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CAPITULO IVMEDIOS DE CULTIVO

(Tomado de «Phycologycal Methods», by Janet R. Stein)

Cristalería.Limpieza.Agua salada.

- Método general depreparación .

Esterilización en autoclave.Soluciones stock.

- Recomendaciones.

- Micronutrientes inorgánicos.

- Micronutrientes orgánicos:

Cianocobalamina (Vit. B12).Biotina (Vit. H).Tiamina (Vit. B1).

- Preparación del extracto de suelo.

- Medios marinos enriquecidos:

Medio Walne.Medio «f/2» Guillard.Medio Erdschreiber.

- Preservación de cepas:

- Liofilización.

- Miscelanea de preguntas.

- Bibliografía.

Medios para algas de agua dulce

Entre las principales consideraciones a seguir están:

El ph del medio.

Las concentraciones de nutrientes primarios.

La fuente de nitrógeno.

Los posibles factores orgánicos o de crecimiento parael enriquecimiento.

La composición de micronutrientes.

Los medios de naturaleza artificial, de composiciónquímica conocida, son a menudo empleados como aditi-vos para medios naturales de composición química des-conocida como es el agua de un río o de un lago. Estamosentonces ante medios de crecimiento enriquecidos (aguafertilizada), en donde se aspira a cumplir con los requeri-mientos nutricionales de una especie o grupo de algas dequienes no se conoce exactamente sus requirimientos.

Objetivos

Después de estudiar éste capitulo el estudiante debe-rá estar en condiciones de:

1.-Saber preparar un medio de cultivo elemental paracasos emergentes.

2.-Conocer los pasos a seguir para una buena limpie-za de vidriería.

3.-Saber preparar un medio enriquecido. Preparar unasolución stock de macro o de micronutrientes.

4.-Conocer los medios más usados en el cultivo dealgas de agua dulce y de agaua salada.

5.- Saber como almacenar agua salada «cruda» y cómoremover materia orgánica disuelta del agua.

6.-Usar el autoclave en el proceso de esterilizaciónde vidrios y de soluciones.

7.-Preparar una solución stock de trabajo.

8.-Preparar extracto de suelo, esterilizarlo y saber pre-servarlo.

9.-Entender la técnica de liofilización en la preserva-ción de cepas.

Sinopsis del capitulo

- Medios para algas de agua dulce.

- Materiales:

Químicos.Esterilización.Cristalería.Procedimiento de lavado.Agua.Suelo.

- Método de preparación.

- Medios de cultivo definidos:

Beijerinck.Bold Basal.Chu Nº10.

- Recomendaciones.

- Medios para algas marinas.

- Materiales:

Químicos.Equipos.

Folleto de Algas©Escuela Superior Politécnica del Litoral, 1994Impreso en Ecuador

30 Medios de Cultivo

Materiales

Químicos:

Deben ser de buena calidad y evitar reactivos degra-dados o contaminados. Es importante la exactitud en elpeso de los químicos a ser usados.

El agar es usado para solidificar medios de crecimien-to, es agregado al medio que fue preparado antes de serautoclavado. Si el pH es muy ácido no hay que autoclavar.Se suguiere entonces autoclavar ambos por separado.

El agar es un polímero neutral de galactosa de bajaviscosidad cuando está diluído en agua . Se gelatiniza atemperatura estable y su estructura es fuerte. Se disuelvea 95 grados centígrados y endurece a 45.Usar del 1 al 2 %de concentración del agar. Preparar como la gelatina.

Autoclavado:

A 121 grados centígrados, 20 lb/inch2 por 20 a 35minutos después que ha alcanzado la presión indicada enel autoclave.

Esta esterilización puede ser con el agar ya puesto entubos, petri - dish y fiolas o vertir el agar esterilizado encada recipiente asepticamente en los vidrios. Los vidriosdeben estar esterilizados debidamente.

Cristalería:

Tubos de ensayo : De diferentes volúmenes, contapa rosca o algodón o tapones de neopreno.

Platos petri con tapa: No mantienen esterilidad porlargo tiempo.

Fiolas: De diferentes volúmenes, igualmente tapa-dos con algodón o tapones de neopreno.

Agua:

El agua para el medio de crecimiento puede ser fil-trada con membrana si la condición del cultivo así lo re-quiere. Agua destilada para la preparación de stock.

Suelo:

En caso de usarse su extracto, el suelo debe ser:

Poca cantidad de arcilla ( barro ).

Que se asiente al ser mezclado con el agua.

Poco contenido de humus.

No fertilizado reciente.

Que no haya recibido pesticidas.(Ver preparación del extracto más adelante en este

capítulo).

Lavado de vidrieria:

Agua de llave más detergente.

