manual de procedimientos

Toxicología Ambiental y Ecotoxicología

Dr. Fernando R. Cussi S. 1

MANUAL DEPROCEDIMIENTOS“LABORATORIO DE

TOXICOLOGÍAAMBIENTAL”

Dr. Fernando R. Cussi S.

2010



CONTENIDO

Objetivo del Laboratorio de Toxicología Ambiental; Carrera de Ingeniería

Ambiental de la Escuela Militar de Ingeniería.

Objetivos generales y específicos del manual.

Glosario.

Áreas de aplicación.

Responsables.

Relación de procedimientos del Laboratorio de Toxicología Ambiental.

Procedimientos del Laboratorio de Toxicología Ambiental.

Ubicación del Laboratorio.



OBJETIVO DEL LABORATORIO DE TOXICOLOGÍA AMBIENTAL; CARRERADE INGENIERÍA AMBIENTAL DE LA ESCUELA MILITAR DE INGENIERÍA.

OBJETIVOS GENERALES DEL MANUAL

El objetivo del presente manual de Toxicología Ambiental es fortalecer laformación académica de los alumnos de la carrera de Ingeniería Ambientalmediante una secuencia de actividades en el laboratorio, los cuales pretenden serformativos y motivadores. De tal manera, que el trabajo en laboratorio, debe serprogramado, calendarizado y organizado en cuanto a los apoyos humanos ymateriales que permitan lograr las metas planeadas por los objetivos terminales dela materia.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Los objetivos específicos del presente manual de Toxicología Ambiental, es tal,que el alumno conocerá los efectos de los diversos agentes contaminantes en lasalud humana, los principales estudios toxicológicos que incluyen lacaracterización del riesgo, evaluación de la exposición de dosis respuesta de loscontaminantes, los procesos de toxicocinética y toxicodinámia que lo llevarán alentendimiento de los mecanismos de absorción y biotransformación de loscontaminantes dentro del organismo humano. La formación académica recibidapor parte del profesor titular de la materia de toxicología ambiental y el desarrollode la actividad aplicativa fomentará y motivará la inquietud investigadora inherentea cada estudiante, en su afán de conocimiento para conocer y modificar su medio.

GLOSARIO

ÍNDICE

1. Práctica

1. Determinación de la concentración letal media (LC50) del insecticida dimetoatoutilizando la lombriz de tierra Eisenia fetida

2. Práctica



2. Biomarcadores de exposición a plaguicidas organofosforados: actividadcarboxilesterasailización del ensayo de repulsión a un suelo contaminado conla lombriz de tierra Eisenia fetida.

3. Práctica

3. Utilización del ensayo de repulsión a un suelo contaminado con la lombriz detierra Eisenia fetida.

4. Práctica

4.- Biomarcadores de exposición a metales pesados: actividad glutatión-s-transferasa.

ÁREAS DE APLICACIÓN

DOCENCIA

El docente de la carrera de Ingeniería Ambiental desempeña actividadesformativas prácticas docentes, en el laboratorio de Toxicología Ambiental de laCarrera de Ingeniería Ambiental, para lo cual requiere de la infraestructura ymaterial adecuado, lo que conlleva a un aprovechamiento integral por parte delalumno. Dicha actividad deberá ser tal, que el alumno se sienta motivado ycomprometido con su formación académica.

INVESTIGACIÓN

Las actividades desempeñadas en el laboratorio de Toxicología Ambiental de laCarrera de Ingeniería Ambiental, involucran a los profesores investigadores, loscuales desarrollan proyectos de investigación, de los cuales, son responsables dela implementación, desarrollo, ejecución y evolución de los mismos, siendo partefundamental en el fortalecimiento de la infraestructura del laboratorio.

EXTENSIÓN

El laboratorio de Toxicología Ambiental de la Carrera de Ingeniería Ambiental,desarrollará funciones propias que presten servicios de asesoría y asistencia aotros organismos públicos y privadas, cuando así fuera necesario, pretendiendoen lo posible ser autosuficiente, tanto en recursos técnicos y materiales, mediantedichas actividades, además de fortalecer la infraestructura del laboratorio.

RESPONSABLES

El Coordinador del laboratorio, el docente titular.



