manual de prácticas de laboratorio de biología molecular i (2)
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Manual de Prácticas de Laboratorio de Introducción a la Biología Molecular I
LBT-BUAP
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Manual de Prácticas de Laboratorio de
Introducción a la Biología Molecular I
Autores
Ricardo Carreño López, Fabiola Avelino
Flores, María del Rocío Bustillos Cristales,
Edith Chávez Bravo, Rocío Pérez y Terrón,
Lorena Milflores Flores
Licenciatura en Biotecnología de la
Benemérita Universidad Autónoma de
Puebla
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Autores
Ricardo Carreño López
Doctor en Ciencias Microbiológicas, Profesor Investigador, Centro de
Investigaciones en Ciencias Microbiológicas del Instituto de Ciencias de la
Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Puebla, México. Correo
electrónico: [email protected]
Fabiola Avelino Flores
Doctora en Ciencias Ambientales, en el Área de Ambiente y Salud.
Profesora Investigadora, Centro de Investigaciones en Ciencias
Microbiológicas del Instituto de Ciencias de la Benemérita Universidad
Autónoma de Puebla. Puebla, México. Correo electrónico:
[email protected]. Laboratorio de Patogenicidad Microbiana.
María del Rocío Bustillos Cristales
Candidata a doctora en Microbiología. Profesora Investigadora, Centro de
Investigaciones en Ciencias Microbiológicas del Instituto de Ciencias de la
Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Puebla, México. Correo
electrónico: [email protected]
Edith Chávez Bravo
Doctora en Ciencias Ambientales, en el Área de Ambiente y Salud.
Profesora Investigadora, Centro de Investigaciones en Ciencias
Microbiológicas del Instituto de Ciencias de la Benemérita Universidad
Autónoma de Puebla. Puebla, México. Correo electrónico:
[email protected]. Laboratorio de Patogenicidad Microbiana.
Rocío Pérez y Terrón
Doctora en ... Profesora Investigadora, Escuela de Biología de la
Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Puebla, México. Correo
electrónico: [email protected]
Lorena Milflores Flores
Doctora en Ciencias Químicas, Profesor Investigador. Escuela de Biología
de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Puebla, Mexico. Correo
electrónico: [email protected]. Laboratorio de Biología Molecular
y Microbiología.
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Índice
Objetivo General 4
Resumen 4
Normas generales del uso del laboratorio de Biología Molecular 5
Extracción de ADN Genómico: Método tradicional y con kit 8
Extracción de ADN plasmídico por método tradicional 15
Purificación de ADN plasmídico por Silica. 19
Purificación de ADN cromosómico y ADN plasmídico 23
Cuantificación de ADN en geles de agarosa. 32
Cuantificación de ADN por espectrofotometría 37
Extracción por kit de ARN bacteriano. 41
Conclusión del Manual 45
Bibliografía general 46
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Objetivo General
Que el alumno aprenda a realizar y compare las diferentes metodologías de
purificación y análisis de ácidos nucleicos
Resumen
La biología molecular como una disciplina científica cuyo objetivo es el estudio de
los procesos que se desarrollan en los seres vivos desde un punto de vista molecular.
Pretendiendo explicar los fenómenos de la vida a partir de sus propiedades
macromoleculares. Especialmente a través del estudio de los ácidos nucleicos y las
proteínas.
Al estudiar las moléculas que componen a las células vivas, la Biología Molecular
roza con las metodologías utilizadas por otras disciplinas científicas que abordan temas
similares como la genética, la ingeniería genética y la bioquímica entre otras.
Para el profesionista que se desarrollará en el ámbito de la biotecnología
aprovechando las cualidades de los microorganismos, células eucariotas y de las
estructuras subcelulares activas, es de suma importancia aprender a manipular y analizar
los ácidos nucleicos.
Los métodos de manipulación y análisis de los ácidos nucleicos revisten especial
importancia cuando deseamos saber la composición, secuencia, tamaño y forma de
actuación de un gen para seguir el proceso de transmisión de esta información genética
al ARN y posteriormente a un posible péptido, proteína y/o enzima.
En este manual se pretende dar al alumno la información básica y procedimientos
para la manipulación de los ácidos nucleicos. Se abordan diferentes metodologías de
purificación de ADN para que el alumno juzgue las ventajas y los inconvenientes de cada
una de ellas, así como los métodos de detección cualitativos y cuantitativos del ADN y ARN.
Es una obra básica que en sus secciones intenta complementar la información
teórica que ha recibido el alumno con metodologías de purificación y análisis de los ácidos
nucleicos.
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Normas generales del uso del laboratorio de Biología Molecular
Para el desarrollo de las prácticas en el laboratorio es conveniente tener en cuenta algunas
normas elementales que el alumno debe seguir:
1. Antes de empezar la práctica de laboratorio, debe leerse detenidamente las normas
elementales de laboratorio de Biología Molecular, así como la práctica respectiva a
desarrollar, con el fin de tener una idea clara del objetivo, fundamento y metodología a
seguir.
2. Accidentes personales, tales como derrame de reactivos, cortes, quemaduras u otros
deben comunicarse inmediatamente al Profesor-Instructor.
3. El orden y la limpieza son esenciales antes, durante y después de haber desarrollado la
práctica de laboratorio.
Cada grupo o sección de alumnos se responsabilizará de su zona de trabajo y de su
material.
4. No se podrá ingerir alimentos o bebidas dentro del laboratorio así como se evitará jugar
o hacer bromas durante el desarrollo de la práctica.
5. Los productos inflamables (gases, alcoholes, éter, cloroformo etc.) deben mantenerse
alejados de las llamas, por ejemplo de los mecheros. Si se manejan mecheros de gas
se debe tener mucha precaución de cerrar las llaves de paso al apagar la llama.
6. Antes de utilizar un reactivo hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de que es el
que se necesita, de la forma de manipulación y de los posibles riesgos a su salud.
7. Todo el material y equipo especialmente los aparatos delicados, como cámaras de
electroforesis, deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus
mecanismos de apertura y cierre.
Se debe guardar especial atención al utilizar la cámara electroforética. El umbral mínimo
de contracción muscular se produce con 9 mA, pudiendo afectar a los músculos
respiratorios.
El umbral de corriente peligrosa ocurre a los 80 mA en corriente alterna, que puede
provocar fibrilación ventricular con posible parálisis temporal cardiaca y respiratoria. En
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términos generales una corriente ya sea continua o alterna de 100 mA es peligrosamente
mortal.
El uso de ollas de presión y hornos de microondas debe ser con sumo cuidado evitar
sellar frascos al introducirlos a dichos aparatos y evitar introducir metales al horno de
microondas.
8. Todos los materiales de desecho que hayan entrado en contacto con microorganismos
(como pipetas, placas Petri, tubos, puntas de micropipeta etc.), deben colocarse en
bolsas de autoclave preparadas para tal efecto y proceder posteriormente a su
esterilización. Las pipetas Pasteur de cristal, los cubreobjetos y portaobjetos usados se
colocarán en un recipiente especial para vidrio que indicará el profesor antes de iniciar
la práctica.
9. Usar siempre “bata” en el laboratorio, asi como guantes cubrebocas, gafas etc. cuando
el Profesor instructor lo indique o este señalado en la práctica de laboratorio que se
realizará.
No tocar solventes con la mano desnuda como acetona, metanol etc.
Si usa lentes de contacto el riesgo es mayor para sus ojos con los gases pues se pueden
ocluir detrás de las lentes.
