manual de toxicología. facultad de química. original

Laboratorio de Toxicología 2010-I

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

1

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE QUÍMICA

DEPARTAMENTO DE FARMACIA

Manual de guiones experimentales para la enseñanza y

aprendizaje del laboratorio de Toxicología (clave 1614)

María Elena Bravo Gómez Jorge Cornejo Garrido Francisco Hernández Luis Juan Francisco Palacios Espinosa Araceli Pérez Vázquez Francisco Sánchez Bartez

Perla Carolina Castañeda López Manuel Gutiérrez Aguilar Bernardo Lucas Florentino Carlos Pérez Muñoz Alejandra Quijano Mateos

Facultad de Química, UNAM México, D.F. 2009



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ÍNDICE

Página PRÓLOGO

3

REGLAMENTO DE HIGIENE Y SEGURIDAD PARA LOS LABORATORIOS DE LA FACULTAD DE QUÍMICA

6

REGLAMENTO DE HIGIENE Y SEGURIDAD PARA LOS LABORATORIOS DEL DEPARTAMENTO DE FARMACIA

8

REPORTE DE SEGURIDAD E HIGIENE 9

EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE TÓXICOS NO VOLATILES EN UNA MUESTRA PROBLEMA

10

CUANTIFICACIÓN DE CIANURO DE HIDRÓGENO, COMO TÓXICO VOLÁTIL, A PARTIR DE GLUCÓSIDOS CIANOGÉNICOS

22

PRODUCCION DE METAHEMOGLOBINA POR NITRITOS Y EFECTO PROTECTOR DEL AZUL DE METILENO IN VIVO

31

DETERMINACIÓN DE MALATIÓN RESIDUAL

39

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LA QUERCETINA Y EL ÁCIDO NORDIHIDROGUAYARÉTICO

47

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD GENOTÓXICA DE LA CICLOFOSFAMIDA UTILIZANDO LA TÉCNICA DE MICRONÚCLEOS EN MÉDULA ÓSEA

53

EFECTO TÓXICO DE PLOMO EN RATAS

63

EFECTO DEL pH EN LA LIBERACIÓN DE PLOMO POR UTENSILIOS DE BARRO VIDRIADO

75

DETERMINACIÓN DE ETANOL EN UNA MUESTRA PROBLEMA

80

IDENTIFICACIÓN DE ALCALOIDES Y BARBITÚRICOS EN MUESTRAS PROBLEMA

87



3

PROLOGO En noviembre de 2004, el H. Consejo Técnico de la Facultad aprobó las modificaciones al plan de estudios de la carrera de Química Farmacéutico Biológica (QFB) y en junio de 2005 fue aprobado por el Consejo Académico de las Ciencias Biológicas y de la Salud (CAABYS). De tal manera, que a partir del semestre 06-I se inició la implantación gradual del mapa curricular del plan de estudios 2005. En este nuevo mapa curricular, la asignatura teórico-experimental de Toxicología, con clave 1614, quedó ubicada en el 6° semestre para la carrera de QFB. El diseño del actual contenido programático de la asignatura, consideró revisar los conocimientos básicos de toxicología como son citotoxicidad, bioactivación tóxica, estrés oxidante, mutagénesis, carcinogénesis y teratogénesis, para integrarlos a las etapas de estudio sobre el riesgo de exposición, toxocinética y toxodinamia de las reacciones adversas ocasionadas por xenobioticos —fármacos, metales pesados y sustancias de abuso. A través del aprendizaje de esta asignatura, se pretende contribuir al perfil del egresado en el diseño, evaluación y producción de medicamentos, producción de reactivos para diagnóstico, diagnóstico de laboratorio, investigación biomédica y conservación del medio ambiente. En consecuencia, el grupo de profesores de toxicología, en forma colegiada, decidió realizar la actualización y modificación del curso práctico, incluyendo algunos temas de interés actual en esta asignatura, y rediseñando los existentes de acuerdo a la reforma a la enseñanza experimental (Hernández y Llano, 1994). Siguiendo estos criterios, se implementaron dos nuevas prácticas con el apoyo del proyecto PE202006 a través del Programa de Apoyo a Proyectos para la Innovación y Mejoramiento de la Enseñanza (PAPIME), lo cual permitió la adquisición de equipos, materiales y reactivos para la enseñanza experimental de esta asignatura. Con base a lo anterior, los autores presentamos el “Manual de guiones experimentales para la enseñanza y aprendizaje del laboratorio de Toxicología”. Este manual está constituido por diez guiones experimentales que cubren las unidades temáticas del curso teórico (Tabla 1) y que permiten integrar, aplicar y relacionar los conocimientos teóricos adquiridos en la asignatura. Así mismo, los guiones propician la integración de algunos de los conocimientos adquiridos previamente en asignaturas como Bioquímica, Farmacología, Química Analítica, y Química Orgánica, así como su correspondiente aplicación a la resolución de problemas de esta área.



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Tabla 1. Relación entre las unidades temáticas del curso teórico y los guiones experimentales.

Curso laboratorio Guión experimental

Curso teórico Unidad temática

Extracción y cuantificación de tóxicos no volátiles en una muestra problema

Introducción a la Toxicología

Cuantificación de cianuro de hidrógeno, como tóxico volátil, a partir de glucósidos

cianogénicos

La biotransformación de xenobióticos y su importancia toxicológica.

Producción de metahemoglobina por nitritos y efecto protector del azul de metileno in vivo

La biotransformación de xenobióticos y su importancia toxicológica.

Determinación de malatión residual La biotransformación de xenobióticos y

su importancia toxicológica Determinación de la capacidad antioxidante

de la quercetina y el ácido nordihidroguayarético.

El estrés oxidante

Cuantificación de micronúcleos en eritrocitos de médula ósea como indicador de

genotoxicidad

Mutagénesis, Carcinogénesis y Teratogénesis

Efecto tóxico de plomo en ratas Toxicidad de metales pesados Efecto del pH en la liberación de plomo por

utensilios de barro vidriado Toxicidad de metales pesados

Determinación de etanol en una muestra problema

Toxicidad de sustancias de abuso

Identificación de alcaloides y barbitúricos en muestras biológicas

Toxicidad de sustancias de abuso

Los guiones experimentales se elaboraron siguiendo los criterios establecidos por la Reforma de la Enseñanza Experimental, donde la adquisición del conocimiento se da a la luz de las evidencias observables o medibles de los fenómenos que ocurren en el laboratorio. El estudiante es enfrentado a los mismos a través de un problema bien definido, el cual debe ser resuelto encontrando las relaciones causa-efecto de éstos a través del trabajo experimental. Cada uno de los guiones está estructurado de la siguiente manera: OBJETIVO ACADÉMICO. Se establece para reforzar y enriquecer los conocimientos adquiridos en las clases teóricas, así como el desarrollo de habilidades para el manejo de materiales y técnicas analíticas empleadas comúnmente para determinar y/o identificar la presencia de xenobióticos.



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PROBLEMA Se plantea con la intención de enfrentar al estudiante con fenómenos relacionados con el área que le permita adquirir los conocimientos planteados en el OBJETIVO ACADÉMICO a través del trabajo experimental; encontrando las relaciones causa-efecto y relacionando estos hallazgos con el riesgo de intoxicación y/o el potencial toxicológico.

DESARROLLO EXPERIMENTAL

Describe el procedimiento y técnicas utilizadas para el desarrollo y obtención de resultados que permitan resolver el PROBLEMA.

CUESTIONARIO Se incluye con la intención de dirigir al estudiante hacia la resolución del PROBLEMA, resaltando los aspectos vivenciales de la experiencia en el laboratorio y, de esta forma, reforzar el proceso cognoscitivo.

APÉNDICE I : CONOCIMIENTOS PREVIOS Éste apéndice contiene un listado de los conceptos indispensables para que el estudiante comprenda el guión y sea capaz de resolver el PROBLEMA planteado.

APÉNDICE II: PREPARACIÓN DE REACTIVOS En este apéndice se indican las cantidades necesarias para la preparación de los reactivos a emplear en el DESARROLLO EXPERIMENTAL.

APÉNDICE III: DISPOSICIÓN DE RESIDUOS Considerando que en cada sesión de laboratorio se generan un número importante de residuos se contempló la necesidad de indicar puntualmente cada uno de ellos así como la manera en que deberán ser confinados y etiquetados para su posterior tratamiento. Los autores consideramos importante también incluir en el presente material el Reglamento de Higiene y Seguridad de la Facultad y del Departamento de Farmacia, para concientizar a los alumnos de la relevancia y carácter obligatorio de ambos, promoviendo de esta forma el desarrollo de actitudes apropiadas para un profesionista en el área de las ciencias biológicas y de la salud.

Finalmente, los autores agradecemos el apoyo brindado a través del proyecto PAPIME No. PE202006 de la Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA) de la UNAM. Hernández Luna, M. y Llano Lomas, M. “Propuesta de Reforma de la Enseñanza Experimental”. Revista del IMIQ, Año XXV, vol. 07, 1994, pp. 5-7.



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Reglamento de Higiene y Seguridad para los Laboratorios de la Facultad de Química ARTÍCULO 1. El presente Reglamento es aplicable en todos aquellos de la Facultad de Química en donde se realice trabajo experimental, sea de docencia o de investigación. Estos sitios, para efectos del presente Reglamento, serán denominados laboratorios. Su observancia es obligatoria para el personal académico alumnos y trabajadores administrativos y no excluye otra reglamentación que resulte aplicable. ARTÍCULO 2. Es necesario que el personal que trabaja en cada laboratorio conozca el sistema de alertamiento, las zonas de seguridad, las rutas de evacuación, el equipo para combatir siniestros y las medidas de seguridad establecidas en cada laboratorio. ARTÍCULO 3. Los laboratorios deberán estar acondicionados, como mínimo con lo siguiente: a) Un control maestro para energía eléctrica b) Un botiquín de primeros auxilios c) Extintores d) Un sistema de ventilación adecuado e) Agua corriente f) Drenaje g) Un control maestro para suministro de gas h) Señalamientos de protección Civil ARTÍCULO 4. Todas las actividades que se realicen en los laboratorios deberán estar supervisadas por un responsable. Los Departamentos académicos respectivos nombrarán a dicho responsable en sus áreas correspondientes. ARTÍCULO 5. Al realizar actividades experimentales, nunca deberá estar una persona sola en los laboratorios. El mínimo de personas deberá ser, invariablemente, de 2. ARTÍCULO 6. Los usuarios deberán abstenerse de dejar, en el lugar de trabajo, cosas de valor a la vista y cerrar las puertas de cubículos y laboratorios, así como cajones y archiveros, siempre que se ausente del laboratorio. ARTÍCULO 7. Para trabajar en los laboratorios es obligatorio que los estudiantes usen bata y lentes de seguridad. En el caso del personal académico y administrativo, el equipo de protección personal, lo dictaminará la Comisión Mixta de Higiene y Seguridad. Este equipo será de uso obligatorio. El alumno que no tenga protección no podrá permanecer en el laboratorio, siendo su responsabilidad contar con el equipo mencionado. Además no podrá trabajar ni permanecer dentro de los laboratorios, si no se encuentra su profesor o alguien responsable que los sustituya. ARTÍCULO 8. En los laboratorios queda prohibido: fumar, consumir alimentos o bebidas, el uso de lentes de contacto y el uso de zapatos abiertos (tipo huarache). ARTÍCULO 9. Para realizar trabajos con material radiactivo es obligatorio aprobar el curso de su manejo, así como la obtención del dosímetro correspondiente. ARTÍCULO 10. Todas las substancias, equipos, materiales, etc., deberán ser manejados con el máximo cuidado, atendiendo a las indicaciones de los manuales de uso o de los manuales de seguridad, según el caso. ARTÍCULO 11. Las puertas de acceso y salidas de emergencias deberán de estar siempre libres de obstáculos, accesibles y en posibilidad de ser utilizadas ante cualquier eventualidad. El responsable del área deberá verificar esto, al menos una vez cada semana. ARTÍCULO 12. Las regaderas deberán contar con el drenaje correspondiente, funcionar correctamente, estar lo más alejadas que sea posible de instalaciones o controles eléctricos y libres de todo obstáculo que impida su correcto uso. El responsable del área deberá verificar esto, por lo menos una vez cada semana. ARTÍCULO 13. Los controles maestros de energía eléctrica y suministros de gas para cada laboratorio deberán estar señalados adecuadamente, de manera tal que sean identificados fácilmente. ARTÍCULO 14. En cada laboratorio deberá existir al alcance de todas las personas que en él trabajen, un botiquín de primeros auxilios. El responsable del área deberá verificar, al menos una vez cada semana, e contenido del botiquín, para proceder a reponer los faltantes. ARTÍCULO 15. Los extintores de incendios deberán ser de CO2, y de polvo químico seco, según lo determine la Subcomisión Mixta de Higiene y Seguridad y/o el Departamento de Bomberos de la Universidad; deberán de recargarse cuando sea necesario, de conformidad con los resultados de la revisión o por haber sido utilizados.



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ARTÍCULO 16. En caso de emergencias, con incendios, derrames o personas accidentadas, dirigirse a la zona de seguridad establecida y/o activar el servicio de Emergencias 55 (red digital UNAM). Al activarlo: Identifíquese: Nombre y Puesto. Ubicación: Dé el mayor número de referencias físicas posibles y las vías de acceso. Tipo de siniestro. Número de lesionados. Apoyo: Especifique si requiere apoyo adicional de vigilancia. Avisar de inmediato al encargado de la Seguridad del área y a la Coordinación de Seguridad. ARTÍCULO 17. Los sistemas de extracción de gases deberán de mantenerse siempre sin obstáculos que impidan que cumplan con su función, deberán de evaluarse al menos una vez cada mes, y deberán recibir el mantenimiento preventivo o correctivo que los responsables de cada área soliciten. ARTÍCULO 18. Tanto los sistemas de suministro de agua corriente como de drenaje, deberán de recibir el mantenimiento preventivo o correctivo que los responsables de cada área soliciten. ARTÍCULO 19. Los lugares en que se almacenen reactivos, disolventes, equipos, materiales, medios de cultivo, y todo aquello relacionado o necesario para que el trabajo en los laboratorios se lleve a cabo, estarán sujetos a este Reglamento en su totalidad. ARTÍCULO 20. Queda prohibido desechar sustancias al drenaje o por cualquier otro medio sin autorización del responsable del área correspondiente. Los manuales de prácticas correspondientes deberán incluir la forma correcta de desechar los residuos. ARTÍCULO 21. Para transferir líquidos con pipetas, deberá utilizarse la llenadora correspondiente. Queda prohibido pipetear con la boca. ARTÍCULO 22. Al finalizar las actividades en el laboratorio, el responsable del área deberá verificar que queden cerradas las llaves de gas, agua, vacío, tanques de gases y aire, según sea el caso; apagadas las bombas de vacío, circuitos eléctrico, luces, etc. En caso de requerir que algún equipo trabaje de manera continúa, deberá dejarse en el interior y en el exterior del laboratorio correspondiente, en forma claramente visible y legible, la información acerca del tipo de reacción o proceso en desarrollo, las posibilidades fuentes de problema, la manera de controlar los eventuales accidentes, y la forma de localizar al responsable del equipo. ARTÍCULO 23. Cuando se trabaje con sustancias tóxicas, deberá identificarse plenamente el área correspondiente. Nunca deberán tomarse frascos por la tapa o el asa lateral, siempre deberán tomarse con ambas manos, una en la base y la otra en la parte media. Además se deberá trabajar en área con sistema de extracción y equipo de protección personal (según el manual correspondiente). ARTÍCULO 24. En cada laboratorio de la Facultad deberá existir, de manera clara, visible y legible, la información acerca de los teléfonos de emergencia a los cuales llamar en caso de requerirlo. ARTÍCULO 25. Todas aquellas cuestiones que no estén específicamente señaladas en el presente Reglamento, deberán ser resueltas por la Dirección de la Facultad con la opinión de la Coordinación de Seguridad, Prevención de Riesgos y Protección Civil. ARTÍCULO 26. Cualquier alteración en las condiciones de seguridad o en el cumplimiento del presente reglamento, deberá ser reportado al responsable correspondiente. ARTÍCULO 27. Las personas a quienes se sorprenda haciendo mal uso de equipos, materiales, instalaciones, etc. propias de los laboratorios, de todo aquello mencionado en el artículo 2 del presente Reglamento, o de las señalizaciones instaladas para protección civil, serán sancionadas conforme a la Legislación Universitaria, según la gravedad de la falta cometida. ARTÍCULO 28. En el caso de los alumnos, las sanciones aplicables serán las que decida el H. Consejo Técnico, conforme a las disposiciones de la Legislación Universitaria. ARTÍCULO 29. Tratándose de personal académico y administrativo, se levantarán las actas correspondientes y se dictarán las sanciones conforme a las disposiciones de la Ley Federal del Trabajo. ARTÍCULO 30. Cada área académica deberá tener un Reglamento Interno de Higiene y Seguridad y será de observancia obligatoria, siendo este complementario al presente Reglamento, en tanto no lo contravengan. TRANSITORIO ÚNICO. El presente reglamento entrará en vigor el día siguiente de su publicación en la gaceta de la propia Facultad.



