1. Tecnologa Mdica, Universidad de Chile Curso de Citopatologa 2013 MFP&CDManejo de muestras citolgicas para estudios de citologa pulmonarPresentador: Kenneth Walker B.

2. INTRODUCCIN El examen citolgico de las vas respiratorias es con frecuencia la tcnica diagnstica inicial para pacientes con sntomas respiratorios o una anormalidad pulmonar. La mayor parte del diagnstico citolgico pulmonar implica el estudio de las vas respiratorias inferiores o distales. Debido a la complejidad de las vas respiratorias y la diversidad de las localizaciones para las distintas lesiones, se han desarrollado una gran variedad de tcnicas. 3. La citologa respiratoria se utiliza principalmente para la bsqueda de clulas neoplsicas o de signos que delaten enfermedades con potencial neoplsico. Adems es muy til en la investigacin de una serie de enfermedades incluyendo infecciones oportunistas, tuberculosis, enfermedad por oficio (Ej: Asbestosis) y el rechazo de trasplante pulmonar. 4. BIOSEGURIDAD El personal del laboratorio corre especial riesgo por exposicin a material infeccioso voltil. Deben protegerse de este riesgo mediante el uso de mscaras con filtro, guantes y batas. El lugar de procesamiento debe estar equipado con una zona dedicada al trabajo con materiales de riesgo biolgico. Un requisito es la campana de extraccin. 5. CONTENIDOS Expectoracin (Esputo) Lavado bronquial Cepillado bronquial Puncin pulmonar percutnea Agentes oportunistas en muestras citolgicas 6. RESPECTO A LA CITOLOGA EXFOLIATIVA Cada una de las tcnicas utilizadas para la obtencin de muestras posee limitaciones, ventajas y una precisin diagnstica asociada. La precisin diagnstica puede ser optimizada mediante la seleccin de la tcnica ms adecuada para una situacin clnica dada. 7. EXPECTORACIN O ESPUTO La produccin espontnea de cantidades significativas de esputo suele indicar enfermedad pulmonar. El esputo se compone predominantemente de sustancias mucoides as como de un nmero variable de elementos de inflamacin y clulas epiteliales. Las variaciones en los nmeros de macrfagos, neutrfilos, clulas epiteliales y sus alteraciones morfolgicas pueden dar informacin valiosa sobre el proceso patolgico subyacente. Del mismo modo, el nivel de pigmentacin dentro de los macrfagos y la presencia o ausencia de espirales de Curschmann indican mucho sobre la fisiopatologa pulmonar subyacente. 8. Ej.: Espirales de CurschmannBronchial wash. Curschmann's spirals represent inspissated mucus that forms as a cast of a bronchiole. 20x 9. TOMA DE MUESTRA El diagnstico de las lesiones pulmonares es ptimo cuando la muestra proviene de los primeros esputos matutinos producidos espontneamente. Cuando es imposible reunir una cantidad suficiente de esputos producidos espontneamente, las muestras pueden ser inducidas por inhalacin de una solucin nebulizada compuesta de 15% de cloruro de sodio, con o sin un 20% de propilenglicol o con una solucin del 3%8% de cloruro de sodio tibia. 10. PROCESAMIENTO Una variedad de tcnicas han sido adoptadas para el procesamiento de las muestras de esputo siendo las ms populares las de ''Pick and smear'' o Untar y extender y la metodologa de Saccomanno. La tcnica de Untar y extender evita el uso de Carbowax y comienza con la inspeccin visual de las muestras frescas para la identificacin de hebras o manchas de material slido o sanguinolento. Se toman las partes ms representativas y otras seleccionadas al azar para llevarlos a fijacin inmediata con alcohol etlico de 95 o Cytospray. 11. Mtodo de procesamiento por Saccomanno. Las clulas se recogen en solucin de etanol de 50 y polietilenglicol al 2% (Carbowax). Tras la recepcin en el laboratorio, se utiliza un mezclador para emulsionar la muestra que posteriormente se centrifuga y se prepara como frotis. Se recomienda la realizacin de frotis adicionales en caso de resultados contradictorios con la sospecha clnica Estudios abalan al mtodo de Saccomanno como uno de los ms fehacientes. 