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UNIVERSIDAD DE COLIMA Maestría en Ciencias: Área Biotecnología
Aislamiento y evaluación de hongos nematófagos asociados a quistes de Globodera rostochiensis (Woll.) en la región del Cofre
de Perote
Tesis
Que para obtener el grado de:
Maestro en Ciencias, Área Biotecnología
Presenta:
ANGEL ENRIQUE NÚÑEZ SÁNCHEZ
Asesores:
DR. OSCAR REBOLLEDO DOMÍNGUEZ. M. en C. GLORIA LUZ LAURA CARRIÓN VILLARNOVO.
Tecomán, Colima, México. Septiembre del 2002.
UNIVERSIDAD DE COLIMAFACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS
OFICIO No. 440/2002.
C. ANGEL ENRIQUE NUÑEZ SANCHEZEGRESADO DE LA MAESTRIA EN CIENCIASAREA: BIOTECNOLOGIAP R E S E N T E .
Con fundamento en el dictamen emitido por el jurado revisor del colegiado del área: deBiotecnología de esta Facultad a mi cargo, de su trabajo de tesis de Maestría y en virtud de queefectuó las correcciones y acató las sugerencias que le habían indicado los integrantes del mismo,se le autoriza la impresión de la tesis " Aislamiento y evaluación de hongos nemátofagosasociados a quistes de Globodera rostochiensis (Woll) en la región Cofre de Perote ", mismaque ha sido dirigida por los C.C. Dr. Oscar Rebolledo Dominguez y la M.C. Gloria Luz LauraCarrión Villarnovo, Profesor-Investigador de la Universidad de Colima e Investigadora delInstituto de Ecología de Xalapa, Veracruz.
Este documento reunió todas las características apropiadas como requisito parcial paraobtener el grado de Maestro en Ciencias; Area: Biotecnología y fue revisado en cuanto a formay contenido por los C.C. Dr. Alfonso Pescador Rubio. Dr. Oscar Rebolledo Domínguez y laM.C. Edelmira Galindo Velasco, Profesores-Investigadores de la Universidad de Colima.
Sin otro particular de momento. me despido de usted muy cordialmente.
A T E N T A M E N T E “ESTUDIA * LUCHA * TRABAJA”
TECOMÁN, COL., A 27 DE AGOSTO DEL 2002.
C.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTE.C.C.P. ARCHIVO. Of. No. 44012002.RVMD/Lety* *
Km 40 Autopista Colima-Manzanillo • Tecomán, Colima, México • C.P. 28100Tel. 01 (313) 322 94 05 • Ext. 52251 • Fax 52252 • [email protected]
C.C.P. EXPEDIENTE ACADEMICO DEL ALUMNO
ING. RODOLFO VALENTINO MORENTÍN DELGADODIRECTOR
DEDICATORIA
A mi esposa Conchita, mis hijos María del Carmen, Luisa Fernanda y Angel
Enrique, por enseñarnos que este logro es el resultado de el esfuerzo conjunto, con
todo lo que exige de renuncia y entrega, de lucha y de esperanza, de contagiar valores,
de soñar utopias y generar proyectos, de señalar causes y seguir con constancia nuestro
propio camino.
A mis padres José Cruz y María del Carmen, por tanto ejemplo por tanto orgullo,
por su invaluable apoyo y su lucha incansable para sacarnos adelante.
A mis hermanos, María Araceli, Luis Carlos, Marco Antonio, Carmen Patricia,
Mario Alberto, María Cristina, Edna Guadalupe, José Cruz y José Manuel, Angel Armando
y Alma Angelina, Gerardo Alonso; por ese espíritu de lucha que los caracteriza y la
seguridad de saber que nunca hemos estados solos.
A mis cuñados y cuñadas, nuestros sobrinos por formar parte una gran familia.
A Don Norberto y Lola Gámes de Ocoroni Sinaloa por demostrarme que la
humildad es toda una virtud.
A los amigos de ayer generación 1959-1965 de la Escuela Primaria Enrique
Quijada de Nogales Sonora, por todas las vivencias de esa época que fuerte influencia
género en mi formación. Donde quiera que estén, los recuerdo; desde siempre y hasta
siempre.