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Reglamento de Higiene y Seguridad de los Laboratorios del Departamento de Farmacia ARTÍCULO 1. El presente Reglamento es complementario del Reglamento de Higiene y Seguridad, para Laboratorios de la Facultad de Química de la UNAM, aprobado por el H. Consejo Técnico el 28 de abril de 1994. Su observancia es obligatoria para el personal académico, alumnos y trabajadores administrativos, y no excluye otra reglamentación que resulte aplicable. ARTÍCULO 2. REGLAS DE SEGURIDAD 2.1 Seguir todas las indicaciones de seguridad que se señalan en cada equipo o reactivo, así como las señaladas en cada práctica. 2.2 Queda prohibido correr dentro del laboratorio. 2.3 Todas las lesiones sufridas dentro del laboratorio, no importa qué tan insignificantes sean, deberán darse a conocer al coordinador del laboratorio. 2.4 Antes de desarmar o limpiar un aparato eléctrico, debe asegurarse de que esté desconectado de la corriente eléctrica. Nunca opere un equipo que desconoce, pregunte primero al laboratorista o al profesor. 2.5 No debe usarse material de vidrio roto o despostillado. 2.6 Si en su área o equipo se va a efectuar algún servicio de mantenimiento, asegúrese de dar aviso oportuno a todos los involucrados y comuníquelo a la Coordinación de Seguridad. 2.7 El alumno que necesite salir por cualquier motivo, deberá comunicarlo a los profesores. 2.8 El alumno que actúa como supervisor de cada equipo de trabajo, deberá verificar, al finalizar la práctica, el orden y la limpieza de cubículos y equipos. 2.9 Al finalizar cada sesión práctica, los alumnos entregarán al profesor responsable de la asignatura o al laboratorista en turno, los cubículos y equipos empleados, limpios y en buen estado; asimismo deberán informar cualquier defecto o anomalía detectada en los mismos. 2.10 Deberá colocar sus artículos personales en el sitio que para tal efecto se asignará en cada laboratorio. ARTÍCULO 3. MANUFACTURA DE MEDICAMENTOS 3.1 Todo el personal involucrado en la manufactura de medicamentos, deberá cubrir totalmente su cabello con una cofia limpia y en buen estado. 3.2 Deberá usar guantes de cirujano y cubrebocas limpios, en buen estado, cuando el proceso lo indique (por ejemplo, surtido y pesado de materias primas, etc.). 3.3 De preferencia debe portar zapatos cerrados con suela antiderrapante. 3.4 Queda prohibido introducir alimentos, bebidas o golosinas, excepto cuando así se requiera (Biofarmacia). 3.6 Quedan prohibidas las visitas. 3.7 Las puertas de los cubículos deben permanecer cerradas. ARTÍCULO 4. DISPOSICIÓN DE RESIDUOS BIOLÓGICOS 4.1 En caso de romper o derramar material contaminado, se deberá agregar fenol al 5% y dejar actuar el desinfectante por 10 minutos. 4.2 Queda estrictamente prohibido arrojar medio de cultivo, disolventes orgánicos o productos biológicos, al sistema de drenaje, así como a los colectores de basura; estos residuos se deberán incorporar a recipientes que se localizan en cada laboratorio, para ser dispuestos adecuadamente. 4.3 Los cultivos deben esterilizarse antes de ser desechados; si se encuentran en material desechable, éste debe depositarse en los recipientes que se localizan en cada laboratorio. Estos residuos serán reciclados. 4.4 Otros desechos orgánicos (alimentos, animales, muestras biológicas) se depositarán en los recipientes etiquetados que para este propósito se encuentran en cada laboratorio. 4.5 El material de plástico se depositará en otro recipiente especial. 4.6 El material de vidrio se colectará aparte, en el recipiente indicado. 4.7 El papel limpio de desecho se depositará en otra caja para ser reciclado. ARTÍCULO TRANSITORIO ÚNICO. El presente Reglamento entrará en vigor al día siguiente de su aprobación por el H. Consejo Técnico de la Facultad.



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REPORTE DE SEGURIDAD GRUPO:_____________ FECHA:___________________ PRACTICA:_______________________________________________________________ INTEGRANTES:___________________________________________________________ UTILIZACIÓN DE REACTIVOS.

REACTIVO Cantidad empleada Observaciones

VIGILANCIA DE EQUIPO

Equipo Hora de inicio Hora final Observaciones

MEDIDAS DE SEGURIDAD TRATAMIENTO DE RESIDUOS

OBSERVACIONES

Firma del responsable:________________________________________



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EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE TÓXICOS NO VOLÁTILES EN UNA MUESTRA PROBLEMA

OBJETIVO ACADÉMICO

Que el alumno emplee métodos de extracción ácida y básica para obtener eficientemente

tóxicos no volátiles de naturaleza ácida y básica en una muestra problema y concluya que

método de extracción es el más eficiente.

PROBLEMA

Establecer las condiciones más adecuadas para realizar una extracción mayor o igual al

90% de los tóxicos no volátiles ácidos y básicos (ácido acetilsalicílico [AAS] y cafeína)

presentes en una muestra problema. La muestra deberá trabajarla en medio ácido y medio

básico.

REACTIVOS

Ácido tartárico Cafeína Hidróxido de sodio (NaOH) Cloroformo (CHCl3) Nitrato férrico (Fe(NO3)3) Salicilato de sodio Ácido clorhídrico (HCl) Cloruro mercúrico (HgCl2) Bicarbonato de sodio (NaHCO3) Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4)

EQUIPO

Espectrofotómetro Balanza analítica Rotaevaporador Vórtex

MATERIAL

MATERIAL POR EQUIPO Gradilla 1 Piseta con agua destilada 1 Tubos de ensayo 13 x 100 4 Matraz de bola de 50 mL 2 Matraz aforado de 10 mL 2 Pipeta Pasteur 2 Matraz aforado de 25 mL 2 Probeta de 25 mL 1 Embudo de separación de 250 mL 2 Espátula 1 Matraz Erlenmeyer de 250 mL 1 Pipeta graduada de 10 mL 2 Matraz Erlenmeyer de 50 mL 2 Pipeta graduada de 5 mL 2 Anillo metálico 2 Pipeta graduada de 1 mL 1



11

MATERIAL PARA LA CURVA PATRÓN Gradilla 1 Matraz volumétrico de 10 mL 5 Matraz volumétrico de 25 mL 5 Tubos de ensayo 10 Vaso de precipitado de 100 mL 1 Pipeta graduada de 1 mL 1 Pipeta graduada de 10 mL 1 NOTA: El profesor proporcionará las celdas a los alumnos.


El profesor proporcionará 30 mL de muestra problema la cual deberá dividirse en dos

porciones de 15 mL para realizar a una porción la extracción en medio ácido y a la otra

porción la extracción en medio básico. La cuantificación de ácido acetilsalicílico (AAS) y

cafeína se determinará siguiendo los apéndices correspondientes.

A) PROCESO DE EXTRACCIÓN EN MEDIO ÁCIDO PARA TÓXICOS NO VOLÁTILES

1. Agregar ácido tartárico hasta un pH = 2.

2. La solución ácida se extrae con 2 porciones de 15 mL de CHCl3, separando las fases

orgánicas y reuniéndolas en un matraz.

3. La fase acuosa se guarda, etiquetándola como fracción A.

4. La fase orgánica se extrae con dos porciones de 10 mL de agua destilada y se reúnen las

fases acuosas con la fracción A.

5. Tratamiento de la fase orgánica: ésta fase se trata con 5 mL de una solución saturada de

NaHCO3, se separan las fases. Etiquetar la fase acuosa como fracción B. Tratar esta

fracción como se indica en el inciso C.



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5.1. Extraer la fase orgánica con 5 mL de NaOH 0.1 N. La fase acuosa resultante,

etiquetarla como fracción C y trabajarla como se indica en el inciso C. La fase orgánica

resultante marcar como R1.

6. Tratamiento de la fracción A. La fase acuosa obtenida del inciso 4 se alcaliniza hasta pH

= 10 con NaOH 2.5 N.

6.1. Extraer con dos porciones de CHCl3 de 10 mL (2 x 10 mL CHCl3) y separar las fases.

Desechar la fase acuosa resultante en el contenedor etiquetado como R2.

6.2. Concentrar la fase orgánica hasta sequedad en rotaevaporador. Etiquetar como

fracción D y tratarlo como se indica en el inciso D. El disolvente orgánico resultante que se

encuentra en el matraz de condensación debe ser desechado en el contenedor etiquetado

como R1.

B) PROCESO DE EXTRACCIÓN EN MEDIO BÁSICO PARA TÓXICOS NO VOLÁTILES

1. La muestra se ajusta a pH = 10 con NaOH 2.5 N.

2. Realizar la extracción con dos porciones de CHCl3 de 15 mL, separando las fases.

3. La fase orgánica se concentra hasta sequedad y el residuo se etiqueta como fracción E y

se trata como se indica en el inciso D.

4. La fase acuosa se etiqueta como fracción F y se trata según el inciso C.



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C) CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDO ACETILSALICÍLICO

Tratamiento de la muestra (Fracciones B, C y F)

1. Colocar 1 mL de las fracciones B, C y F en tubos de forma separada y adicionar a cada

una 5 mL del reactivo para desarrollar color (apéndice II), agite, espere 2 min.

2. Determinar la absorbancia a 540 nm. Si la lectura de absorbancia no cumple con la ley

de Lambert y Beer, realice las diluciones necesarias, repita el procedimiento y vuelva a

realizar la lectura.

3. Calcular la concentración de AAS presente en su muestra, interpolando la lectura de

absorbancia en la curva patrón.

4. Después de haber realizado la lectura y una vez obtenidos los resultados, las fracciones

B, C y F se reúnen y desechan en el contenedor etiquetado como R3.

Curva patrón del AAS

1. Solución patrón de salicilato de sodio (1000 g/mL): Pesar 25 mg de salicilato de sodio

y disolverlo. Llevar hasta 25 mL con agua destilada.

2. A partir de la solución patrón de salicilato de sodio (1000 g/mL), preparar la curva

patrón como se describe a continuación (realizar dos curvas patrón por grupo).

Alicuota de la solución patrón

(mL)

Aforo con agua destilada

Concentración (g/mL)

0.5 10 50 1 10 100 3 10 300 5 10 500 7 10 700

En un tubo de ensaye colocar 1 mL de las soluciones recién preparadas y adicionar 5 mL

del reactivo para desarrollar color (apéndice II), agitar la muestra en un vórtex durante 1



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min, esperar 2 min. y determinar la absorbancia a una longitud de onda de 540 nm,

ajustando a cero con un blanco (1 mL de agua y 5 mL del reactivo para desarrollar color).

D) CUANTIFICACIÓN DE CAFEÍNA

Tratamiento de la muestra (Fracciones D y E)

1. Disolver por separado los residuos de las fracciones D y E en 5 mL de NaOH 0.1 N.

Transferirlo a un matraz volumétrico de 25 mL y aforar con NaOH 0.1 N.

2. Determinar la absorbancia de la solución anterior a 275 nm utilizando NaOH 0.1 N

como blanco. Si la lectura de absorbancia obtenida no cumple con la ley de Lambert y

Beer, realice las diluciones necesarias con NaOH 0.1N.

3. Calcular la concentración de cafeína presente en su muestra, interpolando la lectura de

absorbancia en la curva patrón.

4. Después de haber realizado la lectura y una vez obtenidos los resultados, las fracciones

D y E se reúnen y desechan en el contenedor etiquetado como R2.

Curva patrón

1. Solución patrón de cafeína (100 µg/mL). Disolver 10 mg de cafeína anhidra en 10 mL

de NaOH 0.1 N y afore con la misma solución a 100 mL.

2. A partir de la solución patrón de cafeína (100 µg/mL) preparar la curva patrón como se

describe a continuación. Por grupo realizar dos curvas patrón.

Alicuota de la solución patrón

(mL)

Aforo con NaOH 0.1 N

Concentración (g/mL)

1 25 4 2 25 8 3 25 12 4 25 16 5 25 20

3. Determinar la absorbancia de la curva patrón a una longitud de 275 nm, ajustando a cero

con un blanco (NaOH 0.1 N).



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CUESTIONARIO

1. En el caso de emplear una muestra biológica indique ¿cuál es el objetivo de adicionar

ácido tartárico además de ajustar el pH?

2. Una vez desarrollado el guión para una eficiente extracción de un xenobiótico ¿qué

puntos del proceso y propiedades fisicoquímicas considera que son críticos?

3. Complete la siguiente tabla e indique los datos de la regresión lineal de cada curva.

Tabla 1. Curva Patrón

AAS

[μg/mL]

Abs*

curva

1

Abs*

curva

2

cafeína

[μg/mL]

Abs*

curva

1

Abs*

curva

2

50 4

100 8

300 12

500 16

700 20

Pendiente (m) Pendiente (m)

Ordenada al origen (b) Ordenada al origen (b)

Coeficiente de

correlación lineal (r)

Coeficiente de

correlación lineal (r)

*Abs: Absorbancia

Tabla 2. Lecturas de Muestras

Equipo Absorbancia de las fracciones

B C F D E

1

2

3



16

4. Interpole los datos de absorbancia de cada una de sus fracciones y calcule la

concentración de AAS y/o cafeína en su muestra indicando el procedimiento que siguió

para realizarlo.

5. ¿Es necesario considerar el factor de dilución para calcular la concentración inicial de

los xenobióticos en su muestra? Justifique su respuesta.

6. Complete las siguientes tablas y de acuerdo a los resultados grupales concluya cual es el

mejor método de extracción para los xenobióticos analizados.