Enjuagar en agua de llave.

Lavar con solución ácida ( ej. ClH )

Enjuagar 3 veces con agua destilada

Método de preparación

Un medio de crecimiento es generalmente preparadoa partir de soluciones stock ( pre - mixed ):

Las alícuotas de estos stocks son medidos y agrega-dos a un volúmen dado de agua dulce.

En algunos casos los componentes son agregados di-rectamente al volúmen dado de agua dulce.

Desorden en la aplicación de los componentes oalícuotas pueden causar problemas.Ej. Las precipitacio-nes.

Las soluciones stock deben guardarse en frío o en re-cipientes de vidrio bien sellados para evitar evaporacio-nes.

El agua dulce a ser enriquecida debe ser esterilizadao debidamente filtrada.

Medios de cultivo definidos

Los medios generalmente son preparados a partir desoluciones stock previamente mezcladas. Las alícuotas deestas soluciones son medidas y agregadas a un volúmendado de agua. En algunos casos los componentes indica-dos son pesados y agregados directamente al volúment deagua, quedando así preparado el medio. Los procedimien-tos incorrectos pueden causar precipitaciones, especial-mente nitratos y fosfatos.

Las soluciones stock pueden prepararse y almacenarseen frio por largo tiempo, para lo cual se recomienda el usode recipientes con tapa de vidrio. Todas estas solucionesdeben prepararse con agua destilada.

A continuaciòn se describen tres medios de cultivopara algas de agua dulce:

1. Beijerinck ( pH 6.8 ): Se compone de 3 solucio-nes stock de macronutrientes y una de micronutrientes.

Soluciones stock de macronutrientes

TIPO CANTIDAD

Stock I (para 100 ml / l )NO3 NH 4 1,5 g / lPO4 HK2 0,2 g / lSO4 Mg . 7 H2O 0,2 g / lCl2Ca . 2 H2O 0,1 g / l

Stock II ( para 40 ml / l )PO4 H 2 K 9,07 g / l

Stock III ( para 60 ml / l )PO4 HK2 11,61 g / l

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Solución stock de micronutrientes

TIPO CANTIDAD

Micronutrientes ( para 1 ml / l )BO3H3 1 g / lSO4 Cu . 5H2O 0,15 g / lEDTA . Na2 5 g / lSO4Zn . 7 H2O 2,2 g / lCl2Mn . 4 H2 O 0,15 g / lMo7O24 ( NH4)6. 4 H2O 0,10 g / l

Los micronutrientes se disuelven uno por uno en 100ml de agua tibia, luego el pH se ajusta a 5 con KOHgranulado. La solución final debe tener un pH 6,5. Elhierro precipita en pH 7

2. Bold Basal ( pH 6,6 ) o solución Bristol: Secompone de 1 solución stock de macronutrientes y 4 demicronutrientes.

Solución stock de macronutrientes

TIPO CANTIDAD

Stock I ( para 60 ml / l )NO3Na 10 g / 400 mlCl2Ca. 2 H2O 8 g / 400 mlSO4 Mg. 7H2O 3 g / 400 mlPO4HK2 3 g / 400 mlPO4H2K 7 g / 400 mlClNa 1 g / 400 ml

Soluciones stock de micronutrientes

TIPO CANTIDAD

EDTA Na2 ( para 1 ml / l )EDTA Na2 50 g / lKOH 31 g / l

Hierro ( para 1 ml / l )SO4Fe. 7 H2O 4, 98 g / lSO4 H2 1 g / l

Boro ( para 1 ml / l )BO3H3 11,42 g / l

TrazasSO4Zn. 7 H2O 8,8 g / lCl2Mn . 4 H2O 1,44 g / lMo O3 0,71 g / lSO4 Cu. 5H2O 1,57 g / l(NO3)2 Co. 6 H2O 0,49 g / l

3. Chun Nº 10 (pH 6,5 - 7,0): Evitar pesos repetitivos.Seguir la secuencia propuesta para la mezcla.

Solución stock

NUTRIENTE CANTIDAD

( NO3 )2 Ca 0,04 g / lPO4 HK2 0,01 g / lSO4Mg. 7H2O 0,025 g / lCO3Na2 0,02 g / lSiO3Na2 0,025 g / lCl3Fe 0,8 g / l

Recomendaciones

Los medios enriquecidos tienen la ventaja de sopor-tar el crecimiento de un gran número de especies de algas.Si estos medios son muy orgánicos corren el riesgo decontaminarse con bacterias más fácilmente que losinorgánicos. Un medio definido puede transformarse enindefinido si se le hacen modificaciones.

