UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMACCARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIALLABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC

FACULTAD DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL

CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL

GUA DE PRCTICAS DE BIOTECNOLOGA

Ing. Anderson Nez Fernndez

Apurmac Abancay Per 2013

INTRODUCCIN

La Biotecnologa es una palabra compuesta. Sin embargo, si se analiza por partes es ms fcil entender qu significa Bio quiere decir vida, y biologa es el estudio de los seres vivos. El trmino Tecnologa se refiere a las herramientas o tcnicas que se usan para fabricar o producir algo. Entonces, si se junta todo se podra definir la biotecnologa como las herramientas o tcnicas que emplean a losseres vivos para obtener algn producto. Los seres vivos que participan en estas tcnicas son microorganismos (bacterias, hongos,levaduras),plantasyanimales.Yloqueseobtienesonalimentos, medicamentos y otros productos tiles para las personas y para el ambiente en general. En realidad, el hombre practica la biotecnologa desde hace miles de aos, pero en ese entonces lo haca de forma ms simple que en la actualidad. Por ejemplo, usaba bacterias y levaduras para fabricar yogur, queso, pan, vino, sidra, etc. Estas tcnicas an siguen en prctica, pero hoy en da la biotecnologa usa herramientas ms modernas para obtener nuevos productos

Hace miles de aos cuando el hombre descubri que al fermentar las uvas se obtena un producto como el vino. Tambin es biotecnologa la fabricacin de cerveza a partir de la fermentacin de cereales que el hombre empez a elaborar hace 4.000 aos, y la fermentacin dejugo de manzanaspara la fabricacin de sidra. En estosprocesos intervienen microorganismos que transforman componentes del jugo de frutas o de cereales en alcohol. Tambin es biotecnologa la fabricacin de pan mediante el uso de levaduras, la elaboracin de quesos mediante el agregado de bacterias, y tambin de salames. Elyogur tambin es un producto que se obtiene mediante procesos biotecnolgicos desde la antigedad. Aunque enese entonces loshombres noentendan cmo ocurran estos procesos, ni conocan la existencia de microorganismos, podan utilizarlos para su beneficio. Estas aplicaciones constituyen lo que se conoce como biotecnologa tradicional y se basa en laobtencinyutilizacindelosproductosdelmetabolismodeciertos microorganismos. Se puede definir la biotecnologa tradicional como la utilizacin de organismos vivos para la obtencin de un bien o servicio til para el hombre

Actualmente, los cientficos comprenden mucho mejor cmo ocurren los procesos biolgicos que permiten la fabricacin de productos biotecnolgicos. Esto les ha permitido desarrollar nuevas tcnicas a fin de modificar o imitar algunos de esos procesos y lograr una variedad mucho ms amplia de productos. Los cientficos hoy saben, adems, que los microorganismos sintetizan compuestos qumicos y enzimas que pueden emplearse eficientemente en procesos industriales. Estos conocimientos dieron lugar al desarrollo de labiotecnologa moderna.

Por qu el agroindustrial debe conocer de la Biotecnologa y tener los procedimientos bsicos y tcnicas comunes en un laboratorio de Biotecnologa. Porque la biotecnologa trata sobre la utilizacin y produccin de microorganismos y del estudio de los cambios bioqumicos que ocurren en el proceso de obtencin de diferentes productos antes mencionados.

PRESENTACIN

Los experimentos formulados en el presente manual de prcticas de Biotecnologa son formulados con el objetivo de guiar al estudiante en los procesos ms importantes de fermentaciones Agroindustriales de los cursos de especialidad de la Escuela Acadmico Profesional de Ingeniera Agroindustrial. En la preparacin de una clase de laboratorio, el estudiante va a encontrar dos puntos de importancia para entender los experimentos a realizar:

1. Cul es el propsito del experimento y 2. Cules son los principios cuantitativos involucrados o como los clculos deben ser realizados.

Con estas dos herramientas el estudiante debe ser capaz de entender y discutir los resultados de una prctica determinada. Para poder realizar estos dos puntos durante el semestre, el estudiante requiere conocer el laboratorio, las normas de seguridad en este, como tomar notas sobre las prcticas a realizar y los resultados de estos experimentos y como elaborar un reporte de los resultados obtenidos, lo que se expresa en los siguientes objetivos:

1. Aprender los pasos bsicos para la elaboracin del reporte de prctica.2. Conocer las normas de seguridad necesarias para el trabajo en el laboratorio de qumica.3. Aprender las normas bsicas en el manejo de equipos, insumos, reactivos y materiales en el laboratorio.4. La realizacin de las prcticas que permitan comprender el proceso principal de la fermentacin industrial y principios de la bioqumica, aplicados y orientados a la transformacin de la parte alimentaria.5. Del mismo modo el presente manual promueve la investigacin al estudiante que hace entender como un conjunto sistematizado de conocimientos, sobre la realidad observada, que se obtienen aplicando un sinfn de mtodos. El fin esencial de la Universidad y de los universitarios es la investigacin y por ello exhorto al estudiante a plantear alternativas de solucin a los problemas que aqueja a nuestra regin y el Pas.

Ing. Anderson Nez Fernndez

PAUTAS Y SUGERENCIAS PARA LA ELABORACIN DEL INFORME

El informe de laboratorio es una acabada prueba de que hicimos un experimento, lo analizamos y comprendimos. Cuando redactamos el informe es cuando terminamos de ordenar nuestros datos, grficos, anotaciones y sobre todo nuestras ideas. Debe ofrecer a los lectores un recuento claro y completo de las actividades experimentales realizadas, nuestras conclusiones y reflexiones de lo que hicimos. El informe debe ser, ante todo, claro, y, en lo posible, breve. Debemos redactarlo en lenguaje preciso y ameno, tratando de atraer y retener la atencin de los lectores. Hagamos el siguiente ejercicio: Son las doce de la noche y el lector de nuestro informe tiene tambin como opciones hojear el diario o ver televisin. Nuestro trabajo entrar en competencia con estas alternativas solo si est cuidadosamente redactado y si en l expresamos nuestras ideas con claridad y concisin. Esto podemos lograrlo usando construcciones cortas y cuidando que las descripciones no den lugar a interpretaciones ambiguas, de manera que el lector no se vea obligado a tener que volver sobre lo ledo. Recordemos que no estaremos al lado de nuestro lector para hacerle aclaraciones a sus dudas y decirle que donde escribimos una cosa, en realidad, quisimos decir otra.

El informe no debe ser considerado como un documento que se presenta con el solo fin para que el profesor juzgue el trabajo realizado, sino que debe ser pensado como un texto que sea capaz de mostrar que hemos ganado la habilidad de comunicar por escrito nuestras ideas y resultados. Con esto en mente, los informes que se realizan en los cursos bsicos de laboratorio son un muy buen entrenamiento para mejorar nuestra redaccin y con ella nuestra capacidad de comunicar temas cientficos y tcnicos.

ORGANIZACIN DEL INFORMEEl informe debe contar con secciones bien diferenciadas, que garanticen orden y cohesin. Se sugiere el siguiente esquema para el texto del informe, que es usualmente empleado en publicaciones cientficas y tcnicas.

El informe de laboratorio debe cubrir los siguientes apartados:

I. GENERALIDADES

1. PORTADA 1.1. Nombre de la universidad (en letras grandes en la parte superior central)1.2. Nombre de la facultad o carrera profesional (en letras ms pequeas debajo del nombre de la universidad)1.3. Puede ir el logotipo de la universidad debajo del nombre de la carrera profesional no pudiendo exceder de 5cm x 5cm.1.4. Numero de prctica y ttulo del experimento (corto e ilustrativo).1.5. Nombre de la asignatura.1.6. Nombre(s) del (de los) participante(s).1.7. Identificacin de (de los) participante(s) (por ejemplo grupo de trabajo, semestre).1.8. Nombre del profesor.1.9. Fecha en que se realiz el experimento.1.10. Fecha de entrega del informe.II. ENCABEZAMIENTO DEL INFORME 2.1. TTULO: El ttulo del trabajo debe ser especfico e informativo, y en lo posible agudo y provocador. Con l debemos dar una idea clara del tema estudiado.

2.2. RESUMEN: El resumen del informe debe dar un adelanto de lo que se leer en el cuerpo del mismo, en lo posible en no ms de 150 palabras. Aqu debemos indicar con concisin el tema del trabajo, referirnos sucintamente a la metodologa seguida y destacar los resultados ms importantes obtenidos.

2.3. OBJETIVOS (que se busca con el experimento)El o los objetivos deben especificar de manera clara lo que se pretende estudiar y los conocimientos que se pretenden adquirir. No deben confundirse con una lista de las actividades realizadas.

III. CUERPO DEL INFORME

INTRODUCCIN: En esta seccin debemos orientar al lector hacia el tema de estudio y la motivacin por hacerlo elegido. Para esto es aconsejable que incluyamos un marco tericoexperimental del tema que estudiamos, con referencias adecuadas (ver Referencias) que lleven rpidamente a los antecedentes del problema y que destaquen la conexin de esas ideas con el trabajo realizado. Estas referencias deben orientar al lector hacia el estado del arte del tema. Asimismo debemos enunciar claramente el propsito u objetivo del experimento.