Tabla 3. Resultados grupales AAS

Equipo

ácido acetilsalicílico

Extracción en medio ácido Extracción en medio básico

Concentración

(µg/mL)

Rendimiento

(%)

Concentración

(µg/mL)

Rendimiento

(%)

1

2

3

Tabla 4. Resultados grupales cafeína

Equipo

cafeína

Extracción en medio ácido Extracción en medio básico

Concentración

(µg/mL)

Rendimiento

(%)

Concentración

(µg/mL)

Rendimiento

(%)

1

2

3

7. En caso de no haber obtenido un rendimiento superior al 90% analice a que puede

atribuirse el hecho.



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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.

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Clarke, E.G.C. Screening Tests for Common Drugs. En: Isolation and identification of drugs in pharmaceuticals body fluids and post-mortem material. Vol. 1. Pharmaceutical Press, London, 1974, p 3-15.

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Florey, K. Aspirine. En: Analytical Profiles of drug substances. Vol 8. Florey, K. (Ed.). Academic Press Inc., London, 1991, pp 111.

Goodman & Gilman. Las bases farmacológicas de la terapéutica. Vol I, (9ª ed.) McGraw-Hill, Mexico, 1996, pp 669-677.

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18

APÉNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS

1. Efectos tóxicos del ácido acetilsalicílico (AAS) y de la cafeína.

2. Relación entre el pKa de una sustancia con el pH del medio en el que se encuentra

disuelto.

3. Estructura de la forma iónica y no iónica del AAS y de la cafeína.

4. Reacción de hidrólisis del AAS.

5. Valores de pKa del AAS, ácido salicílico, ácido tartárico, ácido acético y de la cafeína

6. Solubilidad de una sustancia iónica en medio acuoso y disolvente orgánico.

7. Densidad de los disolventes a emplear.

8. Fundamento de una extracción múltiple y selectiva.

9. Sustancias que pueden precipitar proteínas.

10. Esquema de los procesos de separación empleados tanto en medio ácido como en

medio básico especificando qué especies químicas se encuentran en cada uno de las

fases.

11. Propósito de lavar la fase orgánica con dos porciones de agua destilada en la extracción

en medio ácido.

12. Propósito de juntar las facciones acuosas obtenidas de la partición con CHCl3 con la

fracción A en el proceso de extracción en medio ácido.

13. Objetivo de adicionar NaHCO3 y NaOH 0.1N en el proceso de extracción ácida.

14. Naturaleza de los compuestos obtenidos en cada una de las fracciones.

15. Dibujo de la reacción de identificación y cuantificación del AAS.

16. Rango de absorbancia en el cual se cumple la ley de Lambert y Beer.

17. Razón por la cual se determinan la cafeína y el AAS a diferentes longitudes de onda.

18. Forma de obtener el rendimiento de la extracción de una sustancia.

19. El análisis de una muestra biológica de 20 mL para determinar la presencia de

salicilatos y/o cafeína arrojó las siguientes lecturas de absorbancia:



19

Tabla 1. Absorbancia y volumen final de las fracciones B,C y D

Absorbancia a = 540 nm

Volumen (mL)

Absorbancia a = 275 nm

Volumen(mL)

fracción B = 0.613 15 fracción D = 0.785 6 fracción C = 0.456 7

Para la realización de los cálculos considere el proceso de extracción en medio ácido

descrito en el guión experimental y tome en cuenta las diluciones necesarias.

Las lecturas de absorbancia de las curvas patrón para AAS y cafeína son las que se

muestran a continuación:

Tabla 2. Curva patrón

AAS Cafeína

Concentración

[g/mL]

A = 540 nm Concentración

[g/mL]

A = 275 nm

50 0.060 4 0.184

100 0.133 8 0.484

300 0.421 12 0.684

500 0.713 16 0.885

700 0.970 18 1.000

b = 5.8 x 10-3

m = 1.409 x 10-3

r= 0.999

b = 9.2 x 10-3

m = 0.0566

r =0.996

Calcule la concentración de AAS y Cafeína en la muestra inicial.



20

APÉNDICE II: PREPARACIÓN DE REACTIVOS

Reactivo para desarrollar color:

Pesar 4 g de HgCl2 y disolverlo en 12 mL de HCl 1N. Adicionar 4 g de Fe(NO3)3 y agitar

hasta su total disolución. Diluir con agua destilada a 100 mL (considerar cantidades

adicionales para el blanco y curva patrón)

Solución de hidróxido de sodio 2.5 N

Disolver 10 g de NaOH en 25 mL de agua destilada y aforar a 100 mL.

Solución de hidróxido de sodio 0.1 N

Disolver 0.4 g de NaOH en 25 mL de agua destilada y aforar a 100 mL.

Solución de ácido clorhídrico 1 M

Colocar 83 mL de HCl concentrado en un matraz aforado y adicionar agua destilada hasta 1 L.

Solución de ácido tartárico al 10%

Colocar 10 g en 100 mL de agua destilada.

Solución saturada de bicarbonato de sodio.

Colocar una cantidad aproximada de bicarbonato de sodio R.A., en 10 mL de agua

destilada, hasta que no se pueda disolver en frío.



21

APÉNDICE III: DISPOSICIÓN DE RESIDUOS

R1: Cloroformo (restos de acido acetilsalicílico y cafeína)

R2: Solución acuosa básica de NaOH (pH = 10), tartrato de sodio y restos de cafeína

ionizada, ácido acetilsalicílico y ácido salicílico.

R3: Solución acuosa con HgCl2 y Fe(NO3)3.



22

CUANTIFICACIÓN DE CIANURO DE HIDRÓGENO, COMO TÓXICO

VOLÁTIL, A PARTIR DE GLUCÓSIDOS CIANOGÉNICOS

OBJETIVO ACADÉMICO

Que el alumno determine la cantidad de cianuro de hidrógeno liberado a partir de

glucósidos cianogénicos presentes en muestras que forman parte de la dieta de humanos y

animales, y relacione la concentración con su potencial toxicológico.

PROBLEMA

Que el alumno cuantifique la concentración de cianuro de hidrógeno presente en una serie

de 2 muestras de semillas o plantas, y concluya cuál de estas muestras presentan riesgo de

toxicidad para el humano, en base a la cantidad de HCN que está presente en el consumo de

100 g de muestra.

REACTIVOS

Reactivo de Guignard * Ácido clorhídrico * (HCl)

Cianuro de potasio * (KCN) Cloroformo (CHCl3)

Carbonato de sodio (Na2CO3) Ácido pícrico

* VER APÉNDICE II

EQUIPO

Espectrofotómetro Termómetro

Estufa

MATERIAL POR EQUIPO

Tubos de ensaye 20 x150 con tapón de hule 3 Tijeras 1

Cajas Petri 1 Pinzas 1

Mortero con pistilo 1 Navaja (traer por equipo) 1



23

Tiras de papel filtro cualitativo (filtración

rápida) de 2 x 10 cm

3

Matraz Erlenmeyer de 250 mL con

tapón de hule

3

Pipeta volumétrica de 25 mL 1 Pipeta graduada de 1 mL 1

Probeta de 50 mL 1 Embudo de cola corta 3

Vaso de precipitado de 100 mL 3 Hielo (proporcionado por

laboratorista)

MATERIAL PARA LA CURVA

Matraces Erlenmeyer de 250mL con tapón de hule 6

Matraces volumétricos de 25 mL 6

Pipeta graduada de 1 mL 1

Tubos de ensaye 20 x 150 con tapón de hule. 6

Papel filtro (tiras de 2 x 10 cm) 6

NOTA: El profesor proporcionará las celdas para las lecturas

MATERIAL DE ESTUDIO

Traer por equipo aproximadamente 1g de una de las siguientes muestras: almendra de

durazno, semillas de manzana roja, almendra de ciruela pasa, semilla de lima,

almendra de capulín, almendra de cerezas.


Cada equipo trabajará con 2 muestras problema de plantas o semillas según la lista

mencionada, una de las cuales será proporcionada por el profesor.

NOTA: La solución patrón de cianuro de potasio, el ácido clorhídrico 0.5N y el agua destilada deben de estar en baño de hielo antes de realizar la parte experimental. PREPARACIÓN DE LA TIRA REACTIVA



24

1. Cortar 2 tiras de papel filtro de 2 x 10 cm. El equipo que prepare curva patrón de HCN

deberá preparar 6 tiras adicionales.

2. Sumergir las tiras de papel filtro en el reactivo de Guignard y escurrirlas, colocándolas

para su secado sobre una caja Petri.

3. Introducir las tiras en una estufa que se encuentre estable a una temperatura entre 50-

55oC, dejándolas aproximadamente 10 min cuidando que estén humedecidas.

PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS NOTA: Antes de comenzar a triturar y pesar su muestra deberán tener todos los reactivos necesarios dentro del matraz, así como lista la tira reactiva, tanto para su muestra como para la curva patrón. A cada una de las muestras se le realizará el siguiente procedimiento:

1. Medir 25 mL de agua destilada con pipeta volumétrica y agregarlos a un matraz

Erlenmeyer de 250 mL, colocar el matraz en baño de hielo.

2. Adicionar al matraz del inciso anterior 1mL de solución de HCl 0.5N y dos gotas de

CHCl3.

3. Poner con cuidado la tira reactiva de papel en el matraz como se indica en la figura 1

4. Tapar inmediatamente cada uno de los matraces Erlenmeyer con su tapón después de

concluir este procedimiento.

5. Pesar la cantidad de cada muestra de acuerdo al siguiente cuadro y colocarla en el

mortero con la ayuda de las pinzas de disección y navaja cortarla y macerarla lo más

rápido posible.

Insertar Tabla Leticia

6. Colocar rápidamente la muestra fragmentada en el matraz Erlenmeyer de 250 mL y

tapar inmediatamente.

7. Introducir simultáneamente en la estufa a 40ºC los matraces con las muestras problema y

con los correspondientes de la curva estándar de HCN durante 1 hr.



25

FIGURA 1. Preparación de la muestra en el matraz y colocación de la tira

reactiva.

PREPARACIÓN DE LA CURVA PATRÓN DE ÁCIDO CIANHÍDRICO

La curva patrón de HCN se prepara colocando en matraces volumétricos de 25 mL los

volúmenes de la solución patrón de KCN indicados en la siguiente tabla y llevando al aforo

con agua destilada:

Tabla 2. Curva patrón de HCN

Alícuota de la solución

patrón de KCN (mL)

Concentración de HCN

(g/mL)

0.0 Blanco

0.1 0.4

0.2 0.8

0.3 1.2

0.4 1.6

0.5 2

TAPON DE HULE

PAPEL FILTRO (TIRA REACTIVA)

MUESTRA



26

1. Colocar con cuidado la tira reactiva en el matraz como se indica en la figura 1 y agregar

a cada matraz 1 mL de la solución de HCl 0.5 N y dos gotas de CHCl3, cuidando de no

mojar la tira. Tapar inmediatamente cada uno de los matraces Erlenmeyer con su

tapón después de concluir este procedimiento.

2. Una vez preparadas las soluciones de la curva patrón, pasarlas inmediatamente a

matraces Erlenmeyer de 250 mL, debidamente etiquetados y colocarlos en baño de

hielo.

3. Introducir simultáneamente en la estufa a 40ºC los matraces con las muestras problema y

con los correspondientes de la curva estándar de HCN durante 1 h.

TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS PROBLEMA, CURVA PATRÓN Y

BLANCO

1. Transcurrido el tiempo de incubación, los matraces se sacan de la estufa y se dejan

enfriar. Decantar el contenido del matraz y colocar el residuo líquido en un contenedor

etiquetado como R1. El material vegetal se deja secar en la campana sobre papel

periódico para ser desechado posteriormente.

2. Introducir en un tubo de ensaye la tira reactiva positiva (procedente de muestra

problema, curva estándar ó blanco) adicionar al tubo 20 mL de agua destilada, tapar el

tubo y agitar vigorosamente. Filtrar la solución con papel filtro para eliminar residuos

de la tira de papel.

3. Determinar la absorbancia de la muestra y de la curva patrón en el espectrofotómetro a

520 nm, utilizando como blanco el primer punto de la curva.

4. Después de haber realizado la lectura y una vez obtenido resultados, la mezcla se coloca

en un contenedor etiquetado como R2.



27

CUESTIONARIO

1. Reporte en la siguiente tabla los valores de absorbancia obtenidos, e indique los valores

de la regresión lineal.

Tabla 1. Absorbancias de la curva patrón

HCN

[μg/mL] Absorbancia

0.4

0.8

1.2

1.6

2

Pendiente (m)

Ordenada al origen (b)

Coeficiente de correlación lineal (r)

2. Interpole sus valores de absorbancia en la curva y calcule la concentración de HCN en

mg/100g de muestra, indicando el procedimiento realizado para esta determinación.

3. Reporte los resultados obtenidos en su grupo y llene la siguiente tabla:

Tabla 2. Resultados grupales

Equipo Material

vegetal

Concentración de HCN

(µg/mL)

mg HCN/100 g de

muestra

Riesgo de

toxicidad*

1

2

3

* alto ≥ 10 mg/100g de muestra; bajo < 10 mg/100g de muestra



28

4. Indique cuáles muestras representan un riesgo potencial en caso de su consumo.

5. ¿Cómo podría eliminar la presencia de glucósidos cianogénicos de sus muestras?

6. Proponga un método para extraer tóxicos volátiles a partir de una muestra.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Fabre, R. Y Truhaht, R. Tratado de toxicología. Vol. I. Paraninfo, S.A., Madrid, 1976, pp 311332.

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Harborne, J.B. Cyanogenic glucosides and their function. En: Phytochemical ecology. Academic Press, London, 1972, 104123.

Linder, E. Toxicología de los alimentos. Ed. Acribia, Zaragoza, 1978, pp 15-19. Lucas, B. Sotelo, A. (1984). A simplified test for the quantitation of cianogenic glucosides

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Food Safety Handbook: Science, International Regulation, and Control. Younes, M., Fishbein, L., Miller, S., (Eds.). Marcel Dekker, Inc, New York, 1999, pp 368380.

Vetter, J. (2000). Plant cyanogenic glycosides. Toxicon 38, 1136.



29


1. Estructura de un glucósido cianogénico.

2. Hidrólisis enzimática de un glucósido cianogénico.

3. Importancia toxicológica de los glucósidos cianogénicos.

4. Reacción de Guignard para la detección de HCN.

5. Importancia que tiene durante la práctica que la trituración de la muestra se realice

rápidamente y sea colocada en baño de hielo.

6. Razón por la cual la tira reactiva no debe tocar la solución en que se encuentra la

muestra.

7. Razón por la cual se da una reacción positiva sin que la tira reactiva esté en contacto

con la muestra.

8. Razón por la cual es necesario colocar las soluciones de cianuro de potasio y el HCl

0.5N empleadas en la preparación de la curva patrón en baño de hielo.

9. Propósito de agregar HCl y CHCl3 a la muestra y a la curva patrón.

10. Propósito de calentar la muestra a 40C en la estufa.

APÉNDICE II: PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

Reactivo de Guignard

Colocar 2.5 g de ácido pícrico en un matraz Erlenmeyer de 250mL y disolver con 200mL

de agua destilada. Enseguida agregar 12.5 g de carbonato de sodio (Na2CO3) y agitar

cuidadosamente para disolverlo. Llevar la solución a un volumen de 500 mL con agua

destilada.

