de este
compuesto (Costa y Gaugler, 1989).
2.3.6 identificación y caracterización de B. bassiana
Históricamente la identificación de los hongos ha sido basada en las características
morfológicas, bioquímicas y propiedades inmunológicas (Hegedus y Khachatourians,
1996b).
Debido a la importancia del género Beauvetia en los programas de control de plagas
en el mundo, se ha usado un número de técnicas para la identificación de éste
hongo. Los estudios más frecuentes han usado isoenzimas (Poprawski et al., 1988;
St. Leger et al., 1992; Castrillo y Brooks, 1998), secuencias de rRNA (Rakotonìrainy
et al., 1991), y análisis con PCR (Pfeifer y Khachatourians, 1989; Kosir ef al., 1991;
St. Leger et al., 1992; Pfeifer y Khachatourians, 1993; Neuvéglise et al., 1994;
Hegedus y Khachatourians, 1993, 1996a, 1996b; Couteaudier et al., 1996; Viaud et
aI., 1996; Maurer et a/., 1997; Cravanzola et al., 1997; Castrillo y Brooks, 1998; Glare
y Inwood, 1998; Ben-eta et a/. , 1998; Travis y Inwood, 1998; Viaud et al , 1998).
El uso de los métodos de genética molecular como PCR, pueden complementar y
evaluar el impacto ambiental. También se pueden evaluar los efectos de las
liberaciones intencionales de micoinsecticidas sobre la biodiversidad y en el
reestablecimiento de poblaciones nativas de flora microbiana (Hegedus y
Khachatourians, 1996a). Además, estos métodos han proporcionado marcadores
para el análisis de poblaciones; otros estudios moleculares aplicados recientemente
incluyen el análisis de secuencias de ARN para distinguir entre los géneros
Tolypocladium y Beauveria (Rakotonirainy et al., 1991).
Las variaciones en el ADN ribosomal de los filamentos del género Beauveh
muestran un alto grado de polimorfismo entre cepas de B. brongniartii, y permite su
separación dentro de siete grupos distintos, uno de estos grupos contiene
específicamente todas las cepas aisladas de gallina ciega Hoplochelus marginalis
(Neuvéglise, 1994).
Las variaciones genéticas entre aislados de Beauveria spp. definidas por un
análisis de electroforesis demuestra variaciones alélicas de alozima codificando
genes. 146 aislados de diversos sitios geográficos fueron asignados a 47
distintas clases de genotipos. El análisis de la agrupación demostró que 4
especies morfológicas (B. brongnia rtii, B vermiconia, B . caledonica y
Tolypocladium cylindrosporum) son genéticamente distintas (St. Leger et al.,
1992).
El nivel de distancia genética entre cepas de B. bassiana indica que éste representa
un agregado de especies; a pesar del mantenimiento de la alta diversidad en B.
bassiana, se encontró que tres genotipos ampliamente distribuidos contienen a la
mayoría de los aislados; esto sugiere que en muchas situaciones, B. bassiana existe
con una estructura poblacional clonal. Otros aspectos de los datos de alozima (la
magnitud de las distancias genéticas entre poblaciones, diversidad genética, y el
patrón de distribución de clases genotípicas) indican que la recombinación
cromosoma1 entre diferentes genotipos de B. bassiana es rara o no se presenta (St.
Leger et a/., 1992).
El análisis genómico con RFLP de dos cepas de B. bassiana con características de
virulencia distantes, no indica diferencias detectables entre ellas, ya que muestran
similares patrones de bandas en el gel (Kosir et al., 1991).
Los hongos tienen diferentes proporciones de proteínas totales (Gorinstein et al.,
1996). Se ha analizado la variación proteínica de este hongo a través de
electroforesis por varios autores (Poprawski ef a/., 1988; Sosa ef al., 1994; Todorova
et al., 1994; Varela y Morales, 1996; Gorinstein et al., 1996).
El análisis electroforétìco de proteína de cepas diferentes de B. bassiana indica
diferencias significativas entre ellas; la cepa ARSEF 2991 posee una banda de
proteína predominante con bajo peso molecular, estimado a 34 kDa, mientras que la
cepa ATCC 44860 difiere en la presencia de una proteína de 70 kDa ausente en la
cepa ARSEF 2991 (Todorova et al., 1994).
Varios sistemas enzimáticos son polimórficos y suficientemente bien resueltos para
la realización de estudios genéticos confiables de B. bassiana (St. Leger et al., 1992).
Las isoenzimas han sido usadas como marcadores genéticos para analizar la
variabilidad entre aislados de B. bassiana (Poprawski et a/., 1988; Mugnai et al.,
1989; St. Leger et al., 1992). La electroforesis, y especialmente la técnica de enfoque
isoeléctrico pueden ser utilizadas para detallar la variabilidad entre especies
(Poprawski et al., 1988). El enfoque isoeléctrico es una técnica que da alta resolución
en bandas de proteína, y ya ha sido ampliamente usado en estudios de variabilidad
de especies en hongos (Riba et al., 1986). La electroforesis de isoesterasa es una
herramienta de gran uso y ventaja en la caracterización de aislados (Varela y
Morales, 1996).
Se puede usar el análisis de isoesterasa para identificar un aislado virulento, debido
a la variación en los perfiles de ésta enzima entre aislados de diferentes insectos
hospederos y/o diferentes regiones geográficas (Poprawski et al., 1988).
Los aislados de B. bassiana, que atacan especies de Sitona en Inglaterra, Francia, y
Marruecos fueron analizados con enfoque isoeléctrico, los perfiles de isoesterasa son
monomórficos y similares a una cepa que originalmente se aisló de Osttinia nubilalis
(Hübner) del norte de Francia (Poprawski et al., 1988).
La variabilidad en isoesterasas entre poblaciones de regiones geográficas cercanas
es menor que la variabilidad entre poblaciones de regiones distantes (Sosa et al.,
1994). Este mismo fenómeno fue observado por Poprawski et al. (1988), aunque
ellos consideraron sólo un carácter; contrariamente Varela y Morales (1996),
encontraron que de acuerdo a los perfìles electroforéticos de isoesterasa, los
aislados de un hospedero en común estan más relacionados que los que son de un
origen geográfico similar.
En análisis por electroforesis de isoesterasas de seis aislados de B. badana, se
presentaron seis perfiles distintos, uno para cada aislado. El 75% de las bandas
fueron comunes entre dos o más aislados (Varela y Morales, 1996).
Algunos aislados de B. bassiana son polimórficos en las bandas de isoesterasa,
mientras que otros presentan bandas idénticas (Sosa et al., 1994). En investigaciones
realizadas con distintos aislados del mismo hongo, derivados de picudos del género
Sitona, se presentaron 11 perfiles electroforéticos de a-esterasa diferentes; 18
aislados de un mismo sitio geográfico fueron monomórficos en sus perfiles de
isoesterasa (Poprawski et al., 1988) .
2.3.7 Modo de infección
Los hongos entornopatógenos poseen un conjunto de mecanismos que les permite
penetrar y asimilar los materiales del hospedero, y a la vez superar los mecanismos
de resistencia. La mayoría de los metabolitos fúngicos ayudan al patógeno con
aspectos físicos de ingreso. Las enzimas degradadoras de cutícula destruyen o
modifican la integridad estructural del hospedero, inhiben sus procesos selectivos, e
interfieren con su sistema regulatorio (Hajek y St. Leger, 1994).
Los hongos penetran a través de la cutícula, la cual está compuesta principalmente
de proteínas, quitina, lípidos y compuestos fenólicos, los cuales funcionan como una
barrera contra la invasión de microorganismos y medio ambiente (Hegedus y
Khachatourians, 1995).
Cada daño, asociado con los síntomas de la enfermedad, puede ser producido por
las enzimas del patógeno y sus metabolitos de bajo peso molecular (toxinas) (Hajek
y St. Leger, 1994). Sin embargo, la producción de enzimas no es el único factor que
influye en el factor de la virulencia, o en el éxito del proceso de la penetración
(Champlin et al., 1981).
La infección inicia con esporas asexuales (conidias) depositadas sobre el
integumento externo de los insectos (Johnson y Goettel, 1993; Feng ef al., 1994).
Los insectos generalmente son infectados por B bassiana después de que la conidia
está en contacto con la cutícula del hospedero, germina y penetra el integumento. En
algunos insectos como los chapulines, la ruta precisa de invasión dentro de cuerpo
se desconoce, pero generalmente se cree que el modo principal de infección es a’
través del integumento externo (Goettel et al., 1995).
-Los propágulos germinativos de los hongos, están continuamente en movimiento a.través de diferentes partes durante la penetración cuticular, éstos responden a
cambios por estímulo de los procesos bioquímicos hasta originar una diferenciación
celular y formar estructuras morfológicas específicas (Hajek y St. Leger, 1994). Las
interacciones hidrofóbicas, la producción de mucosidad y apresorios por el hongo
influyen en la adhesión del hongo a la cutícula del insecto (Bidochka ef al., 1997),
aunque es raro que estas estructuras se produzcan en B. bassiana (Hegedus y
Khachatourians, 1995).
Los tubos germinativos constantemente detectan su medio y se adaptan para
colonizar el tejido del insecto y contrarrestar el potencial de respuestas del
hospedero, éstas estructuras infecciosas probablemente evolucionaron como un
mecanismo con el cual el patógeno supera las barreras del hospedero (Hajek y St.
Leger, 1994).