IV. REVISIN BIBLIOGRFICASe hace referencia a los principios fsicos relacionados directamente con el experimento y que dan soporte al trabajo realizado. Se describen las frmulas empleadas, definiendo la simbologa utilizada. Debe hacerse con apoyo de material bibliogrfico, pero no debe ser una copia textual de ste ni una secuencia de prrafos copiados y sin relacin entre ellos, el redactor debe extraer las partes que se relacionan de manera directa con la prctica desarrollada debiendo citar en cada una la fuente bibliogrfica.V. MATERIALES Y MTODOS5.1. Materiales: Se presenta una descripcin de materiales y/o equipo con el cual se trabaj y de los instrumentos utilizados. Se deben incluir esquemas y se debe describir la funcin de cada instrumento. En lo posible, debe indicarse la precisin del equipo. No debe limitarse a una simple lista de instrumentos.5.2. Mtodos o Procedimiento del experimento: En la seccin describimos los procedimientos seguidos y el instrumental usado. Es til incluir un esquema del diseo experimental elegido. Para esto puede recurrirse a diagramas esquemticos que muestren las caractersticas ms importantes del arreglo experimental y la disposicin relativa de los instrumentos. Es una buena prctica indicar tambin cules variables se miden directamente, cules se obtienen indirectamente y a cules tomamos como datos de otras fuentes (parmetros fsicos, constantes, etc.). Tambin es aconsejable describir las virtudes y limitaciones del diseo experimental, analizar las fuentes de errores e individualizar las que aparezcan como las ms crticas. VI. RESULTADOS: Los resultados deben presentarse preferiblemente en forma de grficos. En lo posible evitemos la inclusin de tablas de datos, a menos que sean sustanciales. Los datos del experimento deben estar diferenciados de otros datos que puedan incluirse para comparacin y tomados de otras fuentes (se sugiere ver la Unidad 4 donde se dan pautas para hacer grficos). Como prctica invariante, debemos expresar resultados con sus incertidumbres, en lo posible especificando cmo las calculamos.

VII. DISCUSINES: En esta parte debemos explicitar el anlisis de los datos obtenidos. Aqu se analizan, por ejemplo, las dependencias observadas entre las variables, la comparacin de los datos con un modelo propuesto, o las similitudes y discrepancias observadas con otros resultados. Si el trabajo adems propone un modelo que trate de dar cuenta de los datos obtenidos, es decir, si el modelo es original del trabajo, su descripcin debe quedar lo ms clara posible; o bien, si se us un modelo tomado de otros trabajos, debe citarse la fuente consultada. Si fuera necesaria una comparacin de nuestros resultados con otros resultados previos, resaltemos similitudes y diferencias de los materiales, mtodos y procedimientos empleados, para as poner en mejor contexto tal comparacin.

VIII. CONCLUSIONES. En esta seccin tenemos que comentar objetivamente qu hemos aprendido del experimento realizado, y sintetizar las consecuencias e implicancias que encontramos asociadas a nuestros resultados. Podemos decir que un buen informe es aquel que demuestra el mayor nmero de conclusiones (correctas) alcanzadas a partir de los datos obtenidos.

IX. CUESTIONARIOS. Desarrollar los cuestionarios encargados por el docente que regenta el curso.

X. REFERENCIAS: Las referencias bibliogrficas se ordenan al final del informe. Deben contener el nombre de los autores de las publicaciones (artculos en revistas o libros) citados en el texto, el ttulo de los trabajos; el nombre de la revista o editorial que los public; adems se debe incluir los datos que ayuden a la identificacin de los mismos: volumen donde estn incluidos, captulo, pgina, fecha de publicacin, etc.

XI. APNDICES: Algunas veces son necesarios para la mejor comprensin de alguna parte del informe. Por lo general no es conveniente distraer al lector con muchos clculos, despejes de trminos y propagaciones de errores en la mitad del texto, as que este lugar puede ser propicio para estas consideraciones. En el texto principal deberemos orientar al lector para que consulte estos apndices.

XII. COMENTARIOS FINALES Nuestra experiencia nos ensea que no es fcil congeniar de primera con la literatura cientfica, ms aun si actuamos como escritores. Es cuestin de prctica lograr que nuestra narrativa descriptiva sea desenvuelta y precisa. No se debe de confundir el informe con la bitcora de laboratorio. Esta ltima es donde se registraron todos los datos y detalles de experimento. La bitcora es principalmente un cuaderno de uso personal donde en lo posible estn documentados todos los detalles del experimento. El informe es una versin final depurada y tiene como destinatario un lector que no necesariamente realiz el experimento. PRCTICA N 01 y 02: Normas de seguridad en el laboratorio de Biotecnologa Agroindustrial y reconocimiento de materiales, equipos y clculos bsicos.

I. OBJETIVOS

El alumno conocer el reglamento de Laboratorio de Biotecnologa Agroindustrial y comprender la importancia de respetarlo para optimizar el trabajo experimental as como minimizar las posibilidades de sufrir u ocasionar accidentes. El alumno revisar las medidas de seguridad ms importantes que se utilizan en un laboratorio de Biotecnologa Agroindustrial para minimizar la posibilidad de accidentes. Identificar los materiales y equipos ms usados en el laboratorio y sus funciones Manipular materiales y equipos de uso y cuidados especficos. El alumno realizar algunos clculos bsicos de los ms utilizados en el laboratorio de Biotecnologa Agroindustrial, para aislar, identificar y preparar soluciones.

II. INTRODUCCIN

Prcticamente todos los laboratorios de Biotecnologa Agroindustrial, donde el trabajo de laboratorio es frecuente han sido escenarios de accidentes, la mayora de poca importancia, pero algunos de graves consecuencias. Estos, as llamados accidentes no suceden, sino que son causados por descuidos o faltas de atencin en el trabajo. Una observancia rigurosa de las precauciones que se indican a continuacin prevendr directamente la mayora de dichos accidentes y ayudar indirectamente a los alumnos a adquirir aquellos hbitos de seguridad que les sern de inestimable valor no slo en el laboratorio, sino en cualquier sitio donde se desarrolle como profesional en la vida cotidiana.

III. REVISIN BIBLIOGRFICA

3.1. Reglamento del laboratorio. Usar siempre bata de algodn, manga larga, abotonada, de preferencia blanca. Usar siempre dentro del laboratorio lentes de seguridad. Usar guantes de ltex cuando se usen reactivos txicos, corrosivos y cuando se lave el material. No fumar, no consumir alimentos ni bebidas en el laboratorio. No jugar, ni correr en el laboratorio. No utilizar equipos de sonido ni celulares. La salida del laboratorio debe ser autorizada por el profesor. No se admitirn visitas durante la sesin de laboratorio. Nunca pipetear con la boca ningn lquido (sin exceptuar el agua), usar propipeta. Realizar exclusivamente los experimentos que indique el profesor. Cuando se trabaje con lquidos inflamables evitar tener mecheros encendidos cerca. No verter a la tarja residuos slidos o reactivos corrosivos. Identifique recipientes de desechos cidos, bsicos, orgnicos o inorgnicos. Al final de la prctica dejar limpio el material y la mesa de trabajo.

3.2. Medidas de seguridad. Manipular las sustancias voltiles, inflamables y explosivas en la campana de extraccin o en su defecto en un lugar ventilado. Evitar encender mecheros o generar calor cerca de lugares donde se manipulen disolventes orgnicos. Etiquetar los recipientes de reactivos y disolventes que se tengan en uso; aquellos que se encuentran sin identificacin y se ignore el contenido, desecharlo en un lugar adecuado. Rotular siempre el material con el que se est trabajando. Investigar la peligrosidad de cada uno de los reactivos a utilizar en cada prctica para minimizar los riesgos. En caso de tener algn accidente en el laboratorio avisar rpidamente a su profesor. Si trabaja con dispositivos de reflujo o destilacin verifique que las piezas estn correctamente colocadas, pinzas perfectamente cerradas, para as evitar perdida de material por ruptura. Cuando est trabajando con la parrilla de calentamiento nunca trabaje con temperaturas muy altas. En caso de romper algn material no recoger los restos con las manos.

3.3. Los materiales de laboratorio se pueden clasificar en:

1. Material de vidrio: vasos precipitados, placas de petri, tubos de ensayo, probetas, pipetas aforadas, pipetas volumtricas, buretas, matraces de Erlen Meyer y matraces aforados.2. material de calor y fro y sus accesorios: refrigerantes, mecheros (de Bunsen), baos termorregulados, baos de arena, calefactores elctricos, congeladores, autoclaves, estufas, etc.3. Material de porcelana, acero, caucho.4. Materiales de medicin de temperatura, tiempo y masa: termmetros, balanzas y cronmetros.5. otros: equipos en general

IV. SECCIN EXPERIMENTAL.

4.1 Por equipos analizar y discutir, El reglamento de laboratorio y las medidas de seguridad.Criticarlas y considerar su pertinencia e importancia.4.2 Despus de un tiempo razonable determinado de comn acuerdo entre profesores y alumnos, discutir en forma grupal el reglamento y las medidas de seguridad.4.3En seguida se realizar un recordatorio de los materiales, equipos y reactivos con sus determinados usos y precauciones.4.3 Realizar los clculos bsicos por equipo, y despus el profesor seleccionarn a diferentes equipos para que pasen al pizarrn a resolver los ejercicios y a explicarlos.

