1.Manipulacin de la expresin gnica en bacteriasEl objetivo principal de la ingeniera gentica con fines industriales es lograr la correcta expresin a altos niveles del gen clonado en el microorganismo husped elegido. Sin embargo, la clonacin directa (sin manipulacin adicional) de un gen en un vector normal (como el pBR322) no suele asegurar que nuestro gen de inters se vaya a expresar bien, sobre todo cuando procede de especies alejadas filogenticamente. Por esta razn hay que proceder al diseo de vectores especializados y a menudo a modificaciones del gen de inters, con objeto de que este pueda transcribirse y traducirse bien en el microorganismo husped. He aqu algunos de los elementos que conviene manipular para este fin:Naturaleza de las secuencias de inicio y final de la transcripcin (promotores-operadores, terminadores)

Seales para el comienzo de la traduccin, especialmente sitios de unin del ribosoma y codn de inicio de la traduccin

Eficiciencia de la traduccin, lo que puede obligar a utilizar codones sinnimos adaptados a la abundancia de los correspondientes ARNt del husped

Estabilidad de la protena en la clula husped

Localizacin celular de la protena a expresar: en muchos casos interesa que la protena se secrete, por lo que el diseo gentico debe incluir seales de procesamiento postraduccional adecuadas. Otras veces interesa que la protena se quede en el espacio periplsmico de la bacteria Gram-negativa husped, o que se retenga en el citoplasma

Nmero de copias del gen clonado. Cuando se pretende que el gen se exprese a alto nivel, se suele escoger un plsmido de control relajado, es decir, con gran nmero de copias, mientras que si interesa un nivel bajo de expresin se escoge un plsmido de control estricto (poco nmero de copias) o se recurre a integrar el gen de inters en el cromosoma

Cada vez que queramos clonar y expresar un gen, debemos ajustar especficamente muchos de estos parmetros, construyendo vectores de expresinad hoc, escogiendo las cepas huspedes, etc. Se trata de una labor que frecuentemente es bastante ardua, y que pone en juego una gran cantidad de conocimiento de biologa molecular y de pericias tcnicas.Uno de los microorganismos huspedes ms usados es nuestro viejo amigo, el colibaciloEscherichia coli, probablemente el ser vivo ms estudiado a nivel molecular, y del que se dispone de una vasta batera de mtodos de manipulacin genticain vitro. Pero para muchos experimentos se debe recurrir a otros huspedes, comoBacillus subtilis, la levaduraSaccharomyces cerevisiae, o incluso clulas de insectos o de mamfero.Antes de entrar en detalles, hagamos un retrato rpido de lo que debe tener un vector de expresin enE. coli(se citan los elementos genticos siguiendo el orden desde el lado 5 al lado 3):Un promotor eficiente, dotado de las regiones conservadas 35 (TTGACA o parecida) y 10 (TATAAT o parecida)

A corta distancia del promotor, una regin que al transcribirse suministre el sitio de entrada al ribosoma: la denominada secuencia de Shine-Dalgarno, que es complementaria del extremo 3 del ARNr 16S

A unos 3-11 pb aguas abajo de la secuencia de Shine-Dalgarno, debera situarse el codn ATG que seala el comienzo de la traducccin del ARNm. Este codn lo puede suministrar el gen a clonar, o bien el vector puede disponer de ese codn, seguido de alguna diana que permita la insercin del gen a expresar

Finalmente, y situado al lado 3 de todo lo anterior, una secuencia que funcione como terminador de la transcripcin (que en su forma de ARN constituye la tpica horquilla por emparejamiento intracatenario, donde la ARN polimerasa se desliga del ARN recin formado).