12. MUESTRA ADECUADA Deben contener macrfagos alveolares. La ausencia de tales clulas indica la presencia de slo saliva. No hay un mnimo establecido para el nmero de macrfagos pero se recomienda una cantidad que sea fcilmente detectable por el microscopista. Greenberg postula la calidad de una muestra de esputo es directamente proporcional al nmero de macrfagos alveolares que contiene'' Una muestra de esputo debe ser lo suficientemente abundante para preparar de 2 hasta 4 frotis.Bardales et al. mostraron que la preparacin de cuatro frotis de una muestra de esputo aumenta considerablemente el rendimiento diagnstico. Sin embargo, tambin aumenta significativamente los costos. 13. Ej.: Muestra adecuada de esputoSputum. This sputum sample contains respiratory macrophages, a criterion of adequacy. 40x 14. LAVADOS Y CEPILLADOS BRONQUIALES Los cepillados y lavados bronquiales son tcnicas complementarias a la citologa de esputo en el diagnstico de lesiones pulmonares. Se realizan a travs de una broncoscopa. Las indicaciones ms frecuentes para la realizacin de una broncoscopa son la tos persistente, la documentacin radiogrfica de un ndulo pulmonar solitario, hemoptisis, obstruccin bronquial, atelectasia, etc 15. Las indicaciones para la obtencin de muestras a repeticin incluyen: Controversia entre citologa de esputo y citologa por lavado o cepillado. Ng y Horak demostraron que la sensibilidad diagnstica aumenta de un 70% a un 90% cuando se usan dos muestras citolgicas bronquiales en lugar de una. 16. BRONCOSCOPIO 17. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA Los lavados y cepillados se toman directamente de las reas clnicamente sospechosas. Los cepillados se obtienen por el uso de un pequeo cepillo de cerdas duras circular. Los cepillados deben obtenerse antes de cualquier biopsia para evitar excesivo oscurecimiento de la muestra por sangre. 18. CEPILLADO In Situ Los frotis se preparan inmediatamente rodando el extremo del cepillo sobre un portaobjetos. Los frotis se fijan inmediatamente con alcohol de 95 o Cytospray. Cualquier secado prolongado al aire antes de la fijacin dar lugar a graves artefactos. 19. En el laboratorio (transporte de muestra) El cepillo desechable se desarma desde su eje y se coloca en un tubo que contiene una solucin de sal equilibrada o solucin de Saccomanno y es transportado a al laboratorio. En el laboratorio, el cepillo se hace girar sobre dos portaobjetos. Los frotis se secan a T ambiente para aumentar la adhesin celular y se les aplica la tincin de Papanicolaou. El cepillo se coloca de nuevo en el tubo y se le somete a vrtice. El cepillo se deshecha y se hace una cito-centrifugacin para preparar frotis adicionales. 20. MUESTRA ADECUADA Debe contener un gran nmero de clulas epiteliales ciliadas bronquiales bien conservadas y macrfagos. Las muestras que contienen pocas clulas o estn fuertemente contaminadas y oscurecidas por un gran nmero de clulas escamosas orales o saprofitos orales deben considerarse insatisfactorias. De manera similar, las muestras en que los detalles celulares estn oscurecidos por la sangre, inflamacin, o artefactos de secado al aire, se deben considerarse insatisfactorias. 21. Ej.: Muestra adecuada de cepilladoBronchial brush. Polymorphonuclear leukocytes with macrophages and other material are present in the background. This may represent infection, chronic inflammatory conditions or other lung insults. 40x 22. PRECISIN DIAGNSTICA Pueden alcanzar una sensibilidad de hasta un 90% cuando se realizan mltiples cepillados durante una broncoscopa. Los mltiples cepillados disminuyen la necesidad de otros procedimientos ms invasivos. La sensibilidad depende de una serie de factores incluyendo la habilidad del endoscopista y la ubicacin, tamao, y tipo histolgico de la neoplasia o lesin buscada. 