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UniversidadAutónomadeSanLuisPotosí

FacultaddeCiencias

LicenciaturaenBiología

ManualdeprácticasdeBioquímicaBásica

Dra.CatalinaArenasHuerteroIlustracióndeportadatomadadeopenstructure.org

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IndicePrefacio......................................................................................................................3

Reglamento................................................................................................................4

DeterminacióncuantitativadelaconcentracióndeCuSO4medianteespectroscopíadeabsorciónmolecularUV-VIS...................................................................................6

Identificacióndecarbohidratos,reaccionescaracterísticas.......................................11

Hidrólisisdelalmidón...............................................................................................14

Determinacióndelípidostotalesdediferentesórganosdepolloycuantificacióndecolesterol..................................................................................................................18

Separacióneidentificacióndeaminoácidosporcromatografíaenpapel..................21

Extracción,cuantificacióndeproteínas.....................................................................23

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Prefacio

“Labioquímicaeselestudiode lavidaenelnivelmolecular.Portanto,consisteenelestudiodelasestructurasylasinteraccionesdeátomosymoléculasconlabiologíadelasestructurasy las interaccionesdecélulasyorganismos;por loanterioresque“lavida”ensunivelmásbásicoesunfenómenobioquímico”.1

Estemanual de prácticas del laboratorio de Bioquímica Básica, es una compilación yadaptación de prácticas que pueden ser desarrolladas acorde con la infraestructurapresenteenlaFacultaddeCiencias,UASLP.Complementanelestudiodecadaunadelasbiomoléculasqueserevisanenelprogramadeestudiosdelamateria.Constade6prácticasenlasquesedaunabreveintroducción,objetivo,materialautilizar,asícomoelprocedimientoyuncuestionarioaresolver.

Es importante resaltar que se estimula al estudiante a familiarizarse con lasmetodologías generales cualitativas y cuantitativas para analizar las moléculasdependiendo sus características químicas. También se establece que además de larealizacióndelapráctica,elestudianteensayelaelaboracióndeunreporteporescrito,en donde se establezca una breve introducción, objetivo, hipótesis, reporte deresultados y análisis de ellos; finalizando con una conclusión y resolución delcuestionario.

Este material se encuentra adecuado para los programas de estudio en donde seimparteBioquímicageneral.

1. Donald Voet, Judith G Voet. 2006, Bioquímica, (Silva Rondinone, Diana Klajn y M. V. Preciado) 3ra ed.EDITORIALMEDICAPARAMERICANA.ARGENTINA.1763pp.

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Reglamentodelaboratorio.1. Paraingresarallaboratorio,esobligatorioelusodelabatareglamentaria(blanca,de

algodónymangalarga)debidamenteabrochadaydesumanualinstructivo.2. Paraeldesarrollodelaprácticasedeberáportarzapatocerradocómodoyseguro.

Cuandoseleindiquedeberáusarcubrebocay/ocareta,guantesylentesdeseguridad.

3. Evitarelusodejoyas(anillos,pulseras,dijes,areteslargos,etc.)quepuedanreaccionarconlosproductosquímicosoquepuedanengancharseenmaterialesoequipos.Además,esrequisitotraerelpelorecogidoylasuñascortadasparaevitarcontaminación.

4. Eltiempodetoleranciaparallegaryentrarallaboratorioseráestablecidoporelmaestro(a)y/oinstructor.

5. Losútilesypertenenciasquenocumplanuncontenidoenlapráctica,deberánsercolocadosenellugarindicadoporelmaestro(a)y/oinstructor.

6. Aliniciaryterminarcadapráctica,deberálimpiarsumesadetrabajodejándolaenelordenenquelefueentregada.Encasodetrabajarconmuestrabiológicaseláreadetrabajosedesinfectaráconbenzaloalgúngerminicidaqueleseaproporcionadoporelmaestro(a)y/oinstructor.

7. Jamásdeberáiniciarunaprácticasinestarsegurodeloquesevaahacer,porloqueserásuobligaciónleerpreviamenteelmanualyatenderlasindicacionesdelmaestro(a)y/oinstructor.

8. Antesdeempezarlaprácticaleseráconfiadomaterialdellaboratorioelcualtendráquedevolveralfinaldelamisma.Enalgunasocasiones,tendráqueaportarmaterialesosustanciasqueseanrequeridasparaeldesarrollodeunaprácticaparticular.

9. Antesdeempezarlapráctica,deberáverificarlaidentidaddelosproductosquímicosybiológicos.Nodeberáolerniprobarlosreactivosoproductosquímicos-biológicosquedesconozca.Nopipetearconlaboca.

10. Porsuseguridadquedaestrictamenteprohibidofumaryconsumiralimentosobebidasduranteeldesarrollodelasprácticas.Deigualforma,quedaprohibidollevarsecualquiertipocosasalabocadentrodellaboratorio.

11. Lasprácticasdeberánserrealizadasenordenocupandoellugarasignadoenlasmesasdetrabajoynodeberándesplazarseaotrasmesasinterviniendoeneltrabajodesuscompañeros.

12. Laprácticasedebedesarrollarconlimpiezaevitandoderramarsustanciasenlamesadetrabajoyetiquetandodebidamentelassolucionespreparadas.

13. Encasoderomperoderramarmaterialcontaminado,viertainmediatamenteelgerminicidaproporcionadoenellaboratorioydejeactuaralmenos10min.Antesdelimpiareláreaaviseasusupervisor.Deigualforma,encasodealgúnaccidente(cortadura,salpicaduraconmaterialcontaminadooalgúnreactivo,quemadura,entreotros)aviseasusupervisor.