AGRADECIMIENTOS A Dios, por permitir encontrar en mi camino a personas generosas y comprensivas, que con su apoyo pude alcanzar es meta....Gracias Señor A mí hija María del Carmen, por su apoyo, su dedicación y esfuerzo, deseando
que este estudio sea muy significativo en tu formación profesional.
Al Dr. Oscar Rebolledo Domínguez, Profesor investigador de la Universidad de
Colima, a quien agradezco su invaluable asesoramiento, apoyo y dedicación para la
realización de esta trabajo y por ser un autentico tutor y amigo.
A la M. En C. Gloria L. L. Carrión V. Investigadora del Instituto de Ecología Xalapa
A.C. por darme la oportunidad de superarme por su comprensión y valioso apoyo en el
asesoramiento y realización de esta investigación eternamente agradecido.
A la comisión revisora, integrada por el Dr. Alfonso Pescador Rubio, Dr. Oscar
Rebolledo Domínguez y M. en C. Edelmira Galindo Velazco por su dedicación,
observaciones y sugerencias al manuscrito del presente trabajo.
A la Universidad Veracruzana, por otorgarme la oportunidad de participar en los
programas de posgrado.
A la Secretaria de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación
por su apoyo para llevar acabo esta etapa de capacitación.
A la Universidad de Colima, por permitirme realizar con el apoyo de su personal
académico y administrativo los estudios de Maestría en Ciencias en Biotecnología.
Al Instituto de Ecología Xalapa, A.C. por permitirme desarrollar el presente
estudio en sus instalaciones mí reconocimiento al personal académica y administrativo
por su apoyo en pro de la investigación.
A Promep, por el apoyo económico y moral otorgado para proseguir estudio de
posgrado.
Al Dr. Jaime Molina Ochoa, por apoyar mi ingreso a la Universidad de Colima, por
su amistad y ayuda desinteresada.
Al Dr. Roberto Lezama Gutiérrez de la Universidad de Colima por su simpatía a
este proyecto, sus acertado consejos y conocimientos para logar culminar este estudio.
A la M. en C. Marycruz Abato Zarate de la Facultad de Ciencias Agrícolas de
Universidad Veracruzana por su orientación y apoyo tan valioso para la realización de
este trabajo, pero ente todo por su alegría y entusiasmo.
Al Químico Jesús Gerrero de la Falcultad de Ciencias Agrícolas de Universidad
Veracruzana por la ayuda durante el desarrollo de este estudio.
A la M. en C. Irma López Guerrero, al M. en C. Santiago Chacón Zapata,
investigadores del Instituto de Ecología por sus recomendaciones en la realización de
esta Tesis.
Al Técnico Tiburcio Laez Aponte, del Instituto de Ecología Xalapa A.C. por su
ayuda en la toma de fotografías en el microscopio electrónico de barrido.
Al Ing. José Regalado Aguayo, Jefe de Distrito de Desarrollo Rural Coatepec
por su apoyo y autorización para continuar estudio de posgrado.
Al Lic. Mario Urbina de la Unidad de Capacitación de la Delegación SAGARPA en
Veracruz, por su entusiasta apoyo.
Al Ing. Arturo Paredes Tenorio, por la formación aportada sobre el nematodo
dorado de la papa en Perote.
A Doña Chepi, por su apoyo moral, pero sobre todo por su confianza y amistad.
A mi compañero de Maestría en Ciencias Ing. Rubén Ramiro Sandoval por su
apoyo y amistad.
A todas aquellas personas que de alguna o otra manera contribuyeron a la
realización de un sueño de tantos........