NOTA: Manejar con cuidado el ácido pícrico, ya que esta sustancia es cancerígena y se absorbe fácilmente por la piel.

Solución patrón de cianuro de potasio.(KCN)

Se pesa exactamente 12.05 mg de KCN transferir la pesada cuidadosamente a un matraz

aforado de 50mL, disolver y aforar con agua destilada.



30

NOTA: A pesar de que la concentración utilizada de KCN en este guión es de aproximadamente 0.24 mg/mL y esta concentración está por debajo de la DL50 en ratones, no deberá descuidar las medidas de seguridad para su trabajo.

Solución Ácido clorhídrico 0.5 N. (HCl)

Medir 42.5 mL de HCl concentrado (densidad: 36.46g/100mL) y vaciar a un matraz

volumétrico de 1000 mL que contiene aproximadamente 500mL de agua destilada, aforar

enseguida con agua destilada.


R1: Solución acuosa de HCl (0.5 N), KCl, KCN.

R2: Solución de ácido pícrico, Na2CO3, restos de isopurpurina.



31

PRODUCCION DE METAHEMOGLOBINA POR NITRITOS Y EFECTO

PROTECTOR DEL AZUL DE METILENO IN VIVO

OBJETIVO ACADEMICO

Que el alumno observe la formación de metahemoglobina (MHb) como consecuencia de la

administración de nitrito de sodio y el efecto protector del azul de metileno.

PROBLEMA

Determinar cuantitativamente, en ratas tratadas con NaNO2, la reducción en el porcentaje

de MHb debida a la administración de azul de metileno.

REACTIVOS.

Heparina 1000 UI o EDTA al 10% Solución amortiguadora de fosfatos*

Cianuro de potasio* (KCN) Ferricianuro de potasio* (K3[Fe(CN)6])

Solución salina isotónica (SSI) Nuevo azul de metileno*

Ácido acético glacial (CH3COOH) Nitrito de sodio* (NaNO2)

Hidróxido de amonio (NH4OH) Éter dietílico

*Ver APÉNDICE II

EQUIPO.

Espectrofotómetros UV-Vis

Centrífugas

Balanza para pesar animales

MATERIAL.

Jeringa de insulina (traer por equipo) 3 Jeringa de 3 mL (traer por equipo) 3

Tubos de ensaye 13x100 10 Tijeras de disección 1

Pinzas de disección 1 Tabla de disección 1



32

Caja de contención 1 Rejilla 1

Pipeta graduada de 5 mL 2 Pipeta graduada de 1 mL 1

Pipeta graduada de 0.1 mL 1 Tubos de ensaye 16 x 150 3

ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN

3 Ratas Wistar macho de 200-250 g (por equipo).

PARTE EXPERIMENTAL

1. Pesar cada uno de los animales e identificarlos como I, II y III.

2. Administrar a la rata III, por vía intraperitoneal (i.p.) una dosis de 2 mg/Kg de la

solución de azul de metileno y 15 minutos después administrar por la misma vía, 50

mg/Kg de la solución de nitrito de sodio.

3. Administrar a la rata I por vía i.p. 1 mL/Kg de SSI.

4. Administrar a la rata II por vía i.p., 50 mg/Kg de la solución de nitrito de sodio.

5. Dejar transcurrir 30 min después de la administración.

6. Preparar 3 jeringas con 0.1mL de solución de heparina o EDTA y 3 tubos de ensaye

con 0.3 mL del mismo anticoagulante e identificarlos de acuerdo al número de rata

correspondiente.

7. Anestesiar a cada rata con éter, colocarla en la tabla de disección y extraer de cada una,

por punción cardiaca 1 mL de sangre.

8. Colocar la muestra sanguínea en el tubo correspondiente. QUITAR LA AGUJA DE

LA JERINGA PARA EVITAR HEMOLIZAR LA MUESTRA SANGUINEA.

MEZCLAR LOS TUBOS PERFECTAMENTE POR INVERSIÓN PARA

EVITAR LA COAGULACIÓN DE LAS MUESTRAS.

9. Depositar las jeringas y las agujas en el contenedor para residuos peligrosos biológico-

infecciosos (RPBI). Envolver los restos de los animales de experimentación en una

hoja de papel periódico y colocarlos en la caja de contención para su posterior

incineración.



33

10. Determinar el contenido de metahemoglobina y hemoglobina total de cada muestra

como se indica a continuación:

a) Colocar 4.9 mL de solución amortiguadora de fosfatos pH 6.6 en un tubo de

ensaye.

b) Agregar 0.1 mL de sangre. Conservar el resto de la muestra hasta el final de la

determinación y después desactivar con hipoclorito de sodio (NaClO).

c) Mezclar y dejar reposar durante 5 minutos.

d) Centrifugar a 2500 rpm durante 10 minutos.

e) Separar el sobrenadante.

f) Medir la absorbancia del sobrenadante a 630 nm (lectura A1), contra un blanco de

solución amortiguadora de fosfatos.

g) Pasar la solución a un tubo limpio.

h) Agregar una gota de la solución neutralizada de KCN al sobrenadante y al blanco.

i) Mezclar y dejar reposar 2 minutos.

j) Determinar nuevamente la absorbancia a 630 nm (lectura A2). Recuperar la

solución en el mismo tubo.

k) Agregar una gota de NH4OH concentrado al tubo del inciso i, y mezclar.

l) Transferir 2 mL de la solución del tubo del inciso k, a otro tubo y agregar 8 mL de

la solución amortiguadora y 0.1 mL de la solución de K3[Fe(CN)6] al 20% en

solución acuosa. Desechar el sobrante de la solución proveniente del inciso k en el

contenedor etiquetado como R1.

m) Preparar un blanco empleando 2 mL de agua destilada, 8 mL de solución

amortiguadora y 0.1 mL de la solución de K3[Fe(CN)6] al 20% en solución acuosa.

n) Después de 2 minutos agregar una gota de la solución neutralizada de KCN a cada

tubo (blanco y problema).

o) Mezclar, esperar 10 minutos y determinar la absorbancia a 540 nm, contra su

respectivo blanco (lectura A3). Después de haber realizado la lectura y una vez

obtenidos los cálculos, desechar el contenido de la celda y el resto de la solución

del inciso n en el contenedor etiquetado como R1.



34

NOTA: Todo material de vidrio que estuvo en contacto con muestras sanguíneas deberá

ser inactivado con NaClO previamente a su lavado.

11. Cálculos:

Hemoglobina total (Hbt) en g/100 mL = A3 x 37.4

Metahemoglobina total (MHbt) en g/100 mL = (A1 - A2) 23.4

Porcentaje de MHb en sangre total (%MHbt) = (MHbt) x 100/Hbt



35

CUESTIONARIO

1. Reporte los resultados grupales en las siguientes tablas:

Tabla 1. Lecturas espectrofotométricas

Equipo SSI NaNO2

Azul de metileno + NaNO2

A1 A2 A3 A1 A2 A3 A1 A2 A3

1 2 3

Tabla 2. Determinaciones de Hb y MHb totales

Eq SSI NaNO2

Azul de metileno + NaNO2

Hbt (g/100 mL)

MHbt (g/100mL)

Hbt (g/100 mL)

MHbt (g/100mL)

Hbt (g/100 mL)

MHbt (g/100mL)

1 2 3

Prom SD

%CV Tabla 3. Comparación del porcentaje de MHb en los diferentes tratamientos

Equipo SSI NaNO2 Azul de metileno + NaNO2

%MHbt %MHbt %MHbt 1 2 3

Prom SD

%CV

2. Graficar los resultados promedio de Hbt y MHbt para cada tratamiento

3. Graficar los resultados porcentuales de MHbt para cada tratamiento

4. ¿Qué efecto observó en el %MHbt en la rata II? A qué lo atribuye?

5. ¿Qué efecto observó en el %MHbt en la rata III? A que lo atribuye?



36

6. ¿Observó algún cambio en la cantidad de Hbt en función de los xenobióticos

administrados?, ¿Por qué?

7. ¿Por qué es necesario comparar la cantidad de MHbt en valores porcentuales?


Dreisbach, R. H. y Robertson, W.O. Tratamiento de los envenenamientos. En: Manual de toxicología clínica, prevención diagnóstico y tratamiento. Editorial El Manual Moderno (6ª ed.), México, D.F. 1988, pp 6870.

Hall R., Malia, R.G. Investigation of hemolitic anaemias. Medical Laboratory Hematology. Ed. Butterworths, Gran Bretaña. 1984, pp 327333.

Klassen, C.D., Watkins, J.B. Casarett & Doull, Manual de Toxicología. Ed. McGraw-Hill Interamericana (5ª ed.), México. 2001, pp 394395.

Stahr, H. M. Inorganic and other Analisis. Analitical Methods in toxicology. Ed. John Wiley and sons, inc., USA. 1991, pp 57.



37


1. Efectos tóxicos de una intoxicación por nitritos.

2. Efectos tóxicos de una intoxicación con azul de metileno.

3. Esquema que explique el efecto protector del azul de metileno en una intoxicación por

nitritos.

4. Fundamento de los métodos analíticos para determinar hemoglobina total y

metahemoglobina en sangre.

5. Especies que se determinan en A1, A2 y A3.

6. Propósito de agregar la solución amortiguadora de fosfatos pH 6.6, NH4OH en el paso

“k” de su técnica, K3[Fe(CN)6] y KCN.


a) Solución amortiguadora de fosfatos pH = 6.6.

Realizar una primera solución amortiguadora de fosfatos, disolviendo 3.8 g de fosfato

disódico anhídro (Na2PO4) y 5.44 g de fosfato monopotásico anhídro (KHPO4) en 1000

mL de agua destilada. Mezclar una parte de la solución anterior con tres partes de agua

destilada y ajustar el pH a 6.6.

b) Solución de cianuro de potasio neutralizada.(KCN)

Mezclar una parte de una solución de cianuro al 10% y otra parte de ácido acético glacial al

12% (v/v).

NOTA: Tanto el cianuro de hidrógeno como los cianuros sólidos o en disolución son tóxicos por absorción por la piel, ingestión e inhalación.

c) Solución de ferricianuro de potasio al 20%. (K3[Fe(CN)6])

Preparar 10 mL de ésta solución.



38

d) Solución Salina Isotónica (SSI)

Preparar 50 mL de ésta solución o comprar una presentación comercial.

e) EDTA al 10%. (Preparar sólo en caso de no haber heparina, consultar con el

laboratorista o el profesor)

Pesar 1 g de EDTA y disolver en agua destilada, aforar a 10 mL.

f) Solución de nuevo azul de metileno en SSI (4 mg/mL)

Preparar 10 mL de ésta solución, pesando 40 mg de nuevo azul de metileno y disolviendo

en 10 mL de SSI.

g) Solución de nitrito de sodio (NaNO2) en SSI (100 mg/mL)

Preparar 10 mL de ésta solución, pesando 1 g de NaNO2 y disolviéndolos en 10 mL de

solución salina isotónica.


R1: Solución amortiguadora de fosfatos pH 6.6, KCN, NH4OH, K3[Fe(CN)6] y residuos de sangre.



39

DETERMINACION DE MALATION RESIDUAL

OBJETIVO ACADÉMICO

Que el alumno sea capaz de extraer y cuantificar un xenobiótico empleando sus

propiedades ácido-base y reacciones de degradación.

PROBLEMA

Cuantificar malatión residual en la superficie de vegetales comestibles y reportar un

porcentaje de recuperación mayor o igual al 75% en la muestra control. Relacionar la

cantidad de insecticida presente en ambas muestras con el riesgo toxicológico de su

consumo.

MATERIAL VEGETAL

Traer por equipo 50 g de cáscara de limón, calabaza ó chayote; o bien 50 g de hojas

externas de col o coliflor.

MATERIAL POR EQUIPO

Frasco de vidrio de boca ancha con

tapa (traer por equipo)

2

Probeta graduada de 25 mL

1

Pipeta volumétrica de 10 mL 1 Tubo de ensaye de 16 x 150 2

Pipeta graduada de 1 mL 3 Vasos de precipitado de 100 mL 2

Pipeta graduada de 5 mL 2 Propipeta 1

Pipeta graduada de 10 mL 2 Soporte universal con anillos de fierro 2

Embudo de filtración rápida 2 Embudo de separación de 125 mL 2

Probeta graduada de 50 mL 1 Papel filtro



40

MATERIAL PARA LA CURVA

Embudo de separación de 125 mL 3 Pipeta graduada de 5 mL 1

Tubo de ensaye de 16 x 150 3 Vasos de precipitado de 100 mL 3

Embudo de filtración rápida 3

REACTIVOS

Sulfato de sodio* (NaSO4) Malatión al 50%

Hidróxido de sodio* (NaOH) Fenoftaleína*

Cloruro férrico* (FeCl3) Etanol (EtOH)

Sulfato cúprico* (CuSO4) Tetracloruro de carbono (CCl4)

Acetona Disulfuro de carbono (CS2)

* Ver APÉNDICE II


1. Colocar 25 g del material de estudio (únicamente la cáscara o superficie del vegetal) en

un frasco de vidrio de boca ancha y añadir 30 mL de CCl4, tapar y agitar

vigorosamente durante 5 minutos.

2. Filtrar y recolectar cuando menos 20 mL. (Medir el volumen exacto con una probeta).

3. Desechar el material vegetal tratado con CCl4 colocándolo sobre un papel periódico,

identificar como R1 y colocar en la campana. Al finalizar la sesión los responsables de

seguridad e higiene deberán colocar R1 en una bolsa de plástico y cerrarla.

4. Preparar un tubo problema con 10 mL del extracto filtrado midiendo con pipeta

volumétrica. Adicionar a cada tubo 0.2 mL de solución de CS2 al 0.5% y 5 mL de

etanol. Pasar esta mezcla a un embudo de separación y agitar suavemente.

5. Adicionar 15 mL de solución ácida de Na2SO4 al 9% y agitar cuidadosamente el

embudo por 1 minuto.



41

6. Colectar la fase orgánica en un vaso de precipitado y filtrarla transfiriéndola

nuevamente al embudo de separación enjuagado previamente con acetona. Etiquetar la

fase acuosa como R2.

7. Añadir 5 mL de etanol, agitar y añadir 0.2 mL de NaOH 6N. Agitar nuevamente por 5

minutos, dejar reposar durante 1 minuto y adicionar 15 mL de solución de Na2SO4 al

9%. Mezclar, separar las fases, recolectar la fase acuosa y desechar la fase orgánica

etiquetándola etiquetar como R3.

8. Añadir 5 mL de CCl4 a la fase acuosa y una gota de indicador fenoftaleína al 1%.

Neutralizar gota a gota con HCl 6N con agitación continua hasta la desaparición del

color azul violeta.

9. Añadir 0.2 mL de solución de FeCl3, agitar y desechar la fase orgánica en el recipiente

etiquetado como R3.

10. Añadir a la fase acuosa 5 mL de CCl4 y 0.3 mL de solución de CuSO4 al 3.5% y agitar.

Colectar la fase orgánica y desechar la fase acuosa etiquetándola como R4.

11. Leer la fase orgánica en el espectrofotómetro a 416 nm, ajustando previamente a 100%

de transmitancia con CCl4.

12. Una vez que se obtengan los resultados finales desechar la fase orgánica etiquetándola

como R5.