LABORATORIO DE TOXICOLOGÍA AMBIENTAL

PRÁCTICA No 1

Nombre de la práctica:

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA (LC50) DELINSECTICIDA DIMETOATO UTILIZANDO LA LOMBRIZ DE TIERRA

Eisenia fetida

1.- INTRODUCCIÓN

Los ensayos de toxicidad constituye un elemento esencial en el esquema delproceso Evaluación del Riesgo Ecológico (ERA). Éstos son utilizadosfundamentalmente para recibir los efectos agudos o crónicos de nuevassustancias químicas potencialmente peligrosas para el medio ambiente como losfitosanitarios, o bien para estimar el impacto ecológico de una nueva fuente deemisión de residuos tóxicos al ambiente (efluentes). Si bien este enfoque de ERAes predictivo, podemos igualmente hacer uso de los ensayos de toxicidad paraevaluar los efectos tóxicos de un ambiente históricamente contaminado queocasione, o pueda ocasionar, un deterioro ecológico. En estos casos estaríamosempleando los ensayos de toxicidad bajo una perspectiva retrospectiva.

2.- OBJETIVO

• Aprendizaje del significado de LC50, como calcularlo, sus ventajas ylimitaciones.

• Manipulación de la lombriz de tierra.

• Aprendizaje en la ejecución del ensayo de toxicidad aguda, contempla lautilización del ensayo de toxicidad aguda con la lombriz de tierra como criteriodeterminante para definir un suelo contaminado.

.

3.- MARCO TEÓRICO.

En términos generales, los ensayos de toxicidad constituyen el principalinstrumento en la toma de decisiones acerca de la gestión ambiental de una matrizambiental contaminada (agua, suelo, sedimento, etc.). Esto ha llevado aldesarrollo de múltiples protocolos estandarizados dependiendo de la matriz



ambiental considerada, la especie a utilizar en el ensayo o el tiempo de ejecucióndel mismo, entre otros factores.

En la relación de la toxicidad de un suelo contaminado o de una sustancia quepuede contaminar el suelo (ej.: plaguicidas), el ensayo de toxicidad emplea lalombriz de tierra como un organismo modelo. Estos organismos presentancualidades ecológicas y biológicas que justifican su uso como bioindicadores decontaminación del suelo. En términos generales las lombrices de tierrarepresentan el 80% de la biomasa del suelo; sus hábitos alimenticios yescavadores contribuyen a la aireación del suelo, a una mayor filtración del agua yestructuración del suelo y favorecen la generación de una importante capa dehumus en la superficie del suelo, entre otras características.

Desde el punto de vista ecotoxicológico, Lanno et al. Destacan una serie depropiedades en relación con la exposición de las lombrices a contaminantespresentes en el suelo. Algunas de ellas son: presentan un tegumento muyvazcularizado y desprovisto de cutícula lo que le permite la entrada directa decontaminantes; son capaces de ingerir grandes cantidades de suelo o fraccionesespecíficas del mismo (materia orgánica) lo que se traduce en una vía importantede entrada de contaminantes; muchas especies tienen el tamaño considerable loque facilita no solo analizar residuos de contaminantes en diversos tejidos, sinodeterminar la respuesta de biomarcadores bioquímicos y moleculares; existe unamplio conocimiento de la fisiología de estos organismos en la relación a otrosinvertebrados.

El porcentaje de supervivencia, la tasa de reproducción o de crecimiento de lalombriz son los parámetros que comúnmente de utilizan para estimar la potenciatóxica de un suelo contaminado y/o riesgo de efectos adversos en el ambienteedáfico. Tales pruebas toxicológicas tienen repercusiones importantes a la hora derealizar o establecer decisiones acerca de la peligrosidad de un contaminante enel suelo y en la puesta en marcha de medidas correctoras, de recuperación (ej.:fitorremediación), o incluso sancionadoras.

Fundamentos de la Operación

Se desarrollara un protocolo de experimentación empleando, un insecticida(dimetoato, organofosforado) a determinada concentración, el compuestoorganofosforado es ampliamente utilizado en agricultura y se determinará susefectos al medio ambiente, específicamente a la fauna, mediante el empleo de lalombrices de tierra y determinando la dosis letal media.