V. RESULTADOS. Indicar los resultados de la identificacin de materiales, equipos adems las funciones. Redactar los resultados de las normas de seguridad, las prevenciones y las medidas que debe tener antes, durante y despus de ingresar al laboratorio.

VI. DISCUSIONES 6.1 Discutir e indicar la importancia de respetar el Reglamento de Laboratorio.6.2 Discutir e indicar la importancia de conocer los diferentes materiales, equipos e insumos que existen en el laboratorio.6.3. Las discusiones se realizan en relacin a los resultados obtenidos adems considerando la revisin de la literatura para el proceso de aseveracin o contradiccin.

VII. CONCLUSIONES7.1 Realice sus conclusiones indicando la importancia que tiene el hecho de conocer y respetar el reglamento de laboratorio, as como tambin tener conocimiento de las medidas de seguridad ms importantes que se tienen que observar en un laboratorio de Biotecnologa Agroindustrial.

VIII. CUESTIONARIO.

1. Dibuje, describa y mencione sus funciones de los materiales, reactivos y equipos del laboratorio que no observaste en la prctica y que es necesario que debe incluirse en el laboratorio de Biotecnologa.2. Dibuje y explique los smbolos de seguridad que existe en el laboratorio y que smbolos ms considerara Ud. Que debe ir en el laboratorio como sealizacin. Por qu.3. Realiza previamente los clculos necesarios para determinar los gramos necesarios de NaCl para preparar 40ml de una solucin al 3%.4. Mencione cmo se debe realizar la limpieza y desinfeccin de un laboratorio.5. De qu manera se debe realizar el almacenamiento de muestras biolgicas.6. Cmo actuara Ud. En caso de quemaduras con algn cido?

PRACTICA N 03: ESTUDIO DEL CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS: SEGUIMIENTO DEL CRECIMIENTO DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

I. Objetivos

Determinar la curva de crecimiento en microorganismos como levaduras cultivados en aerobiosis utilizando diferentes fuentes de carbono. Determinar la velocidad de fermentacin utilizando un medio definido con diferentes fuentes de carbono. Comparar las tasas de crecimiento especfico durante la fermentacin de Saccharomyces cerevisiae con diferentes fuentes de carbono. Controlar la fermentacin por produccin de CO2 y decrecimiento en peso del medio de cultivo.

II. Marco terico

2.1. Metabolismo de azcares por levaduras

Bajo condiciones de crecimiento estrictamente anaerbicas, la fosforilacin a nivel del substrato en la gluclisis es la nica fuente de ATP en Saccharomyces cerevisiae y posibilita un rendimiento neto de 2 ATP por cada molcula de glucosa convertida en dos molculas de piruvato. La disimilacin de glucosa a piruvato va la gluclisis est unida a la reduccin de NAD+ en la reaccin catalizada por la gliceraldehdo-3-fosfato-deshidrogenasa. Un balance redox cerrado en disimilacin es logrado por descarboxilacin de piruvato a acetaldehdo, el cul (NAD+) subsecuentemente acta como un aceptor de electrones para la reoxidacin de NADH2.1El NADH2 y el NADPH tienen diferentes funciones en la red metablica de Saccharomyces cerevisiae. El NADPH es preferentemente usado en vas asimilatorias. La gluclisis juega un rol esencial en la disimilacin de azcar, pero tambin genera bloques constituyentes para la biosntesis. Adems, aunque muchas reacciones biosintticas usan NADPH como un reductor, algunas reducciones unidas a NADH ocurren en la conversin de metabolitos centrales (piruvato, oxalacetato, acetil CoA) a monmeros celulares, por ejemplo en la biosntesis de aminocidos. Durante el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae sobre azcar, la preferencia del NADH en reducciones disimilatorias (en la reduccin de acetaldehdo a etanol y la reduccin del pool de quinona de la cadena respiratoria) es muy fuerte.

En Saccharomyces cerevisiae, el mantenimiento de las condiciones de cultivo aerbico no es suficiente para lograr metabolismo respiratorio de azcar. Incluso cultivos totalmente aerbicos exhiben un metabolismo mixto respiro-fermentativo, a menos que ellos sean desarrollados con un suplemento limitado de azcar a tasas bajas de crecimiento especfico.2, 3 Este fenmeno de fermentacin aerbica (frecuentemente referido como efecto de la glucosa o Crabtree) es parcialmente debido a la represin de la sntesis de enzimas respiratorias por exceso de glucosa.4, 5Durante el crecimiento respiratorio sobre azcares, la reoxidacin del NADH2 formado en la gluclisis puede ocurrir va respiracin mitocondrial, de esta manera rinde ATP adicional va fosforilacin oxidativa. Adems por otra parte, la reoxidacin respiratoria de NADH2 glucoltico implica que el piruvato no tiene que ser convertido en acetaldehdo (aceptor de electrones), pero puede ser posteriormente oxidado. La oxidacin de piruvato a acetil coenzima-A, ocurre predominantemente va el complejo mitocondrial piruvato-deshidrogenasa, y subsecuentemente el acetil-CoA es oxidado a CO2 y H2O por las enzimas del ciclo del cido tricarboxlico (TCA).6 Los anlisis cuantitativos de culturas respiratorias, han concluido que la eficiencia in vivo de este proceso en Saccharomyces cerevisiae es menor que en muchos otros microorganismos, esta baja estequiometra de fosforilacin oxidativa est relacionado con la ausencia de un protn de translocacin NADH deshidrogenasa en Saccharomyces cerevisiae, la disimilacin respiratoria completa de glucosa rinde aproximadamente 16 ATP por molcula de glucosa (cuatro ATP desde la fosforilacin a nivel del substrato y cerca de 12 a partir de la fosforilacin oxidativa).

Gay-Lussac fu el primero en mostrar que la fermentacin de la glucosa rinde aproximadamente pesos iguales de etanol y CO2 (45 partes de glucosa rinden 23 partes de alcohol y 22 partes de CO2). Pasteur encontr que 100 partes de sucrosa rinden 105.4 partes de azcar invertida, el cual fu fermentada a 51.1 partes de etanol, 49.4 partes de CO2, 3.2 partes de glicerol y 1.7 partes de cido succnico.El rendimiento de etanol en fermentaciones de vinos no alcanza el valor terico, el cual debe ser 51.1% por peso basado en glucosa fermentada. Este rendimiento se debe a la formacin de sub-productos durante la fermentacin alcohlica y a la asimilacin de azcar por la levadura, adems de esto el rendimiento es afectado por diversas variables incluyendo la temperatura, pH, cantidad de inculo y presencia ausencia de O2, en la prctica 47.0 47.5 gramos de etanol son usualmente obtenidos por cada 100 gramos de azcar fermentado.

III. Culturas, reactivos y materiales

Levadura Saccharomyces cerevisiae 10 gBagetas02

Glucosa, sucrosa20g c/uPinzas01

Extracto de levadura5.0 g/LChapitas 30

KH2PO44 g/LEspectrofotmetro01

MgSO4.7H2O2 g/LBalanza analtica01

(NH4)2SO45 g/LPotencimetro01

Agua destilada5 LAlgodn01 rollo

HCl al 10%50mlCinta mazkin01

Matraces Erlenmeyer de 1L02Rotulador01

Matraces Erlenmeyer de 250ml06Papel aluminio01 rollo

Pipetas de 10 ml02Tijera01

Vasos de precipitacin de 200ml04Pabilo01 rollo

Esptulas02

Pizeta01

Pipetas 5ml, 10ml02 c/u

IV. Metodologa

Preparacin de inculo: Preparar 100 ml de una solucin que contenga: Glucosa sacarosa 2 g, extracto de levadura 0.1 g, KH2PO4 0.5 g, MgSO4.7H2O 0.04 g, ajustar el pH a 3.8. Luego de esterilizarlo a 121 C por 20 minutos a 15 libras/pulg2, inocular aspticamente con la levadura Saccharomyces cerevisiae usando una asa de siembra y cultivar por 24 horas en agitacin a 28C.

Medio de fermentacin: Preparar 250 ml de una solucin que contenga: Glucosa sacarosa 5 g, extracto de levadura 0.25 g, (NH4)2SO4 0.5 g, KH2PO4 1.0 g, MgSO4.7H2O 0.1 g.

V. Procedimiento

En cada uno de 3 matraces Erlenmeyer de 400 ml se adicionan 250 ml de medio de fermentacin de composicin citada anteriormente, el pH se ajusta a 3.8 con HCl al 10%. Luego se esteriliza a 121 C por 20 minutos a 15 libras/pulg2, seguidamente se deja enfriar hasta alcanzar los 28 C (temperatura de cultivo con Saccharomyces cerevisiae). Luego aspticamente se inocula con el 5% del inculo cultivado anteriormente. El inculo a utilizar debe centrifugarse previamente a 3 000 rpm x 10min., y enjuagado con agua destilada antes de inocular al medio de fermentacin.