Durante la infección, la epicutícuta es la primer barrera en cruzar (St. Leger et al.,
1988); la penetración de la ésta puede realizarse por infección a través de ganchos
producidos por apresorios (St. Leger et al., 1989a; Hajek y St. Leger, 1994), o por la
entrada directa de los tubos germinativos, las hifas y placas penetran en la
procutícula (St. Leger, 1993).
Una vez que la epicutícula es perforada, el inicio de la penetración a través de la
cutícula puede ser vía directa por hifas o estructuras que se pueden extender
lateralmente, esta expansión lateral puede causar fracturas que favorecen el proceso
y facilitan la dispersión de las enzimas fúngicas degradadoras de la cutícula (Hajek y
St. Leger, 1994).
Al invadir el hemocele, el hongo prolifera, y el micelio de los tubos germinativos libera
blastosporas (Feng et al., 1994; Hegedus y Khachatourians, 1995). Las blastosporas
se desarrollan para su dispersión a través del hemocele (St. Leger, 1993). Estas
usualmente germinan a las 48 h después de la infección, comparado con 3 o 4
semanas de las conidiosporas (Todorova et al., 1994). El hongo prolifera dentro del
cuerpo del hospedero, frecuentemente como un estado de vida que no sobrevive
naturalmente fuera del hospedero (Hajek y St. Leger, 1994).
El insecto infectado muere debido a la reducción drástica de su hemolinfa, nutrientes
y la toxemia causada por los metabolitos tóxicos del hongo (Feng ef al., 1994), o bien,
por la combinación de éstos con el daño mecánico producido por el crecimiento del
hongo (Hajek y St. Leger, 1994; Pedigo, 1998; Bidochka et al., 1997). En ocasiones el
cuerpo graso puede ser infectado inmediatamente después de la penetración a la
cutícula, mientras que otros tejidos y órganos permanecen intactos por más de una
semana, o son coionizados hasta después de la muerte (Hegedus y Khachatourians,
1995).
Bajo condiciones húmedas, uno o dos días después de que el hospedero muere, el
hongo emerge y produce una capa de conidias en la superficie del cadáver
(Steinkraus et al., 1991; Feng et al., 1994; Goettel et al., 1995).
La importancia de estos mecanismos varía con el aislado específico del hongo o el
hospedero (Hajek y St. Leger, 1994). La habilidad de la conidia de B. bassiana para
germinar rápida y sincronizadamente se considera un aspecto importante en el
proceso de infección (Inglis et al., 1997b).
2.3.7.1 Función de las enzimas durante la infección
El éxito en la penetración de la cutícula de los insectos por B. bassiana depende
principalmente de varias enzimas hidrolíticas que degradan las proteínas, quitinas y
lípidos en el integumento del insecto y proporcionan nutrientes para el hongo (Feng
et al., 1994; Hegedus y Khachatourians, 1995).
Los niveles de enzimas específicas que degradan la cutícula como la lipasa,
quitinasa, proteasa, quimoelastasa, y quimotripcina tienen relación con los
parámetros de virulencia específica (Gupta ef al., 1994). Indudablemente, muchas
enzimas patogénicas son importantes al determinar la virulencia debido a que
permiten al patógeno coexistir con el proceso de cambios metabólicos asociados con
el estado de la enfermedad del hospedero (Hajek y St. Leger, 1994).
La variación en la virulencia de 8. bassíana se puede relacionar con la producción y
actividad enzimática durante la penetración en la cutícula del hospedero (Bidochka y
Khachatourians, 1990). Sin embargo, las enzimas no son el único factor que influye
en el fenómeno de la virulencia, o en el éxito del proceso de la infección (Champlin
ef al., 1981). Otros factores pueden ser el éxito de la adhesión de la conidià a la
cutícula, presencia de ácidos grasos en la superficie de la cutícula, crecimíéto
fúngico antes de la penetración, y la producción y regulación de otras toxinas
(Bidochka y Khachatourians, 1990).
La mezcla de quitinasa, lipasa y proteasa, en B bassiana actúa como una unidad, y
aparentemente tiene una acción común que permite al hongo penetrar, con ayuda de
la secreción enzimática de las hifas a través del integumento del insecto
(Samsináková et al., 1971). Las lipasas y proteasas actúan antes que las quitinasas,
la producción secuencial de estas enzimas se puede interpretar con respecto a la
estructura física de la cutícula del insecto, las fibras de quitina son rodeadas por una
capa de proteína; por consiguiente, la quitina no puede ser degradada hasta que las
proteínas son removidas (Fig. 1) (Bidochka et al., 1997; Leathers y Gupta, 1993).
Estas enzimas son sintetizadas en una manera coordinada con relación a la
estructura cuticular, y son inducidas in vitro cuando son cultivadas sobre cutícula de
insecto; la significancia de alguna de las enzimãs depende de las características
cuticulares, y estado fisiológico del insecto, así como de los mecanismos de invasión
por el hongo (Hegedus y Khachatourians, 1995).
Los lípidos de la epicutícula son la primer barrera en cruzar, por lo que las lipasas son
importantes en el proceso de la infección; la composición de estos lípidos incluye
aproximadamente 65% de alkanos, 25% de ésteres cerosos secundarios, triglicéridos,
alcoholes, y ácidos grasos; además de lípidos, la apicutícula contiene aminoácidos, y
aminoazucares que funcionan como nutrientes para la germinación del hongo
(Bidochka et al., 1997). Los hidrocarburos son los lípidos más comunes y abundantes
en la cutícula de los insectos, en Schisfocerca gregaria constituyen el 76% del total de
lípidos extraídos de la cutícula, los lípidos son usualmente mezclas de n-alcanos
(principalmente C12 - C33) y alcanos ramificados metilados (St. Leger et aI., 1988).
La incapacidad para utilizar los lípidos que predominan sobre la superficie de la
cutícula puede reducir la virulencia de algunos hongos; éstos lípidos son
suficientemente heterogéneos y contribuyen en la especificidad de la relación
patógeno-hospedero (St Leger, 1993; Kosir et al., 1991). La importancia de las lipasas
depende principalmente del sistema de especificidad patógeno-hospedero
(Hegedus y Khachatourians, 1995). Los hongos entornopatógenos f3. bassiana y M.
anisopliae poseen lipasas y otras esterasas que son capaces de hidrolizar los lípidos
cuticulares de los insectos (Bidochka et al., 1997).
Los estudios preliminares indican que existen dos posibles funciones de los lípidos
cuticulares de los insectos en la actividad de los hongos entornopatógenos; algunos
de ellos podrían ser usados como recursos pobremente accesibles de energía para
la germinación de la espora. Otros.podrían tener una actividad antifúngica específica
probablemente expresada en el crecimiento hifal, polaridad, insaturación, o
ramificación como longitud de cadenas de los lípidos cuticulares probablemente
involucrados en cada proceso. Es necesario realizar investigaciones sobre la posible
correlación entre cepas infectivas y los lípidos cuticulares de los hospederos
(Lecuona et al., 1997).
La producción constitutiva de niveles de lipasa es evidente cuando 6. bassiana es
propagado en un medio complejo, y la adición de triglicéridos, como el aceite de
oliva, inducen en gran cantidad a la actividad de las lipasas sin alterar las
características de crecimiento del hongo. Además ciertos ácidos grasos presentes en
la cutícula de los insectos, inhiben el crecimiento fúngico y la germinación de la
espora (Hegedus y Khachatourians, 1995).
Las lipasas han ganado atención especial por su uso potencial en la biotecnología
debido a su disponibilidad y estabilidad (Essamri et al., 1998). La producción de
lipasa por un hongo entornopatógeno contribuye significativamente en la penetración
y provisión de nutrientes. In vivo, la lipasa actúa antes que la quitinasa sobre los
lípidos, y como en el caso de las proteínas, pueden situarse como una capa
protectora de la quitina. Sólo a través de la acción coordinada y combinada de las
tres principales enzimas hidrolíticas, (proteasa, quitinasa y lipasa) ocurre la
desintegración completa de la cutícula (Hegedus y Khachatourians, 1995).
Una vez que la superficie Iípida de la epicutícula es degradada por las lipasas, el
hongo produce grandes cantidades de proteasas (Prl), para degradar el material
proteínico de la procutícula que se encuentra adherido como una cubierta de la
quitina. Una vez liberadas las fibras de quitina, las proteínas solubilizadas son
degradadas por aminopeptidasas y exopeptidasas, para ser convertidas en
aminoácidos útiles como nutrientes para el hongo (Bidochka ef al., 1997)
La degradación de la cubierta de proteína permite accesar a las enzimas quitinolíticas
hacia las fibras de quitina para degradarlas, lo cual induce a la producción de más
quitina (GlcNAc), y esta a su vez a la síntesis de más’ quitinasa, reduciendo la
actividad de las proteasas (Hegedus y Khachatourians, 1995; Bidochka et al., 1997).
Las quitinasas extracelulares o N-acetilglocusamidasas (NAGasa) son producidas por
B. bassiana y M. Anisopliae después que las proteasas; esta secuencia se debe a la
estructura física de la cutícula del insecto. Las fibras de quitina se encuentran
cubiertas por una capa de proteína, la cual debe ser degrada para poder activar a las
quitinasas e hidrolizar la quitina (Bidochka et al., 1997); sin embargo, la degradación
parcial de lípidos es suficiente para abrirle el camino a las quitinasas (Samsináková et
al., 1971).