10. Nunca deben sustraerse cultivos de microorganismos ni sustancias químicas del
laboratorio.
11. Lavarse las manos con jabón o con un desinfectante si es necesario, frecuente
mente durante el desarrollo de la práctica y siempre antes de dejar el laboratorio.
12. Los medios de cultivo inoculados deben colocarse en las cámaras de cultivo con su
identificación respectiva, ej.: nombre del microorganismo, nombre del alumno,
naturaleza del medio, fecha etc.
13. No arrojar residuos químicos al desagüe deberá informarse la manera de
desecharlos con su Profesor –instructor.
14. Las micropipetas deberán utilizarse conforme a las instrucciones del profesor. Si no
tiene claro cómo se utilizan deberá preguntar al profesor instructor para evitar su
descalibración. Recuerde que las micropipetas a pesar de ser un instrumento pequeño
son de alta exactitud y de costo elevado.
15. Las celdas para el espectrofotómetro, y los cubreobjetos y portaobjetos deben
cogerse por los bordes para evitar que se engrasen, así como su manipulación debe ser
con firmeza y delicadeza para evitar su daño.
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16. Los tubos de ensayo que contengan medios de cultivos o cultivos de
microorganismos, nunca deben abrirse en posición vertical, sino lo más horizontalmente
posible (inclinados) y para quitar el tapón se mantendrán inclinados con una mano y se
abrirán con la otra, que sostendrá a su vez el asa. Una vez abierto, se flamea por algunos
segundos el orificio, repitiendo dicha operación una vez realizada la siembra (el tapón
nunca debe dejarse sobre la mesa).
17. Antes de utilizar las asas con hilos de platino que sirven para las siembras, éstas
deben flamearse al rojo en posición vertical bajo la acción de la llama; también debe
flamearse el mango. Antes de efectuar la siembra debe esperarse algunos segundos a
que se enfríen, pudiendo enfriarse también en el borde de la placa de Petri que contiene
el medio de cultivo. Inmediatamente después de haberlas utilizado, deben flamearse
nuevamente para eliminar a los microorganismos que aún se encuentren en ella.
18. El alumno deberá ser metódico en la realización de la práctica de laboratorio y anotar
los resultados inmediatamente después de haberlos obtenido.
19. En caso de tener dudas o preguntas deberá dirigirse al Profesor- Instructor nunca
con su compañero alumno.
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Extracción de ADN Genómico: Método tradicional y con kit
Objetivo.
Extraer ADN genómico de una bacteria Gram negativa utilizando un método
tradicional y el ADN genómico de sangre con un kit comercial.
Introducción.
La extracción y purificación de los ácidos nucleicos es el primer paso en la mayoría
de los estudios de Biología molecular. Para manipular o amplificar el ADN es necesario
eliminar otros componentes celulares que pueden interferir con los experimentos, como
proteínas, ARN y lípidos sin dañar al ADN. Existen varios métodos para la extracción y
purificación de los ácidos nucleicos, los cuales son seleccionados según:
El tipo de ácido nucleico a extraer (ADN genómico, ADN plasmídico, ARN total, ARN
mensajero).
El organismo de donde se extraerá (células animales, plantas, levaduras, bacterias,
virus)
El material de extracción (órganos completos, tejidos, cultivos celulares, sangre,
muestras ambientales)
Los resultados deseados (rendimientos, pureza, tiempo de purificación)
La aplicación posterior (amplificación, clonación, expresión, transcripción reversa).
La extracción de los ácidos nucleicos a partir de materiales biológicos requiere la
homogeneización de los tejidos, en su caso, el lisado de las células y la inactivación de las
nucleasas celulares que podrían digerir el ADN. Esto asegura que la cantidad de ADN
intacto obtenido sea la máxima. La homogeneización y la lisis celular deben ser lo
suficientemente fuertes para romper el tejido, la pared y las membranas celulares, pero ser
suave para preservar los ácidos nucleicos. Los procesos más comunes son:
La disrupción mecánica, como la ruptura hipotónica, o la congelación-
descongelación.
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El tratamiento químico, como la lisis con detergentes o agentes caotrópicos.
La digestión enzimática con proteasas, lisozima o mutanolisina.
La ruptura celular y la inactivación de nucleasas intracelulares deben de ser
combinadas. Se puede utilizar una solución con detergentes para solubilizar las membranas
celulares y sales caotrópicas fuertes para inactivar las nucleasas. El ADN y otros
componentes celulares como lípidos, azúcares y proteínas, se disuelven en la solución de
lisis. El ADN tiene carga negativa debido a los grupos fosfato de su estructura, y esta carga
eléctrica es lo que hace soluble a esta molécula.
Posteriormente a la extracción se debe purificar el ADN y ésta se logra
frecuentemente con métodos combinados como:
Extracción/precipitación usando solventes para eliminar contaminantes, como la
combinación de fenol y cloroformo para eliminar proteínas; mediante la utilización
de altas concentraciones de sal o cambios en el pH para precipitar las proteínas
(precipitación selectiva); o la precipitación de los ácidos nucleicos con isopropanol
o etanol, dado que el ADN es insoluble en altas concentraciones de sal y alcohol. El
ADN precipitado forma unas finas hebras blancas, mientras que el resto de las
sustancias permanecen disueltas.
Cromatografía la cual se puede llevar a cabo por fltración en gel, separando las
moléculas por su tamaño molecular; por intercambio iónico, separando y
concentrando las moléculas por interacciones electrostáticas con la matriz de la
columna; por adsorción, utilizando membranas de sílica en presencia de altas
concentraciones de ciertas sales y posterior elución con agua o un buffer; por
afinidad, ligando a los ácidos nucleicos a una matriz particular, y posteriormente se
agrega una molécula que compite por el ligando dejando libre a los ácidos nucleicos.
Centrifugación, que es un método de purificación importante utilizado
frecuentemente en combinación con otros métodos, como la filtración en gel y la
cromatografía de adsorción.
Electroforesis en geles de agarosa, que se utiliza frecuentemente para determinar
el tamaño y la integridad del ADN extraído.
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Requerimientos.
Equipo Material Reactivos
Campana de extracción Tubos tipo falcón de 15 mL Medio LB
Vórtex Tubos para microcentrífuga de
1.5 mL, estériles
Agua bidestilada estéril o
Milli-QTM
Incubadora con
agitación orbital a 37 °C
Micropipeta de 100 a 1,000 L y
puntas desechables estériles
Fenol equilibrado con Tris
Microcentrífuga Micropipeta de 10 a 100 L y
puntas desechables estériles
Acetato de sodio 3 M con pH
5.2
Campana de extracción Cepa de E. coli K-12 Etanol absoluto
Congelador a -20 °C Sangre 1 mL Cloroformo
Baño María Kit Quick-gDNA MiniPrep de
Zymo Research
Buffer TE pH 8.0
Protocolo.
Extracción de ADN genómico de una cepa de Escherichia coli.
1. Propagar un cultivo de E. coli en medio LB (5 mL) durante toda la noche (18-24 hora)
a 37°C con agitación constante de 200 rpm.
2. Colocar 1 mL del cultivo en un tubo de polipropileno de 1.5 mL, centrifugar el tubo a
4,000 rpm durante 5 minutos y decantar el sobrenadante.
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3. Agregar 250 µL de agua desionizada estéril al paquete celular y agitar
vigorosamente utilizando un vórtex hasta lograr la resuspensión de las células
(aproximadamente 30 s).