Tratamiento del inculo:

Agitacin150rpm, 24h, 28C24 horasPipetear 5% del volumen de fermentacinCentri-fugacin

Enjuagar con H2OdCentri-fugacin

3000 rpm x 10minInoculo enjuagado y centrifugado100 ml de medio estrilglucosa sacarosaInocular con levadura

Proceso de cultivo: 250 ml de medio de cultivo estril glucosa sucrosa

DO

glucosa sacarosa Inculo tratado

Espectrofotometra

Tiempo (h)

mg biomasa seca/ml

glucosa sacarosaAgitacin 150 rpm

Inculo tratado

Tiempo (h)

28C, tiempo: a criterio

Medicin: Biomasa total (biomasa seca/L) Etanol: picnometra

Agitacin 150 rpm

Inculo tratado

28C, tiempo: a criterio

Medicin: Biomasa total (biomasa seca/L) Etanol: picnometra Control de la fermentacin: Pesado

Anaerobiosis

VI. Mediciones:

Para determinar la curva de crecimiento en el cultivo aerobio se realizar por dos mtodos indirectos:

1. Determinacin del crecimiento por gravimetra: Con una pipeta se extrae aspticamente 2 3 ml de medio cada 4 horas, se centrifuga y las clulas se vierten en una placa metlica previamente tarada. Seguidamente la biomasa centrifugada se coloca en la estufa para secarlo durante 1hora a 100 C. Con los datos obtenidos: peso seco de las clulas y el intervalo de tiempo en el que se tomo la muestra se construye una grfica tiempo peso seco de biomasa (mg de biomasa seca/ml). Luego se determinar la tasa de crecimiento especfico al inicio de la fase logartmica con la siguiente formula:

Ln X1 Ln Xo = ---------------------- t1 to

2. Determinacin del crecimiento por densidad ptica: Se tomar muestras del medio de fermentacin (2ml aprox.) cada 4 horas para medir la densidad ptica del medio a 620nm. Con estos datos se construye una curva de crecimiento de la levadura ploteando densidad ptica y tiempo de toma de muestras.

Para controlar el tiempo de fermentacin (en anaerobiosis), se toma el peso inicial del medio de cultivo correspondiente a 250ml (no olvidar descontar el peso del matraz y el tapn) y cada 4 horas se vuelve a pesar el matraz para determinar la velocidad de fermentacin, se anota el intervalo en que se toma cada medida y el peso neto del medio de cultivo en ese instante, y se construye una grafica tiempo peso.

Se determinar el etanol producido al final de la fermentacin por picnometra, con los datos obtenidos se calcular la eficiencia de cada fermentacin

VII. Cuestionario

Cul es la importancia de controlar el desprendimiento de CO2 en una fermentacin?Cmo esta caracterizada la fase exponencial de crecimiento microbiano?Qu es la fase lag y que factores influye en su duracin?Qu rendimientos en etanol ha encontrado utilizando diferentes azcares?Realice una discusin respecto a los valores encontrados de produccin de etanol y biomasa bajo condiciones aerobias y anaerobias

VIII. Referencia bibliogrfica

Bisson, L. F. Metabolismo de azcares por levaduras, en la microbiologa y biotecnologa del vino. Chur, Suiza: Ed. Harwood Academic Publishers, 1993, p. 55-75. De Deken, R. H. El efecto Crabtree: Un sistema regulatorio en levaduras., 1966. Revista: Gen. Microbiol. Vol. 44, p. 149-156. Estela, W. D. Evaluacin del comportamiento fisiolgico de levaduras Saccharomyces y no-Saccharomyces bajo diferentes condiciones de crecimiento. Reporte anual, VSCHT, Praga Repblica Checa, 2001.

PRCTICA N 04: LEVADURAS COMO AGENTE LEUDANTE DE LA MASA PANARIA

I. OBJETIVOS Evaluar la actividad de las levaduras como agente leudante a travs del esponjamiento de la masa. Determinar la eficiencia de la levadura en presencia de azucares fermentables (sacarosa) en la produccin de CO2

II. INTRODUCCIN

Casi todos los tipos de pan que se hacen hoy en da incorporan algn agente leudante, lo que significa que una sustancia es aadida a la masa para iniciar su fermentacin y hacerla subir.Sin la levadura u otro agente leudante, la mezcla de harina y agua, una vez cocida, sera una simple torta plana y poco apetitosa.En un momento determinado de la historia, nuestros antepasados descubrieron que dejando fermentar la masa en un lugar clido obtenan un pan ms ligero y esponjoso.La transformacin de la masa en pan es por la levadura u otro agente leudante mediante la produccin de dixido de carbono que se expande, la masa se estira y unas diminutas bolsas de aire se introducen en la masa.Cuando sta se cuece, el proceso se estabiliza y el aire queda atrapado dentro.

III. MARCO TERICO

3.1. Agentes leudantes. Denominados tambinagentes gasificantes, son aquellas substancias capaces de producir, o incorporargases, en productos que van a serhorneadoscon el objeto de aumentar suvolumeny producir cierta forma y textura en su masa final. En laindustria alimenticiaestos agentes leudantes se emplean en las masaselaboradas tanto enpanaderacomo enrepostera. En el caso concreto de lapanaderalaslevaduras, mediante lafermentacin, son empleadas como agentes leudante naturales con el objeto de que hinchen las masas de pan condixido de carbono(CO2) y den como resultado unamigade textura. En muchas ocasiones, dentro de las masas de repostera se empleanlevaduras qumicas(como elbicarbonato de sodio) que liberan dixido de carbono igualmente, hinchando su volumen. Durante el horneado estas masas se estabilizan, se rigidizan y liberan el gas quedandoesponjosas.

3.2. CaractersticasPara que un agente leudante sea capaz de aumentar el volumen de la masa debe existir una substancia capaz de "retener" el gas liberado en su interior. Este papel lo realizan en los procesos culinarios, por regla general, las protenasexistentes en los alimentos. En el caso de laharina de trigoempleada en la panificacin, es elgluten.2Sin gluten no se producira el aumento de masa, a pesar de incluir agentes leudantes. Esta es la razn por la que aquelloscerealescon un menor contenido de gluten poseen menor capacidad de leudar. Las protenas durante el amasado forman una red en el interior capaz de favorecer la retencin de los gases que liberan los agentes leudantes.

3.3. El mtodo del esponjadoAlgunas levaduras para pan se preparan con el mtodo del bizcocho, que consiste en disolver la levadura en agua ms caliente de lo normal, y luego mezclndola con parte de la harina para hacer una especie de pasta.Esto puede hacerse en un bol o haciendo un volcn en la harina e incorporando sta a la levadura disuelta slo parcialmente al principio, como en la receta del pan partido.La pasta se deja en reposo por lo menos unos 20 minutos -normalmente durante mucho ms- hasta que se forman burbujas en su superficie, proceso que se conoce como esponjado.A continuacin se mezcla con el resto de la harina y se aaden otros posibles ingredientes.Este mtodo permite a la levadura empezar a actuar sin verse inhibida por la presencia de ingredientes como huevos, manteca o azcar que reducen su eficacia.

3.4. Insumos utilizados en el proceso fermentativo de la masa panaria 3.4.1. Azcares.Presentes en la harina, suelen estar en forma de sacarosa y maltosa. Estos disacridos no son fermentables directamente, sino que es preciso transformarlos enzimticamente, en azcares simples, monosacridos, que s lo son. Estas transformaciones se realizan por medio de las enzimas invertasa y maltasa, presentes en la harina, dando lugar al llamado azcar invertido, constituido por una mezcla de glucosa y fructosa.

3.4.2. El agua.El agua es un cuerpo formado por la combinacin de un volumen de oxgeno y dos de hidrgeno, cuya frmula qumica es H2O. Es lquida, inodora, inspida e incolora, disuelve muchas substancias. Habitualmente la encontramos en estado lquido, aunque, dependiendo de las condiciones de presin y temperatura, es usual hallarla en estado slido o gaseoso.El agua que empleemos debe ser potable, por lo que debe reunir las propiedades anteriores y tener un buen estado sanitario. El agua constituye una tercera parte de la cantidad de harina que se vaya a emplear, aunque esto es un clculo estimado la cantidad final que se aadir depender de una serie de circunstancias, como el tipo de consistencia que queramos conseguir. As, si aadimos poca agua, la masa se desarrolla mal en el horno, mientras que un exceso hace que la masa resulte pegajosa y se afloje el pan quedando aplanado.

3.4.3. Levadura.Antes de nada debemos distinguir entre levadura biolgica y gasificantes, las primeras realizan la fermentacin biolgica del producto, transforma los azcares en CO2, alcohol etlico y energa, adems de descomponer los azcares complejos fermentables en otros ms simples por mediacin de la enzima Zymasa. Los gasificante son productos empleados para provocar la hinchazn o elevacin de la masa sin llegar a transformar ningn componente de la harina, en el modo que ocurre en la biolgica. Son compuestos alcalinos como el bicarbonato amnico, sdico, etc. La levadura biolgica es un hongo perteneciente al gnero de los hemiascomicetos y ms especialmente a los miembros del gnero Saccharoromyces. No todas las levaduras son aptas para la panificacin, la ms utilizada por los panaderos es la Saccharomyces Cerevisiae.

IV. MATERIALES Pipetas Gradilla Erlenmeyer Balanza Probeta Baguetas Esptula Bao mara

V. PARTE PROCEDIMENTAL (EXPERIMENTAL). Prepare los siguientes tratamientos:ComponentesTratamientos

123

Harina10g10g10g

Sacarosa1g1g1g

Agua115ml15ml15ml

Levadura0.3g0.5g0.7g

Bicarbonato0.3g0.5g0.7g

Mezclar y homogenizar la masa en cada beaker con ayuda de una bagueta Trasladar el homogenizado a las probetas rotulada y homogenizadas Incubar a 37C Leer y anotar el volumen inicial de la masa, en los diferentes intervalos de tiempo segn lo establecido. Leer y anotar el peso inicial de la masa, en los diferentes intervalos de tiempo segn lo establecido.