Las proteasas extracelulares producidas por B. bassiana solubilizan las proteínas
cuticulares, las cuales ayudan en la penetración y proporcionan nutrientes para una
mayor proliferación del hongo dentro del insecto (Bidochka et al., 1997). Durante los
primeros estados de infección, la proteasa Pr1 de B. bassiana se localiza próxima a la
hifa, pero es indispensable la separación mecánica de las proteínas, en los últimos
estados, Pr1 se distribtiye en toda la región de invasión (Hegedus y Khachatourians,
1995). La Fig. 1 muestra la representación de la interacción entre las enzimas
extracelulares y la degradación de la cutícula.
Fig. 1. Estrategia de los hongos entornopatógenos para la penetración a través de la cutícula de los
insectos.
Se ha identificado una variedad amplia de proteasas extracelulares en hongos
entornopatógenos; en B bassiana, estas enzimas muestran mayor preferencia por
las proteínas ácidas que básicas (Hegedus y Khachatourians, 1994).
Varias cepas de B. bassiana y algunas de B. brongniartii producen una proteasa
inmunológicamente idéntica, y la proteasa básica de B. bassiana inmunológicamente
difiere de las proteasas de P. fumosoroseus y M. Anisopliae; las proteasas básicas
de B bassiana, P. fumosoroseus, y M. anisopliae contienen antígenos comunes
(Shimizu et al., 1993).
La proteasa degradadora de cutícula con una quimoelastasa específica, es la
proteina principal en la generación de estructuras infecciosas de M. anisopliae in situ
durante la penetración de la cutícula del hospedero. La producción de quimoelastasa
por las estructuras infecciosas se favorece por los niveles de nutrientes insuficientes
por las estructuras infecciosas se favorece por los niveles de nutrientes insuficientes
para reducir la represión catabólica. Así, el proceso patogénico involucra la relación
morfogénesis - infección, y la producción de enzimas ocurre sólo cuando es necesario
para establecer una relación nutricional del patógeno con el hospedero (St. Leger et
al., 1989b).
Una cepa de 5. bassiana que sobre produce proteasa tendrá un valor más bajo de
TL50 (Tiempo Letal medio); en este caso, otros factores de virulencia pueden limitar el
curso de la patogénesis y por consiguiente cambiar el TL50 (Bidochka y
Khachatourians, 1990).
Se ha encontrado una relación entre la producción de amilasa y la virulencia, donde
niveles elevados de amilasa se asocian con una hipervirulencia en M. anisopliae, y
los aislados con deficiencia de esta enzima, no presentan virulencia (Hegedus y
Khachatourians, 1995).
Se ha identificado una amplia variedad de enzimas catabólicas en hongos
en!omopatógenos; alcalino fosfatasa, esterasa C4, esterasa/lipasa C8, lipasa C14,
leucina aminopeptidasa, valina aminopeptidasa, cisteina aminopeptidasa, tripsina,
quimotripcina, ácido fosfatasa, fosfohidrolasa, a-galactosidasa, P--galatosidasa,
fi-glucuronidasa, a-glucosidasa, B--glucosidasa, @-glucosaminidasa, a-mannosidasa
y a-fucosidasa, y P-galactosidasa. No se ha desarbierto la contribución de estas
enzimas en los procesos de infección (Hegedus y Khachatourians, 1995).
2.4 Mecanismos de defensa de los insectos
Los insectos manifiestan respuestas inmunes tanto humorales como celulares que
son efectivas contra varios patógenos y parásitos, incluyendo hongos, protozoarios,
bacterias, nematodos e himenópteros parasitoides (Washburn ef al., 1996). El
mecanismo principal de defensa contra la invasión de microorganismos es la barrera
que proporciona la cutícula (Hegedus y Khachatourians, 1995), así como la membrana
peritrófica que rodea el bolo alimenticio y protege el epitelio del intestino medio (Dunn,
1986). Poco se conoce sobre como un insecto reconoce al hongo como algo extraño, e
inicia sus respuestas de inmunidad (Hajek y St. Leger, 1994).
La epicutícula presenta múltiples capas, y cada una tiene sus propiedades; la capa
superior se caracteriza en la mayoria de los insectos por ser mecánicamente frágil,
resistente a la degradación enzimática e impermeable. La composición de la epicutícula
interior consiste de quitina protegida con una capa proteica; ésta composición implica
resistencia, pero las enzimas producidas por los hongos entomopatógenos ‘pueden
superar este obstáculo (Hajek y St. Leger, 1994).
Una infección puede ser abortada en la epicutícula si un factor esencial de la fase de
adhesión, desarrollo microbiano, o patogénesis está ausente. Específicamente, la
infección puede ser inhibida por la falta de humedad, inhabilidad para utilizar los
nutrientes disponibles en la superficie de la cutícula, o ausencia de los factores
necesarios para el reconocimiento de un hospedero susceptible o sitio penetrable para
la infección (Hajek y St. Leger, 1994).
Para algunos sistemas, los fracasos de los hongos en invadir la cutícula del insecto, se
atribuyen a la presencia de compuestos inhibidores (fenoles, quinones, y lípidos) en la
superficie cuticular (Hajek y St. Leger, 1994). En el estudio realizado por Samsináková
ef al. (1971), encontraron que el contenido de lípidos de la cutícula de larvas de Galleria
mellonella es de 18.5% de peso seco en promedio. 24% de carbohidratos, quitina
16.6% de peso seco, el contenido de nitrógeno total fue de 2.46%, considerando el
nitrógeno contenido en la quitina; el total de nitrógeno que contiene un 15.1% de
proteínas.
Los triacigliceroles, esteroides, y fosfolípidos han sido encontrados en pequeñas
cantidades en la cutícula. Sin embargo, sólo evidencias circunstanciales indican que
algunos de estos compuestos pueden estar involucrados en la resistencia a la
enfermedad (St. Leger et al., 1988).
El proceso de la muda puede emplazar la infección de los insectos hasta que el
hongo finalmente invade el organismo y causa la muerte; la infección se desarrolla
rápidamente en algunas larvas de L. decemlineata que mueren antes de mudar (Vey
y Fargues, 1977).
La respuesta inicial de la hemolinfa de los insectos a partículas extrañas se origina
por la circulación de los hemocitos; éstos son extremadamente eficientes removiendo
las partículas extrañas como bacterias, hongos, nematodos, y huevecillos de
parasitoides; también por fagocitosis, formación de nódulos, o encapsulación
(Hegedus y Khachatourians, 1995).
La reacción principal en los mecanismos de defensa celular antifúngica es la
encapsulación del hongo, el cual es rápidamente melar-izado. Durante la
encapsulación, los granulocìtos son atraídos hacia el hongo y pueden cubrirlo
totalmente (fagocitosis), entonces los plasmatocitos son aislados y forman un
pseudotejido en capas concéntricas que forman un nódulo en el cual el hongo puede
ser descompuesto (Hajek y St. Leger, 1994).
En el caso de cepas hipervirulentas de una especie de hongo, los hospederos son
incapaces de formar granulomas típicos o superar la encapsulación y el crecimiento
fúngico continúa (Hajek y St. Leger, 1994). B. bassiana es capaz de suprimir la
habilidad de extensión de los hemocitos en larvas de Spodoptera exigua; las
blastosporas fagocitadas de B bassiana producen tubos germinativos que crecen
fuera de los granulocitos y las hifal circularon libremente (Hung ef al., 1993).
III. MATERIALES Y METODOS
3.1 Localización del experimento
El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Biología Celular, del Centro
Regional de Estudios Nucleares, y en el Laboratorio de Entomología y Control
Biológico, de la Facultad de Agronomía, de la Universidad Autónoma de Zacatecas,
durante el período de agosto de 1998 a julio de 1999.
3.2 Origen de los aislados en estudio
Los aislados de B bassiana utilizados fueron originalmente extraídos de insectos del
orden Coleoptera, BbD2, BbCOl y BbCR, fueron proporcionados por el Centro
Nacional de Referencia de Control Biológico de la SAGAR, mismos que se
encuentran en la colección de hongos entornopatógenos de dicho Centro, que se
ubica en el municipio de Tecomán, Colima. El aislado BbZl fue obtenido por la
autora de este trabajo en el campo agrícola de la Facultad de Agronomía de la
Universidad Autónoma de Zacatecas y un quinto aislado de la especie Nomuraea
fireyi (Farlow) Samson, fue proporcionado por el Dr. Roberto Lezama Gutiérrez, de la
Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de Colima, fue
utilizado como testigo por ser especie diferente de B. bassiana, y su inocuidad a
coleópteros (Ignoffo, 1981), para la caracterización de los aislados, a través de la
expresión de las isoesterasas. Estos hongos tienen su origen en diferentes sitios
geográficos de la República Mexicana (Cuadro 1).
Cuadro 1. Aislados de Beauveria bassiana y N. rileyi, utilizados en este estudio.
Aislado Hospedero de origen Cultivo Origen
geográfico
BbD2 Diabrotica sp. (Coleoptera: Chrysomelidae) Maíz Ocotlán, Jal.