PROCEDIMIENTO PARA LA CURVA PATRÓN

Preparar la curva patrón de la siguiente forma:

Tabla 1. Procedimiento para la curva patrón de malatión

Tubo Reactivos Concentración

1 1 mL de solución patrón de malatión + 4 mL de etanol 8 g/mL

2 2.5 mL de solución patrón de malatión + 2.5 mL de etanol 20 g/mL

3 5.0 mL de solución patrón de malatión 40 g/mL



42

Colocar el contenido de cada tubo en un embudo de separación. Adicionar 10 mL de CCl4 y

0.2 mL de solución de CS2 al 0.5%. Agitar suavemente y continuar el procedimiento como

en la muestra a partir del inciso 5.


Adrien. A. Selective Toxicity: the physicochemical basis of therapy. Ed. Chapman and Hall (6a ed.), London, 1979, pp 455463.

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York, 1971.



43

CUESTIONARIO

1. Reporte sus resultados en la siguiente tabla:

Tabla 1. Resultados Malatión (µg/mL) %Transmitancia Absorbancia

8 20 40

Muestra 1 Muestra 2

Pendiente (m) Ordenada al origen (b)

Coeficiente de correlación lineal (r)

2. Explique por qué se determinan las lecturas en transmitancia.

3. Indique el procedimiento que siguió para realizar los cálculos de concentración de

malatión en sus muestras.

4. Reporte los resultados grupales en la siguiente tabla:

Tabla 2. Resultados grupales Equipo Material

vegetal Malatión (µg/mL)

Rendimiento Malatión en la muestra (ppm)

Riesgo tóxico*

1

---

2

---

3

---

* Alto ≥ 8 ppm; bajo < 8 ppm

5. De acuerdo a los resultados obtenidos concluya si existe un riesgo toxicológico por el

consumo del material vegetal analizado.

6. En caso de encontrar una baja concentración en alguna de las muestras. Comente como

influiría cada uno de estos factores en el resultado del análisis: A) estabilidad del



44

compuesto, B) el desarrollo experimental realizado, C) cumplimiento de las normas de

aplicación del pesticida en cuestión.


1. Usos y propiedades biológicas del malatión.

2. Ventajas que presentan los pesticidas organofosforados con relación a los

organoclorados.

3. Mecanismo de toxicidad del malatión en el insecto.

4. Mecanismo de potenciación del efecto tóxico del malatión en insectos.

5. Enzimas involucradas en la destoxificación del malatión en insectos y en mamíferos.

6. Comparación de los valores de DL50 para mamíferos y para insectos.

7. Propósito de adicionar los siguientes reactivos: CCl4, CS2, EtOH, solución ácida Na2SO4

al 9% , NaOH, solución Na2SO4 9%, fenoftaleína, HCl, FeCl3 y CuSO4.

8. Dibuje la reacción que se lleva a cabo con el malatión en medio básico y presencia de

etanol .

9. Estructura del compuesto de coordinación que se forma durante la práctica con los

productos de la reacción anterior y el catión Cu2+, Relación matemática entre

absorbancia y transmitancia.

10. Límites permitidos de acuerdo a la NOM vigente para el malatión.


Solución patrón de malatión 40 g/mL

Medir 0.1 mL de malatión al 50% y aforar con etanol a 100 mL. De esta solución medir 8

mL y aforar a 100 mL con etanol.

Nota: El malatión es inhibidor de la colinesterasa y se absorbe fácilmente por piel y vias respiratorias, se debe extremar cuidado con su contacto directo. Sus efectos agudos incluyen convulsiones, coma y fallo respiratorio.



45

Disulfuro de carbono al 0.5% (CS2)

Para preparar 100 mL, medir 0.5 mL de CS2 y aforar a 100 mL con CCl4.

Nota: El CS2 es altamente tóxico, se absorbe por piel y vías respiratorias. Sus efectos tóxicos incluyen irritación de membranas, nausea, vómito, pérdida de conocimiento y convulsiones.

Sulfato de sodio al 9% (Na2SO4)

Para preparar 100 mL, pesar 9 g de Na2SO4 y aforar a 100 mL con agua destilada.

Solución ácida de sulfato de sodio

A 100 mL de solución de Na2SO4 al 9% adicionar 3 mL de HCl concentrado.

Hidróxido de sodio 6N (NaOH)

Para preparar 100 mL, pesar 24 g de NaOH y aforar a 100 mL con agua destilada.

Ácido clorhídrico 6N (HCl)

Para preparar 100 mL, medir 48.5 mL de HCl concentrado y aforar a 100 mL con agua

destilada.

Cloruro férrico al 5% (FeCl3)

Para preparar 100 mL, pesar 5 g de FeCl3 y disolver en 1 mL de HCl 6N, aforar a 100 mL

con agua destilada.

Sulfato cúprico al 3.5% (CuSO4)

Para preparar 100 mL, pesar 3.5 g de CuSO4 y aforar a 100 mL con agua destilada.

Fenolftaleína al 1%

Para preparar 100 mL, pesar 1 g y aforar a 100 mL con EtOH.



46


R1: Material vegetal con CCl4

R2: Solución ácida de Na2SO4 al 9% y EtOH

R3: CCl4 y subproductos orgánicos de hidrólisis ácida

R4: CuSO4, FeCl3, Na2SO4, fenoftaleína, H2O

R5: CCl4 y compuesto de coordinación de cobre



47

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LA QUERCETINA Y EL ÁCIDO NORDIHIDROGUAYARÉTICO

OBJETIVO ACADÉMICO

Que el alumno sea capaz de determinar la capacidad antioxidante de sustancias químicas.

PROBLEMA

Determinar la capacidad antioxidante de la quercetina y el ácido nordihidroguayarético

mediante la reducción en la producción de anión superóxido utilizando el sistema xantina-

xantina oxidasa-nitroazul de tetrazolio.

REACTIVOS

Xantina (Xan) Carbonato de sodio (Na2CO3)

Xantina oxidasa (XO) Bicarbonato de sodio (NaHCO3)

Nitroazul de tetrazolio (NAT) EDTA

Quercetina Nitrato de cobre (Cu(NO3)2)

Ácido nordihidroguayarético (ANDG)

EQUIPO

Balanza analítica Potenciómetro

Espectrofotómetro

MATERIAL POR EQUIPO

4 Tubos Eppendorf 1.5 mL 1 gradilla

1 micropipeta de 100-1000 l 1 espátula de cromo níquel

1 micropipeta de 10-100 l 1 nave de pesado

1 celda 2 matraces de 250 mL



48


1. Todo el material de vidrio deberá ser enjuagado previamente con EDTA.

2. Marcar 4 tubos Eppendorf como control positivo (C+), control negativo (C-), quercetina

y ANDG.

3. Preparar los tubos de acuerdo a la siguiente tabla, siguiendo el orden de adición indicado

en la columna reactivo.

Tabla 1. Preparación de los tubos problema y control

Tubo Reactivo

Control positivo

(L)

Control negativo

(L)

Antioxidante 0.25 M

quercetina (L) ANDG (L)

a. Xantina 100 100 100 100 b. EDTA 100 100 100 100 c. Solución

amortiguadora 300 600 200 200

d. NBT 300 300 300 300 e. Antioxidante - - 100 100 f. XO* 300 - 300 300 g. Agitar e Incubar ** 1h 1h 1h 1h h. Cu(NO3)2 200 200 200 200

* Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo.** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversión e incubar a 24-30°C

4. Transcurrido el tiempo de incubación leer las diferentes muestras a 560 nm empleando

como blanco una solución amortiguadora de carbonatos pH 10.2.

5. Interpretar los resultados obtenidos considerando que el control positivo representa el

100% de formazán en el sistema Xan-XO-NAT de acuerdo a la siguiente fórmula.

% atrapamiento= 100 - [(AM) x100/A C+] En donde: AM= absorbancia de la quercetina y/o ANDG A C+= absorbancia del control positivo

6. Una vez obtenidos los resultados desechar el contenido de los tubos en un frasco

etiquetado como R1.

7. Depositar las puntas y los tubos Eppendorf en un contenedor proporcionado por el

profesor.



49

CUESTIONARIO


Tabla 1. Resultados por equipo

Control positivo

(C+)

quercetina ANDG

Absorbancia

% Atrapamiento 0 %

2. ¿Cuál de los dos antioxidantes muestra una mayor capacidad atrapadora del radical O2

•-

3. ¿Considera que el consumo habitual de estos antioxidantes contribuiría a disminuir el

estrés oxidante?. Justifique su respuesta.



Equipo % de Atrapamiento

quercetina ANDG

1

2

3

4

promedio

desviación estándar

4. En caso de que los resultados grupales muestren una elevada variabilidad discutan a que

factores se podría atribuir ese comportamiento.



50

BIBLIOGRAFÍA

Cadenas, E. Packer L. Handbook of Antioxidants. Marcel Dekker, Inc., New York, 2002. Klaassen, C.D., Watkins, J.B. Manual de Toxicología de Casarett & Doull: la ciencia

básica de los tóxicos. (5ª ed.) McGraw-Hill, México, 2001. Klassen, C.D. Casarett and Doull’s Toxicologia. La ciencia de los venenos. (6a ed.). Ed.

Mc Graw Hill, Interamericana 2001. Martínez-Flórez, S., González-Gallego, J., Culebras, J. M., y Tuñón, M.ª J. (2002). Los

flavonoides: propiedades y acciones antioxidantes. Nutrición Hospitalaria. XVII, 271278.

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World Health Organization monographs on selected medicinal plants. Volume 1. 1999, Geneva. Pp 16-32.



51


1. Definición del proceso de estrés oxidante.

2. Reacción catalizada por la XO.

3. Concepto de radical libre y especies reactivas.

4. Concepto de antioxidante.

5. Reacción de Fenton.

6. Propósito de la adición secuencial de: xantina, EDTA, solución amortiguadora de

carbonatos pH 10.2, nitroazul de tetrazolio, XO y Cu(NO3)2.

7. Completar los productos en el siguiente diagrama.

+

8. Especie química que absorbe a 560 nm.


1. Xantina 1.5 mM

Pesar 22.7 mg de xantina, agregar Na2CO3 0.4 M hasta solubilizar y aforar a 50 mL con

solución amortiguadora de carbonatos.

2. Solución amortiguadora de bicarbonato de sodio-carbonato de sodio 84 mM, pH 10.2

Pesar 970 mg de NaHCO3 y 1.01 g de Na2CO3, disolverlos con agua destilada. Ajustar pH a

10.2 y aforar a 250 mL.



52

3. Nitroazul de tetrazolio 0.1 M

Pesar 41 mg de nitroazul de tetrazolio y aforar a 50 mL con agua destilada. Guardar la

solución en un frasco ámbar en el refrigerador.

4. EDTA 0.1 mM

Pesar 33.6 mg de EDTA, disolver con agua destilada, aforar a 1L.

5. Xantina oxidasa

La enzima se preparará durante la sesión de laboratorio de acuerdo a la indicación de los

profesores.

6. Nitrato de cobre 0.2 mM (Cu(NO3)2)

Pesar 4 mg de Cu(NO3)2 y aforar a 100 mL con agua destilada.

7. Quercetina 0.25 M

Pesar 1.4 mg de quercetina y aforar a 250 mL con solución amortiguadora de carbonatos

pH 10.2 (solución stock).

8. ANDG 0.25 M

Pesar 1.3 mg de ANDG y aforar a 250 mL con solución amortiguadora de carbonatos pH

10.2 (solución stock)


R1: xantina, xantina oxidasa, EDTA, solución amortiguadora de carbonatos pH 10.2,

nitroazul de tetrazolio, quercetina, ácido nordihidroguayarético, Cu(NO3)2, formazán, ácido

úrico, H2O2.



53

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD GENOTÓXICA DE LA CICLOFOSFAMIDA

UTILIZANDO LA TÉCNICA DE MICRONÚCLEOS EN MÉDULA ÓSEA

OBJETIVO ACADÉMICO

Que el alumno sea capaz de determinar la actividad genotóxica de un xenobiótico

empleando la técnica de cuantificación de micronúcleos en médula ósea de ratón.

PROBLEMA

Identificar la presencia de micronúcleos, inducidos por ciclofosfamida, en eritrocitos

policromáticos de médula ósea murina.

ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN

1 ratón ICR por equipo administrado 24 horas antes con ciclofosfamida con una dosis de 40

mg/Kg i.p. o un ratón ICR control negativo no tratado.

MATERIAL POR EQUIPO

Tijeras de disección 2 Portaobjetos 6

Pinzas de disección 2 Pipeta Pasteur 4

Bulbo para Pipeta Pasteur 4 Contador de células 1

Microscopio de Contraste 2

REACTIVOS

Solución salina isotónica (SSI) Colorante de giemsa 2 %

Aceite de inmersión. Etanol (EtOH)

Solución amortiguadora de fosfatos pH=6.8



54


NOTA: El siguiente protocolo requiere que no pasen más de 30 minutos entre los pasos 1 y 9. 1. Sacrificar al ratón por dislocación cervical.

2. Una vez muerto el animal de experimentación fijarlo a la mesa de trabajo.

3. Dislocar la articulación del fémur con la cadera, estirando las patas traseras del animal.

4. Diseccionar y extraer el fémur cortando por arriba de la cresta iliaca (en la cadera) y por

debajo de la rodilla.



55

5. Limpiar cuidadosamente cada fémur con papel hasta eliminar totalmente todo el tejido

muscular. Para facilitar la eliminación del tejido muscular, tomar la parte que queda

debajo de la rodilla y rotarla al lado contrario del movimiento natural de la articulación

de la rodilla y el femur.

6. Una vez limpio, cortar cuidadosamente ambas epífisis y lavar el interior del fémur con 3

mL de SSI empleando una jeringa de 3 mL con aguja del número 21. Recolectar y reunir

en un mismo tubo de 13 x 100, la médula de cada fémur.

7. Envolver los restos del animal de experimentación en una hoja de papel periódico,

colocarlos en la caja de contención para su posterior incineración.

8. Centrifugar a 3000 rpm durante 5 min el tubo que contiene la médula (tubo del inciso 6),

extraer el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta Pasteur y resuspender el botón

en una gota de SSI. Depositar el sobrenadante en una solución de hipoclorito de sodio.



56

9. Realizar 4 extendidos de la siguiente manera: colocar en la orilla de un portaobjetos una

gota de la suspensión de médula ósea y un segundo portaobjetos justo atrás de la gota en

ángulo de 45°. Dejar que la muestra se distribuya por capilaridad y deslizar suavemente

para formar una delgada capa de células.

10. Secar completamente los extendidos al aire.

11. Adicionar por goteo EtOH a las laminillas hasta cubrir la superficie y secar al aire.

Repetir esta operación durante 5 minutos.

12. A cada laminilla adicionar dos o tres gotas de colorante giemsa 2% y cubrir con un

cubreobjetos, dejar reposar durante 10 minutos.

13. Retirar cuidadosamente el cubreobjetos, y enjuagar la laminilla con agua destilada.



57

14. Cubrir la laminilla con solución amortiguadora de fosfatos pH 6.8 durante 5 minutos.

15. Enjuagar la laminilla una vez más con agua destilada y secar al aire.

16. Observar al microscopio con aceite de inmersión, y registrar los siguientes datos:

El número de eritrocitos policromáticos por cada 200 eritrocitos totales.

El número de eritrocitos policromáticos micronucleados por cada 1000 eritrocitos

policromáticos.