VI. RESULTADOS. Analice, describa los atributos de cada tratamiento, segn corresponda.Tabla 01: Descripcin de los atributos ms importantes de los tratamientos AtributoTratamientos

123

Color

Olor

Sabor

Flavor

Textura

Volumen

Contenido de humedad

Elasticidad

Peso

Tabla 02: Descripcin del volumen y peso de los diferentes tratamientos TiempoTratamientos (Volumen)Tratamiento (Peso)

123123

0 minutos

5 minutos

10 minutos

15 minutos

20 minutos

30 minutos

40 minutos

50 minutos

60 minutos

VII. DISCUSIONES

6.1 Discutir e indicar la importancia de los agentes leudantes de la masa panaria. 6.2 Discutir e indicar la importancia de conocer los diferentes agentes leudantes de la masa panaria.6.3. Realice el proceso de discusin en base a sus resultados obtenidos y la contrastacin del fundamente terico.

VIII. CONCLUSIONES7.1 Realice sus conclusiones indicando la importancia que tiene el hecho de conocer los agentes leudantes, del mismo modo deber tener relacin con los objetivos del informe de prctica de laboratorio.

IX. CUESTIONARIO1) Mencione cules son los factores que interviene en el proceso de hinchamiento de la masa panaria? Por qu?2) Grafique la frecuencia de variacin del volumen y del peso de os diferentes tratamientos e interprtelos correctamente. 3) Mencione en que tiempo es necesario parar el proceso de fermentacin? y por qu?4) Desarrolle las condiciones de Saccharomyces Cerevisiae.

X. BIBLIOGRAFA Matz, S (1972). "Bakery Technology and Engineering", AVI Publishing Co. Francisco Javier Alonso de la Paz, El libro del pan y de la leche; Madrid 1999, Editorial gata.ISBN 84-8238-328-0. Simmons, Amelia. "American Cookery". Oxford University Press, 1958 Graciela Martnez de Flores Escobar,Marcela Gonzlez-Garza , (2005),Iniciacin a Las Tcnicas Culinarias, Madrid, pg 212

PRCTICA 05: AISLAMIENTO Y SELECCIN DE MICROORGANISMOS

I. OBJETIVOS

Adiestrar al estudiante en las tcnicas de aislamiento y seleccin de microorganismos. Diferenciar morfolgicamente los tipos de levaduras que habitan en nichos naturales. Familiarizarse con el manejo de microorganismos y con las tcnicas de aislamiento en placa de Petri. Obtener colonias separadas, utilizando uno o ms mtodos.

II. INTRODUCCIN

En la naturaleza, la mayora de los microorganismos no se encuentran aislados, sino integrados en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar unos de otros y trabajar con especies aisladas, obteniendo cultivos axnicos o puros.

Un cultivo axnico o puro es aquel que contiene un slo un tipo de microorganismo y que procede generalmente de una sola clula; el crecimiento de sta origina, en medio slido, una masa de clulas fcilmente visible que recibe el nombre de colonia.Para obtener cultivos axnicos o puros a partir de una poblacin microbiana mixta, se utilizan las denominadas tcnicas de aislamiento, que fueron desarrolladas durante el siglo XIX. En un principio, Lister utiliz diluciones seriadas en medio lquido con esta finalidad, pero la presencia de contaminacin, es decir, de microorganismos no deseados, dificult el aislamiento. La escuela de Robert Koch introdujo los medios slidos, complementados con agar, y las placas de Petri en Bacteriologa, permitiendo as la separacin fsica de las colonias sobre la superficie del medio de cultivo o en el interior del mismo.

El aspecto de las colonias sirve para diferenciar distintas especies microbianas.

III. REVISIN BIBLIOGRFICA

3.1. Generalidades del proceso de aislamientoEl proceso de aislamiento consiste en disponer de la descendencia de un individuo (clula) inmovilizada sobre la superficie de un medio slido y separada del resto de individuos presentes en el cultivo mixto. Esta clula, en las condiciones de crecimiento adecuadas dar lugar a una descendencia (clon) que resultar macroscpicamente visible y que se llama colonia. Cada colonia contiene millones o miles de millones de clulas idnticas y con el mismo origen y propiedades. Se puede demostrar que prcticamente cada colonia procede de una sola clula o de un grupo de clulas del mismo tipo si el microorganismo forma agregados. Por ello lo ms correcto es hablar de unidades formadoras de colonias (UFC) al referirnos al origen de una colonia. El cultivo descendiente de una misma colonia es un cultivo puro.

En los primeros tiempos de la Microbiologa se utilizaban como sustratos slidos para inmovilizar los microorganismos patatas o pan, con el inconveniente de la opacidad de estos sustratos. En el laboratorio de Robert Koch se desarrollaron tcnicas para solidificar un medio lquido con composicin conocida aadiendo una sustancia sin opacidad y con la posibilidad de modificar la composicin del medio lquido segn los requerimientos nutricionales del microorganismo a aislar.La gelatina fue el primer agente solidificante utilizado por Koch, sin embargo, presentaba el inconveniente de que algunos microorganismos son capaces de utilizarla para su crecimiento.Entonces la gelatina fue sustituida por el agar; introducida por Fanny Eilshemius (1881). El agar es un polisacrido que se obtiene de algunas algas rojas y para pasar de slido a lquido se debe calentar por encima de los 100C y una vez fundido es mantiene lquido hasta enfriarse a 44C.

3.2. Nociones sobre el proceso de inculo y siembra

Inculo es la masa microbiana que se utiliza para sembrar el medio de cultivo. Para evitar contaminaciones a la hora de inocular el medio de cultivo, habitualmente se trabaja al lado de la llama del mechero Bunsen. Para la toma del inculo a partir de una muestra a examinar a partir de un medio slido o de un tubo con lquido, se recomiendan las maniobras siguientes:

1. Colocar frente al mechero la muestra a analizar y el resto del material necesario (tubos, placas...) de manera que sea fcilmente accesible.2. Tomar el asa de siembra o la pipeta. La pipeta debe estar previamente esterilizada. Se debe flamear el asa de siembra hasta que el filamento alcance un rojo incandescente y despus enfriar en la proximidad de la llama (unos 10 segundos).3. Tomar con la otra mano el recipiente (tubo, placa...) que contiene la muestra a analizar:

a) Si la muestra est en un tubo, quitar el tapn y flamear la boca del tubo.b) Si la muestra est en una placa de Petri, colocar la placa invertida sobre la mesa y levantar la parte de la placa que contiene el crecimiento bacteriano. Situar en la proximidad de la llama del mechero.

4. Trabajando en todo momento en la proximidad de la llama, tomar la alcuota o inculo:a. Si el medio es lquido agitar ligeramente el tubo e introducir la pipeta o el asa de siembra en la cual quedar adherida una gota por tensin superficial.b. Si el medio es slido, rozar con el asa de siembra una pequea porcin de colonia.c. Si la muestra se encuentra en la profundidad del agar, hundir el filamento dentro del medio hasta tomar una pequea porcin.

5. Transferir el inculo a otro medio de cultivo estril, tomando las mismas precauciones en su manejo (flameando la boca del tubo, trabajando en la proximidad de la llama...).

a. Si la transferencia va a ser a un caldo lquido, descargar el inculo mediante agitacin del asa de siembra en aqul o la expulsin del volumen pipeteado.b. Si la transferencia se va a realizar a un tubo de agar inclinado, introducir el asa con el inculo y sembrar en zig-zag sobre la superficie del agar o bien sembrar en picadura en la profundidad del medio.

c. Si la transferencia se va a hacer sobre un medio slido en placa de Petri, existen diferentes tipos de siembra: extensin de una gota con asa de vidrio, siembra en masa y por agotamiento en placa.

6. Una vez realizada la transferencia:a. En el caso de los tubos, flamear la boca antes de colocar el tapn. Identificar los tubos e incubar a temperatura adecuada durante el tiempo necesario para que crezcan los microorganismos.b. En el caso de la placa de Petri, tapar la placa. Identificar las placas marcndolas en la base e incubar en posicin invertida para evitar que el agua de condensacin

IV. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS4.1. Materiales Asa de siembra Pipeta graduada Placas de Petri Micro pipetas Cultivo de microorganismos (Poblacin de microorganismos)4.2. Equipos Incubadora Microscopio Autoclave Potencimetro Mechero bunsen

4.3. Reactivos Peptona NaCl Na2HPO4 KH2PO4 Agua destilada

V. PARTE EXPERIMENTAL:Lavar las frutas con 100ml de agua estril, utilice una vajilla estril y guantes. La solucin de lavado se considera como la muestra. De la misma forma realice los siguientes pasos:

A. Eliminacin de la poblacin bacteriana Transfiera de 2ml a 5ml de muestra a un tubo el cual contiene 10ml de solucin Raulin e incubar durante 24 horas a 22C 25C. Con esta metodologa garantizamos la eliminacin de bacterias presentes en la muestra.B. Aislamiento de levaduras7. Con una micropipeta, transportar aspticamente 50l de la solucin obtenida en A, a un tubo de ensayo el cual contiene 5ml de agua estril ()agitar antes la muestra moderadamente)

V. RESULTADOS. Indicar los resultados de los anlisis y discusiones de las Reglas de laboratorio y de Las medidas de seguridad. Indicar los materiales, equipos y sus funciones respectivas.