14. Enocasiones,esnecesarioreconoceralgunasustanciaporsuolor.Lamaneraadecuadadehacerloconsisteenabanicar,conlamano,hacialanarizunpocodevaporyaspirarindirectamente(nuncainhalardirectamentedelrecipiente).

15. Jamássedebenverterlosdesechosaloslavabos,sinoenlosrecipientescorrespondientesasignadosporelinstructor.

16. Bajoningunaexcusasepermitiráelausentarsedelapráctica.17. Nosepermitiránvisitasajenasallaboratorioduranteeldesarrollodelapráctica.18. Altérminodelapráctica,deberácerciorarsequelasllavesdegas,vacíoyaguaqueden

perfectamentecerradas.19. Lavarselasmanosalentraryalsalirdellaboratorio.Ellavadotambiéndebeincluirlos

guantesusadoscolocándolosenelrecipienteadecuadoparasudesecho.

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DeterminacióncuantitativadelaconcentracióndeCuSO4medianteespectroscopíadeabsorciónmolecularUV-VIS.

LaboratoriodeQuímicaConceptosarevisar:Absorbancia,leydeLambert-Beer,dilución.Introducción1.EspectroscopíaEltérmino“espectroscopia”provienedelapalabra“espectro”queoriginalmentesereferíaalosmúltiplescoloresdeluzqueaparecíanalanalizarluzblancaatravésdeunprisma.Implicaporlotanto,elusodemúltipleslongitudesdeondadeluz.Un espectrofotómetro es un instrumento para medir la absorbancia de una solución. LaabsorbanciaesunamedidacuantitativaútilyestárelacionadaconlaconcentraciónatravésdelaleydeLambert-Beer,lacualestablecelosiguiente: A=ε clDondeAes laabsorbanciade lamuestraauna longituddeondadada, ε eselcoeficientedeextinción del compuesto a esa longitud de onda y sus unidades son (M·cm)-1, c es laconcentración molar de la especie que absorbe, y l es la longitud de paso de la celda quecontienelasolucióndondeserealiza lamedición, lasunidadesenlasqueseencuentraescm,generalmentees1cm.Así,sielcoeficientedeextinciónesconocido,entonceslaabsorbanciadelasoluciónpuedeserusadaparacalcularlaconcentracióndelaespecieensolución(asumiendoquelaúnicaespeciequeabsorbeeselcompuestodeinterés).Otradefiniciónsobrelaabsorbanciaestádadaporlasiguienteexpresión: A=log(I0/I)Donde I0es la cantidadde luzqueentraa lamuestra,e Ies la cantidadde luzquesalede lamuestra.Laabsorbanciaesporlotantounamedidadelaporcióndeluzquellegaaldetector.Delocualsededucequecuandolaabsorbanciavale1,soloel10%delaluzalcanzaeldetector,ycuandoes2,soloel1%delaluzalcanzaeldetector.

Figura 1. Arreglo interno típico de una cubeta en el espectrofotómetro. Esquema

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tomadode “Manual de Prácticas de Laboratorio de Bioquímica”,Universidad IndustrialdeSantander.España,2013.

UNDATOIMPORTANTEPARATOMARENCUENTA:“Valoresdeabsorbanciamayoresa2nosonconfiablesporquemuypocaluzestáalcanzandoeldetectorparapermitirmedicionesacertadas.Cuando se realizan lasmediciones, si el valor de absorbancia esmayor de 2, se debe diluir lamuestrayrealizarlasmedicionesnuevamente.La lecturaenelespectrofotómetrotambiénpuedeser interferidapor lashuellaspresentesenlascarasópticasdelacubeta,asícomotambiénporlasburbujasdeaireopresenciadesólidosenlasolución,afectandolosvaloresrealesdelamedición.Asíqueantesderealizarlalectura,sedebetomarencuentaestosaspectos.Algunascubetasestándiseñadasparaluzvisibleúnicamente.Cuandoelespectrofotómetroestáenmodo de ultravioleta (340 nmomenos), se debe asegúrese que su cubeta no tenga granabsorbanciacuandosolamentecontieneagua.Losespectrofotómetrostienencapacidaddemedirabsorbanciaavaloresespecíficosdelongitudde onda. El método usado más comúnmente involucra un monocromador que permitedescomponerlaluzincidenteensuscomponentescondiferenteslongitudesdeondaydeestaformaescogerunalongituddeondaalacualunamuestradadaabsorbeconmayorintensidad.Lacapacidadparamedir laabsorbanciaadiferentes longitudesdeondaesmuyútilporqueelcoeficientedeextinciónvaríaalvariarlalongituddeonda.Además,elespectrodeabsorbanciapuedevariardependiendode la composiciónquímicadel compuestoyelambiente (solvente)alrededordeeste.

Figura2.Funcionamientodeunespectrofotómetro.EsquematomadodeMetrixlab.

Porotrolado,paracadasustanciaesnecesarioanalizarsumáximodeabsorbanciaadiferenteslongitudesdeonda.enlafigura3,semuestraelespectrodeabsorbanciadeunaproteína.Estatiene un valor muy alto de absorbancia de alrededor de 280 nm, y muy bajo a mayoreslongitudesdeonda.Paraestaproteína,losúnicoscromóforosqueabsorbenaestalongituddeondasonlosanillosaromáticosdelosaminoácidostirosinaytriptófano.Comoestasproteínasabsorben en el espectro ultravioleta, son incoloras. Sin embargo, hay otras proteínas queabsorban en la región visible como lo son la Hemoglobina que posee un grupo (Hemo) queabsorbefuertementeenestaregión.