4.- MATERIALES Y MÉTODOS

4.1.- Materiales y Equipos

El material necesario para el correcto desarrollo de la práctica es el siguiente:

• Lombriz de tierra (Eisenia fetida).

• Placas de petri.

• Inseticida dimetoato.

• Pipetas automáticas y de vidrio.

• Papel de filtro.

• Matraz aforado.

• Tubo de vidrio (o plástico) de 10ml.

• Pinzas.

4.2.- Procedimiento

4.1.- Preparación de las placas para el ensayo de toxicidad.

• Cortar un trozo de papel de filtro utilizando como molde la parte inferior (menordiámetro) de la placa de petri.

• Cada grupo deberá identificar sus placas (marcador indeleble) con lasconcentraciones de dimetoato a ensayar.

• La placa estará lista para ser contaminada con el insecticida y liberar laslombrices.

4.2.- Preparación del insecticida.

• El insecticida utilizado en la práctica es el dimetoato (organofosforado), unfitosanitario ampliamente utilizado en la agricultura.

• Las concentraciones que se emplearan en el ensayo de toxicidad se obtendrán apartir de un producto comercial.

• Las concentraciones a añadir en las pacas serán las siguientes: 0.1, 0.25, 0.5, 1y 2 μg i.a./ml. El insecticida será disuelto en acetona.



• A cada placa de petri se añadirá 1 ml de cada concentración de dimetoato y sedejara bajo la campaña de gases hasta evaporar la acetona. A las placas ‘control’se añadirá solamente 1 ml. de acetona.

• Evaporada la acetona, se añadirá 1 ml de agua destilada al papel de filtrocontaminado con el dimetoato.

• Las placas están listas para alojar a las lombrices y dar comienzo el ensayo.

4.3.- Liberación de las lombrices en las placas.

• Se liberan 2 lombrices, tomadas aleatoriamente del grupo, en cada placa petri.

• Las placas se colocarán en oscuridad a la temperatura del laboratorio.

• En este punto se dará por iniciado el ensayo de toxicidad aguda (24h).



5.- INDICACIONES

Tiempo estimado - 2 días

Relación con el programa teórico - ensayos de toxicidad bioindicadores,principales contaminantes, evaluación del riesgo ecológico.

CÁLCULOS

Para calcular el valor de la LC50 debemos proceder como sigue:

• Contar con el numero de lombrices muertas en cada placa (o concentración)

• Calcular el porcentaje de mortalidad.

• Comprobar si existen individuos muertos en el grupo de control. Si fuese asídebemos entonces corregir los valores de mortalidad haciendo uso de la fórmulade Abbott:

% M corr = (Mobs – M control) x 10 c

(100 - M control)

• Comprobar que el porcentaje de mortalidad es creciente en relación a laconcentración de dimetoato, de no ser así debemos suavizar los datos, según lafórmula:

Cuando Mt es menor que Mt-1, entonces:

Mt – 1 = (Mt + Mt- 1)

2

• Realizar un gráfico (papel milimetrado) representando la concentración dedimetoato en el eje X, y el porcentaje de mortalidad o valor probit en el eje Y.



6. REPORTAR

*Cuestionario

Transformar la concentración de dimetoato en mg/ml (ó ppm) a ug/cm².

Calcular el LC50, si los resultados lo permiten.

¿Cuáles son las limitaciones de este ensayo?

¿Cuáles son las ventajas del ensayo?

¿Cuál ha sido la principal vía de entrada del insecticida a la lombriz?

¿Cuál crees que ha sido el mecanismo de toxicidad del dimetoato en la lombriz?

7. - BIBLIOGRAFÍA

1. Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD). 1984.Earthworm, acute toxcity tests. Guideline for testing Chemicals. No. 207. Paris.France.



2. Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD). 1984.Earthworm, reproduction tests. Guideline for testing Chemicals. No. 222. Paris.France.

3. International Standar Organization (ISO). 1993. Soil Quality – effects ofpollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 1: Determination of acute toxicitiusing artificial soil substrate. ISO, Geneve, Switzerland. No. 11268-1.

4. International Standar Organization (ISO). 1998. Soil Quality – effects ofpollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects onreproduction. ISO, Geneve, Switzerland. No. 11268-2.