BbCOl Hypofhenemus hampei (Ferrari) Café Oaxaca
(Coleoptera: Scolytiadae)
BbCR (Coleoptera: Chrysomelidae) Maíz desconocido
BbZl (Coleoptera: Curculionidae) Frijol Zacatecas, 1998
N. rileyi L9 Spodopfera frugiperda (J. E. Smith) Maíz Colima, 1998
(Lepidoptera: Noctuidae)
3.3 Producción de inóculo
Los aislados de B. bassiana se cultivaron en un medio estéril a base dé Sabouraud
dextrosa agar + 0 . 2 % de extracto de levadura, en cajas petri, e incubados por 7 días,
a 25° C. Las conidias se colectaron en 20 ml de agua destilada estéril con Tween 20
al 0.05%. La suspensión conidial se pasó, a través de un filtro No.4, con una medida
de poro de 5-15 Mm (Millipore Corp.), y la concentración se determinó en una cámara
nomatìmétrica de Neubauer (Rombach, 1989). La suspensión de conidias se ajustó a
1 x l07 conidias/ml, con esta concentración se llevaron a cabo los bioensayos de
virulencia y determinación de los valores de TL50 Varela y Morales, 1998).
Por otro lado, se ílevó a cabo la producción de micelio de cada uno de los hongos
para extraer las proteínas, evaluar la actividad de las lipasas y caracterizar los
aislados con base en perfiles de isoesterasas. Para lo anterior, se utilizó el medio
líquido Sabouraud dextrosa + 0.2% de extracto de levadura. A matraces de 250 ml se
les adicionó 150 ml de medio, mismos que se esterilizaron a 120 libras de presión
durante 20 minutos y se inocularon con 20 u1 de la suspensión conidial, preparada
con anterioridad, se incubaron a 25°C, en un agitador rotatorio a 150 rpm, durante
siete días,
Posteriormente, el micelio fue separado del caldo de cultivo, lavado y centrifugado,
con agua destilada estéril, una parte de él fue secado en una liofilizadora a -5O°C y
se conservó a -2O°C; mientras que la otra parte de micelio fue utilizado
inmediatamente, para evaluar la actividad de las lipasas (Sosa et al., 1994).
3.4 Cría de E. varivestis bajo condiciones de laboratorio
La cría de E. varivestis fue realizada mediante una modificación de la técnica de
Todorova et al. (1994). Los adultos fueron colectados en campo, de parcelas con
frijol, establecido bajo condiciones de riego en la Facultad de Agronomía de la
Universidad Autónoma de Zacatecas. Tres grupos de 20 insectos fueron colocados
en frascos de vidrio de 2,500 ml de capacidad, a los cuales diariamente se les colocó
hojas de frijol frescas como alimento para los insectos; las hojas además de
funcionar como alimento, lo hicieron como sustrato de ovìposición.
Los huevos fueron colectados de las hojas y colocados dentro de una caja petri, con
algodón húmedo al centro, para evitar la deshidratación. Una vez eclosionadas, las
larvas se colectaron de las cajas petri y se colocaron en frascos estériles con
alimento fresco; estas larvas se utilizaron para mantener la colonia y para los
experimentos de virulencia de los aislados. Las larvas que se utilizaron para los
bioensayos fueron de 48 horas después de haber eclosionado para larvas de primer
estadio, o de haber mudado para larvas de segundo, tercer y cuarto estadio. El
insectario se mantuvo bajo condiciones de laboratorio a una temperatura de 23 + 1°C
y 70 % de humedad relativa, con un fotoperiodo de 16:8 horas luz: oscuridad.
Del mismo modo, para disponer de hojas de frijol frescas y en cantidades suficientes
para mantener la colonia durante los experimentos, desde un mes anterior al
establecimiento del insectario se sembró frijol de la variedad Flor de Mayo por SU
mayor
disponibilidad y aceptación por el insecto, en macetas de plástico de 2 litros de
capacidad, con suelo arcillo-arenoso.
3.5 Evaluación de la virulencia de aislados de B. bassiana sobre larvas y
adultos de E. varivestis
Para evaluar la virulencia y cuantificar los TL50 de los cuatro aislados de B bassiana
sobre E. varivestis, se realizaron bioensayos de virulencia en larvas de primero,
segundo, tercero y cuarto estadio, y en adultos.
Para lo anterior, se inocularon hojas de frijol frescas con una suspensión de conidias
a la concentración de 1 X I0 7 conidias por mililitro de tween 20 al 0.05%, por
inmersión durante 30 segundos. Posteriormente, a las hojas se les eliminó el exceso
de agua, dejándola durante 5 minutos en ventilación en una campana de flujo
laminar; une vez ventiladas, se depositaron en forma individual, en frascos de vidrio
de 150 ml de capacidad, estériles. A la hoja de frijol se le colocó en la base algodón
húmedo y un papel filtro húmedo (Whatman No. 3) en el fondo del frasco, para
mantener condiciones de alta humedad. Como testigo, se utilizaron hojas frescas de
frijol, inmersas en tween 20 al 0.05% estéril (Varela y Morales, 1996).
A cada uno de los frascos con la hoja de frijol inoculada, se les colocó una larva o
adulto, los frascos se taparon con tela de algodón y se incubaron a 25°C, con un
fotoperiodo de l0:14 h durante 20 dias. Los frascos fueron revisados cada 24 h, para
proporcionar alimento, humedecer el papel filtro y el algodón, asi como para registrar
el número de larvas muertas en cada tratamiento. Para corroborar la muerte de los
insectos a causa del hongo, éstos fueron colocados en cámaras húmedas para
propiciar el desarrollo y esporulación del hongo aplicado.
Terminado el experimento el número de larvas muertas cada 24 h, en cada
tratamiento, fue sometido a análisis Probit, mediante la correlación entre el logaritmo
del tiempo de la muerte de los insectos y el Probit de la mortalidad, para determinar
el TL=50 de los aislados que causaron una mortalidad superior a 50% en cada uno de
los estadios larvales y/o adulto (Finney, 1971). Del mismo modo, con los porcentajes
de mortalidad obtenidos en cada uno de los tratamientos se realizó un análisis de
varianza y prueba de medias de Tukey (P<O.05) en el paquete estadístico SAS
(1988), previa transformación angular de los porcentajes (Studdert y Kaya, 1990;
Varela y Morales, 1996), considerando dos factores de estudio, con distribución
completamente al azar de los tratamientos con cuatro repeticiones, donde el factor
“A” fueron los aislados del hongo más el testigo y el factor “B” los estadios larvales y
adulto del insecto.
3.6 Evaluación de la actividad enzimática de las lipasas de aislados de B.
bassiana
Para evaluar la actividad de las lipasas se utilizó la técnica de Hankin y
Anagnostakis (1975). Se empleó el medio de cultivo formado a base de Peptona
Difco (10 g), Cloruro de Sodio (5 g), Cloruro de calcio-2H20 (0.1 g), agar (20 g) y
Tween 20. La mezcla se ajustó a pH de 6.0, utilizando HCL 0.5 M y se esterilizó
durante 20 minutos a 15 libras; una vez estéril se colocó en cajas de petri estériles.
El Tween fue esterilizado por separado, durante 20 minutos a 15 libras de presión y
se adicionó 1 ml , por cada 100 ml de medio de cultivo estéril frío.
El micelio lavado fue tratado en buffer Tris 0.1 M, pH 6.0 (Varela y Morales, 1996),
se tomaron 10 ul de extracto y micelio y se inoculó en cada caja petri, con el medio
de cultivo descrito antes, colocado en el centro de la caja. Posteriormente, cada caja
se selló con cinta testigo y se incubaron a 26° C por 6 días (Rajami y Hilda, 1987). A
partir del sexto día, cada caja se examinó para medir, con un vernier, el diámetro de
la colonia, así como, el diámetro del halo característico de la actividad enzimática en
mm.
La producción de las enzimas se expresó con la proporción del diámetro de la
colonia y el diámetro del halo (Rajami y Hilda, 1987) y para calcular la actividad
enzimática, a los datos de diámetro de halo se les restó los de diámetro de colonia.
(Sosa ef al., 1994). Los resultados de la actividad enzimática fueron sometidos a
análisis de varianza y prueba de medias de Tukey (P<O.05); y la correlación entre la
actividad enzimática de las lipasas y la virulencia fueron desarrollados en el paquete
estadístico SAS (SAS, 1988).
3.7 Caracterización de aislados B. bassiana con base en los perfiles de
isoesterasas
A los aislados de B. bassiana se les extrajo la proteína total pasando 1 g de micelio
en un mortero de porcelana a O° C, donde se adicionó 1 ml de buffer Tris-HCI 0.04 M
(pH 6.8). Una vez molidas las preparaciones miceliales, éstas fueron centrifugadas a
16,000 g por 30 min a 4° C, el sobrenadante fue extraído y liofilizado para concentrar
la proteína, finalmente el extracto fue puesto en tubos eppendorf de 1.5 ml y
congelado a -20° C hasta ser utilizados (Sosa et al., 1994).
Para determinar la concentración de proteína de las muestras de cada extracto, se
utilizó el ensayo de Bradford (1976). Una vez preparadas las muestras de proteína
de los aislados, así como los estardares de albúmina de suero de bovino con el
método de Bradford, se midió la absorvancia a 595 nm en un espectrofotómetro en
cubetas de 3 ml contra un reactivo blanco. Los datos obtenidos de la proteína fueron
analizados contra los datos correspondientes a la curva estándar obtenida por las
muestras de albúmina calculada con regresión lineal en el programa de cómputo
Instat versión 3.5.
Para caracterizar los aislados de B. bassíana con base en puntos isoeléctricos y
peso molecular de esterasas, se utilizaron las técnicas de Enfoque Isoeléctrico de
O’Farrel (1975), y PAGE - gradiente (520%) en condiciones nativas preparado de
acuerdo a Varela y Morales (1996).