4. Agregar 250 µL de fenol (equilibrado con Tris 1M pH 8.0) y agitar vigorosamente
durante 30 s utilizando un vórtex.
i.
5. Agregar 250 µL de cloroformo y agitar vigorosamente utilizando un vórtex durante
30 s.
6. Centrifugar a 9,000 rpm durante 5 minutos.
7. Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 225 µL) y colocarla en otro tubo de
1.5 mL. En muchas ocasiones en la interfase se presenta un precipitado blanco,
este precipitado no debe ser recuperado, ya que son proteínas que pueden
contaminar la muestra e inhibir reacciones posteriores.
8. Agregar 225 µL de cloroformo y agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un
vórtex.
9. Centrifugar a 9,000 rpm durante 5 minutos.
Interfase
Fase acuosa
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10. Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 200 µL) y colocarla en otro tubo de
1.5 mL, teniendo las mismas precauciones que en el paso VII.
11. Agregar 20 µL de Acetato de Sodio (3M) a la fase acuosa, agitar en vórtex 20 s y
agregar 440 µL de etanol Absoluto frío a la fase acuosa.
12. Centrifugar a 12,000 rpm durante 30 minutos. Es importante colocar los tubos en la
misma orientación siempre, para saber en qué lado del tubo está el ADN precipitado.
13. Retirar el sobrenadante y dejar secar a 37 ºC.
14. Resuspender en 100 L de TE o agua grado PCR y conservar a -20 ºC. Para
utilizarlo en análisis posteriores se deberá cuantificar y determinar el grado de
pureza.
Extracción de ADN genómico de sangre con el kit Quick-gDNA MiniPrep.
1. Adicionar 400 μl del Buffer de lisis a 100 μl de sangre en un microtubo de 1.5 mL
(4:1). Mezclar completamente con agitación mecánica de 6-10 segundos, incubar a
temperatura ambiente durante 5-10 minutos.
2. Transferir la mezcla a una columna Zymo-Spin (unida a un tubo de recolección) y
centrifugar a 11000 rpm durante un minuto. Descartar el tubo de recolección junto
con el líquido contenido.
3. Transferir la columna a un nuevo tubo de recolección, adicionar 200 μL del Buffer
de pre-lavado y centrifugar nuevamente a 11000 rpm durante un minuto. Descartar
el tubo de recolección junto con el líquido contenido.
4. Añadir 500 μL del Buffer de lavado a la columna y centrifugar a 11000 rpm durante
un minuto. Descartar el tubo de recolección junto con el líquido contenido.
5. Transferir la columna a un tubo limpio y estéril para microcentrifuga. Adicionar > 50
μL de Buffer de elución de ADN o agua estéril. Incubar durante 5 minutos a
temperatura ambiente. Centrifugar a 12,000 rpm durante 45 segundos para eluir el
ADN. El ADN obtenido puede ser empleado inmediatamente o bien ser congelado
a -20°C.
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Resultados esperados.
Obtendrá en ambos casos una resuspensión transparente que guardará a -20°C
para que se corra en los geles de agarosa en el momento que su instructor se lo indique.
Fotodocumentar los resultados obtenidos y discutir las diferencias observada en el gel.
Cuestionario.
1. ¿Qué procesos de extracción de ADN se emplearon en cada caso?
2. ¿Cuáles son los cuidados que se deben tener al manipular fenol?
3. ¿Será lo mismo obtener ADN de E. coli y de sangre humana? Sustente su
respuesta.
4. ¿Cuál es la función de la columna en el método de extracción de ADN por kit?
Muestra de sangre+
Amortiguador de lisis genómica
CentrifugarLavarEluir
DNA ultrapuro para:PCR
Digestión por endonucleasasSecuenciación
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5. ¿Cuáles serían las aplicaciones de estas técnicas en la Biotecnología?
Preparación de soluciones y reactivos.
1. Fenol equilibrado con Tris 1 M pH 8.0
2. Acetato de sodio 3 M pH 5.2
3. Buffer TE pH 8.0: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA. Esterilizar y mantener a
temperatura ambiente.
Bibliografía.
Green M.R. y Sambrook J. (2012). Molecular cloning: A Laboratory Manual (4ta edic).
Woodbury, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Madigan M.T., Martinko J.M., Bender K.S., Buckley D. H.,, Stahl D. A. y Brock T. (2015).
Brock Biología de los microorganismos (14ava edic). Madrid, España: Pearson.
Zymo Research. (2014). Manual intructivo del kit Quick-gDNA MiniPrep
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Extracción de ADN plasmídico por método tradicional
Objetivo.
Aislar ADN plasmídico de células procariotas usando un método tradicional.
Introducción.
Los plásmidos son moléculas pequeñas de ADN circular (entre una y varios cientos
de kilobases) que se replican de forma autónoma e independiente del cromosoma de la
célula. La inmensa mayoría de los plásmidos son ADN de doble cadena (3). Son muy
comunes en bacterias y algunos de ellos, los más pequeños, existen en las células
bacterianas en un número elevado, se caracterizan por acarrear información genética extra
que es indispensable para la adaptación de las bacterias (1).
La mayoría de los plásmidos se caracterizan por:
Tener un origen de replicación autónomo.
Tener un gen que confiere a la bacteria resistencia a antibióticos o metales pesados,
le sirve para el desempeño de alguna función metabólica, y/o que codifica para
algún factor de virulencia
Poseer un sitio de clonación múltiple en el que se encuentra dianas únicas para
varias enzimas de restricción y que permite la introducción del ADN extraño (3).
Hay varios procedimientos para la purificación de ADN plasmídico, aunque todos
incluyen los tres pasos siguientes: (i) Crecimiento de las bacterias en un medio selectivo de
aquellas que llevan el plásmido. (ii) Lisis de las bacterias para la liberación del plásmido.
(iii) Purificación del ADN plasmídico. Uno de los métodos más empleados es el método de
“lisis alcalina”, por su sencillez, bajo costo y reproducibilidad.
La lisis alcalina utiliza las diferencias en las propiedades de desnaturalización y
renaturalización entre el ADN plasmídico y el ADN cromosómico. La alcalinización con
NaOH en presencia de un detergente fuertemente aniónico (SDS), provoca la lisis celular,
la desnaturalización del ADN cromosómico y de las proteínas, y la liberación de los
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plásmidos. Los plásmidos se ven menos afectados por su pequeño tamaño y estructura
superenrollada. La neutralización del medio en presencia de una concentración alta de sal
(acetato potásico), provoca la precipitación de las proteínas (por el tratamiento con el
detergente y la insolubilidad de la sal potásica del SDS) y la del ADN cromosómico (por
reasociaciones aleatorias intracatenarias). Los agregados insolubles de proteínas y ADN
cromosómico se separan por centrifugación del ADN plasmídico que queda en el
sobrenadante y conserva mayoritariamente su estructura nativa (2).
Requerimientos:
Equipo Material Reactivos
Incubadora de agitación Tubos tipo falcon de 15 mL Caldo LB
Microcentrífuga Tubos eppendorf de 1.5
mL
Solución Birnie I
Vórtex Micropipetas de varios
volúmenes
Solución Birnie II
Refrigerador Puntas azules, amarillas y
blancas nuevas y estériles
Solución Birnie III
Concentrador de vacío Hielo Isopropanol absoluto frío
Etanol absoluto frio
Etanol al 75%
Agua bidestilada estéril o
Milli-QTM
Protocolo
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1. Centrifugar a 8000 rpm 1.5 mL de un cultivo bacteriano de 24 h, durante 2 minutos.