El nitrógeno generalmente se lo introduce como ni-trato y a veces como amoníaco, urea o amino ácidos. Unstock de urea se prepara con 54 g / l en agua destilada y 10ml de esta solución se usa como fuente de nitrógeno parareemplazar al nitrato en el medio Bold Basal.

Vitaminas como cianocobalamina, biotina y tiaminason requeridas por muchas algas cuando crecen en culti-vos axénicos. Ellas son usadas en muy bajas concentra-ciones y almacenadas en solución stock a temperatura decongelamiento. Ellas pueden ser autoclavados o filtra-das con membrana y agregadas asepticamente al medioesterilizado.

Las vitaminas son importantes en los cultivos axénicos(libre de bacterias), ya que cuando las bacterias están pre-sentes (cultivos clonales) pueden suplir vitaminas direc-tamente al cultivo.

A continuacion se indican las clases de algas que hansido cultivadas con éxito en los medios citados:

Medios de cultivo y clases de algas cultivadas

Medios definidos Clase de algas

1. Beijerinck cloroficea2. Bold Basal cloroficea,crisoficea,

cianoficea, fodoficea3. Chu Nº 10 bacilarioficea,cloroficea,

crisoficea, cianoficeaEnriquecidos (Indef.) cloroficea,crisoficea,

cianoficea, rodoficea

Medios para microalgas marinas

El agua de mar es de por sí un medio propicio para elcrecimiento de algas. Este es un medio natural complejoprovisto de más de 50 elementos conocidos (componen-

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tes) y un elevado número de compuestos orgànicos varia-bles.

Este medio marino generalmente es fortalecido cuando sele añaden nutrientes como el nitrógeno, el fósforo, el hie-rro y otros.

Un mejor entendimiento de los micronutrientes y de losfactores de crecimiento han permitido mejorar este me-dio, aunque poco se ha hecho al respecto para lasmicroalgas bènticas.

El uso de estabilizadores (buffers) del pH no tóxicos yquelantes han facilitado la esterilizaciòn por calor de losmedios marinos, sin que éstos se precipiten. Los aparatosde filtración son en muchos casos convenientes para este-rilizar estos medios debido a la rapidez y facilidad conque se lo hace.

Muchos medios enriquecidos y sintéticos han sido desa-rrollados para el cultivo de algas microscópicasplanctónicas y algunas especies bénticas han crecidoexitosamente con estos medios.

Las dificultades encontradas en el desarrollo de los culti-vos algales están a menudo relacionadas con los proble-mas de aislamiento, manipulación, incubación y situaciónfisiológica del organismo.

Un solo medio debe servir para la mayoría de las ne-cesidades del cultivador. Este es el caso del medio R.Guillard f/2 en el cual un gran nùmero de especies algalescrecen sin dificultad.

Un medio sintético puede ser usado igual que uno enri-quecido, pero cualquiera que éste sea, el medio deberá sertan simple como sea posible en su composición y prepa-ración.

Materiales

Químicos:

Los químicos empleados en la preparación de unmedio pueden ser del grado reactivo o grado técnico, de-pendiendo de la calidad del cultivo que se va a realizar.Los químicos de grado reactivo (QP) se usan en la prepa-ración de medios para cultivo menores (Indoor CultureApplication) o que demanden tal grado de pureza. Estosmedios tienen elevado costo, a diferencia de los que sepreparan con grado técnico y se usan mayormente en cul-tivos masivos.

Equipos:

Un autoclave para efectos de esterilización.

Una balanza analítica para pesar metales trazas y vi-taminas.

Una balanza gramera para pesar valores mayores.

Un pHmetro para estabilizar las soluciones y el me-dio final.

Un calentador eléctrico con agitador magnético paradisolver compuestos.

Un lavador automático de pipetas.

Varios baldes de acero inoxidable de 13 a 15 l. decapacidad.

Un refrigerador - congelador para almacenar reactivos,soluciones stocks y vitaminas.

Un incubador con control de luz y temepratura parapreservación de cepas.

Cristalería:

La vidriería marca PYREX es de buena calidad. Serequieren aparatos para filtración al vacío (membranefilter); cilindros graduados con tapa y sin tapa; beakers devarias medidas; fiolas de diferentes volúmenes; botellascon tapa para reactivos; pipetas para medir diferentes vo-lúmenes; cilindros plásticos con tapa para lavado depipetas; tubos de ensayo con tapa rosca; platos petri; ter-mómetros de -20 a 110 grados centígrados; espátulas;embudos; mechero de gas y de alcohol; embudos de por-celana para filtración; fiolas para usar en filtración

La cristalería usada en los trabajos de rutina no debenemplearse en la preparación de medios y toda vidrierianueva debe enjuagarse en ClH diluido para remover cual-quier agente reaccionante.