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El coeficientedeextincióndeunamoléculaauna longituddeondadadapuedesercalculadoutilizandolaleydeLambert-Beerparamedidasdeabsorbanciadesolucionesdeconcentraciónconocida.

Figura 3. Espectro de absorción de una proteína diferente a Hemoglobina. Esquematomadode “Manual de Prácticas de Laboratorio de Bioquímica”,Universidad IndustrialdeSantander.España,2013

2.DilucionesDiversassolucionesusadasenbioquímicasonpreparadaspordiluciónapartirdeunasoluciónestándar. Para esto se necesita considerar la concentración final deseada y el volumenrequeridodelmaterialdiluido,paraestosepuedehacerutilizandolasiguienteecuación. C1V1=C2V2Donde C1 en la concentración inicial,V1 es el volumen inicial,V2 es el volumen del materialdiluidoyC2enlaconcentraciónfinaldelmaterialdiluido.Consideremosunejemplo.Senecesitaprepararunasdilucionesparaunacurvadecalibración.Setieneunasoluciónestándarde1000μg/mLdelcompuestoAysenecesitapreparar200μLaunaconcentraciónde20μg/mL.Elcálculoentoncesseráelsiguiente:V1=?ESELVALORDESCONOCIDOC1=1000μg/mLV2=200μLC2=20μg/mL Estoquieredecirquesetoman4μLde lasolución inicial,se leadiciona196μLdeldisolventeparaobtenerlasoluciónfinaldeconcentraciónconocida.Otrofactorimportanteeslanomenclaturaparalasdilucioneslacualpuedesermostradacomounarelación.Porejemplo:Unarelación1:2quieredecirqueaunvolumen inicialse leagregaotrovolumendesolventepara lograrelvolumenfinal.Unarelación1:5quieredecirqueaun

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volumeninicialseleagregan4volúmenesdesolvente.Otrasveces lanomenclaturaestádadaenvaloresde“X”,porejemplounasolución10X.Si sequierepreparardeestaunadilución1Xsenecesitaradiluirlo10veceso sepuede interpretarquesellevaráacabounarelación1:10paraprepararla.Delamismaformasepuedenprepararotras diluciones para realizar una curva de calibración. En esta practica, se aprenderá cómopreparardiluciones,cómousarelespectrofotómetroycómointerpretarlosdatos.ObjetivoComprender y aplicar los procedimientos de espectroscopia UV-VIS y su importancia paraanalizar soluciones de concentración desconocida. Así también, se revisarán los conceptos demolaridad,normalidad,porcentajesdepesoapesoydilución.Materialporequipode4-5personasMicropipetasPuntasparamicropipetas13tubosdeensayoSustanciassol.Desulfatodecobre(CuSO4)0.1Msol.ProblemadeCuSO4

AguadestiladaEquipoempleadoEspectrofotómetroUV-VisCeldadecuarzoProcedimientoDiluciónsimple11.Colocarelespectrofotómetroaunalongituddeondaa700nmycalibrarunblancoaceroconagua.2. Preparar 3mL de las siguientes diluciones de CuSO4 usando agua destilada: 1:2, 1:5, 1:10,1:50,y1:100.3.Leeryregistrarlaabsorbanciaalalongituddeondadadaparacadadilución.Diluciónsimple21.AsumiendoquelasoluciónestándardeCuSO4es5X,prepararlassiguientesdiluciones:0.5X,1X,2X.2.Leeryregistrarlaabsorbanciaalalongituddeondadadaparacadadilución.Dilucionesenserie1.PrepararlassiguientesdilucionesdeCuSO4usandodiluciónenserie:1:5,1:25,1:125,y1:625.2.Leeryregistrarlaabsorbanciaalalongituddeondadadaparacadadilución.

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SoluciónproblemaLeer y registrar la absorbancia a la longituddeondadadapara las solucionesodilucionesdeconcentracióndesconocida.Registroderesultados1. Realizar en cada caso de las diferentes diluciones, una gráfica de Absorbancia vsConcentración.2.Realizarunanálisisderegresiónlinealparadeterminarelcoeficientedecorrelación.Encadaexperimento extrapolar el valor de absorbancia de la solución problema, para conocer laconcentración.3. Comparar en cada caso que la solución problema haya tenido el mismo valor deconcentración.Cuestionario

1. ¿Quéeslareflectanciadeunasolución?2. ¿Quéeslatrasmitanciadeunasolución?3. ¿Aquelongituddeondaabsorbenloscarbohidratos,lípidosyácidosnucleícos?

BibliografíaPráctica tomada y adaptada de: “Manual de Prácticas de Laboratorio de Bioquímica”,UniversidadIndustrialdeSantander.España,2013.

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Identificacióndecarbohidratos,reaccionescaracterísticasLaboratoriodeQuímicaConceptosarevisar:Definicióndecarbohidratos,Monosacárido,polisacárido.Aldosasycetosas,reaccióndeFehling,reaccióndeBarfoed,reaccióndeSeliwanoffIntroducciónLos carbohidratos sonuna fuente importante de producción rápida de energía, pero tambiénforman parte de las estructuras fundamentales de las células y componentes de numerosasrutas metabólicas. También son tan importantes porque pueden unirse a proteínas y lípidosformando un sistema de información necesaria para los procesos vitales. En esta práctica seidentificarán las características químicas importantes de un grupo de monosacáridos ydisacárido.