5. International Standar Organization (ISO). 2004 Draft: Soil Quality – avoidancetests for evaluating the quality of soils and the toxicity of chemicals. Tests winthearthworms (eisena fetida/andrei). Geneve, Switzerland.

6. Jongmans AG Pulleman MM, Balabame M. Van Oort F, Marinissen JCY. 2003.Soil structure and characteristics of organic matter in two orchards differing inearthworm activity. Appl Soil Ecol 24:219-232

7. Paoletti MG. 1999. The role of earthworms for assessment of sustainability andas bioindicators. Agric Ecosyst Environ 74:137- 155.

8. Lanno R. Wells J, Conder J, Bradham K, Basta N. 2004. The bioavailability ofchemicals in soil for earthworms. Ecotoxicol Environ Saf 57:39-47




PRÁCTICA No 2

Nombre de la práctica:

BIOMARCADORES DE EXPOSICIÓN A PLAGUICIDASORGANOFOSFORADOS: ACTIVIDAD CARBOXILESTERASA.

1.- INTRODUCCIÓN

Las carboxilesterasas (CbE) pertenecen a un grupo de enzimas esterasas quehidrolizan un amplio rango de ésteres de ácidos carboxílicos.

Las CbEs han sido detectadas en el hígado y muchas especies de vertebrados.Las CbEs participan en la detoxificación de insecticidas carbamatos y piretroides(figura 3), por tener una estructura química similar a los ácidos carboxílicos. Porejemplo, los productos de la hidrólisis de los carbamatos son un alcohol y el ácidocárbamico, el cual se descompone rápido en CO2 y metilamina (fig. 3 A). Talesproductos son fácilmente excretados por tener una solución en agua mayor que elcompuesto parental.



2.- OBJETIVO.

Los objetivos de la práctica son los siguientes:

• Aprendizaje en le ensayo de actividad CbE en plasma.

• Aprendizaje en el ensayo enzimático discontinuo.

• Corroborar si existen diferencias en la actividad CbE entre las distintas especiesque se utilizan en la práctica.

• Conocimiento de la función fisiológica de las CbEs y su papel en el mecanismode resistencia de las plagas a ciertos plaguicidas.

3.- MARCO TEÓRICO

En mamíferos, existe un grupo de CbEs que son inhibidas por insecticidasorganofosforados, carbamatos (Fig. 6) a este grupo de CbEs se les ha dado unpapel de detoxificación de estos plaguicidas tal y como ocurre con lascolinesterasas plasmáticas, es decir, actuando como ‘sustrato suicidas’ puesto quela inhibición es el caso de los insecticidas organofosforados es irreversible (Fig.6B).



Fundamento de la Operación

Se evaluará la actividad de las carboxiesterasas (CbE) en diversas especies,obtenidas a través del plasma y se observará cuál de ellas presenta una mejoractividad enzimática.




• Muestra de plasma de diferentes especies (aves, reptiles, peces).

• Tubo de vidrio (o plastico) de 10ml.

• Espectofotómetro UV-Vis.

• Cubeta de plástico.

• Micropipetas automáticas.

• Vasos de precipitados de 100-250 ml.

Reactivos:

• Tris.

• 1-nafil acetato.

• Ácido clorhídrico.

• Cloruro de calcio.

• Acetona.

• SDS.

• Tritón X-100.

• Fast Red ITR.

4.2.- Procedimiento



4.2.1.- Preparación de las muestras de plasma.

• Las muestras de plasma se toman de diferentes organismos y se centrifugan a10.000 rpm durante 10 minutos a 4º C. Se prepara el Sobrenadante (plasma) y sedeshecha el pellet o precipitado.

• Las muestras de plasma son diluidas en H2O destilada a una reacción de 1/20.

4.2.2.- Preparación de las soluciones o reactivos.

• Tampón Tris/HCI 25 mM/1 mM CaCl2, pH=7.6

Disolver 1.50 g de tris y 0.054 g de CaCl2 en 500 ml de agua destilada.

Ajustar a pH=7.6 con HCl. Tener cuidado con el pH porque la actividad CbE es pHdependiente.

• SDS 2.5% (w/v).