A continuacin abordaremos algunos ejemplos de estrategias usadas en la manipulacin de la expresin gentica en bacterias (sobre todoE. coli).1.1Promotores fuertes y regulablesEn principio, uno podra pensar que si queremos expresar un gen a alto nivel, deberamos escoger un promotor fuerte y constitutivo. Sin embargo, la mayor parte de las veces no conviene usar tal tipo de promotores, porque al estar expresando permanentemente el gen de inters a alto nivel, pueden sustraerse recursos para el normal crecimiento de las clulas. Esto es especialmente delicado si la protena fornea tiene efectos negativos para el huped. Por lo tanto, lo normal es emplear promotores regulables, que el investigador puede conectar y desconectar a voluntad. Una estrategia habitual es aquella en la que se cultiva la bacteria recombinante hasta que se logran grandes densidades, momento en que se suministra la seal para que el promotor se active y transcriba el gen insertado.1.1.1Ejemplos de promotores regulablesLos promotores regulables deE. colique se emplean en los vectores de expresin ms habituales son promotores fuertes pero que bajo ciertas condiciones estn reprimidos por las correspondientes protenas represoras, lo que suministra la base para inducir o desreprimir el gen adyacente a voluntad.1.1.1.1Derivados del promotor lacEl promotor del opern de la lactosa (lac) ha servido para disear elementos de control de expresin en numerosos vectores. Mientras en el medio no exista lactosa (o un inductor apropiado), el promotor est reprimido por el represor (producto del genlacI). En el laboratorio, la induccin se suele lograr aadiendo al medio un inductor gratuito (que a diferencia de la lactosa, no se metaboliza, pero se une al represor, inactivndolo). Ejemplo de inductor gratuito es el IPTG (isopropil-b-D-tiogalactsido). Para que el promotorlacse exprese a alto nivel, tenemos que evitar la represin catablica: en ausencia de glucosa la protena CAP se une con AMPc, y el complejo se une cerca del promotor, ayudando a la ARN polimerasa a comenzar la transcripcin.En los vectores de expresin se suele emplear un promotorlacmutante, conocido comolacUV5(con una sustitucin en la regin 10), que es ms potente que el promotor silvestre. Por supuesto, esta variante es reprimible por LacI e inducible por IPTG.1.1.1.2Derivados del promotor trpEl operntrpcontiene los genes estructurales que determinan las enzimas para la sntesis del triptfano. Su promotor se ve reprimido, en presencia del triptfano en el medio, por el complejo represor-triptfano. Si no hay triptfano disponible, el represor queda inactivo, y por lo tanto el operntrpse transcribe. En los vectores basados en el promotortrp, la expresin se logra en medio sin triptfano, mientras que se reprime en presencia del aminocido, o aadiendo el compuesto cido 3-indol-acrlico.1.1.1.3Promotor hbrido artificial tacEn los aos 80 se dise un promotor artificial combinando la regin 35 del promotortrpy la 10 del promotorlac, ponindole de nombre promotortac. Dicho promotor result ser 5 veces ms potente que el detrpy 10 veces ms que el delac. A semejanza del promotor delac, eltaces inducible por IPTG y reprimible por glucosa. Se ha usado mucho en vectores de expresin de alto rendimiento. Se llegan a alcanzar niveles de protena recombinante del 10-30% de la total.1.1.1.4Promotores derivados del fagolSe puede usar un sistema de expresin regulable consistente en el promotor PLdel fagoly su represor cI. En la prctica se recurre al represor mutante cI857, que es un mutante termosensible (ts). De esta manera, podemos cultivar la bacteria recombinante a una temperatura moderada (30C) a la que el represor impide la transcripcin del gen de inters. Cuando el cultivo alcanza la densidad deseada, subimos la temperatura hasta 42C, lo que inactiva al represor, y se logra la expresin a alto nivel de nuestro gen desde el promotor PL1.1.1.5Promotor del fago T7El promotor del fago T7 necesita la ARN polimerasa especfica del mismo fago, por lo que si queremos expresar genes bajo ese promotor, hay que clonar simultneamente el gen de la polimerasa de T7. Normalmente este gen de la polimerasa se inserta en el cromosoma deE. colio en el profagol(la versin insertada del cromosoma dellen las clulas lisognicas) y bajo el control del promotor delac. Entonces se procede a transformar las clulas con la construccin gentica dotada del gen de inters aguas abajo del promotor del T7. Cuando aadimos el inductor IPTG, se induce el gen de la polimerasa de T7, protena que transcribe a gran nivel el gen que hemos clonado.1.1.2Un ejemplo de plsmido de expresin de alta eficienciaEl plsmido pPLc2833 era ya un buen plsmido de expresin, pero vamos a ver cmo, a partir de l, se construy otro an mejor.El pPLc2833 cuenta con un mdulo pensado para clonar genes bajo el control del promotor PLdel fagol: tras el PLexiste un polilinker, es decir, un trecho de ADN dotado de mltiples dianas nicas para las respectivas enzimas de restriccin (lo que permite usar cada vez la enzima ms adecuada a nuestro experimento). Este plsmido presenta unas 40 copias por cromosoma. Para lograr una expresin a mayor nivel, se sustituy su origen de replicacin por el origen de replicacin de otro plsmido, llamado pKN402, de modo que el nmero de copias se puede aumentar unas 8 veces incubando la bacteria a 42C. De esta forma se obtuvo el plsmido mejorado pCP3. Para su uso correcto, las clulas que albergan derivados de pCP3 con genes clonados bajo el promotor PLse cultivan primero a 28C, y una vez alcanzada una buena densidad, la temperatura se sube hasta 42C, con lo que el nmero de copias sube hasta unas 700. A esa temperatura, el represor termosensible cI(ts) se inactiva, por lo que el promotor PLfunciona a su mximo rendimiento, y se logran altos niveles de la protena codificada por el gen clonado.Para hacerse una idea de la eficiencia de este sistema de expresin, baste decir que cuando se clon el gen de la ligasa de T4 en el pCP3, nada menos que el 20% de la protena total a 42C era ligasa de T4. (A ttulo comparativo, la protena natural ms abundante deE. colisupone el 2% de la protena total).1.1.3Otros sistemasEl uso de promotores que se activan al bajar la temperatura presenta la ventaja de que la protena se pliega mejor, con lo que se evitan los problemas de la formacin de cuerpos de inclusin. El promotor mejor caracterizado es el decspA, aunque tiene el incoveniente de que se inactiva al cabo de 1-2 horas, tiempo demasiado corto para los fermentadores.Recientemente ha recibido atencin el sistema de la arabinosa, que ha sido comercializado por Invitrogen. Usa el azcar arabinosa, que es barato, siendo la fuerza del promotor dearaBADms dbil que la de loslac.1.1.4Sistemas de expresin adaptados a la gran escalaLos sistemas de expresin que hemos estudiado hasta ahora son muy buenos ... a escala de laboratorio de investigacin, pero presentan el problema de que resultan caros y complicados si los queremos usar a escala industrial (donde manejamos volmenes de cientos de litros de cultivo):Los sistemas basados en protenas termosensibles plantean el problema de que cuando queremos aumentar la temperatura en un gran fermentador, esto requiere bastante tiempo (hasta 1 hora), y sobre todo, un gasto de energa importante.

En los sistemas que se inducen con inductores como el IPTG, el problema es econmico: no sera rentable aadir la cantidad adecuada de este tipo de sustancias a un gran fermentador.

Para solucionar estos inconvenientes, se dise un sistema de expresin ms barato, con dos plsmidos:Uno de los plsmidos es de bajo nmero de copias, y lleva la parte codificadora del gen del represor cI bajo el control del promotortrp. (El uso de un plsmido de control estricto del nmero de copias garantiza que no se va a producir un exceso de molculas de represor.

El segundo plsmido lleva el gen a expresar bajo el control del promotor pL.

Sabiendo cmo funcionan los elementos genticos implicados, es fcil deducir el comportamiento del sistema:En ausencia de triptfano en el medio, el promotor deltrpest activo, y se producen molculas de represor cI. Este represor se une al promotor pLdel otro plsmido, y reprime la transcripcin de nuestro gen, por lo que no se produce protena.