ObjetivoIdentificarcarbohidratosreductores,monosacáridos,disacáridosydeterminarsisetratadeunaaldosaocetosa.Materialporequipode4-5personas16Tubosdeensayede13x100PinzasparatubosdeensayeGradillaSustanciasReactivodeFehling,soluciónAysoluciónBReactivodeBarfoedReactivodeSeliwanoffEquipoEmpleadoBañodeaguaa>60ºCProcedimientoReaccióndeFehlingInstaleunbañodeaguaatemperaturaporarriba60°C.1.Coloqueensugradilla4tubosdeensayede13x100,numérelosdel1al4.2.Agregue1mLdelazúcarcorrespondienteacadatuboyagregueacadatubo0.5mLdelreactivoAy0.5mLdelreactivoBdeFehling.3.Coloquelostubosalmismotiempoenelbañodeagua.4.Unavezqueaparezcaelprecipitadocaracterísticodecolorrojoladrillo,enlamayoríadelostubos (le lleva de 1-3minutos), saque todos los tubos del baño de agua almismo tiempo. Sialgúntubonohadadoelprecipitadodespuésdecincominutosquieredecirquelareacciónconelcarbohidratoenesetuvofuenegativa.5.Anotesusresultadosenlahojadedatos.Lostubosconreacciónpositivaseránlosquecontienencarbohidratosreductores.

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6.Laveinmediatamentelostubos.ReaccióndeBarfoed1.Repitaelpaso1delareacciónanterioryanexeotrotuboconteniendo1mLdelcarbohidrato2con1mLdelcarbohidrato4.Nouselosmismostubosaunqueyaesténlavados.2.Agregue1mLdereactivodeBarfoedacadatubopreparadopreviamenteconazúcares.3.Coloquelostubosalmismotiempoenelbañodeagua.Espere hasta 10min., observe cuidadosamente la observación del precipitado. El precipitadoserá menos grueso que en la reacción anterior. Anote los tiempos de aparición de losprecipitados. Los tubos positivos a la prueba en 3 min. serán los que tienen carbohidratosmonosacáridos. Los tubos positivos en 5 min. o mas serán los que contienen carbohidratosdisacáridos.Observe detenidamente lo que pasa en su tubo 5, en cuanto aparezca el primer precipitado,saque el tubo y filtre. El filtrado vuélvalo a colocar en agua hirviendo por 10min. hasta queaparezca un nuevo precipitado. De acuerdo a los resultados, verá que esta reacción puededetectarmonosacáridosydisacáridosenmezcla.ReaccióndeSeliwanoff1.Coloqueensugradilla5tubosdeensayeynumérelos.2.Agregue0.5mLdelazúcaracada.3.Agregue2.5mLdelreactivodeSeliwanoffacadatubo.4.Coloquelostubosalmismotiempoenelbañodeagua.5.Observelaaparicióndelcoloryeltiempo.Aqueltuboqueseapositivoseráelquecontienecetohexosas.6.Anotesusresultadosenlahojadedatos.RegistrodeResultadosReaccióndeFehling

Tubo Reaccion+/- Tiempo

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ReaccióndeBarfoed ReaccióndeSeliwanoff

Tubo Reacción+/- Tiempo

Cuestionario

1. PodríausarlapruebadeSeliwanoffparadistinguirsacarosadefructosa?Porquésioporquéno?

2. Sitengotresfrascos,unodeglucosa,otrodemanosayotroconfructosa.Alostreslesañadohidróxidodesodio0.05N.Quéobtengocomoproductoencadaunodelostrestubosyporqué?

3. En el laboratorio había un frasco rotulado lactosa+fructosa y otro rotulado conglucosa+ribosa,perolasetiquetassecayeronyahoranosesabecualfrascotienecualmezcla.Quésepuedehacerparaetiquetarloscorrectamente?

4. EscribaelfundamentodelasreaccionesdeFehling,BarfoedySeliwanoff.BibliografíaProcedimientotomadoymodificadode:EvaIrmaVéjarRivera.PrácticasdeBioquímicaDescriptiva.(2010).Coleccióntextosacadémicos#51.UniversidaddeSonora.México

Tubo Reacción+/- Tiempo

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HidrólisisdelalmidónLaboratoriodeQuímicaConceptosarevisar:Polisacárido,CelulosayalmidónComplejoyodo-almidónIntroducciónLos polisacáridos son polímeros de carbohidratos sencillos unidos por enlacesglucosídicos.Desusentidadesque locomponen,muchosdeellossemantienencomono reductores y solo el residuo terminal, si semantienede forma reducida. Entre loshomopolisacáridosimportantesparalasplantasexistendos,unadeellaseslacelulosayel segundoesel almidón. Losalmidones sepresentan como reservade carbohidratosprincipalmenteentubérculoscomolapapa,semillas,rizomasyfrutas.Sealmacenaenforma de granos esféricos u ovalados. Se encuentra conformado por una mezcla demoléculas de amilosa y amilopectina. Ambas son poblaciones de moléculas dediferentestamaños.