Limpieza:

El detergente remueve la materia orgánica del vidrio.

Primero enjuague la cristalería con agua de la llaveinmediatamente después de usarla.

Déjela remojando toda la noche en una solución condetergente preparada con agua destilada, en un recipiente(balde) de acero inoxidable.

La solución con la vidrieria caliéntela o hiervala poruna hora. Haga un primer enjuague con agua de la llave yfinalmente con agua destilada por varias ocasiones.

Invierta cada recipiente para que escurra y luego tá-pelo.

En el caso de las pipetas emplee el mismo procedi-miento descrito y para escurrir use el porta pipetas.

Toda vidrieria, incluyendo pipetas, que no respondenal lavado con detergente debe ser remojada en SO4H2saturado con NO3Na o en NO3H caliente. Luego enjua-gue bien con agua destilada.

Mínimas cantidades de materia orgánica pueden serdestruidas mediante cocción a 350 y 400 grados centígra-dos por 3 a 4 horas. Los dedos sucios son buenos conta-minantes.

La preparación de soluciones stocks se hacen en agua

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doblemente destilada.Agua Salada

El agua salada a emplearse en la preparación de me-dios debe ser de mar afuera, o de áreas costeras considera-das libres de contaminantes, luego filtrada para mantener-la.

Las partículas mayores son removidas con papel fil-tro Whatman # 1, pero una filtración con membrana(milipor) de 0.45 um es usada para eliminar todas las par-tículas menores incluso las bacterias. Cuando se filtra conmembrana la velocidad de paso del agua debe ser lenta, adiferencia del papel filtro.

Para hacer bioensayos con vitaminas, la materia or-gánica disuelta debe ser primeramente absorvida, pasan-do el agua por una columna de carbón activado que ade-más la estandariza. Esta forma de remover la materia or-gánica es mejor usarla con altas cantidades de agua sala-da.

Cuando se trata de mínimas cantidades, un litro porejemplo, el agua es mezclada con 2 g de carbón activadonuevo y pulverizado, agitarlo por una hora y luego filtrar-lo con membrana milipor. Otra forma de eliminar materiaorgánica es por medio de radiación ultravioleta de altaenergía, que además la esteriliza.

El agua salada puede conservarse en recipiente plás-tico (polietileno), o vidrio. Cuando el recipiente es nue-vo, éste debe ser « curado « con ácido clorhídrico variosdías y luego enjuagarlo bien con agua de la llave. Aguacruda (no esterilizada, ni filtrada con membrana) no debealmacenarse por mucho tiempo. Es mejor preparar unmedio con agua nueva. El agua debe ser almacenada enfresco y oscuro.

Método general de preparación

Coloque el 80 o 90% del volumen requerido en elrecipiente, sea beaker, botella, fiola o matráz.

Agregue los nutrientes apropiados de las solucionesstock, agitando constantemente.

Ajuste el pH a 7.5 empleando ClH 1N o NaOH segúnse requiera.

Complete el 100% del volumen requerido final conagua salada y distribuya el medio en los recipientes indi-cados para su esterilización en autoclave o filtración.

Agregue asépticamente las vitaminas tomándolas deuna solución previamente preparada y esterilizada despuésque el medio fue autoclavado y enfriado.

Asegúrese de que la salinidad final esté correcta.Unasalinidad de 35 UPS es considerada normal para el aguasalada. Si hay que rebajarla use agua destilada y si hayque subirla coloque el agua en un evaporador. La mayo-ría de las algas crecen bien a 30 UPS e incluso menos,

especialmente las unicelulares. El pH del agua de mar esde 8.2 a 8.4 normalmente.

Esterilización en autoclave:

La esterilización se logra autoclavando el medio a 121grados centígrados de temperatura, 15 lb/pulgada cuadra-da de presión (de vapor), por un tiempo que varía de 10minutos para un volumen de 100 ml, 20 minutos para 2 ltsy 35 minutos para 5 lts.

Todo el aire debe salir del autoclave antes de iniciarla esterilización. De no ser así la correcta esterilizaciónno se dará.

En algunos autoclaves este aire se eliminaautomáticamente, no así en otros, donde la válvula de es-cape debe permanecer abierta hasta que se vea salir unacolumna de vapor en forma persistente. Cerrando la vál-vula, se deja subir la presión hasta 15 libras, momento enque se inicia la esterilización y se toma el tiempo.

Los recipientes (frascos, fiolas, matraces, etc.) quecontienen el medio a ser esterilizado deben taparse conmateriales que permitan el paso del vapor caliente al inte-rior, como tapones de gasa - algodón o papel KRAFT noencerado-. El papel aluminio no es recomendable usar.El material esterilizado caliente dejarlo que se enfríe den-tro del autoclave antes de sacarlo.