Se prepararon las muestras para las corridas con 1 OO ug de proteína y 10 ul de
buffer de muestra para enfoque isoeléctrico y 50 ug de proteína y 10 ul de buffer de
muestra para el gel de PAGE - gradiente.
3.7.1 Enfoque isoeletrico
Las isoenzimas a y B esterasas fueron separadas por enfoque isoeléctrico usando
Anfolinas pH 3.5 a 10 y 4 a 7 (Pharmacia Biotech). La corrida se realizó en una
cámara vertical grande, el contenido del gel fue de 10 ml de acrilamida al 40%, bis
5%; 10 ml de NP40 al 10%; 20 ml de agua destilada; 3 ml de anfolinas pH 4 - 7; 2 ml
de anfolìnas pH 3.5 - 10; 45 u l de temed, y 70 ~1 de PSA al 10%.
El buffer del ánodo fue preparado en medio litro de agua desionízada degasificada y
ácido fosfórico 10 mM; mientras que el buffer del cátodo se preparó con NaOH 20
mM en la misma cantidad de agua con similares características.
Se realizó una precorrida con 20 ul de buffer de overlay (urea 9M y amfolitos 2%) en
cada pozo, a 200, 300 y 400 V durante 15 minutos cada voltaje, a temperatura
ambiente para formar el gradiente. Posteriormente se retiraron los buffers de corrida
y el overlay para colocar las muestras de proteína de los aislado, las muestras se
colocaron por duplicado, la corrida se llevó a cabo a 400 V a 4” C durante 12 horas,
al finalizar se le dio una corrida final de 60 minutos a 800 V.
Al finalizar la corrida se verificó la formación del gradiente, para lo cual, se cortó el
carril inicial y final del gel, es decir, donde no se colocó muestra, posteriormente
estos fueron cortados en pequeños trozos de 0.5 cm cada uno y colocados en 2 ml
de agua destilada en tubos de ensayo ordenados en forma descendiente, después
de 24 horas se midió el pH del agua de cada uno.
3.7.2 PAGE - gradiente
El gel (520% de acrilamida) en condiciones nativas se preparó en un formador de
gradiente, y la corrida en una minicámara de electroforesis, ambos de Bio-Rad. El
contenido del gel fue de acrilamida-bisacrilamida, tris-HCL 1.5 M, pH 8.8, ,agua
destilada, sacarosa, persulfato de amonio 10% y TEMED. Las concentraciones
usadas fueron las indicadas por Varela y Morales (1996).
Se prepararon dos geles en las mismas condiciones, se les colocaron las muestras
de proteína de los cinco aislados de hongos entornopatógenos en cada uno, la
corrida se desarrolló a 4°C durante 12 horas a 120 V. Al finalizar la corrida, se
retiraron los geles para ser teñidos y secados.
3.7.3 Tinción de los geles
El gel de enfoque isoeléctrico se dividió en dos de la par-te media, para obtener dos
geles con las mismas características de cada uno de los aislados, uno para teñir el
total de proteína con azul de comassie y otra para teñir las bandas de los enzimas
a y B-esterasas. Del mismo modo los geles de PAGE - gradiente, uno fue teñido con
azul de comassie, mientras que el otro fue utilizado para observar la expresión de las
a y p-esterasas.
La solución teñidora de esterasas de Shaw y Prassad (1970) fue preparada de la
manera siguiente: 100 mg de Fast blue salt RR (sal azul base RR); 10 ml de Tris-HCI
0.5 M, pH 7.1; 3 ml de substrato a y B - naftil acetato y 87 ml de agua desionizada.
La solución teñidora se filtró en papel filtro Whatman No.1, los geles fueron inmersos
en la preparación a 37° C, por una hora para propiciar la reacción de las enzimas en
la presencia del sustrato, posteriormente se lavaron con agua destilada y se fijaron
en ácido acético al 7%.
La solución teñidora para el total de proteína se preparó con 1.25 g de azul de
comassie; 200 ml de agua desionizada; 250 ml de metanol y 50 ml de ácido acético.
Los geles fueron incubados en el buffer a temperatura ambiente durante 1 hora,
luego lavados y fijados en solución desteñidora, se agitaron lentamente hasta
observar una formación clara de bandas azules.
3.7.4 Secado de los geles
Con el fin de secar los geles, se colocaron entre una membrana de papel celofán y
papel filtro Whatman No.3, para posteriormente deshidratarlos en un secador de
geles Bio-Rad a una temperatura de 70° C durante 1.3 horas.
3.7.5 Análisis de los geles
La similitud entre aislados por los perfiles de isoesterasas se estimó con el índice propuestopor Jaccard, el cual consiste en la fórmula siguiente: S = A/(A + B + C)
Donde A son las bandas presentes en ambos aislados, que son comparados, B son
las bandas presentes sólo en el primer aislado y C, las bandas presentes sólo en el
segundo aislado (Skovgaard y Rosendahl, 1998).
IV. RESULTADOS
4.1 Evaluación de la virulencia de aislados de 8. bassiana sobre E. varivestis.
Con la finalidad de evaluar la virulencia de los aislados BbD2, BbCR, BbCO1 y BbZ1
de B bassiana sobre los cuatro estadios larvales y adultos de E. vativestis, se
realizaron bioensayos de patogenicidad, y los porcentajes de mortalidad acumulada
transformados al arco seno se sometieron a un análisis de varianza (Cuadro 2).
Cuadro 2. Análisis de varianza de los factores de virulencia de los aislados de 8.
bassiana (A), y susceptibilidad de los estados biológicos de E. varivesfis (B).
Fuentes de Grados de Suma de Cuadrado Valor de F P>F
variación libertad cuadrados medio calculada
Factor A 4 22998.5781 5749.6445 37.9475 0.0001
Factor B 4 11886.5312 2971.6328 19.6127 0.0001
Interacción 16 6196.5625 387.2851 2.5561 0.004
Error 75 11363.6718 151.5156
Total 99 52445.3437
Coeficiente de variación= 33.97%.
La comparación de medias (cuadro 3) muestra que el aislado BbCOl fue
significativamente más virulento sobre E. varivestis, con una mortalidad superior al
76% transformado a 61, mientras que los otros tres aislados presentaron una
virulencia estadística similar hacia este insecto plaga. La mortalidad encontrada en el
testigo no presentó ningún signo de infección por el hongo.
Con respecto a la susceptibilidad de larvas y adultos, a la infección por el hongo, la
comparación de medias de Tukey indica que no existe diferencia significativa entre
los cuatro estadios larvales, no obstante que los dos primeros estadios presentan
medias de un 58 y 46% de mortalidad, transformados a 49 y 42 respectivamente,
mientras que el tercer y cuarto estadio presentan medias de 38 y 33
respectivamente. El adulto fue significativamente menos susceptible al
microorganismo estudiado con un 8% de mortalidad convertido a 17 (cuadro 3).
Cuadro 3. Comparación de medias de los factores de virulencia de los aislados de B.
bassiana (Factor A), y susceptibilidad de los estadios biológicos de E.
varivestis (Factor 6).
Aislados (A) media ’ estadios de media *
E. vativestis (B)
BbCOl 6 1 . 2 2 8 5 a estadio 1 49.4195 a
BbZl 4 1 . 5 7 8 0 b estadio 2 42.9070 ab
BbD2 3 2 . 4 4 0 0 b estadio 3 3 8 . 0 4 8 4 b
BbCR 3 1 . 0 6 0 5 b estadio 4 3 3 . 7 3 1 0 b
Testigo 14.8920 c adulto 17.0930 c
ã Medias de mortalidad de E. varivesfis ocasionada por la virulencia de los aislados de 6. bassiana
b Medias de susceptibilidad de estadios de E. varivestis a B bassiana
Medias seguidas por la misma literal en cada columna, son estadísticamente iguales.
Tukey (0.05). a= 10.9133
4.2 Tiempo letal medio de los aislados de B. bassiana sobre E. varivestis
La determinación de tiempo letal medio sobre larvas y adultos de E. varivestis se
realizó con los aislados que presentaron los porcentajes de mortalidad mayores al
50% (cuadro 4).
Cuadro 4. Porcentajes de mortalidad de los estadios larvales y adultos de E.
varivestis por los aislados de B. bassiana al día 20 después de la
inoculación.
Estadios BbZl Bb02 BbCOl BbCR
ler- 55* 55’ 1 00* 32.5
2do 42.5 37.5 8 5 ’ 3 5
3er 4 9 27.5 65’ 32.5
4to 45 10 67.5’ 15
Adulto 5 0 12.5 5
‘Valores utilizados para determinar el TL50
El insecto de primer estadio larval presentó mortalidad superior al 50% con los
aislados BbZl, BbD2 y BbCOl, mientras que el segundo, tercer y cuarto estadio
larval presentaron valor superior al 50% con el aislado BbCOl. El adulto no alcanzó
dicho porcentaje con ninguno de los aislados. En el cuadro 5 se presenta los TL50
obtenidos durante la investigación.
Cuadro 5. TL50*s de aislados de B bassiana sobre estadios larvales de E. varivestis.