Figura1.Estructuradelalmidón.(a)serepresentalaamilosa.(b)serepresentalaamilopectinayen(c)serepresentalareddegránulosdealmidón.EsquematomadodeLehninger,PrincipleofBiochemistry,2000.ObjetivosdelaprácticaObteneralmidónengranosapartirdepapaObservarlosgranosdealmidónalmicroscopioObservardelareversibilidaddelcomplejoyodo-almidónMedirlahidrólisisácidadelalmidónMaterialporequipode4-5personas11Tubosdeensayede13x100

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PinzasparatubosdeensayeGradillaPapadetamañomediano(Provistaporelalumno)Peladordepapa(Provistaporelalumno)Rayadordequeso(Provistaporelalumno)Placaconpozos1/dosequipos.GasadobleVidrioderelojpipetaserológicaPro-pipetaMicropipetade1000µLPuntasparamicropipetade1000µLVasodePrecipitadode250ml,1L.SustanciasReactivodeFehling,soluciónAysoluciónBSolucióndeYodoSolucióndelugolEquipoBañodeaguacaliente90ºCProcedimientoOBTENCIONDELALMIDON1.Peselapapaaliniciodelapráctica,pelelapapayráyelaconunrayadordequeso,demaneraque la pulpa fina que se obtenga caiga en el vaso de precipitado de 600 mL. (esto deberealizarseconrapidezparaevitarlaoxidacióndelapulpa).2.Agregueaguadestiladaalapulpa,masomenoseldobledesuvolumenyagitefuertemente,porunosminutosutilizandounavarilladevidro.3.Conlagasadoble,oconunpañuelodetejidonomuycerrado,filtreapretandosiesnecesariohacia el vaso de precipitados de 250 mL. La parte gruesa que queda en el filtro y que esfundamentalmentecelulosa,sedescarta.4. Deje unos minuto a que el filtrado se asiente. Una vez asentado, descarte el aguasobrenadanteylaveelalmidón,agregandonuevamentesuficientecantidaddeaguadestiladayagitandoporunosminutos. Sedeja asentar. Laoperación sepuede repetir una vezmasparaobtenerunalmidónlimpio.5. Decante finalmente, lo más posible de agua y extienda el almidón en un vidrio de relojmediano(previamentepesado,pararegistrarelpesodelvidriodereloj).Lléveloala“ESTUFA”a60ºC,pormediahora.Yaseco,peseelvidrioderelojconelalmidónyregistreelpeso.LoquesehaobtenidoenestapartesonlosGRANOSDEALMIDON.OBSERVACIONALMICROSCOPIO1.Deunasuspensióndelalmidóndeaproximadamenteel2%enaguadestilada.(0.5gen25mLdeagua).sirvaenunvasodeprecipitadoalrededorde5mL.2. Coloque sobre la plancha térmica y caliente un poco, teniendo cuidado que no llegue aebullición.3.Conelagitadortomeunagotadelasuspensiónycolóquelaenelcentrodeunportaobjetos,añadaunagotadelugol.

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4.Pongaelcubreobjetossobrelapreparaciónypresioneligeramenteparaeliminarelexcesodeagua.Sequelosbordesconunpocodetoallaabsorbente.5.Observelapreparaciónalmicroscopioconelobjetivosecoydébil.Dibujealgunosgranosqueobserve.6.Porotrolado,coloqueunarebanadadelgadadelapapaenunportaobjetos,tiñaconlugolypongauncubreobjetos,finalmenteobservealmicroscopio.COMPLEJOYODO-ALMIDON1.Pipetee0.5mLdelasolucióndealmidónsolubleal1%auntubodeensayede13x100.2.Agregue3gotasdesolucióndeyodo0.1N,sielcolordelcomplejoestenue,agregueunagotamás.Elcolordelcomplejodebeserdeunmoradooscuro.3. Prenda la lámpara de alcohol. Tome el tubo de ensaye con pinzas y páselo lentamente yrepetidamentesobrelallama,teniendocuidadodequelabocadeltuboapuntehacianohayanadie.4.Anoteel tiempo requeridopara la desaparicióndel color. Lleveel tuboal agua corriente yanoteeltiemporequeridoparaqueaparezcanuevamenteelcolor.Loqueacabadepasareslareversibilidaddelcomplejoyodo-almidón.Anotesusresultados.HIDRÓLISISACIDADELALMIDON1.Coloqueensugradilla10tubosdeensayede13x100ynumérelos.Enunvasodeprecipitadosde50mLcoloque30mLdeunasolucióndealmidón1.5%.Añada15gotasdeácidoclorhídricoconcentradoyagitesuavemente.2.Conunapipetatome200uLdeellaycoloqueenlaplacadelpozo#1y2mLaltubo1.3.Pongaacalentar lasoluciónyanoteeltiempoenque lasolucióncomienzaahervir.Enesemomentotome200uLycolóquelaenelpozo#2y2mLeneltubodos.4. A los dosminutos exacto de haber comenzado a hervir la solución; repita la operación detomar200uLycolóquelaenelpozo#3y2mLeneltubo3.Repetirlaoperaciónhastacumplirlos10pozosytubos.5.Acontinuación,enlaseriedetubosobtenidosdacada2min.,agregueunoauno0.5mLdelreactivoAy0.5mLdelreactivoBdeFehling.6. Ponga sus tubos en un baño de agua caliente. Espere 5min. Saque los tubos y ordene deacuerdo a su numeración. Observe el grado de reducción por la cantidad de precipitado deóxidocuprosodecolorrojoladrilloencadatubo.Estareaccióneslahidrólisisácidadelalmidón.7.Enlospozosreveleconunasgotasdeyodo.Anotesusresultados.Obtencióndelalmidón Pesoengramoslapapaentera:______delalmidónqueseobtuvo:___________Calculeelrendimientodealmidónenporcentaje:_______Observaciónalmicroscopio Objetivoutilizado:_____

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Objetivoutilizado:_____Complejoyodo-almidón Tiemporequeridoparadecolorarlasolución:____________ Tiemporequeridoparareaparecerlacoloracióndelasolución:____________HidrólisisácidadelalmidónPozo colordelcomplejo Tubo Precipitado (+)o(-) (+)o(-)1 _______________ 1 __________2 _______________ 2 __________3 _______________ 3 __________4 _______________ 4 __________5 _______________ 5 __________6 _______________ 6 __________7 _______________ 7 __________8 _______________ 8 __________9 _______________ 9 __________10 _______________ 10 __________Cuestionario

1. ¿Para que se agrega solución de lugol a la preparación del almidón cuando se va aobservaralmicroscopio?