2. Aspirar el sobrenadante con ayuda de una punta estéril y resuspender el paquete ce lular
en 100 L de solución de Birnie I. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente.
3. Adicionar 200 L de solución de Birnie II y mezclar suavemente por inversión suavemente
por 10 veces (La solución debe tornarse clara). Incubar 5 minutos sobre hielo.
4. Adicionar 150 L de Birnie III. Incubar de 15-30 minutos sobre hielo.
5. Centrifugar a 12000 rpm durante 10 minutos. Adicionar 600 L de isopropanol y dejar
reposar por 10 minutos.
6. Centrifugar a 14000 rpm durante 10 minutos.
7. Remover el sobrenadante y lavar el paquete con 1000 L de etanol al 75% frío, mezclar
por inversión suavemente de 7 a 10 veces y centrifugar por 10 minutos a 14000 rpm.
8. Remover tanto como sea posible el etanol y secar el tubo en el concentrador de vacío
por aproximadamente 5 minutos.
9. Resuspender el ADN en 50 L de agua estéril bidestilada y guardar a -20°C.
Resultados esperados.
Obtendrá una resuspensión transparente que guardará a -20°C para que se corra
en los geles de agarosa en el momento que su instructor se lo indique. Fotodocumentar los
resultados observados en el gel.
Cuestionario.
1. ¿Qué finalidad tiene la neutralización en el método de “lisis alcalina”?
2. ¿Por qué la alcalinización en presencia de SDS afecta menos a los plásmidos que al
ADN cromosómico?
3. ¿Qué finalidad tiene el paso de incubación con ribonucleasa A en la purificación de ADN
plasmídico?
4. ¿Qué usos se le puede dar a los plásmidos en Biotecnología?
Preparación de soluciones y reactivos
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1. Medio LB: 10 g/L de peptona de caseína, 5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de
NaCl.
2. Birnie I: 25 mM de Tris-HCl, 10 mM de ácido etilendiamino tetracético (EDTA) y
RNAsa H o A, pH 8.0.
3. Birnie II: 0.2 N de NaOH y 1.0% de dodecil sulfato de sodio (SDS)
4. Birnie III: 3 M de Acetato de potasio (KOAc), pH 4.8
Bibliografía
Balbás P. (2010). De la Biología molecular a la Biotecnología (2da. edic). México: Trillas.
Green M.R. y Sambrook J. (2012). Molecular cloning: A Laboratory Manual (4ta edic).
Woodbury, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Madigan M.T., Martinko J.M., Bender K.S., Buckley D. H.,, Stahl D. A. y Brock T. (2015).
Brock Biología de los microorganismos (14ava edic). Madrid, España: Pearson.
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Purificación de ADN plasmídico por silica.
Objetivo.
Purificar ADN plasmídico mediante el uso de silica.
Introducción.
El aislamiento de ADN plasmídico a partir de bacterias es fundamental en biología
molecular y es un paso esencial en muchos procedimientos tales como la clonación,
secuenciación de ADN, transfección y la terapia génica. Estos procedimientos donde se
manipula el ADN requieren el aislamiento de ADN plásmido de alta pureza. En el mercado
existen a la venta columnas de intercambio aniónico, aunque ampliamente utilizado, son
relativamente costosas. Un método alternativo menos costoso utiliza óxido de sílice como
la matriz de unión al ADN. Pero tiene la desventaja de que el lipopolisacárido bacteriano
(LPS) o endotoxina, son copurificadas y pueden inhibir posibles aplicaciones posteriores.
En particular, el contenido de Lipopolisacarido puede influir en gran medida en la
transfección influyendo en la eficiencia. Además, estos métodos por lo general requieren el
uso de productos químicos peligrosos (por ejemplo, hidrocloruro de guanidina), que actúan
como sustancias caotrópica para facilitar la unión del ADN a óxido de sílice. Un
procedimiento ligeramente modificado es el siguiente que resulta fácil, rápido y
relativamente de bajo costo.
Requerimientos:
Equipo Material Reactivos
Cámara de electroforesis
horizontal
Tubos de polipropileno de
1.5 mL
Agarosa grado Biología
Molecular
Microcentrífuga (14000
rpm)
Puntas amarillas y azules Solución P1
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Fuente de poder Tubos tipo falcón de 15 mL Solución P2
Incubadora Escherichia coli (pTZ18R) Solución P3
Asa bacteriológica Solución de NaI 6M
Placas Petri 90X15
desechables
Marcador de Peso
molecular de ADN de 1 KB
Micropipetas de 2-20 µL,
20-200 µL y 200-1000 µL
Solución de lavado (New
Wash)
Agua bidestilada estéril o
Milli-QTM
Agar LB*
Glicerol
Azul de bromofenol
Ampicilina
Silica
Ácido Acético
Protocolo.
Una colonia de Escherichia coli que contenga un plásmido de interés (ejem.
pTZ18R) se inocula en un tubo que contenga 5 mL de medio de cultivo (LB) con el
antibiótico adecuado (Amp). Se incuba toda la noche a 37°C a 160 rpm.
1. 1.5 mL de cultivo bacteriano son trasferidos a un tubo de polipropileno tipo
“eppendorf” y se centrifuga a 5000 x g durante 5 minutos. El sobrenadante se
desecha en un recipiente adecuado para posteriormente esterilizarlo.
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2. El sedimento (células bacterianas) libre de medio de cultivo se resuspende con 100
µL de solución P1 (con vórtex o micropipeta).
3. Agregar 200 µL de solución de lisis P2, invertir el tubo 4-6 veces (no usar vórtex),
dejando reposar en hielo 5 minutos
4. Adicionar 150 µL de solución de neutralización P3, invertir 4-6 veces el tubo (no usar
vórtex) dejar reposar 10 minutos en hielo y centrifugar a máxima velocidad 10
minutos
5. Recuperar sobrenadante y agregar 800 µL de solución de unión NaI mezclar por
inversión y agregar 5 µL de suspensión de silica, mezclar por inversión e incubar a
temperatura ambiente 5-7 minutos
6. Centrifugar a 14000 rpm 30 s y eliminar todo el sobrenadante por decantación y
pipeta
7. Adicionar 800 µL de new wash y resuspender la silica por inversión, centrifugar a
14000 rpm/30 s, repetir procedimiento si se requiere plásmido de mejor calidad
8. Secar a 42 °C de 2-5 minutos
9. Agregar 50 µL de agua con ARNasa e incubar 1 hora, centrifugar y recuperar el
sobrenadante.
Resultados a documentar.
1. Observe y documente como el paquete celular sufre modificaciones al agregar las
diferentes soluciones;
2. Observe y documente la diferencia entre el paquete celular y el ADN obtenido de
éste por la metodología de silica;
3. Documente el resultado del análisis electroforético del ADN purificado;
4. Compare los resultados de purificación de ADN plasmídico con otras metodologías
realizadas.
Cuestionario.
1. Explique por qué es necesario cultivar a la bacteria Escherichia coli (pTZ18R) con
el antibiótico Ampicilina;
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2. Describa cuál es la función de cada solución en el proceso de purificación de ADN
por esta metodología
3. Explique por qué es necesario eliminar completamente el alcohol contenido en la
solución de lavado para poder eluir el ADN de la silica
Preparación de Soluciones y reactivos.