En presencia de triptfano, se reprime la transcripcin del gen cI desde el promotortrp. Al no producirse represor cI, el gen clonado en el segundo plsmido se puede expresar (desrepresin).

En la situacin real de un fermentador, las cosas ocurren de la siguiente manera:Al principio, la bacteria se cultiva en un medio barato a base de melazas e hidrolizados de casena, que contiene poco triptfano libre, de modo que nuestro gen clonado no se expresa, porque est reprimido por cI.

Una vez que el cultivo se hace denso, se aade al medio triptona (un hidrolizado de protena rico en triptfano). Entonces, al bloquearse el gen cI, queda desreprimido el gen clonado, con lo que se pueden producir grandes cantidades de la correspondiente protena. (Se han logrado niveles de 20% de protena recombinante respecto de protena total).

Para la produccin a gran escala lo ideal sera un promotor que no requiera induccin externa, y que por lo tanto haga el sistema ms barato y automtico. El del genpho(fosfatasa alcalina) puede ser bueno, ya que se induce cuando se produce limitacin de fosfatos, al final del crecimiento. Los rendimientos mejoran cuando al mismo tiempo se muta la protena sensora de fosfato PhoS (PtsS), con lo que se logra la induccin del promotor a una mayor concentracin de fosfato, y prolonga el periodo de produccin. Por lo tanto, se puede adaptar a un fermentador con alimentacin continua de fosfato sin que se reprima el promotor dephoA.1.2Protenas de fusinCuando uno intenta expresar genes en huspedes heterlogos es frecuente encontrarse con el hecho de que la protena buscada se degrade, con lo que se obtienen bajos niveles tiles. Para solventar este problema, uno de los trucos consiste en lograr protenas hbridas, de fusin, en las que nuestra protena heterloga (o la parte funcional que nos interesa) est unida covalentemente con una protena estable del propio husped, lo que la protege del ataque de proteasas de ste.Para conseguir estas protenas de fusin, hay que hacer una construccin gentica en la que unimos, en la adecuada fase de lectura, un gen del husped con el gen que queremos expresar. Veamos brevemente los elementos importantes de un vector especializado para obtener protenas de fusin enE. colique queden expuestas al exterior desde la membrana externa:Porcin terminal 5 del genompFque codifica una protena de membrana externa. Este segmento suministra las seales de comienzo de la transcripcin y de la traduccin, as como las seales para que la protena viaje hasta la membrana externa.

Inmediantamente despus, una versin truncada del genlacZ, desprovista no solo del promotor, sino carente de los codones correspondientes a los ocho primeros aminocidos. A pesar de ello, se podra sintetizarb-galactosidasa funcional en el caso de estar en fase la secuencia que acabamos de describir. Otra caracterstica de estelacZes que su protena es capaz de funcionar incluso cuando va fusionada en su extremo amino-terminal con otra protena.

La situacin relativa entre el extremo 5 delompFy el gen modificado delacZen el vector original es tal que este ltimo no est en fase correcta. Por lo tanto, el vector no codificab-galactosidasa.

Ahora bien, si clonamos un gen entreompFylacZde modo que todos queden en fase, se producir una protena tri-hbrida consistente en el extremo de OmpF fusionado con nuestra protena, que a su vez va fusionada con lab-galactosidasa. Los clones recombinantes que sinteticen esta protena tri-hbrida se pueden identificar fcilmente porque tienen actividadb-galactosidasa, detectable como colonias azules en placas provistas de galactsido artificial cromognico X-gal.

La protena tri-hbrida se puede usar para dos fines:Como antgeno para producir anticuerpos frente a la porcin proteica que hemos expresado con el gen clonado

Como medio para aislar pequeas porciones importantes de nuestra protena.

El elemento Flag se compra a una empresa en forma del vector, previsto para su uso en la levaduraSaccharomyces cerevisiae. Este elemento determina un pptido de ocho aminocidos, cuya secuencia es Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys. Imaginemos que queremos expresar en levadura el gen de la interleucina 2 (IL-2), una citoquina de gran valor teraputico. Pues bien, insertamos dicho gen a continuacin del elemento gentico de Flag. La levadura recombinante produce y secreta la protena hbrida, que no se degrada. Por otro lado, el pptido Flag nos va a facilitar la tarea de purificar en un solo paso nuestra protena de inters, por cromatografa de afinidad:Se prepara una columna cromatogrfica a base de un soporte sinttico (como polipropileno) al que se une anticuerpo monoclonal especfico frente al pptido Flag

Se hace pasar el extracto o sobrenadante de la cepa recombinante por la columna. La protena hbrida que nos interesa queda retenida (al engarzarse con el anticuerpo), mientras que las restantes pasan de largo.

Para eluir la protena recombinante, se lava la columna con un tampn bajo en calcio.

Aunque la IL-2 recombinante provista de los 8 aminocidos de Flag en su extremo N-terminal es funcional, las autoridades sanitarias obligan a eliminar ese pptido, cosa que se hace tratando el hbrido con una proteasa especfica (enteroquinasa intestinal bovina).