2. ¿Quéotrasmanerashaydehidrolizaralalmidón?Expliquecondetalle?3. ¿EnquécondicioneselalmidóndaríalapruebadeFehlingpositiva?

BibliografíaProcedimiento tomado y modificado de: Eva Irma Véjar Rivera. Prácticas de BioquímicaDescriptiva.(2010).Coleccióntextosacadémicos#51.UniversidaddeSonora.México.

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Determinacióndelípidostotalesdediferentesórganosdepolloycuantificacióndecolesterol

LaboratoriodeQuímicaConceptosarevisar:Clasificacióndelípidos,solubilidaddelípidos.Introducción Los lípidos son constituyentes importantes de las membranas biológicas y por sunaturaleza hidrofóbica son solubles en solventes orgánicos como éter, cloroformo y etanolabsoluto. Semejora la solubilidadmientras el solvente seamenos polar y conmayor cadenahidrofóbica. Ladistribuciónde los lípidosen losdiferentesórganosestáen correlación con lafunciónquedesempeñaenelorganismo.Así,elcerebroseráelórganoquemás lípidosposeequetodos losdemásórganos.Enocasiones,deacuerdoalmetabolismoquerealizanasícomosusfunciones,serálacantidaddelípidocomoconstituyente.

Los grupos funcionales de algunos lípidos pueden reaccionar con soluciones y/oreactivos inorgánicoscomobases,ácidosoanhídridos,ypuedenformarcompuestoscoloridosproductode las reaccionesquímicas.Estoofreceunaventajayaqueeldesarrollodelcoloresdirectamenteproporcionalalacantidaddelproducto.DeestamanerasedesarrollóelMétodode Liebermann-Burchard para la cuantificación de colesterol, desde 1885, retomado muchosaños después por Kenny en 1952. Su vigencia continúa hoy en día y sus aplicaciones en lacuantificacióndecolesterolensuerosiguenpatentes.ObjetivoExtraerlípidostotalesendiferentesmuestrasdeórganosdepolloycuantificarcolesterolenlosextractos.MaterialesporgrupoMuestrasdetejidodepollo:corazón,hígado,músculo,cerebro,pulmonesyriñones.ESTOSORGANOSSEOBTENDRÁNALMENOS1DÍAANTESDELAPRÁCTICA.1Celdadecuarzo.Materialesporequipode4-5personas1mangoconnavajadebisturí.Papelaluminio5Pistilosparahomogenarenmicrotubos2pipetasde5ml2propipetas1parrilladecalentamiento2vasodeprecipitadosde1lt2tubosde15mldevidrio.1gradillametálica.1termómetrodemercurio.1flotadoresparamicrotubos.1micropipetade1ml1micropipetade100 µl

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Bañoaguaenvasodeprecipitadosde1litro Sustancias50mldecloroformo:etanolabsoluto,2:1,fríoporequipo.Cloroformoenfriadopreviamenteenhielo.AnhídridoAcético.H2SO4concentrado.Solucióndecolesterol:0.0547gen10mldecloroformo.EquipoEspectrofotómetroUV-VisProcedimiento:Tomarfragmentosdetejidodeaproximadamente0.5cm3decadaunoypesarlos.1.Homogenadodelosórganosdeestudio.Agregar 700 µl del solvente cloroformo:etanol frío a cada tubo de microcentrífuga con elfragmentodetejidoensuinterior.Realizarelhomogenadodecadaunodelosórganoseneltubodemicrocentrífugaconayudadelpistilodeplástico,hastalograrlamayordestruccióndeltejido.Cerrarlosmicrotubos.2.Evaporacióndelsolventeyconcentracióndeloslípidos.Centrifugartodoslosextractosa3000rpmdurante5min.PesarnuevosmicrotubosyregistrarlospesosdecadaunoPasar los sobrenadantes a los tubos nuevos y limpios QUE DEBIERON SER PESADOSPREVIAMENTE.Tenerelbañomaríapreparado,pasarlossobrenadantesoextractosdelípidosdelpasoanterior,enlostubosaevaporarenelbañomaríasobreunflotadordetubos.Dejarsecartotalmenteelsolvente.3.Determinacióndeloslípidos.Pesarcadaunodelostubosdespuésdelpasodeevaporaciónyregistrarelcambioenpeso.Eseseráelcontenidodelípidostotales.4.DeterminacióndecolesterolPrepararunbañomaríaconlaparrilladecalentamientoyelvasodeprecipitadosconagua,paratenerloa37°C.Agregar1mldecloroformofríoacadaunodelostubosdemicrocentrífugaconelextractodelípidostotalesobtenidosynocalientes.Agitarsuavementemoviendoeltubopararesuspenderydisolver los lípidos.Agregar0.2mldeanhídridoacéticoa cada tubo,mezclar suavementeydejarreposar3min.Cuidarporquelareacciónsubeaproximadamente2°C.Enseguida agregar 0.02 ml de H2SO4 concentrado. Cuidar porque la reacción subeaproximadamente8°C.Mezclarydejarreposarenelbañoa37°Cparaeldesarrollodelcolordurante30min.Cuidardelaluz.Preparareltubodecolesteroldeconcentraciónconocidadelasiguientemanera:Pesar 0.0547gde colesterol ydisolverlo en10mlde cloroformo.Posteriormentepreparar lasolucióndetrabajodecolesterol,diluyendo1:50concloroformo.Estasolucióncontendráen1ml=250mg/100mldecolesterol.Meterareaccionar1mldeladilución1:50comoenlospasosanterioresdelasmuestrascon0.2ml de anhídrido acético, reposar 3 min, enfriar y agregar 0.02ml de H2SO4.Mezclar y dejarreposarenbañomaríaa37°Cdurante30min.