P1: 50 mM Tris/HCl (pH 8.0) P2: 200 mM NaOH, 1 % SDS
10 mM EDTA
100 µg/mL RNase A
P3: 3.0 M acetato de potasio, pH 5.5
Preparación de la suspensión de silica
Moler con mortero 2 pipetas Pasteur nuevas
Resuspender en un mismo volumen de agua (Pisa)
Dejar reposar 5 minutos
Tomar la fase superior y secar
Resuspender en un mismo volumen de agua (pisa)
Tomar 1 mL de la fase superior en un tubo eppendorf y centrifugar 1 minutos a 14000rpm
Lavar 6 veces con el mismo volumen de agua (pisa)
Resuspender en agua (pisa aprox. 1 ml)
Solución de unión de ADN a Silika
NaI 6M
NaI ó KI 90 g
Sulfito de sodio 1 g
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CBP 100 mL agua
Filtrar con papel y almacenar en recipiente opaco al abrigo de la luz.
Solución de lavado (New Wash)
100 mM NaCl
1 mM EDTA
10 mM Tris-HCl, pH 7.5
50% Etanol
Bibliografia.
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Purificación de ADN cromosómico y ADN plasmídico.
Objetivo.
Conocer, realizar y comparar el procedimiento de purificación de ADN cromosómico
y de ADN plasmídico.
Introducción.
La purificación de ácidos nucleicos es un requisito imprescindible para realizar
diversas técnicas de biología molecular. La obtención exitosa de datos confiables y
reproducibles depende, en gran medida, de la extracción de ADN íntegro y de su
purificación. La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN y
se basa en las características fisicoquímicas de la molécula.
El ADN está constituido por dos cadenas de nucleótidos unidas entre sí formando
una doble hélice. Los nucleótidos están integrados por un azúcar (desoxirribosa), un grupo
fosfato y una base nitrogenada (adenina, guanina, timina o citosina). La unión de los
nucleótidos ocurre entre el grupo fosfato y el azúcar, mediante enlaces fosfodiester, dando
lugar al esqueleto de la molécula. Las bases de cadenas opuestas se unen mediante
puentes de hidrogeno y mantienen estable la estructura helicoidal. Los grupos fosfato están
cargados negativamente y son polares, lo que le confiere al ADN una carga neta negativa
y lo hace altamente polar, características que son aprovechadas para su extracción. Los
grupos fosfato tienen una fuerte tendencia a repelerse, debido a su carga negativa, lo que
permite disolver al ADN en soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de
la molécula. Pero, en presencia de etanol, se rompe la capa hidratante y quedan expuestos
los grupos fosfato. Bajo estas condiciones se favorece la unión con cationes como Na+ que
reducen las fuerzas repulsivas entre las cadenas de nucleótidos y permiten que el ADN
precipite. Por otro lado, la carga neta negativa del ADN le permite unirse a moléculas y
matrices inorgánicas cargadas positivamente.
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El método clásico de purificación de ácidos nucleicos se basa en el uso de
disolventes orgánicos tóxicos, siendo la extracción mediante fenol/cloroformo la más
conocida. No obstante, recientemente se han desarrollado métodos alternativos que
emplean una alta concentración salina en vez de disolventes orgánicos. El primer paso
consiste en la lisis de las células cuyo ADN se desea purificar. Este paso se realiza
mediante un detergente aniónico que solubiliza los componentes celulares. Dicha rotura
celular se lleva a cabo en presencia de “conservantes”, que garantizan la integridad del
ADN; esto es, que impiden o limitan la acción de las ADNasas presentes en las células o
contaminantes del medio. El ARN presente se elimina mediante tratamiento con ARNasa.
Posteriormente se eliminan las proteínas y otros contaminantes celulares, mediante
precipitación salina (que sustituye al tratamiento clásico con disolventes orgánicos tóxicos).
Finalmente, el ADN genómico se aísla mediante precipitación en presencia de alcohol y se
disuelve en agua o en una solución tamponada que puede contener “conservantes” del
ADN.
Existen diversos procedimientos para la purificación de ADN, aunque todos incluyen
los tres pasos siguientes: (i) Crecimiento de las bacterias en un medio selectivo de aquellas
que llevan el plásmido. (ii) Lisis de las bacterias para la liberación del plásmido. (iii)
Purificación del ADN plasmídico.
El problema principal que hay que resolver es la separación del ADN plasmídico y
ADN cromosómico.
Requerimientos:
Equipo Material Reactivos
Incubador orbital. Tubos de ensayo estériles. Solución isotónica GTE
Micropipetas automáticas. Tubos Eppendorf de 1,5 mL. Solución de lisis
Cámara de electroforesis
horizontal.
Puntas para micropipeta de
10, 200 y 1 000 L con filtro
Solución de neutralización
Fuente de alimentación. Guantes. Etanol absoluto
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Baño termostatizado. Hielo picado. Etanol 70%
Agitador vórtex. Gradilla para tubos de 1.5
o 2 mL
TE pH 8, con Ribonucleasa
A
Transiluminador UV. Toallas de papel Cloroformo
Rotuladores permanentes. Toallas de papel Isopropanol
Contenedores de puntas
utilizadas
Marcador de peso
molecular de 1 Kb
TAE
Proteinasa K
RNAsa A
Protocolo.
Purificación de ADN genómico bacteriano
a. Añadir 0,5 mL de suspensión bacteriana (esto es, cultivo en fase estacionaria
crecido durante la noche) a un tubo Eppendorf de 1,5 mL y sumergirlo en hielo
picado.
b. Centrifugar a 13.000–16.000 g durante 5 segundos para precipitar las células.
Eliminar el máximo posible de sobrenadante: primero por decantación; luego
dejando escurrir el tubo sobre papel absorbente limpio, o retirando restos con
micropipeta.
c. Añadir 300 μL de la solución de lisis y pipetear suavemente hacia arriba y hacia
abajo hasta que las células queden resuspendidas de nuevo.
d. Incubar la muestra a 80 ºC durante 5 minutos para lisar las células.
e. Enfriar la muestra hasta temperatura ambiente.
Digestión del ARN.
f. Añadir 1’5 L de la solución de ARNasa A al lisado celular.
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g. Mezclar bien la muestra, invirtiendo el tubo 25 veces.
h. Incubar a 37ºC durante 15–60 minutos.
Precipitación de proteínas
i. Enfriar la muestra hasta temperatura ambiente. Si la misma fuera superior a 21ºC,
enfriar en hielo.
j. Añadir 100 L de la solución de precipitación de proteínas al lisado celular
previamente tratado con ARNasa.
k. Agitar vigorosamente (p. ej., con agitador tipo vórtex) a alta velocidad durante 20
segundos, para mezclar uniformemente la solución de precipitación de proteínas
con el lisado celular.
l. Centrifugar a 13.000–16.000 g durante 3 minutos.
Nota: las proteínas precipitadas deben formar una pella compacta.
Precipitación del ADN
m. Decantar el sobrenadante (que contiene el ADN) a un tubo Eppendorf de 1’5 mL que
contenga 300 L de isopropanol (también llamado 2–propanol) puro (100%). El
precipitado (que contiene las proteínas) puede tirarse.
n. Mezclar la muestra invirtiendo suavemente 50 veces.
o. Centrifugar a 13.000–16.000 g durante 1 minuto. El ADN debe ser visible como un
pequeño precipitado blanco.
p. Eliminar el sobrenadante por decantación y escurrir el tubo en papel absorbente
q. Añadir 300 L de etanol al 70%. Invertir el tubo varias veces para limpiar el
precipitado de ADN.
r. Centrifugar a 13.000–16.000 g durante 1 minuto.
s. Con cuidado, eliminar el etanol por decantación.
t. Escurrir el tubo en papel absorbente limpio y secar la muestra al aire durante 15
minutos.
u. Rehidratar el ADN a temperatura ambiente durante toda la noche.
v. Guardar el ADN a 2–8 ºC (~4 ºC) hasta su uso.