Disolver 2.5g de SDS en 100 ml de agua destilada

• Tritón al 2.5% (w/v).

Disolver 2.5g de Tritón X-100 en 100 ml de agua destilada.

• Fast red ITR al 0.1% en Tritón 2.5% (w/v).

Disolver, en el momento de su uso 0.01 g de Fast red ITR en 10 ml de

Tritón X al 2.5% en agua. Proteger de la luz.

• 1-naftil acetato 3.46 mg /10 ml de acetona.

Disolver 3.46 mg de 1 naftil acetato en 10 ml de acetona y conservar el tuvo devidrio en hielo (se evita que se concentre el 1 naftil acetato por evaporación de laacetona).

4.2.3.- Ensayo enzimático.

• Añadir 1 μL de suero diluido (agitar los eppendorf antes de tomarlos) en 1940 μLde tampón Tris/HCI y agitar. Usar tubos de vidrio o plástico de 10 ml.

• Incubar la muestra durante 5 min a 25ºC (en baño de agitación).

Recordar hacer 2 blancos para tarar el espectrofotómetro.



• Añadir 50 μL de 1-naftin acetato y agitar los tubos.

• Dejar transcurrir la reacción enzimática durante 10 min a 25ºC.

• Retirar los tubos del baño de agitación y bloquear la reacción con la adición acada tubo de 0.5 ml de SDS 2.5%.Agitar.

• Añadir 0.5 ml de Fast Red ITR en tritón 2.5% y agitar los tubos.

• Dejar reposar durante 30 minutos en absoluta oscuridad.

• Leer Absorbancia total a una longitud de onda de 530 nm

5.- INDICACIONES

Tiempo estimado-- 4 horas



Relación con el programa teórico--Biomarcadores, resistencia a los plaguicidas,evaluación del riego ecológico.

5.1.- Cálculo de la actividad CbE

La actividad CbE se calcula de la siguiente forma:

• Paso 1. Transformación de la variación de Abs/min a variación de concentraciónmilimolar por minuto por ello, se divide el valor de Abs /min por el coeficiente deextinción molar del complejo que se forma entre el naftol y el Fast Red ITR, cuyovalor es de 33,22 mM -1cm-1

• Paso 2. Considerar si la muestra diluida, es decir, el volumen final de la reaccióny el volumen de la muestra añadido a la cubeta , y si éste fue o no previamentediluido.

• Paso 3. Convertir la actividad desde mM a μmol/ml. Teniendo en cuenta que1mM = 1 mmol/L= 1μmol/ml, entonces el resultado es el siguiente

6.- REPORTAR

• La actividad CbE

*Cuestionario

• ¿Qué animal tolerara mejor los insecticidas piretroides, carbamatos yorganofosforados?

• ¿Qué diferencia hay entre un ensayo enzimático continuo y otro discontinuo?



7. - BIBLIOGRAFÍA

1. Walter CH. 1998. In: Calow P. (ed), Handbook of Ecotoxicology, BlackwellScience Ltd, Oxford, United Kingdom.

2. Sogorb M.A., Vilanova E. (2002). Enzymes ionvolved in the detoxification oforganophosphorus, carbamatos and pyrethroid insecticides through hydrylysis,,Toxicol, Lett., 128:215-228.

3. Jokanovic M. (2001). Biotransformation of organophosphorus Compounds.Toxicology, 166:139-160.

4. Satoh T., Hosokawa M. (1998). The mammalian carboxylesterases: frommolecules to functions, Annu, Rev Pharmacol. Toxicol., 38: 257-288

5. Sanchez-Hernàndez J.C. (2001). Wildlife exposure to organophosphorusinsectidcides.

6. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology, 172:21-63.




PRÁCTICA No. 3

UTILIZACIÓN DEL ENSAYO DE REPULSIÓN A UN SUELO CONTAMINADOCON LA LOMBRIZ DE TIERRA Eisenia fetida.

1.- INTRODUCCIÓN.

• Las lombrices de tierra evitan el suelo contaminado gracias a la existencia dequimiorreceptores en el prostomio (fig. 1). Algunos estudios experimentales hanpuesto de manifiesto que esta capacidad de repulsión de las lombrices puedenutilizarse como un índice de contaminación del suelo. De hecho, el protocolo deejecución de tal ensayo toxicológico esta en el proceso de estandarización.

