UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO

T É C N I C A S E N I N M U N O LO G I A

I

M A R I A J O S E J A R A M I L L O E S T R E L L A

8 DE SEPT IEMBRE DEL 2011

DETERMINACION DE LINFOCITOS T EN MUESTRAS DE SANGRE

La cuantificación de los subgrupos de células utiliza 3 factores:

1. Existencia de una molécula en la superficie celular específica

de subgrupo (p.ej. , CD4 para los linfocitos T)

2. Un anticuerpo monoclonal específico de la molécula

3. Sustancias químicas llamadas fluorocromos que producen

fluorescencia a una longitud de onda concreta cuando se

exponen a una fuente de luz excitadora: fluoresceína (verde),

ficoeritrina (naranja) y aloficocianina (rojo)

DETERMINACION DE LINFOCITOS T EN MUESTRAS DE SANGRE

Citometría de Flujo

DETERMINACION DE LINFOCITOS T EN MUESTRAS DE SANGRE

ACT IVAC ION DE LOS L INFOCITOS T Y DETERMINAC ION DE LAS RESPUESTAS EN EL

LABORATORIO : SEPARACION Y ANAL IS IS DE LOS L INFOCITOS PARA

LAS RESPUESTAS PROL IFERAT IVAS

Separación de los leucocitos de la sangre utilizando gradiente de densidad.

La purificación puede obtenerse utilizando anticuerpos monoclonales específicos marcados con bolas magnéticas

ACT IVAC ION DE LOS L INFOCITOS T Y DETERMINAC ION DE LAS RESPUESTAS EN EL

LABORATORIO : SEPARACION Y ANAL IS IS DE LOS L INFOCITOS PARA

LAS RESPUESTAS PROL IFERAT IVAS

Análisis de la proliferación para determinar la respuesta del linfocito T al antígeno específico

A C T I VA C I O N D E LO S L I N F O C I T O S T Y D E T E R M I N A C I O N D E L A S R E S P U E S TA S E N E L L A B O R AT O R I O :

E S T I M U LO S P O L I C LO N A L E S

METODOS DE ACTIVACION

ACTIVADOR POLICLONAL O

MITÓGENO

LA LECTINA FITOHEMAGLUTININA

(PHA)

ENLACES CRUZADOS

CON GLUCOPROTEI

NAS DE SUPERFICIE

DE LINFOCITOS T.

ANTI-CD3

MONOCLONAL

ENLACES CRUZADOS CON

EL COMPLEJ

O TCR

SUPERANTÍGENOS

ENTEROTOXINA B

ESTAFILOCÓCICA

SUSTANCIAS MICROBIANAS SE

UNEN A LOS DOMINIOS DE LAS

CADENAS Vβ DEL TCR

ACTIVACION DE LOS LINFOCITOS T Y MEDIR SU RESPUESTA (INVESTIGACIÓN Y EXPLORACION DIAGNOSTICA EN PACIENTES CON INMUNODEFICIENCIAS)

PROLIFERACION DE LINFOCITOS T Y PRODUCCION DE CITOCINAS EFECTORAS

ACTIVACION Y PROLOFERACION DE TODOS LOS LINFOCITOS T FRENTE A ESTIMULOS ESPECIFICOS

A C T I VA C I O N D E LO S L I N F O C I T O S T Y D E T E R M I N A C I O N D E L A S R E S P U E S TA S E N E L L A B O R AT O R I O :

C I T O C I N A S Y T E T R Á M E R O S

La determinación de la respuesta del linfocito T se lleva a cabo de diferentes modos, uno de los más sencillos es la citometría de flujo pero con frecuencia se requiere de información mas detallada sobre las citocinas, lo que permite clasificar las respuestas como TH1, TH2, TH17 o Treg.

Las citocinas que se producen pueden determinarse:

1. ELISA: inmunoanálisis enzimático sobre fase sólida

2. Citometría de Flujo: para determinarlos dentro de la célula

3. PCR (reacción en cadena de la polimerasa: para los transcritos de ARNm específicos de las citocinas..

4. ADN recombinante para sintetizar molécula del HLA solubles

A C T I VA C I O N D E LO S L I N F O C I T O S T Y D E T E R M I N A C I O N D E L A S R E S P U E S TA S E N E L L A B O R AT O R I O :

C I T O C I N A S Y T E T R Á M E R O S

ADN recombinante para sintetizar molécula del HLA solubles. Las moléculas de HLA se ensamblan en los complejos de 4 componentes péptido-HLA (tetrámero de HLA) lo que aumenta la avidez de interacción . El tetrámero se acopla a un fluorocromo de modo que los linfocitos T individuales son capaces de unirse al epítopo específico.

Revolucionado la capacidad de determinar respuestas inmunitarias por

ejemplo: al virus de Epstein-Barr(respuestas antivíricas)

A C T I VA C I O N D E LO S L I N F O C I T O S T Y D E T E R M I N A C I O N D E L A S R E S P U E S TA S E N E L L A B O R AT O R I O :

A N A L I S I S D E C I T O T OX I C I D A D

Examinar la lisis específica por los CTL y la destrucción de los linfocitos asesinos naturales.

El análisis se basa en la incubación de las células efectoras y las células diana y la determinación de afección de éstas.

En la evaluación de la actividad de CTL debe usarse la célula diana emparejada con la molécula del MCH apropiado.

Las células diana se marcan mediante incubación con cromato sódico radiactivo.Si las células diana son dañadas por los efectores se libera el cromo del citoplasma.Los niveles de radiactividad son proporcionales a la lisis de la célula diana.

TOLERANCIA INMUNOLÓGICA

Burnet y Medewar, galardonados con el premio Nobel de Medicina en 1960, estudiaron el rechazo de injertos cutáneos alogénicos (no propios), en los que observaron una asociación linfocítica masiva.

La importancia radica en que se puede obtener tolerancia a antígenos extraños, aunque la vía de inyección neonatal no se use en el transplante de órganos.

MEDICION ENSAYO EJEMPLOS ESPECIFICOS

Concentración de Ig Nefelometría IgG, IgM, IgA e IgE

Gammapatías monoclonales

Inmunoelectroforesis, inmunofijación

Componente M

Complemento:Componentes individuales Actividad hemolítica total

ELISAPrueba de fijación de

complemento

C1, C2, C3, C4CH50

Anticuerpos de agentes infecciosos:

VIHStreptococo

Treponema pallidum

ELISA, western blotAglutinaciónAglutinación

Anti-gp24, gp41, gp120Polisacarido anticapsular

VDRL

Autoinmunidad:Anticuerpos anti-Ig Hemaglutinacion

pasivaFactor reumatoide

Anticuerpos antinucleares Inmunofluorescencia ANA, y anti DNA`s

Marcadores de superficie celular

Linfocitos normalesTumores celulares

Citometría de flujoCitometría de flujo

CD4, CD8, CD19CD10 o células leucémicas