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Purificación de ADN plasmidico
Recolección de la muestra
1. Se toman 1,5 mL (2 x 750 L) de un cultivo estacionario de una bacteria portadora
de un plásmido con un gen de resistencia a un antibiótico.
2. Se dispensan en un tubo eppendorf y se centrifuga a temperatura ambiente, durante
3 minutos a 12.000 g.
3. Se retira el sobrenadante (2 x 750 L) con mucho cuidado y SE TIRA. Se da un
pulso de centrífuga, se retira cuidadosamente el sobrenadante y se tira. Nos
quedamos con el precipitado de las bacterias.
Proceso por Lisis alcalina
4. Se resuspende (agitando vigorosamente) el sedimento de bacterias en 100 L de
una solución isotónica (GTE: Glucosa, Tris y EDTA) a 4°C. Se deja a temperatura
ambiente durante 5 minutos.
5. Se añaden al mismo tubo, 200 L de la solución de lisis (NaOH, SDS) que está a
temperatura ambiente y recién preparada. Se agita suavemente con la mano por
inversión del tubo (unas 10 veces). Se incuba 5 minutos a 4°C.
Neutralización
6. Se añaden al mismo tubo, 150 L de la solución de neutralización (acetato potásico
3M, pH 4,8). Se agita con la mano por inversión del tubo (unas 10 veces). Se incuba
5 minutos a 4°C.
Aislamiento de los plásmidos
7. Los agregados macromoleculares se precipitan por centrifugación (15 minutos a
12.000 g y 4°C), formándose un sedimento blanco de aspecto lechoso. El tubo se
traslada con cuidado a la mesa de trabajo.
8. Se retira (2 x 200 L) con cuidado el sobrenadante con el ADN plasmídico y se
dispensa en un tubo limpio (previamente marcado).
9. Se añade 1 mL de etanol absoluto (4°C) al tubo en el que hemos puesto la solución
con el ADN plasmídico. Se mezcla con la mano por inversión del tubo (unas 10
veces). Se incuba 15 minutos a 4°C.
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10. Se precipitan los plásmidos por centrifugación (15 minutos a 12.000 g y 4°C), se
retira (2 x 750 L) cuidadosamente el sobrenadante y se tira.
11. Se añaden al mismo tubo, 900 μl de etanol al 70% (4°C). Se mezcla suavemente
con la mano por inversión del tubo (unas 10 veces).
12. Se vuelven a precipitar los plásmidos por centrifugación (10 minutos a 12.000 g y
4°C), se retira cuidadosamente el sobrenadante y se tira.
13. Se da un pulso de centrífuga, se retira cuidadosamente el sobrenadante y se tira.
Nos quedamos con el precipitado de los plásmidos.
14. Se disuelve el precipitado de los plásmidos (aspirando y soltando el líquido varias
veces con ayuda de la micropipeta) en 50 L de tampón TE (pH 8,0), con
ribonucleasa A.
15. Se incuba a temperatura ambiente 5 minutos. Mantener la muestra a 4°C
Resultados a documentar
1. Observe y documente los tipos de extracción ADN total de cada uno de los métodos.
2. Observe y documente las comparaciones de ADN cromosómico y ADN plasmídico
3. Compare los resultados de extracción de ADN con otras metodologías realizadas.
Cuestionario
1. ¿Qué métodos existen para extraer y purificar ADN?
2. ¿Por qué es necesario realizar la extracción independiente de ADN cromosómico y
de ADN plasmídico?
3. ¿Qué elementos y qué sustancias celulares pueden degradar el material genético?
4. ¿Por qué es necesaria la solución de neutralización en los procesos de extracción
y purificación de ADN?
Preparación de soluciones y reactivos.
Solución isotónica GTE:
Glucosa 50 mM, Tris-HCl 25 mM pH 8,0, EDTA 10 mM pH 8,0.
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Solución de lisis:
0,2 N NaOH, 1% SDS, preparar fresca antes de cada extracción de ADN plamídico.
Solución de neutralización:
Acetato potásico 3 M, pH 4,8.
TE pH 8,0 con Ribonucleasa A:
Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM pH 8,0, Ribonucleasa A 0,5 μg/μL.
TAE:
Tris-Acetato 40 mM, EDTA 1 mM.
Bibliografía.
Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K (eds)
(2005): “Current Protocols in Molecular Biology”. Vols 1 a 4. New York: Greene &
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Stormer M., K. Kleesiek y J. Dreier. 2007. High-Volume Extraction of Nucleic Acids by
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Cuantificación de ADN en geles de agarosa.
Objetivo.
Estimar la concentración de ADN por comparación de la densidad de las bandas
en un gel de agarosa
Introducción.
Existen una gran variedad de métodos de extracción y purificación de ADN, la elección
del método dependerá del origen de la muestra, del grado de pureza y calidad que se requiere
para su uso posterior.
Luego de la extracción del ADN, son necesarias la cuantificación y confirmación de
la integridad de las moléculas obtenidas. Si no es posible cuantificar el ADN por métodos
espectrofotométricos la estimación de la concentración se puede llevar a cabo mediante
su visualización en geles de agarosa.
Los geles de agarosa se preparan fundiendo agarosa en presencia del buffer
adecuado hasta que se logre una solución transparente. La solución fundida es puesta en
un molde donde gelifica. El gel forma una matriz cuya densidad está determinada por la
concentración de agarosa. Cuando se aplica un campo eléctrico a través del gel, el ADN
migra hacia el ánodo por los grupos fosfato que confieren carga neta negativa a estas
moléculas. La velocidad de migración de las moléculas de ADN está en función de su
tamaño, de la conformación de la molécula, la concentración de la agarosa y el voltaje
aplicado a la cámara de electroforesis.
Las moléculas de ADN una vez que migraron en la matriz de agarosa pueden
visualizarse mediante tinción con diferentes colorantes siendo el más comúnmente utilizado
el bromuro de etidio. Este colorante se intercala en el ADN y al hacer incidir luz UV sobre
el gel de agarosa se emite una fluorescencia la cual es proporcional a la cantidad de ADN.
La estimación de la concentración de ADN se obtendrá al comparar la fluorescencia emitida
por la muestra problema con la fluorescencia emitida por patrones de peso molecular.
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Fig. 1 Cámara de electroforesis horizontal
Requerimientos:
Equipo Material Reactivos
Cámara de electroforesis
horizontal
1 juego de micropipetas P1000,
P200 y P10
Solución de Agarosa 1%
w/v
Fuente de Poder Puntas de diferentes
capacidades (10, 200 y 1000 µL)
Marcador de peso
molecular (100pb)
Transiluminador Solución de bromuro de
etidio (10 mg/mL)
Buffer de carga
Buffer TAE 1X
Agua desionizada
Muestras de ADN
Protocolo.
1. Pesar 0.5 g de agarosa y mezclarla en un matraz de 250 mL con 50 mL de buffer
TAE 1X. Fundir la solución de agarosa en un horno de microondas (en intervalos de
30 segundos) hasta que la solución se aprecie totalmente transparente.