2.- OBJETIVO.

• Aprendizaje de la ejecución del ensayo de repulsión con la lombriz de tierra.

• Comparar si existen diferencias entre la respuesta de repulsión de la lombriz alCu y al Hg.

• Significado eco toxicológico del ensayo de toxicidad.



3.- MARCO TEÓRICO.

El ensayo de toxicidad consiste en colocar la lombriz entre dos suelos (uno dereferencia y el otro contaminado) y permitir, durante 48 horas, que la lombriz “elija”el suelo. A la hora de llevar a cabo este sencillo ensayo, se han utilizado diversosdiseños experimentales, desde dispositivos de 6 cámaras interconectadas yalbergando 6 tipos de suelos hasta un diseño más sencillo que emplea doscámaras con dos suelos conectados entre si. Este ultimo diseño se empleara en lapractica (fig. 2).


La comprobación de la existencia de quimiorreceptores que presenta la lombriz detierra, para evitar áreas contaminadas por un metal pesado.



• Muestras de suelo no contaminado

• Placas de petri de 20cm de diámetro

• Espátulas de plástico desechables

• Balanza

• Papel de aluminio

• Estándares de Hg. (HgCl2) y Cu (cUSO4)

• Vasos de precipitado



• Pipetas de plástico o vidrio

• Un trozo de radiografía (separador)

4.2.- Procedimiento

4.2.1 Preparación del suelo

• El suelo será tamizado a un tamaño de partícula < 5 Mm. para evitar particular

gruesas que puedan dañar el tegumento de la lombriz.

• El suelo se dividirá en tantas fracciones como concentraciones de Hg y Cu se

quiera ensayar. Así, para realizar el ensayo de repulsión utilizando 5

concentraciones de Cu y 5 concentraciones de Hg, necesitaremos dividir la

muestra desuelo en 12 fracciones considerando 2 submuestras para los controles

de cada metal pesado.

• Las concentraciones de Cu y Hg a ensayar serán las siguientes: 5, 50, 100, 150,

200 ug/g peso seco. Una vez calculada las diluciones y preparados las soluciones

de cada metal se procederá a contaminar los suelos según el peso del suelo y la

concentración deseada.

• Los suelos contaminados se colocaran en bolsas de plástico herméticamente

cerradas y se procederá a su homogenizado. Se añadirá un volumen de agua tal

que la humedad del mismo este entre el 30-40% en relación a su peso (considerar

el volumen de solución acuosa conteniendo el metal pesado).

• Las submuestras de suelos tendrán un peso húmedo de 200 g y ocuparan la

mitad de la placa de petri y tal como se muestra en la foto 1

4.2.2 Liberación de las lombrices en las placas.

• Se liberaran 6 lombrices por placa. Colocándolas en la mitad de la mitad de laplaca donde los suelos toman contacto entre ellos.



• Las placas se colocaran en oscuridad y a la temperatura del laboratorio.Colocando un ligero peso sobre las tapas de las placas para evitar que laslombrices se escapen.

• En este punto se dará por iniciado en ensayo de toxicidad aguda (24 h)



5. INDICACIONES.

• Para estimar la toxicidad del Cu o Hg en los suelos, debemos proceder comosigue:

• Finalizado el ensayo (24 h después), se coloca el separador en la placapermitiendo nuevamente separar los dos tipos de suelos (el contaminado y elcontrol)

• Se cuentan las lombrices en cada suelo, en el caso de cortar una lombriz cuandose coloca el separador, este contabilizara como 0.5 para cada suelo.

• Calcular el porcentaje de lombrices en cada tipo de suelo y placa.

Realizar un grafico tal y como se muestra en la fig. 3

• El suelo se considera toxico cuando el porcentaje de lombrices en el suelocontaminado sea inferior o igual al 20%. En la fig. 3 se muestra este umbral con lalínea horizontal en el 80%



6.- REPORTAR.

*Cuestionario:

• ¿Qué metal resulta más tóxico a la lombriz?

• ¿Cuál, o cuales, seria la vía de entrada del metal a la lombriz de tierra?