NOTA: Debido a que el conteo de los micronúcleos se debe realizar al ciego, el alumno no sabrá hasta el final de la práctica si el animal de experimentación proporcionado ha sido tratado o no con ciclofosfamida.

Eritrocito Policromático Micronucleado

Eritrocito Normocromático

Eritrocito Policromático

Eritrocito Normocromático Micronucleado



58

CUESTIONARIO

1. Con base a la experiencia adquirida, indique dos características que le permitan

identificar un micronúcleo y diferenciarlo de un artefacto producto de la tinción.


Tabla 1. Resultados por equipo

EPCa/ ETb EPCMNc/ EPC Laminilla 1 Laminilla 2 Laminilla 3 Laminilla 4 Sumatoria /200 ET /1000 EPC

a) EPC: Eritrocitos policromáticos, b) ET: Eritrocitos totales, c) EPCMN: Eritrocitos policromáticos micronucleados



Ciclofosfamida EPCa/ ETb EPCMNc/ EPC Promedio /200 ET /1000 EPC

Datos teóricos de los individuos control Control (-) n=3 Promedio 116/200 ET 5/1000 EPC cociente 0.58 0.005 SD 0.0006 0.0006

a) EPC: Eritrocitos policromáticos, b) ET: Eritrocitos totales, c) EPCMN: Eritrocitos policromáticos micronucleados

4. Realice una comparación estadística mediante (t-student) entre los dos grupos y concluya

si existen diferencias significativas como para considerar un daño genotóxico.



59

5. Con el protocolo empleado y los resultados obtenidos ¿Podría establecer si el daño

genotóxico ocasionado por la ciclofosfamida fue clastogénico o aneuploidógeno?. Explique

su respuesta.


Andreoli, C., Gigante, D., Nunziata A. (2003). A review of in vitro methods to assess the biological activity of tobacco smoke with the aim of reducing the toxicity of smoke. Toxicology in Vitro 17, 587594.

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60


1. Definición de Eritropoyesis.

2. Concepto de micronúcleo y proceso de formación.

3. Diferencia entre daño clastogénico y aneuploidógeno y como se pueden diferenciar con

la técnica de micronúcleos.

4. Fundamento de la tinción de giemsa.

5. Coloración que adquieren los eritrocitos maduros, inmaduros y micronucleados con el

colorante giemsa.

6. Mecanismo de acción genotóxico de la ciclofosfamida.

7. Usos clínicos de la ciclofosfamida.

8. Propósito de adicionar: EtOH y solución amortiguadora de fosfatos pH=6.8.

9. Se determinó la actividad genotóxica de la daunorrubicina y la apigenina en sangre

periférica de ratón, administrando grupos de 15 animales para cada tratamiento. Los

xenobióticos en estudio se administraron a 2.5 mg/kg, mientras que el grupo control fue

administrado con SSI, obteniendo los siguientes resultados:

Tabla 1. Promedio de número de micronúcleos por cada tratamiento

Grupo Micronúcleos/1000 células

SSI 0.5 ± 0.33

daunorrubicina 18.6 ± 0.62

apigenina 1.6 ± 0.80

Realice una comparación estadística (t-student) de los grupos tratados respecto al

control y concluya si existen diferencias significativas que sean indicativas de daño

genotóxico.



61

Tabla 2. t-student

Grados de

libertad

0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.025 0.01 0.005

1 1.000 1.376 1.963 3.078 6.314 12.706 31.821 63.657 2 0.816 1.061 1.386 1.886 2.920 4.303 6.965 9.925 3 0.765 0.978 1.250 1.638 2.353 3.182 4.541 5.841 4 0.741 0.941 1.190 1.533 2.132 2.776 3.747 4.604 5 0.727 0.920 1.156 1.476 2.015 2.571 3.365 4.032 6 0.718 0.906 1.134 1.440 1.943 2.447 3.143 3.707 7 0.711 0.896 1.119 1.415 1.895 2.365 2.998 3.499 8 0.706 0.889 1.108 1.397 1.860 2.306 2.896 3.355 9 0.703 0.883 1.100 1.383 1.833 2.262 2.821 3.250 10 0.700 0.879 1.093 1.372 1.812 2.228 2.764 3.169 11 0.697 0.876 1.088 1.363 1.796 2.201 2.718 3.106 12 0.695 0.873 1.083 1.356 1.782 2.179 2.681 3.055 13 0.694 0.870 1.079 1.350 1.771 2.160 2.650 3.012 14 0.692 0.868 1.076 1.345 1.761 2.145 2.624 2.977 15 0.691 0.866 1.074 1.341 1.753 2.131 2.602 2.947 16 0.690 0.865 1.071 1.337 1.746 2.120 2.583 2.921 17 0.689 0.863 1.069 1.333 1.740 2.110 2.567 2.898 18 0.688 0.862 1.067 1.330 1.734 2.101 2.552 2.878 19 0.688 0.861 1.066 1.328 1.729 2.093 2.539 2.861 20 0.687 0.860 1.064 1.325 1.725 2.086 2.528 2.845 21 0.686 0.859 1.063 1.323 1.721 2.080 2.518 2.831 22 0.686 0.858 1.061 1.321 1.717 2.074 2.508 2.819 23 0.685 0.858 1.060 1.319 1.714 2.069 2.500 2.807 24 0.685 0.857 1.059 1.318 1.711 2.064 2.492 2.797 25 0.684 0.856 1.058 1.316 1.708 2.060 2.485 2.787 26 0.684 0.856 1.058 1.315 1.706 2.056 2.479 2.779 27 0.684 0.855 1.057 1.314 1.703 2.052 2.473 2.771 28 0.683 0.855 1.056 1.313 1.701 2.048 2.467 2.763 29 0.683 0.854 1.055 1.311 1.699 2.045 2.462 2.756 30 0.683 0.854 1.055 1.310 1.697 2.042 2.457 2.750 40 0.681 0.851 1.050 1.303 1.684 2.021 2.423 2.704 60 0.679 0.848 1.046 1.296 1.671 2.000 2.390 2.660 120 0.677 0.845 1.041 1.289 1.658 1.980 2.358 2.617 0.674 0.842 1.036 1.282 1.645 1.960 2.326 2.576



62


Solución salina isotónica (SSI)

Para preparar 100 mL, se pesan 0.9 g de NaCl y se disuelven en 100 mL de agua destilada;

o bien, puede utilizarse la solución comercial.

Solución amortiguadora de fosfatos

Na2 HPO4 .....................2.56 g

KH2 PO4........................6.63 g

Agua destilada (cuanto baste para un litro)

Giemsa al 2%

Tomar 2 mL de giemsa comercial y diluir en 100 mL de agua destilada.



63

EFECTOS TÓXICOS DE LA ADMINISTRACIÓN DE PLOMO EN RATAS

OBJETIVO ACADÉMICO

Que el alumno visualice el daño macroscópico ocasionado en hígado y bazo de ratas

administradas de forma sub-aguda con diferentes dosis de acetato de plomo por vía i.p.

Relacionar dicho daño con las alteraciones que se presentan en la morfología de los

eritrocitos y en los valores del hematocrito (Hto), hemoglobina total (Hbt) y hemoglobina

libre (Hbl).

PROBLEMA

Identificar cuál de las dos soluciones de acetato de plomo causa mayor daño en las ratas, al

relacionar los resultados encontrados macroscópicamente en el hígado y bazo, con los

encontrados microscópicamente en los eritrocitos y en la cuantificación del Hto, Hbt, y Hbl


El trabajo experimental se desarrollará por equipos en 4 sesiones de laboratorio.

ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN (POR EQUIPO PARA LAS CUATRO

SESIONES)

3 ratas del mismo sexo y peso entre 180 y 300 g.

MATERIAL POR EQUIPO

Balanza para animales 3 jeringas para INSULINA (traer por cada sesión)

Caja de contención Traer marcadores de tinta permanente color rojo, negro y azul

Algodón Perforador (primera sesión)



64

REACTIVOS

Acetato de plomo (Pb(CH3COO)2) Éter etílico

Solución salina isotónica (SSI) Etanol (EtOH)

Hipoclorito de sodio al 6% (NaClO)

PROCEDIMIENTO SESION I (PRIMERA ADMINISTRACIÓN)

1. Cada equipo contará con 3 ratas.

2. Pesar e identificar mediante tinción en la cola y perforaciones en la oreja, previa

anestesia con éter, a cada una de las ratas.

Nota: El profesor indicará el color con el que se deberá marcar las colas de las ratas en cada equipo y que numeración se asignará a cada una de las ratas, de acuerdo con el siguiente código.

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10

3. A cada equipo se le proporcionará 3 soluciones etiquetadas como solución A, B, y SSI.

4. A cada rata se la administrará por vía intraperitoneal, un volumen de 0.5 mL de la

solución que le corresponda.

PROCEDIMIENTO PARA LA SESION II Y III (SEGUNDA Y TERCERA

ADMINISTRACIÓN)

1. Pesar a cada una de las ratas.

2. A cada rata se la administrará un volumen de 0.5 mL de la solución que le corresponda

por vía intraperitoneal.

Unidades = Oreja derecha Decenas = Oreja izquierda



65

PROCEDIMIENTO PARA LA SESION IV

MATERIAL POR EQUIPO

Navaja para bisturí con porta bisturí 1 Pinza de disección 1

Gradilla 1 Tubos de ensayo de 13 x 100 15

Tijeras de disección 1 Tabla de disección 1

Caja de contención 1 Pipetas graduadas de 10 mL 2

Jeringas de 5 mL 5 Tubos de ensayo de 16 x 150 5

Tubos capilares 8 Vasos de precipitados de 100 mL 2

Portaobjetos 16 Algodón

Pipetas volumétricas de 5 mL 2 Celdas de vidrio 2

Vaso de precipitados de 250 mL 1 Cajas de Petri 4

Micropipeta 1 Pipeta graduada de 1 mL 1

REACTIVOS

Nuevo azul de metileno Reactivo de Drabkin

Solución de heparina 1000 UI o EDTA al 10 % Éter etílico

Colorante de Wrigth Etanol (EtOH)

Solución patrón de cianometahemoglobina (CNMHb) Bencidina al 1%

Peróxido de hidrógeno al 1% (H2O2) Solución salina isotónica (SSI)

EQUIPO

Centrífuga para microhematocrito Espectrofotómetro

Microscopio de inmersión Centrífuga


1. Preparar 3 jeringas con 0.1 mL de solución de heparina o EDTA al 10%.

2. Marcar 3 tubos de ensayo de 13 x 100 con el número de la rata que corresponda y

agregar 0.1 mL de heparina ó 0.5 mL de EDTA al 10 % como anticoagulante.



66

3. Anestesiar las ratas con éter etílico y mediante punción cardiaca obtener un volumen

de 3 mL de sangre de cada una de las ratas.

4. Quitar la aguja de la jeringa y transferir la sangre inmediatamente al tubo de 13 x 100

correspondiente. Mezclar perfectamente con el anticoagulante por inversión del tubo.

5. Sacrificar la rata por dislocación cervical.

6. Llenar dos capilares con la sangre obtenida en el inciso 4 para calcular el hematocrito

de acuerdo a lo indicado en la sección de técnicas experimentales.

7. Realizar dos frotis de cada una de las muestras sanguíneas con colorante de Wright de

acuerdo a la sección de técnicas experimentales.

8. Realizar dos frotis de cada una de las muestras sanguíneas con colorante nuevo azul de

metileno (NAM) de acuerdo a la sección de técnicas experimentales.

9. Realizar la cuantificación de hemoglobina total de acuerdo a la sección de técnicas

experimentales: Una vez realizadas las determinaciones anteriores, centrifugar cada

uno de los tubos con la sangre restante a 2500 rpm x 5 min y separar el plasma del

paquete celular. Determinar hemoglobina libre en plasma según la sección de técnicas

experimentales. Colocar el tubo con el paquete celular residual en un contenedor con

hipoclorito de sodio.

10. Hacer una incisión en la parte media del abdomen y extraer el bazo y el hígado de cada

rata. Colocar los órganos en cajas de Petri con SSI, para evitar su deshidratación.

Observar y comparar los órganos con respecto a la rata control.

11. Envolver los restos de los animales de experimentación en una hoja de papel periódico

y colocarlos en la caja de contención para su posterior incineración.

TÉCNICAS EXPERIMENTALES

TÉCNICA DE MICROHEMATOCRITO

1. Llenar con sangre las 2/3 partes de un tubo capilar para cada muestra. Realizar esta

operación por duplicado.

2. El extremo vacío se cierra con calor.



67

3. Colocar los capilares con el extremo cerrado hacia fuera en los surcos radiales de la

centrífuga para microhematocrito y centrifugar a 11000 rpm x 10 min.

4. Calcular el hematocrito midiendo la altura del paquete globular (M2) en relación con la

altura total de la muestra (M1) y expresarla en %.

5. Una vez obtenido los resultados depositar los capilares en el contenedor para residuos

peligrosos biológico-infecciosos (RPBI).

TINCIÓN DE WRIGHT 1. Hacer un frotis de cada muestra, de la siguiente forma:

Muestra de sangre

1

2

1

2

1

A. Poner una pequeña gota de sangre sobre el portaobjetos 1 y colocar el portaobjetos 2 en

B. Mediante un movimiento uniforme deslizar el portaobjetos 2 sobre el 1

C. Para formar una monocapa uniforme de células

M1 _________ 100 % M2_________ X%

M1

M2



68

2. Dejar que los extendidos sequen al aire.

3. Adicionar por goteo EtOH a las laminillas hasta cubrir la superficie y secar al aire.

Repetir esta operación durante 5 minutos.

4. Cubrir el portaobjetos por completo con el colorante de Wright. Transcurridos 5

minutos, enjuagar con agua destilada y dejar secar. Depositar los residuos de la tinción

en un frasco etiquetado como R1.

5. Observar los frotis al microscopio con el objetivo 100x, usando aceite de inmersión.

TINCIÓN CON NUEVO AZUL DE METILENO 1. Agregar con una pipeta Pasteur 3 gotas de sangre y 3 de colorante a un tubo de 13 x

100 y mezclar. Dejar reposar a temperatura ambiente durante 5 min.

2. Colocar una gota de la mezcla anterior en un portaobjetos y hacer un frotis siguiendo

la técnica descrita la metodología de la tinción de Wright. Dejar secar al aire.

3. Observar los frotis al microscopio con el objetivo 100x, usando aceite de inmersión.

4. Colocar los tubos en el contenedor con hipoclorito de sodio y lavar.

CUANTIFICACIÓN DE HEMOGLOBINA TOTAL 1. Preparar 5 tubos de acuerdo a la siguiente tabla, agitando cuidadosamente después de

la adición de cada reactivo y dejar reposar 10 min.

Tabla 1. Cuantificación de Hbt

Tubo

REACTIVO (mL)

Blanco Referencia* A B SSI

SOLUCIÓN DE REFERENCIA ---- 0.02 ---- ---- ----

MUESTRA ----- ---- 0.02 0.02 0.02

DRABKIN 5 5 5 5 5

*Consultar la concentración de la solución de referencia en la etiqueta del frasco

2. Ajustar la absorbancia a cero con el blanco y leer a 540 nm.

3. Calcular la concentración de Hbt en g/dL empleando la siguiente fórmula:

Hbt = Aprob*(Cref./Aref.)