Este autoclavado puede causar precipitación en algu-nos medios. Este precipitado corresponde a casi todo elfosfato presente en el medio, pero se lo evita aplicando elfosfato, los metales traza y el silicato previamente esteri-lizados. Hacer estas aplicaciones con criterio de asepsiapara evitar contaminación cuando se trate de cultivos me-nores.

Ciertos plásticos que se usan en la esterilización pue-den desprender tóxicos al medio.

Soluciones Stock :

La mayoría de las sales y compuestos empleados enla preparación de soluciones stock son muy solubles enagua, al punto de permitir 500 y hasta 1000 dilucionespara la preparación de medios enriquecidos.

La concentración de algunas soluciones es muy baja.Algunos metales traza, vitaminas y demás nutrientes sonprimeramente diluidos para formar las soluciones que ser-virán para enriquecer un medio de cultivo. Es decir queestas soluciones viene a ser las ¨soluciones stock de traba-jo¨.

Disuelva la cantidad exacta del compuesto en 80-90%del volumen requerido en agua destilada. En una hornillaeléctrica o calentador magnético agite suave y constante-mente mientras se disuelve el compuesto. Déjelo enfriary luego mida el pH de la solución ajustándolo cuando seanecesario. Use una probeta para enrasar el volumen fi-nal..

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En la preparación de una “solución stock de trabajo”que contiene una mezcla de compuestos (sales, vitami-nas, etc) disuelva cada uno por separado en un volumenmínimo de agua destilada, luego combine estas solucio-nes y enrase al volumen final deseado.

Las soluciones stock se almacenan en botellas de vi-drio o recipeintes plásticos y se refrigeran. Si las solucio-nes preparadas van a ser autoclavadas pueden agregarseunas gotas de un preservante volátil, esto es una soluciónque contiene una parte de clorobenceno (v/v), una partede 1.2 dicloroetano y dos partes de n-butilcloruro (1-clorobutano). Agitar fuertemente.

Recomendaciones

Algunas sales no se preparan como soluciones stockdebido a su baja solubilidad. Estas sales son el NaCl,SO4Mg, ClK y SO4Na2.

El nitrógeno es agregado como nitrato de sodio(NO3Na). El amoníaco como cloruro de amonio (ClNH4)en un máximo de 0.1 mM/l debido a su toxicidad paraalgunas especies. Buena parte del nitrógeno se puede per-der del medio (volatiliza) durante el autoclavado, por loque las solucioens estériles se agregan asépticamente lue-go de que el medio se ha enfriado. La úrea se descompo-ne cuando se la calienta y debe ser agregada por filtraciónestéril. Algunos aminoácidos también se degradan cuan-do son autoclavados en el medio.

El fósforo es agregado generlamente comoortofosfato.

El silicio participa en el medio solamente cuando setrata de algas diatomeas. Este elemento es agreagado comosolución de metasilicato de sodio (SiO3Na2). El siliciosiempre se lo disuelve aparte y forma una solución stock.El metasilicato de sodio se disuelve con facilidad en aguadestilada tibia y es altamente alcalino, por lo que precipitao se polimeriza cuando se lo agrega al medio. El proble-ma se resuelve si la solución stock del silicio primero se laacidifica a pH 2 con ClH concentrado. Pero las diatomeascrecen bien si el medio es preparado con solución stockde silicio con pH alcalino.

Sólo dos amortiguadores (buffers) son usados enmedios marinos: el tris (hidroxilmetilaminometano) y laglicilglicina. Ambos amortiguan bien en pH 7.5-8.5. Lassoluciones preparadas con estos buffers se deterioran conel tiempo, por lo que deben ser usadas inmediatamentedespués de su preparación. El tris es fuertemente alcalinopor lo que para evitar precipitaciones no hay que agregar-lo directamente al medio. Disolver la cantidad requeridade tris en agua destilada aparte y use mínimos volúmenespara enriquecer medios marinos. Ajuste el pH del mediocon el ClH concentrado.

La glicilglicina es soluble en agua y el polvo puedeagregarse directamente al medio. Es altamente acídico,por lo que no causa precipitados y el pH debe ajustarsecon gotas de NaOH 1N. La glicilglicina es rápidamente

metabolizada por los microorganismos y debe ser usadasólo con los cultivos axénicos, mientras que el tris puedeusarse con los cultivos xénicos.

Algunos organismos inhiben su crecimiento con eltris y no así con la glicilglicina. Cantidades mínimas de-ben ser empleadas en ambos casos y de 1 a 5 mM es sufi-ciente. Ninguno de ellos sirve como recurso de nitrógenopara el crecimiento algal.