• ¿Qué parámetros fisicoquímicos del suelo afectarían la biodisponibilidad y

toxicidad de los metales a la lombriz?

• ¿Qué significado ecotoxicológico y ecológico tendría la conducta de repulsión de

la lombriz en el suelo?

7.- BIBLIOGRAFÍA

1 Lourerio S, Soares AMVM, Noriega AJA (2005). Terrestrial avoidance behaviourtests as escreening tool to assess soil contamination. Environ Pollut 138:121-131.

2 Lukkari T, Haimi J (2005). Avoidance of Cu-and Zn- contaminated soil byecologically different earthworm species. Ecotoxicol envirom saf 62:35-41

3 ISO (2004). Draft:soil Quality- avoidance test for evaluating the quality of soilsand the toxicity of chemicals. Test wih earthworm’s biomarkers riks assessment:current status and perspective. Reviews of environmental contamination andtoxicology (en prensa).




PRÁCTICA No. 4

BIOMARCADORES DE EXPOSICIÓN A METALES PESADOS: ACTIVIDADGLUTATIÓN-S-TRANSFERASA.

1.- INTRODUCCIÓN.

Las glutatión-S-transferasas (GST, EC 2.5.1.18) son una superfamilia polimorfitade enzimas multifuncionales. Estas enzimas son cruciales en la regulación de lasusceptibilidad a enfermedades como el cáncer, gracias a su habilidad parainmovilizar metabolitos con capacidad cancerígena.

2.- OBJETIVO.

Los objetivos de la práctica son los siguientes:

• Aprendizaje del ensayo enzimático de la GST según el método de Habig et al.(1974)

• Estudiar el efecto de la exposición a Hg (HgCl2) sobre la actividad GST de lalombriz de tierra Eisenia fétida.

• Comparar los niveles de GST en las porciones anterior, media y posterior de lalombriz E. fétida.

3.- MARCO TEÓRICO

Desde el punto de vista de la ecotoxicología las GST participan en el proceso debiotransformación conjugando metabolitos electrofílicos con el glutatión(tripéptido), o en la inmovilización de los metales pesados (Fig. 3).



Como biomarcador, su respuesta es variable dependiendo de la especie, delcontaminante y de las condiciones ambientales de la exposición a la sustanciacontaminante, entre otros factores generalmente, la inducción de este enzima esla repuesta biológica considerada biomarcador de exposición a contaminantes.Las GST son particularmente abundantes en el hígado y otros tejidos con unelevado metabolismo, aunque también se detectan en la sangre. Además de estepapel en los procesos de destoxificación de sustancias contaminantes. Las GSTjuegan un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis oxidativa,funcionando como un mecanismo de defensa antioxidante (fig. 1)




Observar el efecto a la exposición al mercurio a diferentes concentraciones sobrela actividad de la Glutatión-S-transferasa de la lombriz de tierra, para lo cual, seextraerá de tres secciones de su organismo (anterior, media y posterior) ycomparar su nivel de Glutatión.S-transferasa en cada uno.




• Muestras de suelo no contaminado

• Vasos de precipitado de 1L de capacidad

• Espátulas de plástico desechables



• Balanza

• Papel de aluminio

• Parafilm

• Estándares de Hg (HgCl2).

• Pipetas automáticas y de vidrio

• Tubos de plástico o vidrio

• Reactivos para la relación del ensayo enzimático

• Nitrógeno liquido

• Material de disección

• Espectrofotómetro UV-Vis

• Cubetas de plástico

4.2.- Procedimiento

Protocolo de exposición al Hg

• Contaminar 5 muestras de suelo con 5 concentraciones de Hg. Lasconcentraciones de Hg serán las siguientes 50, 100, 200, 400, 1600 μg/g pesoseco. Considerar un suelo control no contaminado.

• Homogeneizar los suelos contaminados con la ayuda de una bolsa de plásticocerrada herméticamente.

• Colocar cada muestra de suelo contaminado en un vaso de precipitado de 1L decapacidad.

• Liberar 6 lombrices de tierra en cada vaso de precipitado.

• Tapar los vasos con parafilm permitiendo el intercambio de aire conperforaciones del papel.