INDICE
RESUMEN ......................................................................................... 1 ABSTRACT ......................................................................................... 2
I.- INTRODUCCIÓN ......................................................................................... 3 HIPÓTESIS ......................................................................................... 7 OBJETIVOS ......................................................................................... 7 II.-ANTECEDENTES. ......................................................................................... 8 2.1. Síntomas y daño ocasionado por Globodera rostochiensis........................... 11
2.2. Clasificación taxonómica de Globodera rostochienis.................................... 15 2.3. Característica morfológicas de Globodera rostochiensis................................ 16 2.4.Biología..................................................................................................... 18 2.5. Métodos de control de nematodos fitoparásitos........................................... 20 2.5.1. Control químico.................................................................................. 21 2.5.2. Control físico....................................................................................... 22 2.5.3. Inundación Artificial y Natural............................................................... 22 2.5.4. Rotación de Cultivos............................................................................ 22 2.5.5. Control genético.................................................................................. 23 2.5.6. Plantas antagonistas y cultivos trampas................................................ 24 2.5.7. Legislación de control......................................................................... 24 2.6. Control biológico de nematodos fitoparásitos............................................. 25 2.6.1. La bacterias en el control biológico de nematodos fitopatogenos............. 26 2.6.2. Rickettisas.......................................................................................... 26 2.6.3. Nematodos Depredadores.................................................................... 26 2.6.4. Depredadores Heterogéneos................................................................ 27 2.7. Hongos parásitos de nematodos................................................................. 28 2.7.1. Los Hongos predadores o atrapadores de Nematodos........................... 28 2.7.2. Los Hongos endoparásitos.................................................................. 31 2.7.3. Productores de toxinas....................................................................... 34 2.7.4. Hongos facultativos antagonistas de nematodos................................... 34 2.7.5. Hongos parásitos de huevos, hembra y quistes..................................... 35 2.7.6. Distribución de hongos parásitos de nematodos.................................... 39 III.- MATERIALES Y MÉTODOS........................................................................ 42 3.1. Ubicación y descripción del área de estudio................................................. 42 3.1.1. Clima................................................................................................. 42 3.1.2. Geología............................................................................................. 42 3.1.3. Suelos................................................................................................ 44 3.1.4. Hidrografía.......................................................................................... 44 3.1.5. Topografía.......................................................................................... 44 3.1.6. Vegetación......................................................................................... 44 3.1.7. Toma de muestra............................................................................... 47 3.1.8. Extracción de quistes.......................................................................... 47 3.1.9. Densidad de la población de quistes..................................................... 48
Página
3.2. Aislamiento de hongos asociados a quistes................................................. 48 3.2.1. Identificación de hongos...................................................................... 49 3.2.2. Conservación de los aislamientos.......................................................... 49 3.3. Bioensayo del proceso de infección de hongos sobre quistes de Globodera
rostochienis.............................................. .............................................. 50
3.3.1. Preparación del inoculo........................................................................ 50 3.3.2. Obtención de quistes sanos.................................................................. 50 3.3.3. Inoculación de los quistes de Globodera rostochiensis............................ 51 3.3.4. Pruebas de patogenicidad.................................................................... 51 IV.- RESULTADOS................................. ........................................................... 53 4.1. Densidad de población de Globodera rostochiensis en las localidades de
estudio .................................................................................................. 53
4.2. Análisis de suelo........................................................................................ 56 4.3. Correlación entre materia orgánica y densidad de población ........................ 57 4.4. Hongos aislados de los quistes de Globodera rostochiensis en la región de
Cofre de Perote....................................................................................... 58
4.5. Proceso de infección de tres hongos aislados de quistes de Globodera rostochiensis...... .............................................. .....................................
60
4.6. Patogenicidad y esporulación de tres hongos sobre Globodera rostochiensis................. .........................................................................
66
V.- DISCUSIÓN................................................................................................ 72 VI.- CONCLUSIÓN............................................................................................ 80 VII.- LITERATURA CITADA .............................................................................. 81
Página
INDICE DE CUADROS
Página Cuadro 1. Zonas más infestadas con nematodo dorado de la papa 11
Globodera rostochienis en México.