Esto ltimo nos ilustra el principio de que para satisfacer los estndares de seguridad y calidad, las protenas recombinantes logradas como hbridos deben ser despojadas de las porciones del elemento de fusin. Por ello, los elementos de fusin suelen ser secuencias reconocidas por proteasas especficas que cortan en la juntura entre dicho elemento y la protena de inters, sin atacar a esta.1.3Manipulacin de factores que afectan a la traduccinComo se sabe, no todos los ARNm se traducen con la misma eficiencia. Uno de los factores que condicionan esta eficacia diferencial es la presencia, al comienzo del ARNm, de una secuencia (de 6 a 8 bases) que se puede emparejar con otra secuencia complementaria situada en el extremo 3 del ARNr 16S. As pues, el ARNm, para que sea traducido bien debe contar con este sitio de unin al ribosoma (RBS en siglas inglesas, tambin conocido como secuencia de Shine-Dalgarno), que suele consistir en 5-UAAGGAGG-3. Por esta razn, muchos vectores de expresin enE. colise han diseado para dotar al gen clonado de una secuencia de este tipo, con objeto de que su ARNm se traduzca eficientemente. Aparte de esto, hay que tener presente otras consideraciones:Debe existir una cierta distancia (en torno a 8 bases) entre la secuencia de Shine-Dalgarno y el codn AUG que seala el comienzo de la traduccin

El segmento inicial del ADN que contiene la secuencia de Shine-Dalgarno y los primeros codones del gen clonado debe ser tal que, una vez transcrito, el ARN no forme emparejamientos intracatenarios. Es decir, a nivel de ARN ese segmento debe de carecer de la capacidad de formar estructuras secundarias en horquillas, que dificultan el acceso de los ribosomas.

Otro factor que puede condicionar la eficiencia de traduccin deriva del hecho de que nuestro gen de eleccin tenga un sesgo de codones diferente al del organismo husped, es decir, tenga abundantes codones para los que el anfitrin no disponga de suficiente nivel de los correspondientes ARNt. (Por ejemplo, de los cuatro codones para Gly, el GGA se usa poco enE. coli, pero mucho en humanos; por lo tanto, si queremos expresar un gen humano con abundantes codones GGA en esta bacteria, nos podemos encontrar que la traduccin es poco eficiente, debido a la escasez de ARNt que reconozca este triplete). Cuando se nos presenta un problema de este tipo de sesgo de uso de codones, lo nico que podemos hacer (aunque suele ser complicado) es sintetizar en laboratorio una versin sinnima de nuestro gen en la que los codones estn optimizados al uso del husped.1.4Mejora de la estabilidad de la protenaCada protena tiene una vida media tpica, que puede ser de unos pocos minutos o de varias horas. A tal estabilidad colabora la presencia de puentes disulfuro y de ciertos aminocidos en el extremo N-terminal. A menudo la simple modificacin que aade un determinado aminocido a ese extremo de una protena a expresar es suficiente para conferirle una mayor estabilidad. Por supuesto, las protenas de gran vida media se acumulan en la clula, y por lo tanto aumentan los rendimientos del producto recuperado.1.5Resolucin de los problemas de los vectores multicopiaMuchos vectores derivan de plsmidos de control relajado: los derivados de ColE1 tienen de 15 a 60 copias. La serie pUC llega a presentar varios cientos de copias por clula. Los derivados p15A estn en unas 15 copias. En ausencia de presin selectiva se pierden (10-5-10-6por generacin) como resultado de multimerizacin. Pero cuando se clonan genes cuyos productos son txicos u originan una gran carga metablica, o cuando las clulas se cultivan en continuo a altas densidades, las prdidas son mucho mayores. El uso de antibiticos para mantener la presin selectiva presenta desventajas, entre ellas la contaminacin del producto o la biomasa con el antibitico. Se han diseado alternativas a esto, entre ellas el uso de plsmidos que ocasionan la muerte celular al perderese. Pero tienen el inconveniente de que introducen restricciones en el diseo de los medios de cultivo e introducen carga metablica adicional. Para saltar estas desventajas, se ha diseado el siguiente sistema:Cepa husped con un gen cromosmico condicionalmente esencial bajo el control del promotor-operador delac

Un plsmido acompaante multicopia que lleva el operador delac

La titulacin (secuestro mayoritario) del represor LacI por los numerosos operadores delacorigina la expresin del gen cromosmico (de resistencia a kanamicina) y el crecimiento selectivo de clulas portadoras del plsmido en medio con el antibitico.

En muchos casos es deseable y ms rentable una produccin no demasiado alto, aunque estable. Para elo se puede intentar recurrir a vectores con menos copias o a integracin cromosmica.1.5.1Plsmidos de mediano nmero de copiasLos plsmidos de medio nmero de copias tienen entre 5 y 20 por clula. Se han construido vectores a partir de varios plsmidos naturales:RK2 (del grupo IncP). De amplio espectro, son de control estricto, autotransmisibles y presentan entre 10-15 copias por cromosoma. Los miniplsmidos derivados de RK2 se han mostrado estables durante 200 generaciones en algunos pseudomonas en ausencia de presin selectiva, pero pueden ser mucho menos estables en otras bacterias.

RSF1010 (grupo IncQ). De amplio espectro, autotransmisibles, presentan unas 20 copias por clula.

1.5.2Plsmidos de bajo nmero de copiasTienen entre 1-5 copias por clula. Se ha construido un vector derivado de F, que presenta las siguientes caractersticas:9 kb de F con elementos necesarios para la replicacin y la estabilidad segregacional:Los orgenesoriV, oriSaseguran replicacin especfica del ciclo celular,

el locus de reparto permite ese reparto equitativo a clulas hijas,

el genrepDrecombina los dmeros hasta monmeros

los genesccdmatan cualquier segregante que pierda el plsmido.