VI. DISCUSIONES 6.1 Discutir e indicar la importancia de realizar las destilaciones.

VII. CONCLUSIONES7.1 Realice sus conclusiones indicando la importancia que tiene el hecho de conocer y realizar las destilaciones por diferentes mtodos.

VIII. CUESTIONARIO.

1. Menciona la importancia de la filtracin?2. Un lquido orgnico comienza a descomponerse a 80C. Su tensin de vapor a esa temperatura es de 36 mm de Hg. Cmo podra destilarse?3. Ctense dos razones que justifiquen que el agua fra circule en un refrigerante en sentido ascendente.4. Se podra separar por destilacin sencilla una mezcla de dos lquidos de puntos de ebullicin 77 C y 111 C? Y por destilacin fraccionada? Qu lquido se recogera en primer lugar?

PRCTICA 06: TOLERANCIA DE LEVADURAS AL ETANOL Y CIDO ACTICO A CONDICIONES ANAERBICAS

I. OBJETIVOS

Evaluar y determinar la tolerancia exgena del etanol sobre Saccharomyces cerevisiae y levaduras aisladas (Saccharomyces Sp) Evaluar la tolerancia del cido actico exgeno sobre Saccharomyces cerevisiae y levaduras aisladas (Saccharomyces Sp) Determinar los procesos de fermentacin con fines tecnolgicos.

II. REVISIN BIBLIOGRFICA

2.1. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA FERMENTACIN ALCOHLICA

Existen factores tanto fsicos como qumicos que inciden positiva o negativamente en el transcurso de la fermentacin alcohlica, ya sea actuando sobre el desarrollo de las levaduras o incidiendo directamente sobre la propia fermentacin. Los ms relevantes son los siguientes:

2.1.1. TEMPERATURA. A mayor temperatura la fermentacin transcurre ms rpidamente, sin embargo es menos pura, es decir, se produce menos etanol y ms cantidad de compuestos secundarios. Las levaduras a 30C tienen su temperatura ptima de desarrollo. Por encima de 35C la actividad disminuye rpidamente y mueren a antes de 45C.

2.1.2. OXIGENO. Aunque la fermentacin es un proceso anaerbico, las levaduras mantienen una leve respiracin utilizando para ello el oxgeno disuelto en el mosto.

2.1.3. NUTRIENTES. Los azcares son fuente de energa para las levaduras.

2.2. INFLUENCIA DE ETANOL SOBRE EL METABOLISMO DE LEVADURAS

El etanol inhibe la viabilidad de las levaduras, la tasa especfica de crecimiento y la tasa especfica de fermentacin; adems de esto, la composicin del medio, concentracin de azcar, pH y la temperatura afectan esta inhibicin.1 Hay algunas teoras acerca de la inhibicin del crecimiento y fermentacin relacionadas a la produccin de etanol, se produce un decrecimiento del contenido de esteroles en la membrana celular y esto puede afectar el transporte de azcares, las enzimas del metabolismo de azcares son inhibidas por los productos que se sintetizan durante la fermentacin, el etanol parece tener un efecto inhibitorio sobre la actividad de la hexoquinasa y consecuentemente sobre el funcionamiento de la gluclisis.

Hoy en da es asumido que la tolerancia al etanol depende de la habilidad de las clulas de levadura para exportar etanol al medio externo, un proceso que depende grandemente de la composicin de la membrana celular y de la fluidez.5 Adems, la permeabilidad del etanol desde afuera hacia adentro de la clula es muy baja, lo cual explica el hecho de que el etanol adherido al medio es menos inhibitorio que el etanol producido por las clulas.

Los lpidos y esteroles de la membrana celular de levaduras son importantes porque ellos afectan el transporte de soluto y la tolerancia al etanol. Al preparar un inculo bajo condiciones aerbicas, incrementa el contenido de esteroles en la membrana celular y ayuda durante la fermentacin anaerbica reteniendo la vitalidad celular, por esta razn ellos son conocidos como factores de sobrevivencia.

Muchos experimentos mostraron que la incorporacin de cido linoleco, ergosterol u otro cido graso insaturado y esterol en la membrana celular de la levadura, incrementa su permeabilidad al etanol, y permite una alta tasa de transporte de etanol hacia fuera de la clula. Cuando no se suplementa con cidos grasos o esteroles al medio de cultivo, la clula podra sintetizarlos cuando hay disponible oxgeno en el medio, pero no en la total ausencia de l. Esta es la razn del mejoramiento a la tolerancia bajo condiciones micro-aerbicas.

Bajo condiciones anaerbicas el contenido de esterol cae rpidamente y la actividad fermentativa se retrasa, por esta razn, en la elaboracin de vinos es necesario una aereacin intermitente de por lo menos de cinco minutos para inducir la sntesis de esteroles.Ocasionalmente, durante la elaboracin de vinos, y otras bebidas fermentadas se puede tambin necesitar una aereacin intermitente para animar el crecimiento de la levadura y as conducir sin duda a la formacin de ergosterol.

El crecimiento en la presencia de etanol conlleva a la adaptacin de la clula al etanol y a una elevada tolerancia al etanol, durante este proceso toma lugar cambios en la composicin de cidos grasos, fosfolpidos y esteroles de la membrana citoplasmtica.

El etanol y el cido actico son bien conocidos como inhibidores del crecimiento y son usados como agentes antimicrobianos. Por otro lado, estos compuestos son sub-productos o substratos de fermentacin, as el cido actico es un sub-producto de la produccin de etanol e inhibe la fermentacin a altas concentraciones, el mecanismo de su toxicidad envuelve la acidificacin del citoplasma y modificacin de ciertas enzimas de la gluclisis.10

III. MATERIALES Y REACTIVOSa. MATERIALES

Levadura Saccharomyces cerevisiae 10 gPipetas de 0.1 ml, 1ml, 10ml01c/u

Glucosa100gVasos de precipitacin de 250ml04

(NH4)2SO4 5.0gTubos de ensayo20

Extracto de levadura5.0gTubos Durham20

KH2PO44.0 gBagetas02

Glicerol20mlEsptulas02

Agua destilada---Pizetas01

HCl al 5%---AlgodnRollo

Balanza analtica de 3 decimales01Rotulador01

pH metro01

Matraces Erlenmeyer de 1L01Espectrofotmetro---

Matraces Erlenmeyer de 250ml04

IV. PARTE EXPERIMENTALPreparacin de inculo

Preparar 100 ml de una solucin que contenga: 0.5 % de extracto de levadura, 0.4% de KH2PO4, luego de esterilizarlo a 121 C por 20 minutos a 15 libras/pulg2, agregar aspticamente 5.0 g de levadura Saccharomyces cerevisiae y agitarlo.

A.- Medio de fermentacin para ensayos de tolerancia a etanol y cido actico

Colocar en tubos de ensayo (20 tubos), 10 ml de medio de fermentacin con la siguiente composicin: Glucosa 20 g/L, KH2PO4 5.0 g/L, (NH4)2SO4 2.0 g/L, extracto de levadura 1.0 g/L. El medio de fermentacin se ajusta a pH 4.0 con HCl al 5% y se esteriliza a 121 C por 20 minutos a 15 libras/pulg2, antes de adicionar los volmenes correspondientes de etanol y cido actico.

PROCEDIMIENTO

Tolerancia al etanol por Saccharomyces cerevisiae a condiciones anaerbicas

Se colocan 10 ml de medio de fermentacin A en cada tubo de ensayo, seguidamente se colocan los tubos Durham en cada uno de ellos y se esterilizan a 121 C por 20 minutos a 15 libras/pulg2 .Los ensayos se llevan a cabo por duplicado, se observa la produccin de CO2 bajo diferentes concentraciones de etanol, la cepa de Saccharomyces cerevisiae se ensaya a 28 oC, durante 72 horas. La cantidad de etanol a adicionar al medio esterilizado en los tubos de ensayo es la siguiente: 4.0 % v/v, 6.0 % v/v, 8.0 % v/v, 10.0 % v/v y 12.0 % v/v.

Tolerancia al cido actico por Saccharomyces cerevisiae a condiciones anaerbicas

Se colocan 10 ml de medio de fermentacin A en cada tubo de ensayo, seguidamente se colocan los tubos Durham en cada uno de ellos y se esterilizan a 121 C por 20 minutos a 15 libras/pulg2 .Los ensayos se llevan a cabo por duplicado, se observa la produccin de CO2 bajo diferentes concentraciones de etanol, la cepa de Saccharomyces cerevisiae se ensaya a 28 oC, durante 72 horas. La cantidad de cido actico a adicionar al medio esterilizado en los tubos de ensayo es la siguiente: 0.1 % v/v, 0.2 % v/v, 0.5 % v/v, 1.0 % v/v y 2.0 % v/v.