Cuadro 2. Hongos predadores y endoparásitos de larvas de nematodos. 33 Cuadro 3. Reportes de parasitismo naturales por hongos en hembras, huevos y quistes de nematodos en diferentes regiones
en el mundo 41 Cuadro 4. Análisis de los datos de densidad de población de quistes en
las localidades de estudio, con la Prueba ”G” de Bondad de Ajuste con Repetición 54
Cuadro 5. Proporciones de cada localidad en sus tres categorías. 55 Cuadro 6: Análisis de los datos de densidad de población de quistes en
las localidades de estudio, con la Prueba ”G” de Bondad de Ajuste con Repetición. 56
Cuadro 7. Niveles de pH y contenido de materia orgánica en
las muestras de las localidades estudiadas. 56 Cuadro 8. Resultado de la correlación entre la cantidad de materia
orgánica, el pH, la cantidad total de quistes y las condiciones físicas de los quistes en las seis localidades estudiadas. 57
Cuadro 9. Hongos nativos asociados a quistes de Globodera rostochiensis
en la región Cofre de Perote. 58 Cuadro 10. Clasificación taxonómica de los hongos aislados a quistes de
Globodera rostochienis. 59 Cuadro 11. Análisis de varianza de la patogenicidad de hongos nativos
sobre quistes de Globodera rostochiensis. 66 Cuadro 12. Porcentajes de quistes de G. rostochiensis con la esporulación
de hongos nativos inoculados. 67
INDICE DE FIGURAS Página FIGURA 1. Dispersión Globodera rostochiensis en el mundo. 9 FIGURA 2: Cuello y puntuaciones del quistes 750x. 17 FIGURA 3: Corte transversal del quiste, corión y masa de huevos 750x. 17 FIGURA 4: Cono vulvar 500x. 17 FIGURA 5: Estrías del corión 1000x. 17 FIGURA 6. Ciclo biológico de Globodera rostochiensis. 19 FIGURA 7. Ubicación geográfica de zona de estudio. 43 FIGURA 8. Diagrama de flujo de Materiales y Métodos. 52 FIGURA 9. Total de quistes obtenidos por kilogramo de suelo en las localidades de estudio. 53 FIGURA 10. Clasificación de los quistes obtenidos de acuerdo a condiciones físicas por localidad. 55 FIGURA 11. Acremonium incrustatum esporas de sobre el corión 12 hrs
después de la inoculación 2,000x. 61 FIGURA 12: Acremonium incrustatum Tubos germinativos vistos
en la parte interna del corión 24 hrs después de la inoculación 1,500x. 61
FIGURA 13: Acremonium incrustatum tubos germinativos a las
48 hrs 1,500x. 61 FIGURA 14: Huevos de Globodera rostichienis con micelio de
Acremonium incrustatum a las 72 hrs 1,000x. 61 FIGURA 15: Acremonium incrustatum micelio de saliendo del corión
96 hrs 1,000x. 61
FIGURA 16: Acremonium incrustatum conidióforo emergiendo
del corión 120 hrs 2,000x. 61 FIGURA 17: Paecilomyces carneus grupo de esporas germinando 12 hrs
después de la inoculación 3,500x. 63 FIGURA 18: Paecilomyces carneus esporas con tubos germinativos
inmersos y superficiales 24 hrs después de la inoculación 1,500x. 63
FIGURA 19: Paecilomyces carneus micelio desarrollado sobre el corión
a las 72 hrs 500x. 63 FIGURA 20: Paecilomyces carneus formación de fialides y conidióforos
esporulando a las 96 hrs 1,500x. 63 FIGURA 21: Paecilomyces carneus cadenas de esporas sobre
el corión 750x. 63 FIGURA 22: Huevos rodeados de micelio de Paecilomyces carneus 100x. 63 FIGURA 23: Phialophora malorum germinación de una espora 12 hrs
después de la inoculación 3,500x 65 FIGURA 24: Phialophora malorum tubos germinativos 72 hrs 1,500x. 65 FIGURA 25: Phialophora malorum micelio desarrollándose sobre el
corión a las 96 hrs 750x. 65 FIGURA 26: Phialophora malorum micelio sobre huevos 120 hrs
después de la germinación 750x. 65 FIGURA 27: Parte interna del corión con micelio de a Phialophora malorum los 18 días 750x. 65 FIGURA 28: Quiste cubierto de micelio de Phialophora malorum a
los 28 días. 65 FIGURA 29: Porcentaje de quistes infectados. 66
FIGURA 30: Acremonium incrustatum conidióforo y micelio sobre el corión 2,000x. 68