Mdulo de clonacin para la expresin:Promotor dearaBADy genaraCpara una expresin inducible por arabinosa

Sitio de clonacin mltiple

Terminadores de transcripcin

Este plsmido es estable en ausencia de presin selectiva, tiene una expresin gnica bien controlada e impone una pequea carga metablica.1.5.3Integracin cromosmicaA menudo es mejor intentar expresar el gen a clonar desde una localizacin estable en el cromosoma del husped, evitando que se replique por medio de plsmidos. Una vez insertado en el cromosoma, el gen puede quedar all de forma estable durante muchsimas generaciones sin necesidad de recurrir a presin selectiva.La integracin debe lograrse en un sitio del cromosoma que no sea esencial. Para que nuestro gen se integre en determinado sitio del husped, debemos hacer una construccin gentica en la que el gen vaya unido a secuencias homlogas del husped, con objeto de favorecer la recombinacin. Veamos un resumen de mtodo para clonar genes por integracin en cromosoma:1. Hay que identificar un sitio adecuado para la integracin (o sea, un lugar que sepamos que al romperlo no vamos a afectar las funciones celulares normales).2. Aislamos y clonamos todo o parte de ese sitio cromosmico.3. Asociamos nuestro gen favorito (provisto de un promotor regulable) al sitio clonado para la integracin. Esto lo podemos hacer de dos modos:a. Nuestro gen lo hemos insertado dentro del sitio de integracin clonado, por lo que tendremos un sandwich de dos trozos del sitio de integracin enmarcando a nuestro genb. Insertamos nuestro gen de modo adyacente al ADN clonado de integracin4. Transferimos nuestra construccin gentica a las clulas huspedes. Para ello la construccin gentica va formando parte de un plsmido que no puede replicarse en el husped (vector suicida).5. Se aplica la presin selectiva que permita recuperar y multiplicar los transformantes buscados. Obviamente, con estas condiciones, la propagacin del gen clonado slo tiene lugar si se ha integrado en el ADN cromosmico de las clulas.Si hemos hecho la transformacin usando un plsmido que lleva el gen interrumpiendo el sitio de integracin clonado [caso a) de la fase 3) citada arriba], los dos segmentos separados de ADN del sitio de integracin suministran sendos lugares de homologa respecto del cromosoma, con lo que se puede producir un doble sobrecruzamiento que lleva a la integracin de nuestro gen.Si hemos transformado con el plsmido en el que nuestro gen est adyacente al ADN clonado del sitio de integracin (caso b), un simple sobrecruzamiento entre este y la regin homloga del cromosoma conduce a la integracin de todo el plsmido, incluyendo nuestro gen de inters.Otra manera de lograr inserciones en lugares cromosmicos predeterminados es mediante un sistema en dos pasos que se ha ensayado con xito enBacillus subtilis:1. insertamos un gen marcador de resistencia a antibiticos en un lugar no esencial del cromosoma (empleando la lgica que hemos descrito ms arriba, en la que el gen interrumpe secuencias del husped previamente clonadas), seleccionando transformantes resistentes a ese antibitico.2. ahora transformamos con un segundo plsmido suicida en el que tenemos a nuestro gen interrumpiendo las mismas secuencias clonadas del husped usadas en la fase 1). Un doble entrecruzamiento entre dichas secuencias y las homlogas del husped nos elimina el gen marcador mientras que nos inserta nuestro gen.Si repetimos la anterior, pero usando en cada caso secuencias clonadas diferentes del hospedador, lo que obtenemos es una cepa que lleva varias copias de nuestro gen insertadas en diferentes lugares del cromosoma.1.6Carga metablicaYa antes hemos aludido a los efectos negativos de carga metablica que suele acarrear la introduccin y expresin de ADN forneo en el organismo husped. Esto se puede deber a una variedad de factores:Gran nmero de copias o gran tamao del vector

Limitacin de oxgeno disuelto en el medio

La gran produccin de la protena fornea puede agotar las reservas de ciertos aminoacil-ARNt (e incluso de ciertos aminocidos) y drenar a la clula de su energa

Si la protena del gen clonado se expresa a alto nivel y se exporta desde el citoplasma hasta la membrana o el periplasma, puede producir atascos en los sitios de exportacin, con lo que dificulta la localizacin correcta de protenas del husped.

Las propias protenas forneas pueden tener efectos negativos interfiriendo con el husped, generando efectos txicos, etc.

Con un buen diseo experimental, se pueden disminuir los efectos de la carga metablica, mejorando los rendimientos de protena recombinante y mejorando la estabilidad de las clulas transformadas. Por ejemplo:Muchas veces es mejor usar un vector de bajo nmero de copias, e incluso no emplear plsmidos, sino sistemas de integracin cromosmica de nuestro gen (vase la seccin que dedicamos a esta cuestin)

Usar promotores fuertes pero regulables, de modo que durante la mayor parte del crecimiento tengamos a nuestro gen desconectado, pero que lo induzcamos o desreprimamos al llegar el cultivo a cierta densidad celular

Siempre que sea posible, adaptar los codones de nuestro gen al sesgo peculiar de uso de codones de nuestro husped. Ello puede suponer tener que construir un gen sinttico que sea sinnimo del original, pero adaptado al husped.

Para evitar los problemas de falta de disposicin de oxgeno, se ha diseado un sistema en el que se expresa la hemoglobina deVitreoscillaenE. coli, lo que incrementa la concentracin de ribosomas y ARNt al final de una fermentacin de 30 horas.Al final de cuentas, y de cara a la produccin industrial, es mejor el rendimiento que se logra con un husped que produce un modesto 5% de protena fornea pero que puede alcanzar densidades en el fermentador de 40 g de peso seco por litro, que el que se lograra con un 15% de eficiencia en protena fornea pero con una densidad de solo 10 g de peso seco de biomasa por litro.2.Ingeniera gentica de levaduras2.1Aspectos generalesLa clonacin en bacterias ha permitido obtener a escala industrial algunas protenas recombinantes, especialmente de inters teraputico. Sin embargo, no siempre las protenas de origen eucaritico se producen adecuadamente en huspedes procariticos, ya que a menudo son inestables o carecen de actividad biolgica. Por otro lado las protenas recombinantes obtenidas en bacterias, a pesar de haber sido cuidadosamente purificadas, pueden venir acompaadas de pequeas cantidades de sustancias bacterianas contaminantes, que pueden tener efectos pirognicos (induccin de fiebre). Por todas estas razones, la ingeniera gentica ha desarrollado otros sistemas, principalmente eucariticos, que salven al menos algunos de estos obstculos. En este sentido, las levaduras presentan una serie de ventajas:Son eucariotas, y por lo tanto ms semejantes a las clulas de los organismos superiores que los procariotas (por ejemplo, sus mecanismos de secrecin)