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Leerlacantidaddecolorenunespectrofotómetroa430nm.RegistroderesultadosCalcularenbasealalecturadeltubodetrabajodecolesterol,lacantidadcontenidadecadaunodelosextractos.Prepararuncuadroógráficaconlosdatosdelascantidadesdecolesterolobtenidas.DiscusiónCómoseexplicalasdiferenciasenlascantidadestotalesdeloslípidosydecolesterolextraídos,deacuerdoalmetabolismoquellevanacabo.ConclusionesAnotatusconclusionesdelosresultadosyqueimportanciatienelapráctica(aplicaciones).Cuestionario

1. ¿CuáleselprincipiodelareaccióndeLiebermann-Burchard?BibliografíaNathM.C.,ChakravortyM.K.ChowdhuryS.R.(1946).Liebermann-Burchardreactionforsteroids.Nature157:103-104.Prácticatomadayoptimizadade:ManualdeprácticasdelaboratoriodeInvestigaciónBiológicaII.UniversidadSimónBolivar.2010.

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Separacióneidentificacióndeaminoácidosporcromatografíaenpapel.Conceptosarevisar:Clasificacióndeaminoácidos,solubilidadypolaridaddelosaminoácidos.Principiosdelacromatografíaenpapel,¿Quéeslaninhidrina?,¿QuéesRf?.IntroducciónLacromatografíaesunmétodofísicodeseparaciónenelqueloscomponentesqueserequierensepararsedistribuyenentredosfases,unadelascualesestáenreposo(faseestacionaria,F.E.)mientrasquelaotra(fasemóvil,F.M.)semueveenunadireccióndefinida.1Existen diferentes modalidades de cromatografía, una de ellas es en gas. Sin embargo, lasdiversastécnicasparalaseparacióndemezclassefundamentanenlaquímicasdelasmoléculasquepresentanafinidadesdiferentesdelassubstanciasdelmediomóvil(yaseagasolíquido)yelmedioestacionario(paple,gelatina,alúminaosílice)atravésdelcualtienenquecircular.ObjetivoRealizarunacromatografíadeaminoácidosenpapelyidentificaraminoácidosdeunamezclaMaterialporgrupoSolucióndeaminoácidos50mM:Aspártico,Leucina,triptófanoyglicina.SolucióndehidróxidodeamónicoSolucióndeninhidrinaal0.05%.Mezclaproblemadeaminoácidos.Materialporequipode4-5personasPapelWhatmanparacromatografía.Lápizyregla.Micropipetaypuntasparamicropipeta.EquipoCámaradecromatografía.ProcedimientoDeterminacióndeaminoácidosporcromatografíaCuando se trabaja la cromatografía depapel, sedebe tenermucho cuidadoenelmanejodelpapel,esnecesarioelusodeguantesdesechablesparanoimprimirhuellasdigitalesenelpapel,queporlagrasaquetienen,dificultaríaellibreflujodesolventesysolutos.1.EnunpapelWhatman1,conmedidas200x200mm.conlápiz,traceunalíneahorizontaladoscentímetrosdeunode losbordesdelpapel,queseráel inferior.Enesa líneamarque4-5puntosequidistantesa1.5o2cm.2. Cargue la mezcla problema en la posición 1 depositando 15 uL de ella en dos ocasionesesperandoqueseque lamuestraentrecadadepósito.En lassiguientesposicionescoloque lasmuestrasdeaminoácidosconocidosunoencadapuntoseñaladosenelpapel,ytratededejarlamuestrahomogéneamente,laexpansióndelamarcadelamuestranodebesermayordemediocentímetrodediámetro.

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1.UniversidaddeAlcalá.Biomodel,Cromatografía.3.Consumocuidado,coloqueelpapelenlacámara,cuandoydelamaneraqueelinstructorseloindique.4.Sedejaascenderelsolventehastaquealcancelapartesuperiordelatiradepapel.5.Saquedelacámaraelpapel,einmediatamentetraceconunlápizunalíneahastadondellegóelsolvente.Dejesecarelpapel,alairelibre.Reveladodelasmuestrasenelpapel1.Unavezsecoelpapel,cuélguelodealgúnsoporteconveniente,cubralaparteposteriorconalgún cartón, y rocíelo con el revelador preparado por el instructor. No debe quedar nimuymojado,niinsuficientementehúmedo.2.MarqueconlápizlasmanchasreveladasensuscentrosycalcularsusRfs.3. Calcule los Rfs de sus muestras y espere a que sus compañeros terminen, para poderdeterminarlosaminoácidosquetienenpresenteslasmezclasproblema.Cromatografía:Rfdeaminoácidos:Manchayaminoácido1Rf=___________________Manchayaminoácido2Rf=___________________Manchayaminoácido3Rf=___________________Manchayaminoácido4Rf=___________________Rf1delamezclaproblema:_________________Rf2.________________Con los datos de Rfs de los aminoácidos estándar de sus compañeros logró identificar losaminoácidosdelasmanchasdesuproblema?Cuestionario

1. Quéfuncióndesempeñalacelulosadelpapelenestesistemadecromatografía?2. Cuáleslafasemóvilycuallaestacionariaenestacromatografía?3. DefinabienelconceptodeRfysuutilidad?4. Qué se puede hacer cuando, en un sistema de cromatografía, dos compuestos no se

puedensepararporteneridénticosRfs?BibliografíaPrácticatomadayadaptadade:JesúsV.JorrínNovo,MaNievesAbrilDíaz,JoséA.BárcenaRuiz.Separacióndeaminoácidosporcromatografíaencapafinaydetecciónmediantereacciónconninhidrina.DepartamentodeBioquímicayBiologíaMolecular,CampusUniversitariodeRabanales,EdificioSeveroOchoa,14071-Córdoba,Argentina.