69

Donde: Cref. = concentración de la solución de referencia (g/dL) Aprob = absorbancia del problema Aref. = absorbancia de la solución de referencia 4. Una vez leídos colocar el contenido de los tubos en un contenedor etiquetado como

R2. CUANTIFICACIÓN DE HEMOGLOBINA LIBRE EN PLASMA 1. Marcar 6 tubos de 16 x 150 y trabajar según la siguiente tabla:

Tabla 2. Cuantificación de Hbl

A B C SSI Solución

Estándar*

Blanco

Bencidina 1% 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

Plasma 0.02 mL 0.02 mL 0.02 mL 0.02 mL ------ ------

Estándar ------ ------ ------ ------ 0.02 mL ------

Agua destilada ------ ------ ------ ------ ------ 0.02 mL

H2O2 1% 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

Mantener los tubos a temperatura ambiente durante 20 minutos

Ácido acético

10%

10.0 mL 10.0 mL 10.0 mL 10.0 mL 10.0 mL 10.0 mL

*Preparar una solución estándar de hemoglobina con una concentración de 150 mg/L a partir de la solución estándar de hemoglobina total.

2. Mezclar y dejar reposar 10 min a temperatura ambiente, leer a 515 nm.

Abs. del problema Cálculos: mg de Hbl = ----------------------------- * concentración del estándar (mg/L)

Abs. del estándar

3. Una vez leídos colocar el contenido de los tubos en un contenedor etiquetado como

R3.



70

CUESTIONARIO


Rata Absorbancia Hbt Absorbancia HblHematocrito* (cm) M1

M2

M1

M2

SSI A B

*M1 = altura total de la muestras, M2 = altura del paquete globular

2. Con los datos de la tabla anterior, calcule según la sección de técnicas experimentales:

Hto, Hbt, Hbl y reporte sus resultados en la siguiente tabla:

Rata Órganos* Frotis* Hto

%

Hbt

g/dL

Hbl

mg/L

Efecto*

Tóxico Hígado Bazo Wrigth NAM

A

B

SSI

*En los espacios para hígado, bazo, frotis Wrigth, NAM y efecto tóxico, calificar con cruces el efecto tóxico, siendo (++) para el de mayor efecto, (+) para el menor y (-) para la ausencia de efecto.

3. ¿Cuáles fueron las diferencias en las alteraciones morfológicas en hígado y bazo para

cada tratamiento?

4. ¿Cuáles fueron las diferencias observadas en las células sanguíneas con respecto al

control utilizando las tinciones de Wright y NAM?

5. Qué relación observó entre las alteraciones morfológicas de las células sanguíneas y la

proporción de reticulocitos?

6. ¿Qué relación observó entre las alteraciones morfológicas de las células sanguíneas y

los valores de hematocrito encontrados en cada una de las ratas?, ¿Qué relación

observó entre la proporción de reticulocitos, los valores de Hbl y Hbt?

7. ¿Qué relación observó entre la proporción de reticulocitos con los valores obtenidos de

Hto?¿Cómo afectó la dosis de la solución A y B al valor de Hbl y Hbt con respecto al

control?



71

8. ¿Qué relación observó entre los valores de Hbt y Hbl con el Hto en cada una de las

ratas?

9. Concluya qué solución provocó mayor efecto tóxico.


Blanke R.V., Decker W.J. Analysis of toxic substances. Textbook of clinical chemistry. Ed.

Saunders. Philadelphia. 1986, pp 16701744. Clark E.E. Isolation and Identification of Drugs. Vol. I y II. Ed. Pharmaceutical Press,

London. 1972 Klaassen, C.D. Casarett y Doull’s Toxicology. The Basic Science of Poisons. (6a ed.).

McGraw Hill, New York. 2001, pp 827834. NORMA OFICIAL MEXICANA NOM- 009- SSA1- 1993. Public information office and Bureau of consumer health. Los peligros del plomo

www.kdhe.state.ks.us Torres-Sánchez, L., López-Carrillo, L., Ríos, C. (1999). Eliminación del plomo por curado

casero. Salud Pública, México 41, 5106–5108.



72


1. Fundamento de la determinación de hemoglobina total, por el método de la

cianometahemoglobina y el de la hemoglobina libre, por el método de la bencidina.

2. Fundamento de la determinación del hematocrito, por la técnica del microhematocrito.

3. Fundamento de la tinción de Wrigth y del Nuevo Azul de Metileno.

4. Influencia de la edad del individuo en la absorción gastrointestinal del plomo.

5. Tejidos principales de distribución y depósito del plomo en el organismo.

6. Efectos que ocurren en los eritrocitos cuando la concentración de plomo rebasa el valor

de 80g/dL y que es lo que provoca esta manifestación.

7. Manifestación principal en una intoxicación por plomo en el sistema nervioso central.

8. Síntomas principales de intoxicación por plomo en el tracto gastrointestinal.

9. Influencia de la edad y el sexo en los niveles de plomo en sangre en los seres humanos.

10. Efectos que producen la anemia que se manifiesta por la intoxicación por plomo.

11. Vida media del plomo en sangre y huesos. Papel que juegan los eritrocitos en la

relación de concentración plasma/orina en la eliminación del mismo.

12. Características en una intoxicación crónica (30-50 g/dL) por plomo en los niños.

13. Papel que juega la sal Na2CaEDTA, en dosis de 40 mg/Kg en el diagnóstico por

intoxicación por plomo.

14. Medidas terapéuticas que se toman en una intoxicación por plomo y que concentración

plasmática del mismo debe de estar presente para que se aplique a los niños.

APÉNDICE II: PREPARACIÓN DE REACTIVOS Solución salina isotónica (SSI)

Puede utilizarse la solución comercial o preparar una solución de cloruro de sodio al 0.9 %.

Para preparar 100 mL, se pesan 0.9 g de cloruro de sodio y se disuelven en 100 mL de agua

destilada.



73

Reactivo de Drabkin. (preguntar al profesor si ya está preparado)

Bicarbonato de sodio (NaHCO3) 1.0 g

Ferricianuro de potasio (K3[Fe(CN)6]) 0.20 g

Cianuro de potasio (KCN) 0.05 g

Saponina 0.1 g

Agua destilada c.b.p. 1000 mL

Nota: El reactivo de Drabkin y la solución estándar de CNMHb. Contienen derivados de

CIANURO, los cuales son tóxicos, sin embargo las concentraciones de éstos están por

debajo de la dosis letal referida a un litro de solución.

Nuevo azul de metileno: (preguntar al profesor si ya está preparado)

Nuevo azul de metileno 0.5 g

Oxalato de potasio 1.40 g

Cloruro de sodio 0.80 g

Agua destilada c.b.p. 100 mL

Filtrar antes de usar.

Solución de bencidina al 1%

Solubilizar 1 g de bencidina en 100 mL de ácido acético al 10%.

Nota: La bencidina es un reactivo considerado como carcinogénico por lo que se deben

extremar precauciones en su manejo.

Peróxido de hidrógeno al 1% Ácido acético al 10%



74

Colorante de Wright (preguntar al profesor si ya está preparado) Utilizar colorante de Wright comercial. Agregar alcohol poco a poco, unos cuantos

mililitros cada vez, y mezclar bien con la ayuda de 10 a 20 esferillas de vidrio. Conservar

bien tapado para evitar la evaporación, guardar en un sitio oscuro durante dos o tres

semanas, mezclar con frecuencia. Filtrar antes de usarlo.


R1: Colorante de Wright, sangre de rata, EtOH.

R2: Sangre de rata, NaHCO3, K4[Fe(CN)6], KCN, saponina.

R3: Plasma de rata, bencidina, H2O2, ácido acético.



75

EFECTO DEL pH EN LA LIBERACIÓN DE METALES PESADOS POR

UTENSILIOS DE BARRO VIDRIADO OBJETIVO ACADÉMICO Que el alumno determine cualitativamente la presencia de plomo en recipientes de cerámica

a diferentes valores de pH.

PROBLEMA

Realizar un análisis cualitativo comparativo de varios tratamientos de curado para vasijas

de barro vidriado y sugerir cuál de ellos presenta mejores resultados para reducir el

contenido de plomo en estos recipientes. Discutir el riesgo de exposición al plomo liberado

por recipientes de barro vidriado en los seres humanos.

MATERIALES Vasija de barro vidriado * 6 Mechero 3

Tubos de ensayo 13x100 10 Rejilla de asbestos 3

Anillo metálico 3 Gradilla 1

Papel pH 3 Pipetas de 1 mL 3

Probeta de 100 mL 1 Pinza para tubos 1

*Este material debe ser nuevo y del mismo lote, se requiere la cantidad de 6 por cada dos equipos con una capacidad máxima aproximada de 250 mL.

REACTIVOS Agua destilada Ácido clorhídrico (HCl)

Hidróxido de sodio 1 N (NaOH) Ácido nítrico (HNO3)

Yoduro de potasio (KI)



76

DESARROLLO EXPERIMENTAL 1. Previo a la sesión el profesor indicará a los alumnos los tratamientos de curado a realizar

a 3 de las 6 vasijas:

Vasija 1 - Ajo: Untar ajo suficiente para cubrir la superficie del interior de la vasija

de barro y dejar reposar por un día antes de lavarla con jabón eliminando cualquier

residuo que se haya formado, secar.

Vasija 2 - Vinagre: Llenar ¾ partes de la vasija con vinagre blanco y hervir durante

1 hora, reponiendo el volumen perdido durante esta operación. Lavar y secar.

Vasija 3 - Cal: Agregar una cucharada sopera de CaCO3 comercial por cada 100

mL de agua y hervir durante 1 hora, reponiendo el volumen perdido durante esta

operación. Lavar y secar.

2. Marcar las vasijas no curadas como A, B y C. y reunirlas con las vasijas curadas 1,2 y 3

3. Colocar el volumen necesario en cada una según el diseño de la siguiente tabla.

Tabla 1. Diseño experimental

A B C 1 2 3

Solución HCL, pH 2 X X X X

Solución NaOH, pH 10 X

Agua destilada X

4. Calentar las vasijas a ebullición y dejarlas hervir 30 minutos. En caso de que el

contenido de agua disminuya considerablemente reponer el volumen perdido con agua.

5. Colocar por separado 0.5 mL de solución de cada vasija en tubos de ensayos.

6. Enfriar los tubos con ayuda del agua de la llave por la parte exterior, y medir el pH.

7. Agregar a cada tubo tres gotas de HNO3 concentrado.



77

8. Agregar a cada tubo, 1 mL de la solución de yoduro de potasio procurando que la

solución caiga directamente en el contenido del tubo. Agitar por unos segundos, dejar

reposar en su gradilla y observar.

9. Una solución o precipitado amarillo indica la presencia de plomo. Emplee un control

negativo con agua destilada y proceda de la misma forma como se indica en los pasos 6

y 7.

10. Una vez obtenidos los resultados vaciar el contenido de los tubos en un contenedor

etiquetado como R1.

11. Reunir el contenido de las vasijas con tratamiento ácido (A, 1, 2, y 3) en el contenedor

etiquetado como R1.

12. Reunir el contenido de las vasijas con tratamiento neutro (C) y básico (B) en un

contenedor etiquetado como R2.



78

CUESTIONARIO

1. Reporte sus resultados en la siguiente tabla, indicando la presencia de plomo con cruces:

negativo (-), bajo (+), medio (++), alto (+++). Utilice el control negativo como

referencia.

Tabla 1. Resultados Vasija pH inicial pH final Presencia de plomo

A HCl B NaOH C agua destilada 1 ajo 2 vinagre 3 cal

2. Compare los resultados obtenidos entre las vasijas A, B, y C. Concluya que método de

extracción fue más eficiente.

3. Compare los resultados obtenidos en las vasijas 1, 2 y 3 con la vasija A e indique si hay

alguna diferencia. ¿A qué la atribuye?

4. Compare los resultados obtenidos entre las vasijas 1, 2 y 3. Concluya qué método de

curado fue más eficiente.

5. ¿Considera usted que los alimentos contenidos en vasijas de barro podrían ser una fuente

de exposición a plomo?

6. ¿Considera que el proceso de curado es suficiente para evitar la exposición a plomo?

Justifique su respuesta.


Blanke R.V. Decker W.J. Analysis of toxic substances. Textbook of clinical chemistry. Philadelphia, Saunders. Pp 1670-1744. 1986.

C.D. Klaassen. PhD. Casarett y Doull’s. Toxicology. The basic science of poisons. 6th edition. McGraw Hill 2001. Pp 827-834.

Clark E. E. Isolation and Identification of Drugs. Pharmaceutical Press, London, 1972 Vol. I y II

L. Torres-Sánchez, L. López-Carrillo y C, Ríos. Eliminación del plomo por curado casero. Salud Pública, México. 41:5106 – 5108 (1999).

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM- 009- SSA1- 1993. Public information office and Bureau of consumer health. Los peligros del plomo

www.kdhe.state.ks.us



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1. Proceso de vidriado de utensilios de barro.

2. Reacciones que se llevan a cabo en las vasijas de barro vidriado A y B durante el

proceso de extracción e identificación.

3. Precauciones que se pueden aplicar en casa para reducir el riesgo de exposición a plomo

por consumo de alimentos.

4. Cinco alimentos de naturaleza ácida y cinco de naturaleza alcalina.

5. Límite máximo permitido de plomo en utensilios de barro vidriado por la NOM vigente.


Solución de HCl pH 2 y solución de NaOH pH 10

Calcular la cantidad adecuada para preparar la solución de pH = 2 con HCl y la solución de

pH 10 con NaOH.

Solución de yoduro de potasio 16.5% (KI)

Pesar 16.5 g de KI y colocarlos en un matraz aforado de 100 mL, disolver en

aproximadamente 25 mL de agua mezclar y aforar. Esta solución es sensible a la luz.


R1: HCl, HNO3, PbI2, KI

R2: NaOH, PbI2

NOTA: El responsable de residuos reunirá el contenido de R1 y R2 al finalizar la sesión, tomando las precauciones necesarias y etiquetando el recipiente final.



80

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ETANOL EN UNA MUESTRA PROBLEMA

OBJETIVO ACADÉMICO Que el alumno realice la determinación presuntiva y cuantitativa de etanol en muestras

problemas mediante un método indirecto.

PROBLEMA Cuantificar al menos el 80% de la concentración de etanol en mg/dL en dos muestras

problema y mediante los resultados obtenidos indicar el grado de intoxicación de los

sujetos de los cuales provienen las muestras analizadas.

REACTIVOS Dicromato de potasio* (K2Cr2O7) Carbonato de potasio* (K2CO3)

Ácido sulfúrico (H2SO4) Etanol (EtOH)

* Ver APÉNDICE II

EQUIPO

Espectrofotómetro

Estufa

Balanza analítica

MATERIAL Caja de Petri con centro de vidrio 2 Matraz volumétrico de 10 mL 3

Pipeta volumétrica de 2 mL 3 Pinzas para tubo de ensayo 3

Pipeta volumétrica de 1 mL 4 Papel filtro ( 2 x 5 cm) 1

Tubo de ensayo 16 x 150 6 Pipeta graduada de 5 mL 3

Celda de vidrio para espectrofotómetro 2 Pipeta graduada de 1 mL 3

Pipeta volumétrica de 5 mL 5 Pipeta Pasteur con globo 4



81

DESARROLLO EXPERIMENTAL A cada alumno se le proporcionarán 2 muestras problema a las cuales se les realizará la

determinación presuntiva y cuantitativa de etanol.