A diferencia de las bacterias, producen cierto tipo de modificaciones postraduccionales en las protenas (glucosilaciones en ciertos aminocidos, eliminacin de la metionina inicial, rotura proteoltica de un precursor inactivo, etc.), lo que puede hacer que las protenas heterlogas de organismos superiores puedan alcanzar su actividad biolgica (aunque esto no siempre est garantizado)

A semejanza de ciertas bacterias, la levaduraSaccharomyces cerevisiaees muy fcil de manejar con mtodos microbiolgicos

S. cerevisiaeest muy bien estudiada al nivel gentico y molecular. No slo se puede realizar gentica clsica (mutagnesis y recombinacin meitica, alternancia de ciclo haploide y diploide), sino que cuenta con herramientas avanzadas de ingeniera gentica, y su genoma se secuenci totalmente en 1996

Desde hace decenios, las levaduras se cultivan a escala industrial, y participan en multitud de procesos biotecnolgicos. Adems, cuenta con la calificacin oficial de organismo reconocido como seguro (GRAS), indispensable para poder usarlo en obtencin de sustancias para consumo humano

Por todo ello, las levaduras son los huspedes eucariticos de clonacin ms fciles de usar, y una buena alternativa para intentar la produccin industrial de protenas de inters. (Sin embargo, debido a que las levaduras poseen un sistema desplicingdiferente y menos efectivo que el de eucariotas superiores, si queremos expresar estos genes, hay que recurrir no a la versin genmica, sino al ADNc tras retrocopia del correspondiente ARNm maduro).Existen varios mtodos artificiales para introducir ADN exgeno en levaduras:Obteniendo protoplastos en medio hipertnico y mezclndolos con el ADN en presencia de una sustancia fusognica como el polietilenglicol (PEG)

Tratando clulas completas con sales de litio, seguido de mezcla con PEG y ADN, con choque trmico para estimular la transformacin

Por electroporacin: el ADN entra en las clulas tratadas con cortos pulsos de corriente elctrica.

Igualmente existe multitud de tipos diferentes de vectores, cada uno con una serie de caractersticas apropiadas para fines concretos. En general, los vectores de levadura, aparte de secuencias de levadura, contienen tambin secuencias de vectores bacterianos, previstas para su amplificacin y manejo sobre todo enE. coli.Por esta razn se suelen calificar como vectores bifuncionales o lanzadera (porque permiten pasar del husped bacteriano a la levadura, y viceversa). Daremos solo una breve lista de las principales clases de vectores y sus rasgos ms notables:Vectores integrativos (YIp): suelen contener un gen silvestre de levadura, lo que permite que el vector se inserte, por recombinacin homloga, con secuencias homlogas de la levadura husped. No se suelen emplear para la expresin de genes heterlogos

Vectores de replicacin autnoma basada en componentes cromosmicos (YRp)Vectores con secuencias de replicacin autnoma (ARS): suelen ser vectores inestables, por lo que no tienen inters industrial

Vectores YCp con ARS y secuencias centromricas (CEN): al disponer de secuencias de centrmeros de levadura, se segregan mejor a las clulas hijas, por lo que son ms estables, aunque se siguen perdiendo poco a poco, por lo que tampoco son demasiado tiles para la expresin a escala industrial

Cromosomas artificiales de levadura (YAC): son vectores que cuentan con una secuencia ARS, una secuencia CEN y dos secuencias telomricas (TEL). Estn previstos para insertar grandes trozos de ADN (de ms de 100 kb). No se usan como vectores de expresin, sino como vectores de gran capacidad a la hora de generar genotecas de organismos complejos y preparar la secuenciacin (por ejemplo, los llamados megaYACs han sido muy tiles en el Proyecto Genoma Humano).

Vectores basados en el crculo de 2mm de levadura: se trata de vectores que se aprovechan de un plsmido natural deS. cerevisiae, conocido simplemente como crculo de 2mm (por su tamao). Es un plsmido crptico (no codifica funciones fenotpicas aparte de su propia replicacin) existente en algunas cepas (cepas cir+) que se encuentra en unas 50 a 100 copias en el ncleo, constituyendo una especie de minicromosoma estable. Los vectores incorporan algunas de las secuencias del 2mm implicadas en su replicacin y mantenimiento.

La manipulacin gentica deS. cerevisiaeha permitido obtener molculas y procesos de gran inters comercial, sobre todo en el mbito clnico.2.2Sistemas de expresin enSaccharomyces cerevisiae2.2.1Expresin directa (sin secrecin)Veamos un ejemplo que ilustre algunos aspectos de cmo lograr expresin directa (sin excrecin al medio) de un gen heterlogo eucaritico, el ADNc de la superxido dismutasa humana citoplsmica que requiere cobre y zinc (Cu/Zn-SOD). Se fabric un plsmido lanzadera con las siguientes caractersticas:Secuencias para manejo enE. coli: un gen de resistencia a ampicilina (ApR) y un origen de replicacin derivado de pBR322

Un gen para seleccionar transformantes en levadura: el gen LEU2, de modo que cuando el plsmido entra en una determinada cepa auxotrofaleu2, la convierte en prototrofa (crece en medio mnimo carente de leucina)

Secuencias derivadas del crculo de 2mm, para la replicacin del plsmido enS. cerevisiae

El ADNc de nuestro gen (el de la Cu/Zn-SOD), emparedado entre secuencias para el comienzo y el trmino de la transcripcin en levadura. En esta ocasin se escogieron secuencias sealizadoras procedentes del gen GAPD (gliceraldehido-fosfato deshidrogenasa) de la propia levadura. Hay que tener en cuenta que los promotores de levadura son diferentes a los procariticos, e incluyen secuencias activadoras a cierta distancia de la porcin codificadora. Estas secuencias, llamadas a menudo UAS (upstream activating sequences) se parecen funcionalmente a los potenciadores o intensificadores (enhancers) de los eucariotas superiores.