23. LAVADO BRONQUIOALVEOLAR Aunque es considerada una tcnica invasiva, el lavado broncoalveolar (BAL) puede ser utilizado con seguridad en pacientes en estado crtico. El BAL junto con la aspiracin con aguja fina, representan las nicas tcnicas citolgicas con que se pueden estudiar los contenidos y la composicin de los espacios areos ms terminales. Mientras que la citologa por aspiracin con aguja fina requiere de un objetivo localizado y circunscrito, BAL puede investigar con xito la enfermedad pulmonar difusa. 24. BAL es el ms ampliamente utilizado y eficaz en pacientes inmunodeprimidos para el diagnstico de infecciones oportunistas. Muchos microorganismos pueden ser diagnosticados mediante BAL en los frotis convencionales o con la ayuda de tinciones especiales. Si est indicado, el BAL puede usarse para cultivos microbiolgicos. BAL muestra rasgos especficos para las siguientes condiciones: Proteinosis alveolar, microlitiasis alveolar, presencia de clulas malignas, exposicin al asbesto, slice y talco. Para la mayora de las enfermedades pulmonares intersticiales no infecciosas, BAL muestra cambios no especficos y su valor diagnstico es controvertido. BAL puede proporcionar informacin pronstica til en algunos casos seleccionados. Ej.: Alveolitis fibrosante, donde un marcado aumento en los neutrfilos y eosinfilos se ha asociado con un alto riesgo de deterioro funcional, mientras que un alto porcentaje de linfocitos se correlaciona con una mejor sobrevida. 25. Ferruginous Body. Fibers of asbestos, or other minerals may be coated with ferroprotein creating a "ferruginous body". This structure is partially engulfed by a macrophage. 26. Mtodos semicuantitativos se han practicado para contar el nmero de macrfagos cargados de lpidos teidos con Oil Red, indicador usado para el diagnstico de neumona lipodea.Lipid. The lipid in cases of lipoid pneumonia may be highlighted by oil-red O stain. 27. LAVADO Mientras que las tcnicas de BAL difieren, se lleva a cabo generalmente bajo anestesia local con un broncoscopio de 5 mm. En la ausencia de una lesin localizada, el lbulo medio derecho suele ser seleccionado para muestreo debido a la conveniencia tcnica y su riqueza de fluidos y clulas. La cantidad de fluido usado y el nmero de alcuotas es importante debido a que estos factores influyen en el diagnstico citolgico. La primera alcuota se separa generalmente de las dems posteriores. Esta tcnica optimiza la separacin de las clulas epiteliales bronquiales del verdadero material alveolar. 28. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA La muestra de BAL debe ser transportada al laboratorio para ser procesada por un mtodo de filtracin o citocentrifugacin. Chamberlain et al. Sugiri que la tcnica de filtracin es superior a la citocentrifugacin. Si grandes cantidades de moco estn presentes, la mayora de los laboratorios hacen pasar la muestra a travs de una malla de nylon para atrapar los agregados de moco. Alternativamente, la muestra puede ser tratada con sputolysin. Luego el lquido se somete centrifugacin de baja velocidad (1.800 G) para obtener un pellet de clulas. Se resuspende en solucin salina, y las alcuotas (deberan contener alrededor de 100.000-200.000 clulas) una vez centrifugadas, se utilizan para preparar los frotis. Para la evaluacin de rutina se usa Papanicolaou. Tambin se tien los frotis con Grocott o Metenamina de plata para la identificacin de microorganismos. 29. MUESTRA INADECUADA El excesivo nmero de clulas ciliadas o escamosas epiteliales (mayor que un 5%) son indicativos de contaminacin por el material bronquial u oral, lo que indica que el espcimen puede no ser representativo de las porciones ms distales. Chamberlain et al. Sugiri criterios especficos para juzgar las muestras como insatisfactorias. Los criterios para el rechazo fueron: Escasez de macrfagos alveolares (Al menos 1 macrfago por campo) Nmero excesivo de las clulas epiteliales, ya sea mostrando cambios morfolgicos degenerativos o que excedan el nmero de macrfagos alveolares presentes Exudado mucopurulento de polimorfonucleares Numerosos eritrocitos en combinacin a los criterios anteriores Artefactos que oscurecen la identidad de la clula. 