EEtadío Aislado TL50 XL Calc. Ecuación
(días)
1 er. BbZl 20.92 1.285 y= 1.55 x -0.15
1 er. BbD2 20.02 0.838 y= 1.23 X +0.93
1 er. BbCOl 5.79 12.44 y= 2.39 X -1.6
2do BbCOl 10.59 12.10 y= 2.72 X -3.23
3er. BbCOl 19.19 10.13 y= 3 x -4.86
4to BbCOl 16.71 7.946 y= 2.56 X -3.26
X2del 5% = 11.7
En el cuadro anterior se destaca que los valores de TLs, para las larvas de primer y
segundo estadio, con el aislado BbCOl fueron de 5.79 y 10.59 días respectivamente;
las figuras 2 y 3 muestran las tendencias de la mortalidad de estos datos. Los TL50
obtenidos para ios demás estadios y aislamientos fueron superiores.
0 1 2 3 4 5 6 7 6
Timpa (días)
Fig. 2. Tendencia de la mortalidad de Iarvas de primer estadio de E. vativesfis, dada por el tiempo letal
medio obtenido con el aislado BbCO1 de 5. bassiana (5.79 días).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
liempo (días)
Fig. 3. Tendencia de la mortalidad de larvas de segundo estadio de E. varivestis, dada por el tiempo
letal medio obtenido con el aislado BbCO1 de 5. bassiana (10.59 días).
4.3 Evaluación de la actividad enzimática de las lipasas de aislados. de 8.
bassiana
Con el fin de evaluar la actividad enzímática de las lipasas de los aislados de B.
bassiana, los datos de actividad medía fueron sometidos a análisis de varíanza
(cuadro 6).
Cuadro 6. Análisis de varianza de actividad de las lipasas de los aislados de B.
bassiana.
Fuentes de Grados de Suma de Cuadrado Valor de F P>F
variación libertad cuadrados medio calculada
Aislamientos 3 328.8984 109.6328 110.7452 0.000
Error 2 8 27.7187 0.9899
Total 3 1 356.6171
Coeficiente de variación= 8 . 2 O %
La comparación de medias muestra que e! aislado BbCO1 presenta un valor
significativamente mayor de actividad de lipasas (16.75), mientras que BbCR
presenta un valor menor con respecto a los demás (7.75), asimismo se observa que
los aislados BbZ1 y BbD2 son similares en esta actividad (12.56 y 11.50
respectivamente) (Fig. 4).
Fig. 4. Actividad enzimática de lipasas (en mm de diámetro de halo) de los aislados BbCOl , BbZl,
BbD2 y BbCR de 5. bassiana. Barras con la misma letra son estadísticamente similares.
4.4 Correlación de la actividad de las lipasas de los aislados de B. bassiana
con la virulencia
Con el fin de evaluar la correlación existente entre las variables de actividad
enzimática de las lipasas y la virulencia de los aislados de 5. bassiana, los datos
respectivos (cuadro 7) se sometieron a un análisis de correlación.
Cuadro 7. Actividad lipasa (mm) y datos de virulencia de los aislados de 5. bassiana
sobre E. varivestis.
Aislado Actividad lipasa Virulencia
BbCOl 16.75 61.22
BbZl 12.56 41.57
BbD2 11.5 32.44
BbCR 7.75 31.06
El coeficiente de correlación fue de 0.92, no significativo.
En la Fig. 5 se observa como el aislado con mayor actividad lipasa presenta la mayor
virulencia (BbCOl); lo mismo ocurre con los demás aislados, hasta llegar al aislado
con menor actividad lipasa y con la menor virulencia (BbCR), No obstante que ésta
figura muestra la relación que existe entre las dos variables, en el análisis de
correlación ésta no es significativa.
1 81 6
7 0
6 0
BbCOl BbZl BbD2 BbCR
Aislados
+Activìdad lipasa +Virulencia
Fig. 5. Correlación entre actividad lipasa y virulencia de los aislados BbCOl, BbZl , BbD2 y BbCR de
6. b a s s í a n a .
4.5 Caracterización de los aislados de B. bassiana con base en los perfiles de
isoesterasas
La expresión de las bandas de isoesterasas, en geles de PAGE - gradiente y de
enfoque isoeléctrico, se observa en las Figuras 6 y 7, respectivamente. La.
disposición de las bandas en ambos geles muestra que los aislados son diferentes
entre ellos, y presentan bandas comunes.
Azul de comassie Expresión de enzimas
A B
Fig. 6. Gradiente de poliacrilamida, teñido con azul de comassie (A) y con sal azul base RR (6). Los
carriles 1, 2, 3 y 4 corresponden a los aislados BbD2, BbCR, BbCOl y BbZl respectivamente,
mientras que el 5 a N. rileyi.
En el gel (Fig. 6 B) se presentó un total de 8 bandas, donde se observan distintos
perfiles de las enzimas CC y p esterasas para cada aislado; existen dos bandas que
son comunes entre los aislados de B. bassiana (E y F), y una que se presenta en
todos los aislados (F). Los aislados BbD2 y BbCR muestran bandas exclusivas (B, C,
D G y H)
Los aislados BbCOl y BbZl son similares al presentar las mismas bandas (E y F),
sin embargo, éstas se localizan en los cuatro aislados estudiados. de B. bassiana.
Por otro lado, se observa una marcada intensidad en la banda “F” del carril 5, que
corresponde al hongo entornopatógeno N. rileyi y que se manifiesta en todos los
aislados.
En la Fig. 6 (A), que corresponde al gel teñido con azul de comassie, se aprecia el
total de proteínas presentes en cada extracto. Se observa gran número de bandas
para los aislados de B. bassiana (1, 2, 3 y 4), mientras que para N. rileyi, se observa
una banda, que coincide con la expresada por la reacción de las isoesterasas (F) en
el mismo aislado.
Con el objetivo de hacer una mejor drferenciacìón entre aislados, se desarrolló la
técnica de enfoque isoelectrico (gradiente de pH) y se caracterizó a los aislados con
base en los puntos isoeléctricos (PI) de las enzimas OL y B esterasas, asimismo se
tiñó un gel con azul de comassie (Fig. 7 A) y uno más para observar la expresión de
las enzimas por la reacción en la presencia del substrato (Fig. 7 B).
El gel de enfoque isoeléctrico muestra mayor resolución de bandas, al manifestarse
mayor cantidád de éstas en diferentes perfiles para cada aislado de B bassiana y N.
rileyi (Fig. 7).
6.87 b6.34 >6.10 >5.99 >
4.92 >4.80 >
I 1 2 3 4 5 1 1 2 3 4 5
Fig. 7. Gradiente de pH por enfoque isoelétrico, tenido con azul de comassie (A) y con sal azul RR
(B). Los caniles 1,2,3 y 4 corresponden a los aislados BbD2, BbCR, BbCO1 y BbZ1 respectivamente,
mientras que el 5 a N ríleyi.
En la Fig. 7 (B) se observa un total de 11bandas de isoesterasas expresadas con
base en su punto isoeléctrico, se presenta una banda en común para todos los
aislados (H). De la misma forma que en la Fig. 6 (B), el aislado BbCR presenta el
mayor número de bandas.
Con base en la presencia o ausencia de bandas de isoesterasas en los geles de
PAGE - gradiente y enfoque isoeléctrico de las Fig. 6(B) y 7(B), se calculó el índice
63
de Jaccard, con el fin de observar la similitud entre aislados, así como las diferencias
por la técnica empleada (cuadro 8).
Cuadro 8. Indice de Jaccard entre aislados de B. bassiana y N. rileyi en geles dePAGE _ gradiente y enfoque jsoelectrico4 . . . . -- -.- -- -- .
Aislados
B b D 2 BbCRy
BbD2 BbCOly
BbD2 BbZly
BbD2 Nr*y
BbCR B b C O ly
BbCR BbZly
BbCR N ry
B b C O l BbZly
BbCOl Nry
I BbZl y Nr
Aislado de N rileyi.
índice en PAGE - gradiente.
0.37
0.28
0.28
0.20
0.33
0.33
0.16
1.0
0.5
0.5
hdice en EIE
0.40
0.28
0.25
0.25
0.42
0.25
0.11
0.66
0.25
0.5
En el cuadro 8 se aprecian los índices de similitud que existen entre los aislados de
B bassiana y N. rileyi con base en los perfiles de isoesterasas expresados por las
técnicas de PAGE - gradiente y enfoque isoeléctrico. Según los datos de similitud, los
aislados BbCOl y BbZl son similares, ya que en la primer técnica presentan un
índice de similitud de 1.0, y en la segunda un índice de 0.66.
Por otro lado, se observa que los índices de similitud entre el aislado de N. rileyi y los
aislados BbCOl y BbZI son de 0.5 en PAGE - gradiente, sin embargo, si se
observan las Fig. 6.(B) y 7 (B), presentan bandas que son comunes entre todos los
aislados. Asimismo, se aprecia que los aislados BbCR y Nr son los más distantes en
similitud por ambas técnicas.
V. DISCUSIÓN
En la presente investigación no se observó una relación clara entre la actividad
enzimática de las lipasas de lo aislados de 8. bassiana con la virulencia sobre E.
varivestis debido a que el coeficiente de correlación no fue significativo (0.92).
Aunque, el aislado con mayor actividad de las lipasas, mayor virulencia, así como los
TL50 favorables de control los presentó el aislado BbCO1. Los aislados BbZ1 y BbD2
que fueron estadísticamente parecidos en su actividad lipolítica, presentan valores de
TL50 similares (20.92 y 20.02, respectivamente) en larvas de primer estadio.