Cuando se transform una levaduraleu2con este plsmido, se aislaron transformantes prototrofos en medio mnimo. Como el promotor del gen GAPD es constitutivo, la protena humana de Cu/Zn-SOD se expresaba continuamente, a grandes niveles. Adems, la levadura haba realizado una modificacin similar a las de la protena nativa de humanos, la acetilacin en el grupo amino de la alanina N-terminal.La mayora de vectores de expresin actuales recurre, sin embargo, a promotores de genes inducibles, como los de la respuesta al choque trmico, o el GAL1 y el GAL10 que se inducen 1000 veces en presencia de galactosa.2.2.2Expresin y secrecinSi la protena que queremos expresar debe ir glucosilada, el gen debe clonarse de modo que el producto se secrete, ya que en levaduras solamente las protenas secretadas son modificadas de esta manera. Para ello, debemos unir al lado 5 de nuestro gen las secuencias responsables del procesamiento y secrecin del factorade la levadura (el factoraes una especie de feromona para el cruce entre clulas haploides de sexos opuestos). De este modo, la protena de fusin es reconocida por el sistema de transporte y secrecin deS. cerevisiae, de modo que se corta el pptido seal del precursor del factora(llamado pre-pro-a), y se excreta la protena recombinante al medio. Este fue el sistema que permiti expresar y secretar en levadura la hirudina, protena anticoagulante de inters clnico procedente de la sanguijuelaHirudo medicinalis.2.3Sistemas de expresin en otras levadurasAunque, como hemos visto, ha habido xitos en la expresin de protenas enSaccharomyces cerevisiae, existe una serie de problemas a la hora de lograrlo a escala industrial:En los grandes volmenes del fermentador, existe una gran frecuencia de prdida de los plsmidos, incluso cuando usamos promotores inducibles que solo se activan al final

La protena heterloga excretada suele tener un patrn de glucosilacin diferente al de la original. Concretamente, existen oligosacridos a base de ms de 100 manosas, mientras que las protenas naturales no suelen pasar de las 10 manosa por cada aminocido modificado.

A veces, la protena, en vez de secretarse, se queda en el espacio periplsmico.

Por todo ello, se ha intentado desarrollar sistemas de expresin en otras levaduras, comoKluyveromyces lactis, Pichia pastorisyHansenula polimorpha.P. pastorisse ha usado desde 1984 para producir unas 300 protenas recombinantes. Es una levadura metilotrfica ascomictica que se us durante un tiempo para producir protena unicelular para piensos, en un proceso desarrollado por la empresa Phillips Petroleum. En los aos 80, esta empresa transfiri a otra empresa californiana (SIBIA) su sistema de expresin gentica, sistema que est disponible comercialmente para investigacin a travs de la compaa Invitrogen.Las ventajas de este sistema son las siguientes:Ventajas derivadas de las caractersticas metablicas de esta levadura:Gran preferencia por el metabolismo respiratorio, lo que permite cultivos ms densos que otras levaduras

Modificaciones postraduccionales mejores que los deS. cerevisiae: procesamiento proteoltico, glucosilacin y formacin de puentes disulfuro

Altos rendimientos de protena, normalmente superiores a los sistemas de baculovirus y de clulas de mamfero

Muy altos niveles de secrecin de protena heterloga, con apenas secrecin de protena nativa

Sistema fcilmente escalable a escala industrial

Sistema ms barato y ms rpido que los de eucariotas superiores

El sistema original de expresin enP. pastorisest basado en el promotor de uno de los genes de la alcohol-oxidasa. La alcohol-oxidasa cataliza la primera reaccin de la ruta de degradacin del metanol, al oxidarlo hasta formaldehido y perxido de hidrgeno. La reaccin tiene lugar en el peroxima, orgnulo que secuestran el perxido del resto de la clula. La alcohol-oxidasa tiene poca afinidad por el metanol, pero esto lo compensa esta levadura sintetizando grandes cantidades de la enzima, determinada por dos genes,AOX1, AOX2. El producto del primero representa ms del 90% de la actividad total. El promotor deAOX1est fuertemente regulado e inducido por metanol, pero est reprimido en otras condiciones, como hambre de carbono. La protena representa hasta el 5% del total de protena soluble durante la induccin con metanol. Por lo tanto, el promotor era un buen candidato para la expresin controlada de genes heterlogos: es posible cultivar la levadura recombinante durante la mayor parte del tiempo en una fuente de carbono no inductora como la glucosa o el glicerol; cuando se alcanza una densidad buena, se aade metanol para la induccin de la expresin del gen clonado. Este sistema, disponible comercialmente y de fcil uso, ha permitido expresar ms de 400 tipos de protenas, desde endostatina humana hasta protena de tela de araa.Veamos un ejemplo concreto: la produccin de antgeno de superficie del virus de la hepatitis B:Se clon el gen del antgeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) entre las seales de inicio y trmino de transcripcin del genAOX1deP. pastoris.