Micronutrientes inorgánicos

Corresponden a los metales que intervienen en el en-riquecimiento del agua de mar. Los micronutrientes quese verán aquí sólo serán aquellos que se usan para enri-quecer medios marinos y no para medios sintéticos porcuanto estos no siempre dan resultados satisfactorios enlas producciones masivas. Los elementos que mayormenteparticipan son el zinc, manganeso, molibdeno, cobalto,cobre y el hierro. Las concentraciones de éstos compues-tos varían según la fórmula del medio que se trate. Esconveniente usar sales hidratadas para facilitar su dilu-ción cuando se prepara la solución de metales traza. Es-tos metales son agregados en forma quelada, siendo el Na2

EDTA el principal quelante y con el que se evitan precipi-tados durante la combinación de las sales.

El cobalto, cobre, manganeso, molibdeno y zinc selos puede preparar por separado como soluciones stockprimarias y diluidas, para luego formar una solución stockde trabajo. Los cloruros o sulfatos de estos elementos(sales) pueden usarse, pero el molibdeno es preparadocomo MoO4Na2. El hierro puede ser diluido aparte juntocon el EDTA y formar la solución Fe.EDTA para así em-plearlo en la preparación del medio. La primera soluciónstock mencionada es estable en condición alcalina, peroel hierro por no brindar esta condición es quelado con elEDTA. Si ha de formarse una solución stock el Fe.EDTAtambién puede ser agregado en un principio y no hay alte-ración.

Otra forma de preparar la solución stock de metalestraza es con el 80 o 90% del volumen de agua destiladarequerida, disolver primeramente el Na2 EDTA y a conti-nuación el hierro, luego se irán disolviendo uno a uno losmetales restantes y agitando constantemente. Completarel volúmen final con agua destilada.

Micronutrientes orgánicos

Sólo tres vitaminas son realmente necesarias para elcrecimiento de las algas marinas, esto es lacianocobalamina, biotina y tiamina HCl. Algunos mediosemplean mayor número de vitaminas.

Cianocobalamina (Vit. B12):

Es estable en forma de polvo y contiene un 12% dehumedad. En la preapración pueden usarse las ampollasque contienen 10 mg del compuesto, para lo cual:Preparar una solución stock primaria de cianocobalaminadisolviendo el contenido de una ampolla (inyección) en

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agua destilada.

Ajustar el pH a 4.5 con ClH y diluir a un volumendeterminado (1 litro).

La condición ácida de la vitamina permite suautoclavado. Ella también puede ser filtrada con mem-brana milipor. Almacenar la solución a -20 grados centí-grados. Esta vitamina resiste los recongelamientos y losreautoclavados.

Biotina (Vit. H):

Es estable en forma de cristal y contiene un 4% dehumedad.

La solución stock primaria se prepara como en el casoanterior, sólo que la biotina deberá ser pesada de acuerdoal requerimiento.

Su acidificación la vuelve estable para el autoclavado.

Tiamina HCl (Vit. B1):

La cantidad requerida puede diluirse en la soluciónde biotina y ajustar el pH a 5.5. Puede autoclavarse enesta condición y guardar en congelamiento. Las tres vi-taminas pueden combinarse para formar una sola solu-ción stock de trabajo hasta para mil diluciones. Agregarlas vitaminas al medio en forma aséptica, aunque ellasson frecuentemente autoclavadas con el medio.

Preparación del extracto de suelo

La muestra de tierra no debe contener aplicacionesde fungicidas ni insecticidas. Debe contener la menorcantidad posible de arcilla.

Mezclar un volumen de tierra en dos volumenes deagua estilada y autoclavar de 40 a 60 minutos o hervir pormás de 60 minutos agitando constantemente. Dejar el cal-do en reposo durante la noche y luego filtrar. El extractoobtenido y la tierra son altos contaminantes, por lo quedeben manejarse con extremo cuidado en el laboratorio.

Medios marinos enriquecidos

Los medios enriquecidos más sencillos sólo contie-nen fuentes de nitrógeno, fósforo y el extracto de suelo,que son agregados al agua de mar. Los medios enriqueci-dos más sofisticados contienen además mezclas de meta-les traza y vitaminas.

Medio Walne (1966).- Sofisticado medio usado paraun gran número de algas unicelulares.

Solución básica de nutrientes:(*)Cl3Fe.6H2O 1,3 g.MnCl2.4H2O 0,36 g.BO3H3 33,6 g.Na2.EDTA 45 g.PO4H2Na.2H2O 20 g.NO3Na 100 g.

Solución metales traza 1 ml.Agua destilada 1 l.

*Agitar en cada aplicación.Agregar 1 ml. de ésta solución por cada litro de aguasalada a enriquecer.