Estos resultados coinciden con los reportados por Varela y Morales (1996), al señalar
que no existió correlación entre la virulencia y la actividad lipasa de los aislados
estudiados sobre H. hampei; no obstante que el aislado con la mayor actividad de las
lipasas fue el más virulento; asimismo Sosa et a/. (1994), reportan que en el
experimento realizado por ellos, no existió una relación clara entre actividad
enzimática y la virulencia de los aislados estudiados, aunque asumen que la alta
virulencia de un aislado fue debida a su mayor actividad Iípolítica.
Hegedus y Khachatourians (1995), y Bidochka et a/. (1997), reportan que la actividad
de las lipasas de los hongos entornopatógenos está estrechamente relacionada con
la virulencia; sin embargo, enfatizan que la importancia de estas enzimas en la
virulencia depende de muchos factores; por lo que la correlación no significativa
entre actividad lipasa y virulencia presentada en ésta investigación se debió a la
influencia de otros factores. Se reporta que varios factores intervienen en la
virulencia de los hongos entornopatógenos (Gupta ef a/., 1994; Feng et a/., 1994;
Kang et al., 1998); la producción de otras enzimas es uno de los factores principales
que participan en la regulación de la virulencia y en la especificidad al hospedero (St.
Leger, 1993; Gupta et al., 1994; Hajek y St. Leger, 1994); así, las proteasas,
quitinasas, amilasa, además de las lipasas de 5. bassiana, son un grupo de enzimas
que degradan los componentes cuticulares importantes y proporcionan nutrientes al
hongo (Bidochka y Khachatourians, 1990; Feng et al., 1994; Hegedus y
Khachatourians, 1995).
La virulencia de los hongos entornopatógenos esta influenciada por la vía de entrada
al hospedero, el modo de aplicación y el aislado utilizado (Harrison et al., 1993). No
obstante que las conidias son ingeridas por el insecto, la virulencia del hongo
dependerá de que éstas germinen y logren provocar la infección (Alle et al., 1990), o
que no germinen y sean desechadas a través de las heces (St. Leger, 1993;
Bidochka et al., 1997). Lo anterior podría parcialmente explicar los bajos valores de
virulencia de los aislados sobre el insecto en los bioensayos realizados en esta
investigación, dado que la técnica de inoculación utilizada a través del alimento
podría haber ocasionado una disminución del efecto del hongo, y los valores de TL50
obtenidos para los aislados evaluados son elevados y alcanzaron los 20 días.
Los resultados coinciden con los obtenidos por Todorova et al. (1994) al aplicar B.
bassíana en el alimento de Coleomegilla maculata Timber lake (Co leoptera :
Coccinellidae), donde dos cepas de B. bassiana no causaron mortalidad después de
la ingestión, sino hasta que se aplicó por contacto; las larvas del coccinelido fueron
susceptibles a todas las concentraciones utilizadas; una de las cepas causó
mortalidad no significativa, mientras que la más virulenta ocasionó hasta un 77.8%
de mortalidad.
La baja mortalidad en larvas y adultos de E. varivestis, ocasionada por los aislados
de B. bassiana durante la presente investigación también podría deberse al poco
contacto del insecto con las conidias en las hojas de frijol. Sin embargo, se han
obtenido resultados positivos de infección en larvas del mayate de junio Phyllophaga
sp. (Coleoptera: Scarabaeidae) al administrar conidias de B. bassiana en el alimento
(Poprawski y Yule, 1991).
Los aislados de hongos entornopatógenos con TL50 mayores a los 14 días se
consideran no patogénicos (Samuels et al., 1989), por lo que los TL50 obtenidos con
los aislados BbD2 y BbZl de B. bassiana sobre larvas de primer estadio de E.
varívestís, y BbCOl sobre larvas de tercer y cuarto estadio, mayores a los 14 días,
no son patogénicos a éste insecto plaga (20.92, 20.02, 19.19 y 16.71 días,
respectivamente), En contraste, el aislado BbCOl presenta valores de TL50
favorables para el primer y segundo estadio larval de E. vativesfis (5.79 y 10.59 días,
respectivamente).
Los porcentajes de mortalidad ocasionados en adultos de E. varivestis durante la
presente investigación fueron bajos (de 0 a 12.5% al día 20 de evaluación), por lo
que el TL50 no pudo ser calculado, al respecto, Steinkraus et al. (1991), menciona
que los adultos generalmente repelen la infección de hongos entomopatcigenos.
Resultados similares fueron reportados por Quintinela ef al. (1990), al aplicar
concentraciones diferentes de conidias de cinco aislados de 5. bassiana sobre larvas
y adultos del picudo Chalcodermus bimaculatus Fiedles (Coleoptera: Curculionidae),
donde observaron que el adulto es considerablemente menos susceptible que la
larva, al reportar un 30 % de mortalidad después de los 21 días de la aplicación.
Por otro lado, se reporta que la muda de los insectos tiene efecto sobre el desarrollo
de la infección ocasionada por los hongos entornopatógenos. Así, la enfermedad
fúngica se desarrolla más rápidamente en larvas de L. decemlineata que mudaron
recientemente y mueren, mientras que otras son capaces de mudar, evitar o alargar
el proceso de infección sin mostrar signos de daño o enfermedad, hasta que el
hongo finalmente invade el organismo y causa la muerte (Vey y Fargues, 1977).
El adulto del escarabajo Alphitobius díaperinus (Panzer) (Coleoptera: Tenebrionidae)
es menos susceptible a la infección con 5. bassiana que la larva. Algunas larvas
infectadas logran pupar y la esporulación ocurre en la pupa. Los adultos
generalmente repelen la infección, y la mortalidad no excede el 27% (Steínkraus et
al., 1991).
La ausencia de diferencia estadística significativa en susceptibilidad de los cuatro
estadios larvales es una muestra de que no todas las larvas de los primeros estadíos
son más susceptibles a la infección de 8. bassiana, lo anterior concuerda con lo
mencionado por Anderson et al. (1989) al reportar que la mortalidad de larvas
ocasionada por el hongo es extremadamente variable, por lo que no se debe
generalizar que los primeros estadios son los más susceptibles. En el caso de L.
decemlineata la mayor mortalidad se presenta en larvas de los últimos estadios, así
como en adulto (Anderson et a/. , 1988).
Por otro lado, este hongo se reporta como virulento sobre adultos de Hippociamia
convergens Guerin (James y Lighthart, 1994), escarabajo benéfico de la familia
Coccinellidae. Existe evidencia de que los aislados de B. bassiana generalmente
tienden a ser más virulentos a su hospedero original, o especies cercanamente
relacionadas; aunque, también hay excepciones, en bioensayos sobre L.
decemlineata con 50 aislados de B. bassiana colectados en diferentes países y de
diferentes insectos, se obtuvieron valores de TL50 de 2 a 10 días (Feng et al., 1994);
Varela y Morales encontraron que aislados originarios de coleópteros fueron menos
virulentos sobre H. hampei, que otros aislados.
El hospedero original no es un indicador de confianza en la probable virulencia de un
aislado específico a un hospedero (Feng y Johnson, 1990; James y Lighthait, 1994).
En la presente investigación los aislados utilizados fueron originalmente extraídos de
insectos del orden Coleoptera; pero aparentemente el origen no interfirió en los TL50
obtenidos, debido a que variaron de 5 a más de 20 días. Si se quisiera evaluar el
efecto del origen, tendrían que evaluarse aislados de diferentes orígenes e incluirse
de la familia Coccinellidae o bien de E. varivestis.
Los perfiles de isoesterasas de B. bassiana, obtenidos durante la presente
investigación, resultan diferentes para cada aislado en ambas técnicas empleadas, la
misma variabilidad entre aislados de B. bassíana fue reportada por Castrillo y Brooks
(1998), a través de enfoque isoeléctrico, y por Varela y Morales (1996) en geles de
PAGE - gradiente.
Este polimorfismo en perfiles de ìsoesterasas en aislamientos geográficos de B
bassiana se presenta como resultado del proceso evolutivo, como las mutaciones,
ciclo parasexual, procesos de selección natural relacionados a los factores bioticos y
abióticos, selección del hospedero, autolisis, y heterolisis (Poprawski et al., 1988;
Perkins, 1991),
Asimismo, éste polimorfismo es un indicador de la existencia de variabilidad genética
(Rhiba et al., 1989; Tigano-Milani et al., 1990; St. Leger el al., 1992; Rakotonirainy et
al., 1994; Varela y Morales, 1996). Además, la amplia distribución de diferentes
aislados, y el rango de hospederos favorecen la existencia de variación genética. Sin
embargo, el análisis molecular contribuiría más ampliamente en el conocimiento de la
diversidad genética en aislados de hongos hyphomycetes (Riba et al., 1989).
La variación en perfiles de isoesterasa, es usada principalmente para distinguir entre
aislados o especies de un mismo origen y aislados exóticos introducidos a un
ecosistema nuevo (Rakotonirainy et al., 1994; Castrillo y Brooks, 1998), así como
para conocer la potencial capacidad de un aislado en su adaptabilidad ecológica
(Riba et al., 1986).
En la presente investigación el aislado más virulento BbCOl presentó el menor
número de bandas (2), y por expresión de ísoesterasas es similar a BbZl en un
índice de 0.66 por EIE, y en 1.0 por PAGE - gradiente, mientras que se diferencian
claramente por actividad lipolítica y virulencia. El aislado BbCR con la mayor cantidad
de bandas (7), presenta igual virulencia que los aislados BbD2 y BbZl, sin embargo
presenta menor actividad lipolítica que los demás aislados, y con índices de similitud
muy bajos por EIE (0.40, 0.25, y 0.42 con los aislados BbD2, BbZl y BbCOl
respectivamente).