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Extracción,cuantificacióndeproteínas.LaboratoriodeQuímicaConceptosarevisar:Métodosparacuantificarproteínasporespectrofotometría.Principiodelosmétodosparacuantificarproteínas.IntroducciónLas proteínas son la expresión final de cualquier gen. De manera genérica las proteínas seclasifican de acuerdo con diferentes criterios: naturaleza química, función celular y sulocalización celular, entre otras. Existen proteínas específicas que caracterizan a cualquierórgano y e conjunto son las que mantienen las propiedades e identidades a als células dedeterminados órganos. Por ejemplo, las neuronas del sistema nervioso central, estaránexpresandoproteínasdemembranaconocidascomorecepetoresdeneurotransmisoresquenoson expresadas en hepatocitos o células del hígado. Esto quiere decir que una cantidad deproteínas totalesdeunórganoesdiferenteaotroórganodandouna“huella”proteicaque loidentifica.Elusodetécnicasexperimentalesparaelestudiodelasproteínas,pasaporunaseriedepasos.Elprierodeelloseslaextraccióndeproteínas.Generalmente,elmedioobufferdeextracciónsepreparadeacuerdoconlosinteresesdeestudio.Porejemploshayqueconsiderarsisetrataráde una evaluación enzimática o solo la evaluación de la presencia de proteínas tal cual porejemplo,entreotroscasos.En resumen, en esta práctica se extraerán y cuantificará las proteínas presentes en unasmuestrasdetejidovegetal.ObjetivoExtraerycuantificarproteínasdediferentesmuestrasvegetales.MaterialporgrupoCeldadecuarzoMaterialporequipode4-5personasMuestrasparaextraccióndeprot:Piña,papaya,fresa.Gradillaparamicrotubosymicrotubosde1.5mLMicropipetasde1mL100y10µLPuntasparamicropipetasVidrioderelojBisturí3PistilosparahomogenarenmicrotubosSustanciasReactivodeBradford100ml:10mg de Azul Coomassie G-25 disolver en 5mL EtOH 95%. Agregar 10mL de ac. Fosfórico (al85%)yaforara100ml.Protegerenfco.Ambar.Solucióndealbuminade0.1mg/mLSoluciónsalina0.9%

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EquipoEspectrofotómetroUV-VisProcedimientoExtraccióndeproteínas1.Fragmentarcadamuestraconbisturísobrevidriodereloj.Pasarunaporcióndeestetejidoauntubode1.5mL(alamitaddelaregióncónicadeltubo)yagregar500µLdesoluciónsalina.2.Introducirelpistiloycomenzarelhomogenadodeltejidoenelinteriordelmicrotubo,hacerloenfríolamayorparte.3.Centrifugarloshomogenadosa8000rpmdurante5min.4.Tomarelsobrenadantedecadaunoypasarloauntubolimpioymantenerenfrio.5.Preparardosdilucionesdelextractoproteico:1:10y1:100enunvolumenfinalde500µLdesolsalina.Prepararlosextractosdeacuerdoalsiguientecuadro:

Concentración Muestras(µL) Agua(µL) Bradford(µL)

1:10 5 47.5 5001:10 50 25 5001:100 5 47.5 5001:100 50 25 500

6.Agitarbienelcontenidodelostubos,dejarlosreposar10min.7.Leerlaabsorbanciadecadaunoa595nm.8.Guardarlosextractosencongelacióna-20°Cparautilizarlosenlasiguientesesión.Prepararlacurvapatrón1.Paralapreparacióndelacurvapatróndealbúmina,de1µg/µLdisueltaenaguadeacuerdoalsiguientecuadroporduplicado.

Concentraciónalb(µg)

Estandaralb(µL)

Agua(µL) Bradford(mL)

1 1 99 12 2 98 14 4 96 18 8 92 116 16 84 132 32 68 1

BLANCO - 100 12.Agitarbienelcontenidodelostubos,dejarlosreposar10min.3. Leer la absorbancia de cada uno a 595 nm. Sacar el promedio de lecturas de cadaconcentracióndealbúmina.

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4. Elaborar la gráfica lineal de absorbancia vs concentración de albúmina utilizando lospromedios.ResultadosReportarlosresultadosdelapráctica,elaborandolagráficadelacurvapatróndealbúminaenExcel.Calcular laecuaciónde lagráfica.Despejarde laecuación. Interpolardeesamanera lasconcentracionesdeproteínasde lospromediosde losdiferentesvolúmenesde lasdiluciones,delosextractosdelostejidos.Mencionaraplicacionesdeestaspruebas.ConclusionesEscribebrevementelasconclusionesdelapráctica.Cuestionario

1. ¿Quéotrométodoexisteparalacuantificacióndeproteínasycualessuprincipio?Referenciabibliográfica1.BradfordMM.Arapidandsensitivemethodforthequantificationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebiending.AnalBioch1976;72:248-254.