• Colocar los vasos en oscuridad y a la temperatura del laboratorio.



Preparación de las muestras.

• Una vez finalizado de la fase de exposición de las lombrices al Hg (2-3 días), seprocederá al aislamiento de las GST y su medida.

• Las lombrices se extraerán de cada suelo y se colocaran en placas de petriconteniendo un trozo de papel humedecido con agua destilada (Foto 2).



• Permanecerán 24 h en oscuridad para su depuración.

• Finalizada la fase de depuración. Las lombrices serán cortadas en 3 porciones(anterior, media y posterior) rápidamente congeladas en nitrógeno liquido.

• Cada submuestra de lombriz será pesada y homogeneizada en un volumen detampón (1:4 p/v) con la ayuda de un homogeneizador Ultra- Turrax.

• El homogenado será centrifugado a la 18.000 X g durante 20 minutos y a 4ºC.

• La GST se medirá en el sobrenadante.

4.3 Preparación de las soluciones para el ensayo enzimático.

1. Tampón de homogenización: Tris/HCl 100 mM / 0.1 mM PMSF,

pH= 7.6.

• Disolver 3.028 g de Tri, 0,093 g de EDTA-K2 y 21.39 g de sacarosa en 250 ml deagua destilada.

• Ajustar a pH = 7.6 con HCl.

2. Tampón de reacción fosfato potásico 100 mM, pH = 6.5

• Disolver 3.97 g de KH2PO4 en 250 ml de agua destilada y llevar a pH = 6.5.

3. PMSF 0.5 M en dimetilsufoxido (DMSO):

• Disolver 0.087 g de PMSF en 1 ml de DMSO. Añadir 50 μL de la solución en250 ml de tampón (factor de dilución 1/5000).

4. Glutatión reducido (GSH) 100 mM.

• Disolver 0.061 g de GSH en 2 ml de tampón fosfato pH = 6.5

5. 1-cloro, 3,4-dinitrobenceno (CDNB) 50 mM.

• Disolver 0.02 g de CDNB en 2 ml de etanol absoluto

4.4 Ensayo enzimático.

Las reacciones que tienen lugar en la cubeta se muestran en la figura 1, lasconcentraciones de GSH y CDNB en el medio de incubación han de ser 5 mM y 1mM, respectivamente. Al añadir 50 μl GSH (50mM) y 20 μl de CDNB (50 mM) a



un volumen final de 1 ml (medio de reacción), se consiguen esas concentracionesfinales.

• Agitar los reactivos con la ayuda de un trozo de parafilm (el volumen final en lacubeta es de 1 ml)

• Añadir 50 μl del homogenado de lombriz y agitar nuevamente.

• Leer cinética a una longitud de onda de 340 nm.



5. INDICACIONES

4.5 Calculo de la actividad GST.

1. transformación de la variación de Abs/min. A variación de concentraciónmilimolar por minuto. Para ello, se divide el valor de Abs/min. Cuyo valor es de 9,6mM-1 cm-1.



ΔA (min. X cm) ÷ε (mM-1 x cm-1) = Δ mM/min.

2. considerar si la muestra fue diluida, es decir, volumen final de la reacción (1 ml)y el volumen de la muestra añadido a la cubeta (0.05), y si este fue o nopreviamente diluido.

3. convertir la actividad desde mM a μmo1/ml. Teniendo en cuenta que 1mM =mmo1/L = 1μmo1/ml, entonces el resultado es el siguiente:

Δ mM/min. = μmol/ml/min

4. Normalizar la actividad de la GST a peso de tejido utilizado. Para ello se divideentre el peso de lombriz por cada ml de homogenado (relación 1:4 en el procesode homogeneización).

μmol/ml/min ÷ g/ml = μmol/min/g de tejido

6.- REPORTAR.

*Cuestionario:

¿Qué efecto produjo el Hg en la actividad GST de la lombriz?

¿Cuál sería la función de la actividad GST en relación al Hg?

¿Qué significa para lombriz tener una actividad GST elevada?

7.- BIBLIOGRAFÍA

1 Wang W., Ballatori N (1998). Endogenus glutathione conjugates:

ocurrente and bilogical funtions. Pharmacological reviews. 50:335-353.

manual de procedimientos

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