2. Preparar la cámara de electroforesis con el peine adecuado en función del número
de muestras.
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3. Verter la solución de agarosa en la cámara de electroforesis y permitir la
polimerización del gel.
4. Retirar el peine y adicionar buffer TAE 1X en el depósito de la cámara de
electroforesis
5. Colocar 2 L de las muestras problema de ADN y del marcador de peso molecular
conocido previamente mezcladas con 2 L de buffer de carga dentro de los pozos
Fig. 2 Esquema para la preparación del gel de agarosa
6. Conectar la cámara de electroforesis a la fuente de poder e iniciar el corrimiento a
90V por un periodo entre 45 minutos a 1 hora
7. Preparar una solución de bromuro de etidio a la concentración (10 mg/mL) en un
volumen de 100 mL.
Precaución: El Bromuro de Etidio es un mutagénico poderoso y tóxico. Evitar
inhalación del polvo. Utilizar guantes al trabajar con soluciones de BrEt.
8. Sumergir el gel en el bromuro de etidio por 10 segundos.
9. Enjuagar el gel en agua para eliminar el exceso de bromuro de etidio.
10. Colocar el gel sobre el transiluminador y encender la lámpara de luz UV colocando
la mampara de acrílico para protección contra la luz UV.
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11. Obtener una imagen del gel.
12. Comparar la densidad de la banda de ADN con las bandas del marcador de peso
molecular.
13. Y hacer la estimación de la concentración.
Resultados a documentar.
1. Observe y documente las características físicas de la muestra de ADN a
cuantificar.
2. Observe y documente la ventaja de utilizar buffer de carga en este protocolo.
3. Documente algunas condiciones durante la electroforesis que puedan dificultar
la visualización de la muestra de ADN.
Cuestionario.
1. Menciones otros métodos de cuantificación de ADN.
2. Que otros colorantes hay para visualizar el ADN .
3. Qué ventajas tiene el Bromuro de etidio sobre otros colorantes.
Preparación de soluciones y reactivos.
TAE 1X
Tris 2.42 g
EDTA 0.373g
Ac. Acético 0.572 mL
Aforar a 500 mL con agua desionizada y ajustar pH =8
Buffer de carga
Azul de bromofenol 0.25%
Xileno cyanol FF 0.25%
Ficoll (Tipo 400) 15%
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Nota:
a. El Bromuro de Etidio tiene propiedades mutagénicas a concentraciones muy bajas,
(hasta 0.01 μg/mL), por lo que se deben extremar las precauciones en su
manipulación y realizar una gestión adecuada de los residuos generados.
b. La luz UV y/o radiación UV es peligrosa y puede causar daños a la retina de los
ojos. Jamás se debe ver directamente la luz UV desprotegida. La luz UV es también
mutagénica y carcinogénica. Para minimizar el riesgo de exposición, la fuente de luz
UV debe ser resguardada adecuadamente. Utilizar guantes protectores adecuados
al sostener materiales bajo una fuente de luz UV.
Bibliografía
Sambrook, J. y Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ª ed).
Nueva York. USA: Cold Spring Harbor Laboratories Press.
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Cuantificación de ADN por espectrofotometría
Objetivo.
Conocer la calidad y cantidad del ADN obtenido mediante la espectrofotometría.
Introducción.
El espectrofotómetro se funda en la transmisión de la luz a través de una solución
para determinar la concentración de un soluto presente en la misma. Cada molécula
absorbe la energía radiante a una longitud de onda específica, a partir de la cual es posible
extrapolar la concentración de un soluto en una solución. Las proteínas y los ácidos
nucleicos absorben la luz en el intervalo ultravioleta, a longitudes de onda comprendidas
entre los 210 y los 300 nm, la absorbancia máxima de las soluciones de ADN y ARN
corresponde a 260. Dado que las soluciones de ADN y ARN absorben parcialmente la luz
a 280 nm y las que contienen proteínas hacen lo propio a 260 nm, el cociente de los valores
obtenidos a 260 nm y a 280 nm (A260/ A280) proporciona una estimación del grado de pureza
de los ácidos nucleicos. Los cocientes A260/ A280 respectivos del ADN y el ARN puros son
aproximadamente de 1,8 y 2,0. Con un paso de luz de 10 mm y una longitud de onda de
260 nm, una absorbancia A = 1 corresponde aproximadamente a 50 µg/ml de ADN
bicatenario, 37 µg/ml de ADN monocatenario, 40 µg/ml de ARN o 30 µg/ml de
oligonucleótidos.
Para cuantificar la cantidad de material obtenido después de una extracción de
ácidos nucleicos o la síntesis química de un oligonucleico, se debe tomar una lectura a
longitudes de onda de 260 nm y 280 nm. La lectura a 260 nm permitirá calcular la
concentración de ácidos nucleicos en la muestra.
Se toma como referencia que una O.D. (Densidad Óptica), medida a 260 nm,
corresponde aproximadamente a:
150 g/ml de ADN de doble cadena,
240 g/ml de ARN o de ADN de cadena sencilla
320 g/ml cuando se trata de oligonucleotidos.
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La proporción de la lectura entre 260 y 280 (OD 260/OD280) proporciona una
estimación de la pureza del ácido nucleico. Es así como preparaciones puras de ADN tienen
OD 260/OD280 de 1.8. Cuando se trata de ARN el valor OD 260/OD280 es muy cercano a
2.0. Si hay contaminación con proteínas o fenol u otras soluciones empleadas durante la
extracción, el valor de la proporción es menor a 1.8 y no es posible cuantificar de manera
precisa el DNA.
Requerimientos.
Equipo Material Reactivos
Microcentrifuga Cubeta de cuarzo Tris HCl, EDTA
Espectrofotómetro Puntas estériles Agua desionizada estéril
Vórtex Gradilla Solución TE
Micropipeta Tubos
Guantes, material de limpieza
Protocolo.
1. Tomar el ADN en estudio y realizar una dilución 1/10 en buffer TE. Preparar1ml de
esta dilución.
2. Colocar la solución de ADN en la cubeta de cuarzo. Esta cubeta debe haber sido
previamente lavada con 1 ml de extran diluido, agua destilada y purgada con
solución TE. Si es necesario, adicionar etanol absoluto para lograr su completo
secado.
3. En otra cubeta colocar como solución blanco, el TE si el ADN fue rehidratado con
este buffer o agua destilada, si fue esta la solución de hidratación.
4. Realizar la medición a 260 nm y a 280 nm.
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5. Para determinar pureza, se utiliza la razón ADN/proteínas. La abundancia de
proteínas residuales en el extracto se determina midiendo A280nm.
6. Realizar los cálculos respectivos, utilizando la siguiente ecuación para estimar la
biomasa de la muestra:
µg/ml de ADN = (A260 X Factor dilución X 50 µg ADN/ml)
7. Estimación de ADN total:
µg ADN/ml ó g = (A260X 20 X 50µg ADN/ml) / (vol. muestra (ml ó g))
Resultados a documentar
1. Observe y documente los datos de la estimación de ADN total de cada una de las
muestras
2. Observe y documente las comparaciones de pureza de ADN.
3. Documente los resultados mediante gráficas de las absorbancias obtenidas de la
(s) muestra (s) de DNA;
4. Compare los resultados de cuantificación de ADN con otras metodologías
realizadas.
Cuestionario.
1. ¿Por qué considera, que es necesario realizar la estimación de la concentración del ADN
aislado?
2. ¿Por qué se debe realizar una dilución de la muestra antes de medir la D.O. en el
espectrofotómetro?