Mediciones:

1. Observacin de la produccin de CO2 a las 72 h en los tubos de ensayo por Saccharomyces cerevisiae en los ensayos de tolerancia a etanol y cido actico. Tomar como referencia lo siguientes parmetros:

Donde:

- = Nulo + = Dbil ++ = Moderado +++ = Intenso

V. RESULTADOS. Tabla 01: Evaluacin de la tolerancia al etanol exgeno por Saccharomyces cerevisiae

Reacciones durante la fermentacin% ETANOLTiempo

4%6%8%10%12 %

Formacin de CO2 24 horas

Formacin de Film

Precipitacin

Formacin de espuma

Formacin de CO2 48 horas

Formacin de Film

Precipitacin

Formacin de espuma

Fuente: elaboracin propiaTabla 02: Efecto del cido actico exgeno en la fermentacin de Saccharomyces cerevisiaeReacciones durante la fermentacinConcentracin de cido acticoTiempo

0.1%v/v0.2%v/v0.5%v/v1%v/v2%v/v

Formacin de CO2 24 horas

Formacin de Film

Precipitacin

Formacin de espuma

Formacin de CO2 48 horas

Formacin de Film

Precipitacin

Formacin de espuma

Fuente: elaboracin propia

VI. Tabla 03: Evaluacin de la Tolerancia al etanol exgeno por levaduras aisladas

Reacciones durante la fermentacin% ETANOLTiempo

4%6%8%10%12 %

Formacin de CO2 24 horas

Formacin de Film

Precipitacin

Formacin de espuma

Formacin de CO2 48 horas

Formacin de Film

Precipitacin

Formacin de espuma

Fuente: elaboracin propiaTabla 04: Efecto del cido actico exgeno en la fermentacin de levaduras aisladasReacciones durante la fermentacinConcentracin de cido acticoTiempo

0.1%v/v0.2%v/v0.5%v/v1%v/v2%v/v

Formacin de CO2 24 horas

Formacin de Film

Precipitacin

Formacin de espuma

Formacin de CO2 48 horas

Formacin de Film

Precipitacin

Formacin de espuma

Fuente: elaboracin propiaVII. DISCUSIONES

VIII. CONCLUSIONES

IX. CUESTIONARIO.

Explique el fenmeno de tolerancia e inhibicin de la fermentacin por etanol y cido actico. Qu levaduras son altas productoras de cido actico? Qu implicancia tiene el sulfito en la produccin de etanol y glicerol en Saccharomyces cerevisiae? Qu soluciones planteara Usted si un proceso de fermentacin se detendra y no se llegara a la conversin total del azcar en etanol?

X. BIBLIOGRAFA1. Sa-Correia, I., y Van Uden, N. Perfiles de temperaturas en la tolerancia al etanol: Efectos del etanol sobre la temperatura mxima y mnima de crecimiento en Saccharomyces cerevisiae y Kluyveromyces fragilis., 1983. Revista: Biotech. Bioeng. Vol. 25, p. 1665-1667.2. La Rue, F., Lafon-Lafourcade, S. y Ribereau-Gayon P., 1980. Revista: Appl. Env. Microbiol. Vol. 39, p. 808-811.3. Nagodawithana, T. W., Whitt, J. T. y Cutaia, A. J. Estudio del efecto de retroalimentacin de etanol sobre enzimas seleccionadas de la va gluclica., 1977. Revista Americana: Soc. Brew. Chem. Vol. 35, p. 179-193.4. Navarro, J. M. y Finck, J. O., 1982. Revista: Cell. Molec. Biol. Vol. 28, p. 85-89.5. Nagodawithana, T. W., y K. Steinkraus. Influencia de la tasa de produccin y acumulacin de etanol sobre la viabilidad de Saccharomyces cerevisiae en fermentacin rpida., 1976. Revista: Appl. Environ. Microbiol. Vol. 31, p. 158-162.6. Novak, M., P. Strehaiano, M. Morena, y G. Goma. Fermentacin alcohlica: Sobre el efecto inhibitorio del etanol., 1981. Revista: Biotech. Bioeng. Vol. 23, p. 201-211.7. Prasad, R., y H. Rose. Relacin de los lpidos en el transporte de solutos., 1986. Revista: Levaduras. Vol 2, p. 205-220.8. Navarro, J. M. y Durand, G., 1978. Revista: Ann. Microbiol. (Instituto Pasteur, 1926), p. 215-224.9. Beech, W. F. Levaduras en la elaboracin de sidra. En: La levadura, 2da. ed. Vol. V. Rose, A.H. y Harrison, J.S. Londres: Ed. Academic Press, 1987. 10. Pampulha, M. E. y Loureiro-Dias, M. C., 1990. Revista: Appl. Microbiol. Biotechnol. Vol. 34, p. 375-380.11. Beech, F. W. Reporte anual de la estacin de investigacin Long Ashton para 1952: 125. Londres, 1953.12. Beech, F. W., 1972b. Revista del instituto de cervecera. Vol. 78, p. 477.13. Beech, F.W., Burroughs, L.F., Timberlake, C.F. y Whiting, G.C. Progresos actuales en los aspectos qumicos y efectos antimicrobiales de dixido de azufre (SO2). Boletn de la O.I.V., 1979. Vol. 52, p. 1001-1022. 14. Reed, G. y Peppler, H. J. Tecnologa de levaduras; AVI Publishing Co.: Westport, Connecticut, 1973, p. 366. 15. Hammond, S. M.y Carr, J. G. Actividad antimicrobial de SO2 con referencia particular a jugos de fruta fermentados y no fermentados. En: Inhibicin e inactivacin de microbios vegetativos, (editado por F. A. Skinner y W. B. Hugo). Londres: Ed. Academic Press, 1976, p. 89-110.

PRCTICA 10: FERMENTABILIDAD DE DISTINTAS FUENTES DE CARBONO POR SACCHAROMYCES CEREVISIAE Y SACCHAROMYCES SP

I. OBJETIVOS

Evaluar la capacidad de las levaduras para fermentar anaerbicamente distintas fuentes de carbono Determinar la velocidad de fermentacin utilizando un medio definido con diferentes fuentes de carbono Identificar que fuentes de carbono son fermentables por las levaduras Saccharomyces cerevisiae Controlar la fermentacin por produccin de CO2 y decrecimiento en peso del medio de cultivo

II. INTRODUCCIN

La fermentaciones un tipo de catabolismo parcial, que se caracteriza por ser un proceso de oxidacin incompleta, tpico de los organismos anaerbicos. Se realiza, pues, sin la intervencin del oxgeno. El proceso de fermentacin no slo incluye la desasimilacin anaerbica como la formacin de alcohol, butanol-acetona, cido lctico, etc. sino tambin la produccin industrial de vinagre, cido ctrico, enzimas, penicilina, etc. Todos estos productos son el resultado de procesos microbianos y se llaman productos de fermentacin.

Durante la fermentacin, la energa obtenida procede, igual que en la respiracin aerobia, de las reacciones de xido-reduccin habidas durante el catabolismo de la glucosa (gluclisis), pero en la fermentacin las coenzimas reducidas no ceden sus electrones a una cadena cuyo aceptor final es el oxgeno, sino que los ceden directamente a un compuesto orgnico que se reduce y es el producto caracterstico de cada fermentacin.

Inculos de levaduras comerciales son ampliamente usados en la industria de las bebidas alcohlicas, sin embargo es preferible utilizar cepas autctonas, las cuales estn adaptadas a los medios de fermentacin de cada rea. Aunque se han encontrado muchos gneros de levaduras en fermentaciones, la especie Saccharomyces cerevisiae es la principal responsable de la fermentacin alcohlica, as como de la produccin de la mayora de los compuestos aromticos. Algunos de los criterios de seleccin de las cepas se basan en su capacidad fermentativa, medida como produccin de etanol, acidez y consumo de azcares.

III. REVISIN BIBLIOGRFICA

3.1. FermentacinSon cambios qumicos en las sustancias orgnicas producidos por la accin de las enzimas. Esta definicin general incluye prcticamente todas las reacciones qumicas de importancia fisiolgica. Actualmente, los cientficos suelen reservar dicha denominacin para la accin de ciertas enzimas especficas, llamadas fermentos, producidas por organismos diminutos tales como el moho, las bacterias y la levadura. Por ejemplo, la lactasa, un fermento producido por una bacteria que se encuentra generalmente en la leche, hace que sta se agrie, transformando la lactosa (azcar de la leche) en cido lctico. El tipo de fermentacin ms importante es la fermentacin alcohlica, en donde la accin de la cimasa segregada por la levadura convierte los azcares simples, como la glucosa y la fructosa, en alcohol etlico y dixido de carbono. Hay otros muchos tipos de fermentacin que se producen de forma natural, como la formacin de cido butanoico cuando la mantequilla se vuelve rancia, y de cido etanoico (actico) cuando el vino se convierte en vinagre.La fermentacin es un proceso que realizan muchos microorganismos, efectuando reacciones sobre algunos compuestos orgnicos y liberando energa. Hay muchos tipos diferentes de fermentacin, pero en condiciones fermentativas solamente se efecta una oxidacin parcial de los tomos de carbono del compuesto orgnico y, por consiguiente, slo una pequea cantidad de la energa potencial disponible se libera.