En el gel de PAGE - gradiente (Fig. 5B), todos los aislados presentan una banda en
común (F), asimismo una banda exclusiva de los aislados de 8. bassiana (E). Lo
mismo ocurre en la caracterización de enfoque isoel&trico (gradiente de pH) (Fig.
6B), al presentarse una banda en común para todos los aislados (H). En este tipo de
gel se observa una mejor separación de bandas que en el anterior (Riba et al., 1986;
Castrillo y Brooks, 1998).
El uso de un sólo tipo de enzima puede ocasionar una caracterización deficiente
debido a la similitud entre los perfiles electroforéticos, por lo que este riesgo puede
ser disminuido si se utilizan varios sistemas enzimáticos (Varela y Morales, 1996;
Sosa et al., 1994). Por otro lado, resulta difícil hacer comparaciones entre los
estudios debido a la naturaleza de cada investigación y los procedimientos
empleados, así como los diferentes tipos de isoenzimas, pero una conclusión común
entre ellos es la presencia del polimorfismo (Castrillo y Brooks, 1998).
VI. CONCLUSIÓN
Se demostró que B bassiana es virulento sobre E. vativestis.
El aislado BbCOl de 8. bassiana tiene potencial como agente de control biológico de
E. varivestis, ya que presentó un TL50 de 5.79 y 10.59 días en larvas de primer y
segundo estadio respectivamente.
No se presentó una evidencia clara de que la actividad enzimática de las lipasas de
B bassiana está relacionada con la virulencia sobre E. varivestis.
Del mismo modo, se pudo constatar que los perfiles de isoesterasas varían entre
aislados, de acuerdo a la metodología usada.
Se recomienda continuar con la evaluación y caracterización de aislados y especies
de Beauvetia, con el fin de encontrar hongos capaces de ser utilizados como agentes
de control biológico de E. varivestis.
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Stuttgart. pp. 217 - 231.
DR. JAIME MOLINA OCHOACOORD. DE POSGRADO EN BIOTECNOLOGIAPRESENTE:
Por medio de la presente me permito informar a usted que la tesis titulada “CARACTERIZACIÓNDE AISLADOS DE Beauveria bassiana (Deuteromycotina: Hyphomycetes) Y SU VIRULENCIASOBRE SOBRE Epilachna varivestis (Coleoptera: Coccinelhdae)“, realizada por la C. MarthaPatricia España Luna, estudiante de la Maestría en Ciencias, área Biotecnología, reune losrequisitos de forma y contenido, para que se le autorice la impresión de la misma. Por lo anterior, elDr. Sergio Hugo Sánchez Rodríguez y un servidor (ASESORES DE LA TESIS) autorizamos a laestudiante, para que haga llegar a usted el documento, con el fin de que sea revisado por el H.cuerpo académico que el Consejo Técnico del Posgrado designe.
Sin más por el momento, aprovecho la oportunidad para saludarlo.
ATENTAMENTETecomán, Col. a ll de mayo de 2000
ccp. Archivo.
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE ZACATECASCENTRO REGIONAL DE ESTUDIOS NUCLEARES
Dr. Sergio Hugo Sánchez RodríguezCipres Núm Fraccto La PeAuela
Zacatecas, Zac., 98063 México.E-Mail: [email protected]
Tel/Fax (492) 27043
Zacatecas, Zac. A 17 de Mayo del 2000.
Dr. Jaime Molina Ochoa.Coord. Académico del Posgrado en Biotecnologíade la Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuariasde la Universidad de Colima.
Dr. Molina:
La presente, es con el fín de informar a usted que la tesis titulada“Caracterización de aislados de Beuveria bassiana (Deuteromycotina:Hyphomycetes) y su virulencia sobre Epilächna varivestis (Coleoptera:Coccinellidae)“, realizada por la C. Martha Patricia España Luna, estudiante dela Maestría en Ciencias, área Biotecnología, reune los requisitos de forma ycontenido, para que se autorice la impresión de la misma. Por lo anterior, el Dr.Roberto Lezama Gutiérrez y un servidor (Asesores de la Tesis) autorizamos ala estudiante, para que haga llegar a usted el documento, con el fin de que searevisado por el H. cuerpo académico que el Consejo Técnico del Posgradodesigne.
Agradeciendo de antemano la atención prestada a la presente, quedo deusted.
Dr sergio ;;Y&~;;JY;- TF.
Asesor de la Tesis. Laboratorio de BiologíaCelular del CREN-UAZ
ccp. C.P. Gillermo Torres García. Dir. Gral. Educ. Sup. de la U. de Colima.ccp. Dra. Sara Griselda Martínez Covarrubias. Dir. Gral. del Posgrado.ccp. Dr. Carlos Izquierdo Espinal. Delegado Regional No. 2.ccp. Ing. Rodolfo V. Morentin Delgado. Dir. de la FCBA.ccp. Interesado.ccp. Archivo.
Universidad de ColimaFacultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia
Votos aprobatorios
Dr. Jaime Molina OchoaCoordinador del Posgrado de la FCBAPresente
Por medio de este conducto informo a usted que ha sido revisada y leída por segundaocasión el borrador de tesis de maestría titulado “CARACTERIZACIÓN DE AISLADOSD E Beauveria bassiatm (DEUTEROMYCOTINA: HYPHOMYCETES) , Y SUVIRULENCIA SOBRE Ii@lachtm varivestis (COLEOPTERA: COCCINELLIDAE)“, quepresenta la C. Martha Patricia España Luna alumna del programa de Maestría enCiencias, Are-a: Biotecnología.
Considero que es un trabajo valioso y bien ejecutado, por lo anterior el manuscrito finalreúne los requisitos necesarios para su impresión, por lo cual doy mi voto aprobatorio paraque la alumna pueda hacer sus trámites correspondientes de la obtención de su grado.
Sin más por el momento, agradezco la atención por haberme distinguido con el honor de serrevisor de la tesis mencionada, y me reitero a sus respetables órdenes.
Atentamente
c.c.p.- Dra. Sara G. Martínez Covarrubias- Directora General de Posgradoc.c.p.- Dr. Carlos izquierdo Espinal.- Delegado Regional No.2c.c.p.- Ing. Rodolfo Morentín Delgado.- Director de la FCBA.c.c.p.- Interesada.c.c.p.- Archivo
Dr. Jaime Molina OchoaCoordinador del Posgrago de la FCBAPresente
Por medio de la presente, tengo el agrado de informar a usted, que leí y revisé, por segundaocasión, el borrador de tesis de maestría titulado “Caracterización de aislados de Beauveriabassiana (Deuteromycotina: Hyphomycetes), y su virulencia sobre Epilachna varivestis(Coleoptera: Coccinellidae)” que presenta la C. Martha Patricia España Luna, alumna delprograma de maestría en ciencias, área: Biotecnología, y detecté, que todas y cada una delas observaciones y recomendaciones que hice al primer borrador fueron consideradassatisfactoriamente en el presente manuscrito.
Por lo anterior, considero que éste manuscrito cumple con los requisitos necesarios paraque la alumna presente su examen de grado en el programa de maestría en ciencias área:Biotecnología de la Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad deColima.
Sin más por el momento, agradezco la atención por haberme distinguido con el honor de serrevisor de la tesis mencionada, y me reitero a sus respetables órdenes.
Atentamente
c.c.p.- Dr. Carlos E. Izquierdo Espinal.- Delegado Regional No. 2.c.c.p.- Ing. Rodolfo V. Morentín Delgado-. Director de la FCBA.c.c.p.- Interesadac.c.p.- Archivo.
Centro Universitario de Invcst@ción y DesnrroIlo &opccuario (CUID4)
OF. No. 049/CUIDA/OO
C. ING. RODOLFO V. MORENTIN DELGADODIRECTOR DE LA F.C.B,A: --- -- .. .. ..P R E S E N T E :
.,
Con fundamento en las funciones como revisor de la tesis de Maestría enCiencias del programa de Bìotecnologia, que presentó la C. Martha PatriciaEspaña Luna, la cual lleva por título, “CARACTERIZACIÓN ENZIMÁTICA DEA I S L A D O S D E Beauveria bassiana (DEUTEROMYCOTINA:HYPHOMYCETES), Y SU VIRULENCIA SOBRE Epilachna vativestìs(COLEOPTERA: COCCINELLIDAE)“, me permito informarle que he concluidodos revisiones en cuanto a forma, estilo y contenido del documento y consideroque las modificaciones y sugerencias han sido acatadas con precisión.
Sin otro particular de momento reciba un cordial saludo.
@* 4c A T E N T A M E N T E
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ESTUDIA l LUCHA *TRABAJA- MAN, COL., A 02 DE OCTUBRE DE 2000
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CMRo~mAluoDC LWEZGACION Y DR. A&ONSO PESCADOR RUBIO
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C.C.P.- DR. JAIME MOLINA OCHOA.-Coord inador de l Posgrado deBìotecnologia.-C.C.P.- MARTHA PATRICIA ESPAÑA LUNA.-interesada.-C.C.P.- ARCHIVO.-
APR/fgv**“Por el saber compartido. Año 2000, 60 aniversario de la Universidad de Colima”.
K m 40, autopscColimcl-F.~~~1~2anillo / k~rh.?, Cd:nw? / AP 22, C P 281 CO / b!&ono @! :332) c 20 43, fau 4 66 64. .-