3. ¿Por qué sólo se toma en cuenta la D.O. a 260 nm en la estimación de la concentración
del ADN? ¿Qué información nos provee la D.O. a 280 nm?
4. Compare sus resultados (Concentración de ADN y relación de pureza D.O.260:D.O.280)
con los del resto del grupo.aAbs260 Abs280 Abs260/Abs280
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Bibliografía.
Catálogos y fichas técnicas 2012 de las casas comerciales: Invitrogene, Promega, Biorad,
Biologend, Bioline, Roche.
Lizcano Losada F. 2005. Fundamentos moleculares en medicina. Manual Moderno.
Universidad de la Sabana.
Solano F. G., Márquez C M.P., Shuler I. 2009. Optimización de la extracción de ADN de
Passiflora ligularis para el análisis por medio de marcadores moleculares.
Universitas Scientiarum 14 (1) 16-22.
Vargas R., Rangel L.F. Cañola E. A., Rodriguez J. E. L., Kilger J.C., Bastidas G. A.E. 2006.
Detección y cuantificación de niveles de ADN circulante en suero humano utilizando
espectrofotometría UV-Visible. Rev. Colombiana de Física 38(2) 946-949.
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Extracción por kit de ARN bacteriano.
Objetivo.
1. Extraer ARN de células procariotas utilizando un procedimiento comercial así como
adquirir conocimiento básico para el manejo y cuidado del ARN extraído
Introducción.
La mayoría de protocolos para extracción de ARN están basados en el método
descrito por Chomezynski y Sacchi, el cual se basa en el aislamiento de este ácido nucleico
empleando fenol-cloroformo e isotiocianato de guanidina. Cada uno de estos componente
juega un papel específico: el ácido tiosanato de guanidina es sumamente fuerte y tiene un
alto poder denaturalizante; el fenol, al estar acidificado, provoca que el ADN se acumule en
la interfase entre la fase acuosa y la del fenol, dejando al ARN en la fase acuosa. Debido a
su estructura química el ARN es una molécula muy frágil que puede romperse por acción
de los grupos 2’-OH (altamente reactivos) adyacentes al esqueleto de ribosa-fosfato.
La mayor dificultad para la obtención de preparaciones de ARN es que la mayoría
de las ARNasas, que degradan nuestras moléculas de interés, son enzimas muy estables
y activas no requiriendo cofactores para su funcionamiento. Una pequeña cantidad de las
mismas que permanezca como contaminante en nuestra preparación puede constituir un
verdadero problema. Por lo que es importante tratar las muestras con ADNasas libres de
ARNasas.
Existen paquetes comerciales para estabilización de muestras de ARN de
compañías como QIAGEN, Ambion y RNA-works, que en general funcionan con una mezcla
de anticuerpos específicos para ribonucleasas, inhibidores de ribonucleasas y/o contienen
compuestos que neutralizan a los grupos 2’-OH (como es el caso de RNA-works). Nosotros
emplearemos el Kit comercial ZR Fungal/Bacterial RNA Micropipet (Zymo Research) para
el desarrollo de esta práctica.
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Requerimientos:
Equipo Material Reactivos
Microcentrífuga Tubos eppendorf de 1.5mL ZR Fungal/Bacterial RNA
Micropipet (Zymo Research) (3)
Vórtex Micropipetas de varios
volúmenes
MgSO4• 7H2O 10 mM
estéril
Campana de Flujo
Laminar
Puntas azules, amarillas y
blancas
Etanol 95-100%
Asa bacteriológica
Mechero
Protocolo.
1. Un día previo a la práctica se inocula una colonia de células de E. coli en 5 mL de
caldo LB usando el antibiótico respectivo. Incubar a 37ºC toda la noche con
agitación.
2. Al día siguiente resuspender en MgSO4•7H2O 10 mM estéril las células bacterianas
que crecieron el día anterior en los tubos eppendorf. Agitar en vórtex y centrifugar a
máxima velocidad. Decantar.
3. Resuspender las células en 800 L en RNA Lysis Buffer y transferir la mezcla a un
tubo ZR Bashing Bead Lysis.
4. Ensamblar el dispositivo anterior en un tubo Bead beater y centrifugar 1 minuto a
12,000 x g
5. Transfiera 400 L del sobrenadante a una columna Zymo-Spin IIIC adaptada a un
tubo de colección (Collection tube) y centrifugue a 8,000 x g por 30 segundos
(guarde el flujo recolectado en el tubo de colección).
6. Añada 0.8 volúmenes de etanol 95-100% y mezcle bien en el vórtex.
7. Transfiera la mezcla a una columna Zymo-spin IC colocada previamente dentro de
un tubo de colección.
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8. Añada 400 L de RNA Prep Buffer a la columna. Centrifugar a 12,000 x g por 1
minuto. Deseche el flujo recolectado y colocar la columna Zymo-spin IC dentro del
mismo tubo de colección.
9. Añadir 800 L de RNA Wash Buffer a la columna. Centrifugar a 12,000 x g por 30
segundos. Deseche el flujo recolectado y colocar la columna Zymo-spin IC dentro
del mismo tubo de colección. Repetir este paso con 400m L de RNA Wash Buffer.
10. Centrifugue la columna Zymo-spin IC a 12,000 x g por 2 minutos. Y asegurarse de
remover todo el wash buffer.
11. Remover la columna Zymo-spin IC del tubo de colección y colocarla dentro de un
tubo eppendorf de 1.5 mL libre de ADNasas/RNAasas (estéril).
12. Añadir ≥6 L de DNAase/RNAase-Free water directamente a la matriz de la
columna y dejar en reposo por 1 minuto.
13. Centrifugar a 10,000 x g por 30 segundos para eluir el ARN de la columna.
14. El ARN puede ser usado inmediatamente o puede almacenarse a -70⁰C
15. Etiquetar el tubo eppendorf con el número del equipo.
Diagrama: ZR Fungal/Bacterial
RNA MicroPrep TM.
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Resultados a documentar.
1. Observe y documente las características fenotípicas del cultivo tanto en placa como
en tubo.
2. Observe y describa el paso del protocolo que se debe cuidar para evitar que el ARN
se contamine y se degrade.
3. Documente el rendimiento y calidad de la muestra obtenida mediante la utilización
de un kit comercial y compárela con el rendimiento obtenido utilizando un protocolo
no comercial.
Cuestionario
1. Mencione tres ventajas y desventajas de utilizar kit comercial o protocolo tradicional
para extraer ARN.
2. Investigue algunos pasos a considerar para que durante la electroforesis de ARN se
impida la degradación de la muestra.
3. Investigar en que pruebas de Biología molecular se puede utilizar el ARN purificado.
Bibliografía
Chomczynski P. and Sacchi. (1987). Anal Biochem. 162:156.
Falcón L.I. y Valera A. (2007). Las Herramientas Moleculares (quinta parte). Extracción de
ácidos nucleicos: Capítulo 16. Ecología Molecular. Luis E. Eguiarte, Valeria Souza
y Xitlali Aguirre (Compiladores).
ZR Fungal/Bacterial RNA MicroPrep TM. Instruction Manual. Zymo Research.
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Conclusión del manual.
Las metodologías de purificación y análisis de ácidos nucleicos son básicas e
importantísimas en cualquier procedimiento de Biología Molecular, por lo que este manual
será de gran ayuda al estudiante que se inicia en desarrollar habilidades y destrezas en la
materia.
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Bibliografía General.
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