Se dise un plsmido lanzadera previsto para la integracin cromosmica de la construccin gentica, y cuya porcin de levadura consista (en este orden):Mdulo de expresin promotor deAOX1-gen HBsAg-terminador deAOX1

Gen marcadorHIS4(para seleccionar transformantes en el auxotrofohis4)

Secuencias del genAOX1correspondientes a la porcin no codificante distal (en 3)

Con este plsmido se transform una cepa auxotrofahis4. El diseo del vector es tal que, al carecer de secuencias de mantenimiento en la levadura, la nica manera de que se originen los transformantes es por recombinacin. Un doble entrecruzamiento por recombinacin homloga en el que, por un extremo participen las secuencias de promotor, y por el otro las secuencias en 3 del genAOX1significa la integracin del mdulo levadura del plsmido, incluyendo el gen silvestreHIS4y la construccin de expresin con el gen de HBsAg, pero con ello interrumpimos el genAOX1silvestre. La seleccin de este evento se hace en:medio mnimo sin histidina, para seleccionar la integracin del genHIS4

con metanol: las colonias que han integrado el mdulo y que inactivan el genAOX1endgeno crecen lentamente en metanol (porque tienen otro el otro gen, menos efectivo,AOX2)

Estos transformantes, cuando se crecen en metanol, sintetizan grandes cantidades del antgeno del virus de la hepatitis B, que se queda en el citoplasma. Un clon transformante lleg a producir el equivalente a casi 10 millones de dosis de vacuna cuando se cultiv en un recipiente de 240 litros. Adems, la construccin gentica era estable durante al menos varios das de cultivo.A pesar de lo anterior, este sistema de expresin presenta ciertas limitaciones, algunas de las cuales se estn resolviendo en los ltimos aos:1. El metanol que se necesita para la induccin supone cierto riesgo de fuego y puede no ser adecuado para producir protenas alimentarias. Por lo tanto, se necesitan promotores fuertes que no necesiten metanol para su induccin. Ya se cuenta con algunos:a. Promotor del gen de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAP). Suministra un alto nivel constitutivo de expresin en glucosa o glicerol. El inconveniente es que al ser constitutivo, puede no ser adecuado para expresar protenas que supongan efectos negativos para el hospedador.b. Promotor del genFLD1deP. pastoris, codificador de una glutatin-deshidrogensasa dependiente de formaldehido. Se puede inducir por metanol o por metilamina (una fuente inocua de N) en medios con glucosa. Los niveles inducidos de expresin con este promotor son parecidos a los del genAOX1en metanol.2. Se necesitan promotores de expresin moderada. Algunos ejemplos:2. Del genPEX8, que codifica una protena de biognesis del peroxisoma. Suministra expresin a bajo nivel sobre glucosa, y se induce moderadamente (unas 10 veces) cuando las clulas se pasan a metanol.2. Del genYPT1: confiere expresin baja pero constitutiva en glucosa, metanol o manitol1. Otra limitacin era la carencia de ms genes marcadores para seleccionar los recombinantes. Hasta hace poco, solo se dispona deHIS4, ARG4ySh ble(resistencia al antibitico zeocina). Ahora contamos con otros marcadores:ADE1, URA3.Otros sistemas de expresin en otras levaduras:Levaduras metilotrficas:Candida boidinii

Hansenula polymorpha

Pichia methanolica

Levaduras que usan lactosa:Kluyveromyces lactis

Levaduras usadoras de alcanos y de cidos grasos:Yarrowia lipolytica

3.Sistemas de expresin de baculovirusLos baculovirus son un tipo de virus que infectan artrpodos, especialmente insectos. Durante su infeccin, las partculas virsicas se empaquetan en unos grupos llamados cuerpos polidricos, que son cuerpos de inclusin localizados en el ncleo celular, compuestos mayoritariamente de la protena poliedrina. La poliedrina se sintetiza en grandes cantidades al final del ciclo infectivo, pudiendo llegar a suponer el 50% del total proteico de la clula.El genoma de los baculovirus consta de una molcula circular de ADN de c.d., de un tamao de entre 88 y 200 kb. Aunque los poliedros se necesitan para la infeccin, no se requieren para mantener el cultivo celular infectado. Por lo tanto, el gen de la poliedrina es dispensable y puede hacerse hueco en esa parte del genoma para manipulacin gentica. Como el genoma es demasiado grande para manupular directamente, se recurre a lo siguiente:El ADN heterlogo se inserta en un vector intermedio llamado de transferencia, sin capacidad infectiva, que es un vector con secuencias deE. coli(para hacer las manipulaciones fcilmente en la bacteria), y que lleva el eficiente promotor de la poliedrina, tras el cual se inserta el gen de inters.

Se co-transfectan clulas de insecto con el vector que lleva el ADN clonado y con ADN virsico no recombinante.

Tiene lugar la recombinacinin vivoentre el vector de transferencia y secuencias del genoma virsico, con lo que se generan genomas recombinantes que se pueden seleccionar y uar para producir la protena de inters.

Presentan las ventajas de que las protenas forneas se expresan a alto nivel, experimentando modificaciones postraduccionales similares a las de mamferos. El coste de produccin es superior al de levaduras, pero menor al de usar clulas de mamferosSe ha logrado adaptar lneas celulares de insectos a algunos de los requerimientos habituales de la produccin a gran escala, incluyendo la resistencia a la agitacin de los fermentadores

Hoy da ya se pueden usar cultivos de clulas de insectos en biorreactores parecidos a los empleados con los microorganismos

Se han hecho avances en diseo de medios de cultivo ms sencillos y baratos, que no necesitan suero. Todo ello permite el escalado, esencial para la produccin de grandes cantidades de protenas teraputicas recombinantes

Una de las aplicaciones ms importantes de los baculovirus derivados de cultivos de clulas de insectos es su uso como insecticidas biolgicos selectivos y seguros, que se emplean sobre todo en lucha biolgica e integrada frente a plagas que afectan a bosques

4.Ingeniera de protenasLa ingeniera de protenas es uno de los mbitos ms novedosos y prometedores de la ingeniera gentica. Mediante este conjunto de tcnicas se alteran genes de modos racionales para modificar la estructura de protenas. Una de las modalidades es realizar mutagnesisin vitrosobre el ADN clonado, introduciendo mutaciones puntuales en sitios predeterminados, deleciones, etc. Si estas tcnicas se unen al mayor conocimiento de la estructura y funcin de las protenas, se puede uno dirigir a alterar aminocidos concretos que afectan a propiedades fisicoqumicas o alostricas. Se puede, p. ej., lograr modificar el estatus nutricional de las protenas, o aumentar su estabilidad ante condiciones de pH, temperatura, etc.