Solución de metales traza:

Cl2Zn 2,1 g.Cl2CO.6H2O 2 g.NH46Mo7O24.4H2O 0,9 g.SO4Cu.5H2O 2 g.Agua destilada 100 ml.

Es necesario acidificar ésta solución con ClH paraobtener un líquido claro.

Solución de vitaminas:

Cianocobalamina (B12) 10 mg.Tiamina.HCl (B1) 200 mg.Biotina (vit. H) 10 mg.Agua destilada 100 ml.

Esta solución debe ser acidificada a pH 4.5 antes deautoclavarse. Agregar 0.1 ml. por cada litro de aguasalada.

Medio “f/2” Guillard (1968).- Sofisticado mediousado para un gran número de especies unicelulares. Pue-de ser efectivo para algas bénticas. Los nutrientes y el aguasalada son autoclavados juntos después del ajuste del pHa 7.4. Sirve para aislar y mantener.

Solución básica de nutrientes:

NaNO3 75 mg.PO4H2Na.H2O 5 mg.SiO3Na2.9H2O 15 - 30 mg.(El silicato es sólo para diatomeas).

Solución de metales traza:

Na2EDTA 4,36 mg.Cl3Fe.6H2O 3,15 mg.SO4Cu.5H2O 0,01 mg.SO4Zn.7H2O 0,022 mg.Cl2Co.6H2O 0,01 mg.Cl2Mn.4H2O 0,18 mg.MoO4Na2.2H2O 0,006 mg.

Solución de vitaminas:

Cianocobalamina (B12) 0,5 mg.Tiamina. HCl (B1) 0,1 mg.Biotina (Vit. H) 0,5 mg.

Por cada litro de agua salada a ser enriquecida.

Medio Erdschreiber (1927).- Este medio es sencilloy ha sido usado para algas unicelulares y macroalgas. Sir-ve para aislar y mantener algas. El agua salada y los aditi-vos son esterilizados por separado y luego combinadosasépticamente. El Fe.EDTA y otros metales traza junto

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con las vitaminas pueden reemplazar al extracto de sue-lo.

Solución básica de nutrientes:

NO3Na 100,30 - 199,75 mg.PO4HNa2 7,90 - 19,80 mg.Extracto de suelo 50,00 ml.

Por cada litro de agua salada a ser enriquecida.

Preservación de Cepas

La liofilización:

El principal propósito de ésta modalidad de preser-vación (congelado-seco) es mantener los cultivos algalesen estado viable por largo tiempo, teniéndose las siguien-tes ventajas para su aplicación:

Reducción de tiempo, equipos y espacio físico re-querido para mantener colecciones, comparado con lasformas rutinarias de transferencia.

Estabilidad genética de las especies preservadas porlargo tiempo.

Los cultivos liofilizados no requieren refrigeraciónpara su almacenaje.

Cuando se congelan, pasan por bajas temperaturas yson liofilizadas, las células son expuestas a una secuen-cia de stress de tipo físico y químico.Cualquiera de ellospueden hacer perder viabilidad a las células.

Entre los daños que pueden sufrir están:

1) Alteración de los procesos metabólicos debido alos efectos causados por el diferencial de temperaturasobre las múltiples reacciones enzimáticas.

2) La formación de los cristales de hielo someten alas células a un stress físico, especialmente si el grado decongelamiento es demasiado rápido.

3) El aumento de los cristales de hielo intracelularesproducen una difusión del agua fuera de las células, ge-nerando su deshidratación.

4) La deshidratación genera un incremento de lasconcentraciones de sales en la célula, con la consiguientedesnaturalización de proteinas, solubilización delipoproteinas y alteración de la permeabilidad de la mem-brana.

5) El descongelamiento de una muestra y su retornoa la temperatura ambiente expone a las células a efectosque pueden resultar letales, como cambiar las concentra-ciones de electrolitos (moléculas) o por efectos de la tem-peratura alterar el grado de reacción enzimática.

Se requieren equipos especiales para éste proceso yestán disponibles para operar tanto a escala de laborato-rio como industrial.

La técnica de congelado-seco (freeze-drying) impli-ca remover el agua o algún otro solvente de un productocongelado a través de un proceso llamado sublimación,que se dá cuando un líquido congelado (cristales de aguapor ejemplo) pasa directamente al estado gaseoso sin pa-sar por el estado líquido. Los productos o materiales asíprocesados no necesitan refrigeración y pueden ser alma-cenados a temperatura ambiente.

Se conocen 3 métodos de congelado-seco:

1) Secado múltiple (manifold drying).

2) Secado en un solo (batch drying).

3) Secado en bulto (bulk drying).