30. Ej.: Muestra adecuada de lavadoBronchoalveolar lavage. Low magnification showing an admixture of epithelial cells and macrophages. 20x 31. ASPIRACIN POR AGUJA FINA La aspiracin con aguja fina (PAAF) es una tcnica ampliamente utilizada para la citologa de patologas localizadas y es la tcnica ms eficaz para establecer un diagnstico definitivo de cncer de pulmn. La PAAF transtorcica es usada en el diagnstico tanto de tumores primarios como metastsicos. Tiene una sensibilidad diagnstica entre el 75-95%. la PAAF transtorcica percutnea se utiliza para la investigacin de ndulos pulmonares. 32. PAAF TRANSTORCICA PERCUTNEA En muchos centros, si la citologa de esputo es negativa y la lesin pulmonar est presente en la periferia o en el pice del pulmn, la PAAF transtorcica se realizar sin broncoscopa. En la mayora de los casos se utiliza una aguja Chiba o Greene de calibre 22 para la recogida. 33. PUNCIN La aguja fina se gua a la ubicacin deseada por imagenologa. Una vez que la punta de la aguja confirma estar en posicin, se retira el estilete y se ensambla una jeringa. Se aplica succin y la aguja se mueve rpidamente hacia delante y hacia atrs en la lesin objetivo. Una porcin de la muestra se expulsa al portaobjetos y se preparan los frotis. La evaluacin rpida mediante frotis debidamente fijados se realiza por Papanicolaou. Esta tcnica permite la realizacin de estudios especiales con el espcimen obtenido, incluyendo inmunocitoqumica, citometra de flujo, microscopa electrnica y cultivo microbiolgico. 34. CONTRAINDICACIONES DE PAAF La falta de cooperacin de un paciente en estado de inconsciencia, incapaz de controlar la tos, alteraciones de la coagulacin no corregibles, mala funcin pulmonar, cuadro de enfisema grave, etc... Las complicaciones asociadas con PAAF incluyen neumotrax, hemorragia intratorcica, hemoptisis y embolizacin de aire. La embolizacin de aire es una complicacin muy rara que puede ser fatal. 35. MUESTRA ADECUADA Williams et al. Demostraron que el 80 % de los cnceres pulmonares fueron diagnosticados dentro las dos primeras aspiraciones y todos los tumores malignos fueron detectados cuando se realizaron seis aspiraciones (anlisis de preparado inmediato). Si no se encuentran seales de un proceso patolgico, la muestra se cataloga como inadecuada. 36. AGENTES OPORTUNISTAS CONTAMINANTES 37. Bronchial wash. Bacteria from the oral cavity commonly contaminate the respiratory sample. Usually, they coat superficial oral squamous cells. 60x 38. Bronchial wash. Hyphae of Candida species may represent oral contamination of the sample or underlying fungal pneumonia. 40x 39. Bronchial wash. Yeast-like fungi may be seen admixed with oral squamous cells. These most likely represent contamination. 20x 40. Actinomycetes. Actinomycetes may be present in sputum. Note the filamentous bacteria. 60x 41. Pollen. Pollen granules have a thick refractile wall, multiple surface spikes, and are typically pigmented. 42. Bronchial wash. Fiber material contaminating the lung may resemble a Curschmann's spiral. 20x 43. Bronchial wash. Vegetable cells in respiratory samples may mimic atypical epithelial cells or cancer. 60x 44. REFERENCIAS 1. Suen K, AbdulKarim F. Guidelines of the Papanicolaou Society of Cytopathology for the examination of cytologic specimens obtained from the respiratory tract. Diagn. Cytopathol. [Internet]. 1999 [cited 2013 Oct 14];21(1):619. Available from: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/(SICI)10970339(199907)21:1%3C61::AID-DC17%3E3.0.CO;2-O/full2. http://cytologystuff.com/indexclang.htm3. Garca Ureta E, Rodrguez Costa J. Aparato Respiratorio I Cuadernos de Citopatologia. Ediciones Daz de Santos. Pginas 5-24.