3.2. Metabolismo de azcares por levaduras Bajo condiciones de crecimiento estrictamente anaerbicas, la fosforilacin a nivel del substrato en la gluclisis es la nica fuente de ATP en Saccharomyces cerevisiae y posibilita un rendimiento neto de 2 ATP por cada molcula de glucosa convertida en dos molculas de piruvato. La disimilacin de glucosa a piruvato va la gluclisis est unida a la reduccin de NAD+ en la reaccin catalizada por la gliceraldehdo-3-fosfato-deshidrogenasa. Un balance redox cerrado en disimilacin es logrado por descarboxilacin de piruvato a acetaldehdo, el cul (NAD+) subsecuentemente acta como un aceptor de electrones para la reoxidacin de NADH2.1El NADH2 y el NADPH tienen diferentes funciones en la red metablica de Saccharomyces cerevisiae. El NADPH es preferentemente usado en vas asimilatorias. La gluclisis juega un rol esencial en la disimilacin de azcar, pero tambin genera bloques constituyentes para la biosntesis. Adems, aunque muchas reacciones biosintticas usan NADPH como un reductor, algunas reducciones unidas a NADH ocurren en la conversin de metabolitos centrales (piruvato, oxalacetato, acetil CoA) a monmeros celulares, por ejemplo en la biosntesis de aminocidos. Durante el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae sobre azcar, la preferencia del NADH en reducciones disimilatorias (en la reduccin de acetaldehdo a etanol y la reduccin del pool de quinona de la cadena respiratoria) es muy fuerte. En contraste a varias otras levaduras, Saccharomyces cerevisiae no puede directamente conectar la oxidacin de NADPH a la cadena respiratoria.1 El metabolismo redox no puede ser visto como un proceso aislado, su regulacin est cercanamente conectada con reacciones centrales y perifricas en el metabolismo de carbono y nitrgeno. Ello implica que el NADH2 generado en estas reacciones es reoxidado y la ocurrencia de NADH2/NAD+ redox mitocondrial y citoslico no es solamente relevante durante el crecimiento en respiracin aerbica, sino tambin durante el crecimiento anaerbico en fermentacin8.

El rendimiento de etanol en fermentaciones de vinos no alcanza el valor terico, el cual debe ser 51,1% por peso basado en glucosa fermentada. Este rendimiento se debe a la formacin de sub-productos durante la fermentacin alcohlica y a la asimilacin de azcar por la levadura, adems de esto el rendimiento es afectado por diversas variables incluyendo la temperatura, pH, cantidad de inculo y presencia ausencia de O2, en la prctica 47,0 47,5 gramos de etanol son usualmente obtenidos por cada 100 gramos de azcar fermentado.IV. Culturas, materiales y reactivos.

Levadura Saccharomyces cerevisiae 10 gVasos de precipitacin de 200ml04

Glucosa, maltosa, sucrosa100g c/uBalanza analtica01

Fructosa, lactosa, almidn100g c/uTubos de ensayo30

Extracto de levadura5.0 g/LAlgodnRollo

KH2PO44 g/LBagetas05

HCl al 5%--Esptulas02

NaOH al 5%---Pizetas01

Agua destilada12 LLapicero rotulador01

Matraces Erlenmeyer de 0,5L10Cinta mazkin01

Matraces Erlenmeyer de 1ml02Mechero Bunsen02

Pipetas de 10 ml03Gradillas02

Pipeta de 20ml04

Fuente: elaboracin propia

V. PARTE EXPERIMENTAL

Preparacin de inculo: Preparar 200 ml de una solucin que contenga: 0,5% de extracto de levadura, 0,4% de KH2PO4, luego de esterilizarlo a 121 C por 20 minutos a 15 libras/pulg2, agregar aspticamente 10 g de levadura de panadera Saccharomyces cerevisiae y agitarlo

Medio de fermentacin: La referencia es; 1L de una solucin debe contener: Fuente de carbono 20 g; extracto de levadura 0,5%; KH2PO4 0,4%; (NH4)2SO4 1,2 g.

Se trabajar en 2 grupos

Para la determinacin de la velocidad de fermentacin

Cada grupo elegir 2 3 azcares para la prctica. En 2 3 Erlenmeyer de 0,5 L se prepara el medio de fermentacin (0,3 L) de composicin citada anteriormente; el pH se ajusta a 3,8 con HCl al 5% NaOH al 5%, se tapa con algodn y luego se esteriliza a 121 C por 20 minutos a 15 libras/pulg2, seguidamente se deja enfriar hasta alcanzar los 27 C (temperatura ptima para el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae). Luego aspticamente con una pipeta estril cada Erlenmeyer se inocula con la solucin de levadura (4% del volumen total de medio de fermentacin) y se incuba a 27C durante todo el proceso.

Para ensayos de fermentabilidad de fuentes de carbono

Cada grupo determinar la fermentabilidad de fuentes de carbono como: sucrosa, maltosa, fructosa, almidn, almidn y lactosa, los ensayos se harn por triplicado por cada fuente de carbono. Colocar en cada tubo de ensayo de 8 10 ml de medio de fermentacin, ajustar el pH a 3,8 con HCl al 5% NaOH al 5%, taparlos con algodn y cubrirlos con papel aluminio, no olvide rotular en cada tubo de ensayo que tipo de fuente carbonada est contenido. Una vez preparado los tubos de ensayo conteniendo los medios de fermentacin se esterilizan a 121 C por 20 minutos a 15 libras/pulg2, seguidamente se deja enfriar para luego inocular aspticamente con un asa de siembra utilizando la solucin de levaduras preparada al inicialmente. Una vez inoculado los tubos de ensayo se colocan en una gradilla y se llevan a incubacin por 48 horas.

Mediciones:

1. Para los ensayos de velocidad de fermentacin, se toma el peso inicial del medio de cultivo correspondiente a 300ml y cada hora se vuelve a pesar el Erlenmeyer, se anota el intervalo en el que se toma cada medicin y el peso neto del medio de cultivo en ese instante (no olvide al inicio pesar el Erlenmeyer ms el tapn), y se construye una grfica tiempo peso.

2. Observacin de la produccin de CO2 por Saccharomyces cerevisiae en los tubos de ensayo a las 48 horas. Tomar como referencia las siguientes consideraciones:

Produccin de CO2: Intensa: +++, moderada: ++, dbil: + Formacin de pelcula sobre la superficie del medio lquido: Intenso: ***, moderado: **, dbil: *

VI. RESULTADOS

Tabla 01: Evaluacin de la fermentacin por Saccharomyces cerevisiae

Reacciones durante la fermentacinCarbohidratosTiempo

AlmidnSacarosaMaltosaFructuosalactosa

Formacin de CO2 24 horas

Formacin de Film

Precipitacin

Formacin de espuma

Formacin de CO2 48 horas

Formacin de Film

Precipitacin

Formacin de espuma

Fuente: elaboracin propiaVII. Tabla 02: Evaluacin de la fermentacin por por levaduras aisladas

Reacciones durante la fermentacinCarbohidratosTiempo

AlmidnSacarosamaltosafructuosaLactosa

Formacin de CO2 24 horas

Formacin de Film

Precipitacin

Formacin de espuma

Formacin de CO2 48 horas

Formacin de Film

Precipitacin

Formacin de espuma

Fuente: elaboracin propiaVIII. DISCUSIONES IX. CONCLUSIONESX. CUESTIONARIO.

1. Cul es la importancia de controlar el desprendimiento de CO2 en una fermentacin?2. Qu comentarios puede hacer acerca de la fermentabilidad de las diferentes fuentes de carbono por Saccharomyces cerevisiae?3. Qu es la fase lag y que factores influye en su duracin?4. Qu puede comentar acerca de la velocidad de fermentacin con diferentes fuentes carbonadas?

XI. BIBLIOGRAFA1. Kappeli, O. Regulacin del metabolismo de carbono en Saccharomyces cerevisiae y levaduras relacionadas., 1986. Revista: Adv. Microbiol. Physiol. Vol. 28, p. 181-209.2. Van Urk, H., Bruinenberg, P. M., Veenhuis, M., Scheffers, W. A. y Van Dijken, J. P. Capacidad respiratoria mitocondrial de Saccharomyces cerevisiae CBS 8066 y Candida utilis CBS 621 crecidos bajo limitacin de glucosa., 1989. Revista: Antonie van Leeuwenhoek. Vol. 56, p. 211-220. 3. Petrik, M., Kappeli, O. y Fiechter, A. Un concepto amplio sobre el efecto de glucosa en levaduras Saccharomyces uvarum, relacin de un trmino amplio y simple de regulacin., 1983. Revista: Gen. Microbiol. Vol. 129, p. 42-49.4. De Deken, R. H. El efecto Crabtree: Un sistema regulatorio en levaduras., 1966. Revista: Gen. Microbiol. Vol. 44, p. 149-156.5. Van Dijken, J. P. y Scheffers, W. A. Balance redox en el metabolismo de azcares por levaduras., 1986. Revista: FEMS Microbiol. Rev. Vol. 32, p. 199-224.6. Pronk, J. T., Wenzel, T. J., Luttik, M. A., Klaassen, C. M., Scheffers, W. A., Steensma, H. Y. y Van Dijken, J. P. Aspectos energticos del metabolismo de glucosa en un mutante piruvato-dehidrogenasa negativo de Saccharomyces cerevisiae., 1994. Revista: Microbiology Vol. 140, p. 601-610.7. Verduyn, C. Fisiologa de levaduras en relacin al rendimiento del crecimiento., 1991. Revista: Antonie van Leeuwenhoek. Vol. 60, p. 325-353.8. Bisson, L. F. Metabolismo de azcares por levaduras, en la microbiologa y biotecnologa del vino. Chur, Suiza: Ed. Harwood Academic Publishers, 1993, p. 55-75.

Docente: Ing. Anderson Nez Fernndez