Su uso depende del producto final y de la configura-ción deseada. Para las algas el primero y segundo son losmétodos más requeridos y convenientes.

Toda la técnica implica 3 pasos a saber :

Precongelado. La colección de algas es adecuada-mente precongelada. Durante ésta fase se forman loseutéticos (solutos que se congelan a una temperatura me-nor que la del agua circundante). Una vez formados loseutéticos, toda la suspensión se va volviendo viscoza amedida que la temperatura baja. Finalmente el productose congela formando un sólido (hielo) de característicasde vidrio. En ésta condición es muy dificil obtener unaliofilización.

Primer secado. El hielo debe ser removido del pro-ducto congelado (colección de algas) vía sublimación, re-sultando en un producto seco y estructuralmente intacto.Este paso requiere de un alto control de la temperatura yla presión de vapor de dicho producto.

Es importante que la temperatura en la cual el pro-ducto es congelado-seco esté balanceada entre la tempe-ratura que mantiene la integridad del congelamiento delproducto y la temperatura que maximiza la presión devapor del producto. Este balance es clave para un secadoóptimo.

Debe crearse la condición que asegure el libre flujode las moléculas de agua desde el producto; es por éstoque una bomba de vacío (vacuum pump) es necesaria enun sitema de congelado-seco para evacuar el ambiente quecircunda el producto.

Otro aparato indispensable es el condensador (coldtrap), usado para colectar la humedad que sale del pro-ducto congelado. La bomba de vacío remueve todos losgases que no son condensables y el condensador «captu-ra» todos los gases condensables, como las moléculas deagua por ejemplo.

La presión de vapor del producto asegura lasublimación del agua (moléculas de vapor) desde el pro-ducto congelado al condensador. El diferencial de la pre-sión de vapor entre el producto y el condensador permite

Henry G. Alvarez Arellano 37

el movimiento de las moléculas fuera del producto; sinembargo, la temperatura del condensador debe ser muchomás baja que la del producto.

Tabla VIII

Relación de temperatura/presión de vapor

Temp. (grados centígrados) Presión (mm de Hg)

0 4.579-10 1.950-20 0.776-30 0.286-40 0.097-50 0.027-60 0.008-70 0.0019-80 0.0004

El tercer componente esencial en el congelado-secoes la fuente de calor que tiene que ser aplicada al productopara asegurar la salida del agua en forma de vapor desdeel producto congelado. Una forma común de aplicar calores usando el ambiente directamente a las cámaras de se-cado (manifold drying). Las cámaras portan las fiolas, tu-bos o ampollas que contienen el producto (algas) a serliofilizado.

Segundo secado. Completado el primer secado y unavez que todos los cristales de hielo han sido sublimados,la humedad de enlace está aún presente en el producto. Setrata de la «humedad residual» que puede estar entre un 7-8%.

Un secado contínuo se necesita bajo una temperaturamás tibia de la anterior a fin de eliminar la humedad resi-dual. Este proceso se conoce como «disorción isotérmica».El segundo secado se hace a temperatura mayor que la delambiente por ser compatible con la sensitividad del pro-ducto.

El vacío debe ser lo más bajo posible y la temperatu-ra del condensador la más fría que se pueda lograr.

Todo éste proceso toma medio tiempo del requeridopara el proceso anterior.

Miscelánea de preguntas

1.- Explique ¿por qué se usa el agar en la solidificaciónde medios de crecimiento y cuál es su principal ven-taja?

2.- Explique en forma breve los pasos a seguir en la es-terilización con autoclave.

3.- Si recuerda nombre el compuesto químico que for-ma el stock II en la solución de macronutrientes delmedio Beijerinck.

4.- ¿Cuáles son las características del suelo para obtener

un buen extracto ?

5.- ¿En qué concentración participa el cloruro de hierroen la fórmula Chu No. 10 ?

6.- En forma breve describa los pasos para una buen la-vado de vidriería.

7.- Describa el método general de preparación de aguasalada enriquecida.

8.- ¿Cómo evita el problema de la precipitación delsilicato antes de agregarlo al medio ?

9.- ¿Cuál es la concentración del nitrato de sodio en elmedio “f/2” Guillard ?

10.- ¿Qué es la disorción isotérmica ?

Bibliografia de consulta:

1) Handbook of Phycological Methods, Culture Methodsand Growth Measurements. Janet R. Stein. 1973.

2) Culture of Phytoplankton for Feeding MarineInvertebrates. Robert R. Guillard. 1971.

3) Tecnología de Cultivo de Microalgas. Eduardo UribeT. 1992.

4) Rotifer and Microalgae Culture Systems. Wendy Fulks.Kevan L. Main. 1991.