I. Determinación presuntiva de etanol

1. Rotular 4 tubos como control positivo, control negativo, muestra 1 y muestra 2.

2. Al tubo control positivo agregarle 5 gotas de etanol.

3. Al tubo control negativo agregarle 5 gotas de agua destilada.

4. A los tubos muestra 1 y 2 agregarles 1 mL de cada una de las muestras problema

respectivamente.

5. A cada uno de los tubos, adicionarles 0.5 mL de solución de K2Cr2O7 (Solución A).

6. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente y observar la coloración de los tubos.

7. Reunir el contenido de los 4 tubos y confinarlos en un recipiente etiquetado como R1.

II. Determinación cuantitativa de etanol

Centro de vidrio

Esquema 1. Cámara de Conway

Cada una de las muestras se tratará de acuerdo al siguiente procedimiento:

1. Colocar 2 mL de la solución B de K2Cr2O7 en el recipiente B.

2. Adicionar 1 mL de solución saturada de K2CO3 en el recipiente B, agitando

suavemente.



82

3. Colocar 1 mL de la muestra problema en el recipiente A y tapar inmediatamente con el

recipiente C, como se muestra en el esquema 1.

4. Colocar la cámara de Conway en una estufa a 40 ºC, durante 45 minutos.

5. Una vez transcurrido el tiempo indicado, transferir el contenido del recipiente B a un

matraz volumétrico de 10 mL, lavando perfectamente dicho recipiente y la parte

externa del recipiente A con un volumen máximo de 5 mL para ambos recipientes

Finalmente aforar a 10 mL con agua destilada (en ocasiones puede aparecer un

precipitado que desaparece al aforar con agua destilada).

6. Determinar la absorbancia a 450 nm, utilizando como blanco agua destilada.

7. Determinar la absorbancia de la solución B de dicromato de potasio diluida 1 a 10, a

450 nm, utilizando como blanco agua destilada. Esta solución se utilizará como

referencia para realizar los cálculos pertinentes.

8. Confinar el contenido del recipiente B y la solución de referencia en el frasco

etiquetado como R1.



83

CUESTIONARIO 1. Reporte en la siguiente tabla sus resultados de la prueba presuntiva para cada muestra.

Tabla 1. Resultados presuntivos

Muestra Coloración Resultado (+/-)

1

2

Control negativo

Control positivo

2. ¿Considera que la intensidad de color en la prueba presuntiva es un indicador de la

concentración de EtOH en sus muestras?

3. Proponga una modificación a la técnica presuntiva que le permita emplearla como prueba

cuantitativa.

4. Indique las lecturas de absorbancia obtenidas para cada muestra. Calcular la

concentración de etanol en la muestra en mg/dL, desglosando los cálculos realizados para

cada una de las muestras tomando en cuenta la lectura de absorbancia de la solución de

referencia. Considere todas las diluciones realizadas tanto de su muestra biológica como de

la solución de referencia.

Tabla 2. Resultados de la prueba cuantitativa

Muestra Absorbancia Dilución* Concentración

(mg/dL)

1

2

Solución de

referencia

*En caso de haberse realizado.



84

5. Con los valores obtenidos en sus muestras relacione la sintomatología en la siguiente

tabla y concluya si los valores se encuentran por encima del límite legal establecido.

Tabla 3. Observaciones clínicas según el grado de intoxicación

Concentración

(mg/dL)

Observaciones clínicas

50 a 150 Falta de coordinación, tiempo de reacción lento, y visión

borrosa.

150 a 300 Deterioro visual, tambaleo y lenguaje cercenado,

hipoglucemia intensa, sobre todo en niños.

300 a 500 Falta notoria de coordinación, estupor, hipoglucemia y

convulsiones.

≥ 500 Coma y muerte, excepto en individuos tolerantes.

6. ¿Cuál es la concentración máxima de EtOH que se puede determinar con este protocolo?

7. ¿Qué resultados esperaría si la concentración de EtOH en la muestra es mayor a la

concentración máxima que puede determinar el protocolo?

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Fister, H.J. Ethyl alcohol. Manual of standardized procedures for spectrophotometric

chemistry. E-10a.1-E-10b.3 (1950) U.S.A. Standard scientific supply corporation. U.S.A.

Hobbs, W.H., Rall, T.W., Verdoorn. T.A. Hipnóticos y sedantes: etanol. En: Goodman & Gilman. Las bases farmacológícas de la terapéutica. 1 9a ed. Ed. McGraw-Hill Interamericana, México D.F., 1996, pp 411419.

Klassen, C.D. Watkins, J.B. Efectos de los solventes y vapores en Toxicología Clínica. En: Casarett & Doull, Manual de Toxicologia, la ciencia básica de los tóxicos. (5ª ed.) McGraw-Hill Interamericana, México D.F. 2001, pp 739744, 934935.

Pesce, A.J., y Kaplan, L.A. Alcohol por T. J. Schroeder. Methods in clinical chemistry. The C.V. Mosby Company. U.S.A., 1987, pp 324329.

Sunshine, I. Ethanol. Methodology for Analitical Toxicology. CRC Press, Inc., 1978, pp 145-154.



85

APÉNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS 1. Balanceo de la siguiente ecuación:

CH3OH + K2Cr2O7 Cr3+ + R-COO -

2. Color de las soluciones que contienen cromo (VI) y cromo (III).

3. Especificidad de la prueba, tipo de sustancias que pueden dar un resultado falso positivo.

4. Longitud máxima de absorción del K2Cr2O7 en el visible.

5. Fundamento de la prueba presuntiva.

6. Fundamento de la prueba cuantitativa.

7. Propósito de adicionar solución saturada de K2CO3 e incubar.

8. Límite máximo de EtOH en sangre legalmente establecido para conductores.

9. Calcular la concentración de etanol en sangre de la siguiente muestra problema:

Solución de referencia: 2 mL de una solución 0.01 M de dicromato de potasio se

diluyeron a 10 mL, de esta solución se tomaron 5 mL y se diluyeron a 10 mL. La

lectura de absorbancia para la última solución, a 450 nm, fue de 0.205.

Muestra: 2 mL de la solución 0.01 M de dicromato de potasio se colocaron en la

celdilla B y se hicieron reaccionar con 1 mL de muestra problema (celdilla A). Al

término de 45 minutos de calentamiento, el contenido de la celdilla B se diluyó a 10 mL

y se leyó a 450 nm, dando una absorbancia de 0.23.

Respuesta: 60.72 mg de etanol/100 mL de sangre.


Solución A: Solución de dicromato de potasio (K2Cr2O7)

Pesar 2.5 g de K2Cr2O7 y solubilizarlo en 20 mL de H2SO4 al 50 %, aforar a 100 mL con

H2SO4 al 50 %.



86

Solución B: Solución de dicromato de potasio (K2Cr2O7)

Disolver 0.5 g de K2Cr2O7 en 25 mL de agua destilada y agregar cuidadosamente 40 mL de

H2SO4 concentrado, dejar enfriar y diluir con agua destilada a 100 mL.

NOTA: El contacto con altas concentraciones de dicromato de potasio puede resultar en

ulceración de manos, destrucción de membranas mucosas y perforación del tabique

nasal.

Solución saturada de carbonato de potasio (K2CO3)

Con agitación, agregar la cantidad necesaria de K2CO3 en el volumen de agua destilada a

preparar hasta su saturación (se observa que ya no se disuelve). Posteriormente filtrar.

PM del etanol : 46 g/mol

PM del K2Cr2O7: 294.7 g/mol

Densidad del etanol: 0.7893 a 20 °C

APÉNDICE III: DISPOSICIÓN DE RESIDUOS R1: EtOH, K2Cr2O7, H2SO4, CH3COOH, Cr(SO4)3, K2SO4, K2CO3



87

IDENTIFICACIÓN DE ALCALOIDES Y BARBITURICOS EN MUESTRAS

PROBLEMA

OBJETIVOS ACADÉMICO

Con base en los conocimientos adquiridos en los guiones anteriores, que el alumno

proponga un proceso de extracción e identificación para alcaloides y barbitúricos.

PROBLEMA

Aislar e identificar escopolamina y/o ácido barbitúrico de una muestra problema.

REACTIVOS

Hidróxido de amonio (NH4OH) Cromatofolios de aluminio

Metanol (MeOH) Yoduro se sodio (NaI)

Ácido acético glacial Acetato de etilo

Carbonato de bismuto (Bi2(CO3)3) Isopropilamina

Acetato de cobalto tetrahidratado Escopolamina

Ácido barbitúrico

EQUIPO

Rotaevaporador Bomba de aspersión

Lámpara de luz ultravioleta

MATERIAL

Embudo de separación de 250 mL 2 Agitador de vidrio 1

Embudo de cola corta 2 Probeta de 10 mL 1

Matraz Erlenmeyer de 125 mL 3 Pipeta graduada de 10 mL 2

Matraz de bola de 50 mL 2 Anillo metálico 1

Vaso de precipitado de 250 mL 3 Tubos de ensayo 4



88

Vaso de precipitados de 100 mL 4 Anillos de corcho 2

Pipeta Pasteur 3 Anillos de corcho 2

Tubo capilar 2


1. El profesor proporcionará una muestra que contiene escopolamina y/o ácido barbitúrico.

El alumno desarrollará el procedimiento que proponga para aislar la forma no ionizada de

los compuestos antes mencionados.

2. Una vez obtenida la forma no ionizada de las sustancias, evaporar a sequedad en un

rotaevaporador. Dejar enfriar y reconstituir cada uno de los residuos con 0.5 mL (3 o 4

gotas) de metanol. Etiquetar cada uno de ellos con el nombre de la sustancia que espera que

contenga.

3. Para el proceso de identificación, solicitar a los profesores dos placas para cromatografía

en placa fina. En una de ellas (placa 1) del lado izquierdo tendrá aplicada previamente la

referencia de escopolamina y en la otra (placa 2) la de ácido barbitúrico. Una muestra del

residuo reconstituido previamente será aplicada del lado derecho de cada una de las placas

de acuerdo al siguiente esquema.

Esquema 1. Placa cromatográfica



89

4. Para la identificación de la escopolamina emplear como sistema de elución una mezcla

CHCl3/MeOH (9:1) + 3 gotas de NH4OH.

5. Para la identificación del ácido barbitúrico emplear como sistema de elución una

CHCl3/Acetona (9:1) + 3 gotas de ácido acético.

6. Saturar las cámaras durante 10 minutos antes de eluir las muestras en las placas

cromatográficas.

7. Eluir hasta la línea “limite de elución” indicada en el esquema 1.

8. Visualizar la presencia de escopolamina y/o ácido barbitúrico con una lámpara de luz

U.V. y posteriormente, revelar las cromatoplacas utilizando la solución etiquetada como

solución reveladora de reactivo de Dragendorff para el caso del alcaloide, y con yodo

para el otro compuesto. Calcular el Rf para cada sustancia de acuerdo al esquema 1 y

comparar el valor obtenido con el de la referencia proporcionada.

9. Con el residuo reconstituido excedente realizar el siguiente procedimiento de

identificación.

Alcaloides

a) Colocar 2 gotas del residuo reconstituido correspondiente, y agregar 2 gotas de HCl

1N más 2 gotas de “solución stock del reactivo de Dragendorff”.

b) Realizar un control positivo con las muestras de referencia y un control negativo (con

agua) para esta reacción.

Barbitúricos

a) Colocar tres gotas del residuo reconstituido correspondiente y agregar tres gotas del

reactivo A y tres gotas del reactivo B (Dille-Koppanyi).

b) Realizar un control positivo con las muestras de referencia y un control negativo (con

agua) para esta reacción.



90

CUESTIONARIO

1. Reporte el diagrama de separación que utilizó para esta práctica y justifique los

cambios, si los hubo, con relación al diagrama diseñado en los conocimientos

previos.

2. Reporte en la siguiente tabla los resultados que obtuvo en las pruebas de

identificación. Marque con una cruz si la reacción fue positiva.

Tabla 1. Resultados de las pruebas de identificación

Referencia escopolamina

Residuo reconstituido

de escopolamina

Referencia de ácido

barbitúrico

Residuo reconstituido

de ácido barbitúrico

Dille-Koppanyi

Dragendorff

Rf

3. Indique si su muestra contenía ácido barbitúrico. Explique su respuesta.

4. Indique si su muestra contenía escopolamina. Explique su respuesta.

5. ¿Cuáles son los puntos que considera críticos para la adecuada separación e

identificación de la muestra?


Benko A. (1985). Toxicological Analysis of Amobarbital and Glutethimide from Bone Tissue. Journal of Forensic Sciences 30, 708714,

Blanke R.V. Decker W.J. Analysis of Toxic substances. Textbook of clinical chemistry. Saunders, Philadelphia, 1986, pp 16701744.

Bowman y Rand. Farmacología. Bases Bioquímicas y Patológicas. (2ª ed). Editorial Interamericana, México, 1984. 42.2542.32.

Bruneton J. Alcaloides, Generalidades. En: Farmacognosia. Fitoquimica. Plantas Medicinales. Ed. Acribia, Zaragoza, España, 2001, pp 775792.

Clark E.E. Isolation and Identification of Drugs. Vol. I y II. Pharmaceutical Press, London, 1972.



91

Cochin, J., Daly, J.W. (1963). The Use of Thin-Layer Chromatography for the Analysis of Drugs. Isolation and Identification of Barbiturates and Nonbarbiturates Hypnotics from Urine, Blood and Tissues. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 139, 154159.


1. Propiedades acido-base (pKa) de la escopolamina y el ácido barbitúrico.

2. Forma ionizada y no ionizada de cada uno de ellos.

3. Diagrama de separación para aislar escopolamina y ácido barbitúrico presentes en

una muestra problema, justificando en cada etapa el uso de los reactivos sugeridos.

4. Indicar en el diagrama anterior la recolección y almacenamiento de los desechos

generados.

5. Fundamento de la reacción de Dragendorff.

6. Fundamento de la reacción de Dille-Koppanyi.

7. Fundamento de la cromatografía en capa fina como herramienta de identificación de

sustancias químicas utilizando luz UV, Yodo y reactivo de Dragendorff como

reveladores.

APÉNDICE II: PREPARACION DE REACTIVOS

Reactivo de Dragendorff (Solución patrón)

Solubilizar 2.6 g de Bi2(CO3)3 y 7.0 g de NaI en 25 mL de ácido acético glacial, calentar

por 10 minutos a 40oC para solubilizar el reactivo. Dejar reposar por 12 horas y

posteriormente filtrar la solución. Mezclar 20 mL del filtrado (solución rojo-café) con 8 mL

de acetato de etilo, la solución anterior se guarda en un frasco ámbar (la cual es estable por

6 meses).

Reactivo de Dragendorff (Solución reveladora)

Mezclar 10 mL de la solución patrón con 25 mL de ácido acético glacial y 60 mL de

acetato de etilo.



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Reactivo A (Dille-Koppanyi)

Solubilizar 0.1 g de acetato de cobalto tetrahidratado en 100 mL de MeOH absoluto y

agregar 0.2 mL de ácido acético glacial.

Reactivo B (Dille-Koppanyi)

Mezclar 5.0 mL de isopropilamina con 25 mL de MeOH absoluto.

NOTA: El reactivo A y el reactivo B son estables por 2 días.

manual de toxicología. facultad de química. original

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