FIGURA 31: Huevo enrollado de micelio de Acremonium incrustatum 500x. 68 FIGURA 32: Micelio de Acremonium incrustatum interior del quiste 500x. 68 FIGURA 33: Quiste cubierto de micelio Acremonium incrustatum 100x. 68 FIGURA 34: Testigo quiste de Globodera rostochienis 750x. 68 FIGURA 35: Testigo huevos de en el interior del quiste de
Globodera rostochiensis 500x. 68 FIGURA 36: Paecilomyces carneus conidióforo 2,000x. 69 FIGURA 37: Paecilomyces carneus cadenas de conidios y micelio
sobre el quiste 750x. 69 FIGURA 38: Micelio de Paecilomyces carneus sobre la masa
de huevos 750x. 69 FIGURA 39: Quiste cubierto por micelio y conidióforos de Paecilomyces
carneus 150x. 69 FIGURA 40: Testigo quiste sano 100x. 69 FIGURA 41: Huevos de Globodera rostochiensis en el interior
del quiste 500x. 69 FIGURA 42: Phialophora malurum grupo de esporas 1,500x. 70 FIGURA 43: Espora y micelio de Phialophora malurum sobre el quiste 100x. 70 FIGURA 44: Micelio de Phialophora malurum sobre el corión 200x. 70 FIGURA 45: Micelio de Phialophora malurum en la masa de huevos 750x. 70 FIGURA 46: Micelio de Phialophora malurum en la masa de huevos y
corión 500x. 70
FIGURA 47: Quiste cubierto por micelio de Phialophora malurum 150x. 70
FIGURA 48: Testigos de Globodera rostochiensis 250x. 71 FIGURA 49: Conjunto de huevos de Globodera rostochiensis en el interior del quiste 500x. 71
Aislamiento y evaluación de hongos nematófagos asociados a quistes de Globodera rostochiensis (Woll.) en la región del Cofre de Perote.
Núñez Sánchez, Angel Enrique. Facultad de Ciencias Biológicas Agropecuarias, Universidad de Colima.
RESUMEN El nematodo dorado Globodera rostochiensis es una de las principales plagas en el cultivo de la papa Solanum tuberosum a nivel mundial; en México se encuentra extendido prácticamente en toda las regiones donde se cultiva. Diversas especies de hongos funcionan en la naturaleza como reguladores de poblaciones, sin embargo sobre este nematodo pocas especies se conocen. Los objetivos de este trabajo fueron aislar y determinar los hongos parásitos de G. rostochiensis en cultivos de papa de la región del Cofre de Perote, Veracruz, México y describir el proceso de infección sobre los quistes de especies seleccionadas. Se tomaron muestras de suelo de seis localidades (Conejos, Tembladeras, Rancho Nuevo, Escobillo, Pescados y Los Altos). Los quistes se obtuvieron mediante la técnica del flotador de Fenwick, se cuantificaron. La cantidad de quistes obtenida fue de 300 hasta 2216 quistes/kg de suelo. De cada muestra se tomaron al azar 100 quistes jóvenes para aislar hongos parásitos. El parasitismo natural obtenido del total de muestras trabajadas fue de 3.5%. Se obtuvieron 21 cepas de hongos: Aspergillus sp. (1), Chetomidium sp. (1), Cladosporium sp. (3), Drechslera sp. (1), Fusarium sp. (1), Micelia sterilia (1), Pteroconium sp. (1), Trichocladium asperum (2), Ulocladium atrum (1), Acremonium incrustatum (1), Paecilomyces carneus (5), Phialophora malorum (1), Phialophora sp. (2).
Acremonium incrustatum, Paecilomyces carneus y Phialophora malorum, fueron seleccionados para estudiar el proceso de infección. En los quistes inoculados con A. incrustatum y P. carneus se encontró evidencia de germinación, penetración y desarrollo del micelio sobre el corión y en los huevos, la capa vitalina se separó y se observó vacuolización en la superficie de los huevos y el mucílago desapareció; los conidióforos emergieron del quiste, y se formaron las primeras esporas a las 72hrs. Sin embargo, en los quistes inoculados con P. malorum no se observó la germinación de las esporas hasta 5 días después de la inoculación, el micelio dentro de los quistes continuó su crecimiento y 15 días después se encontraron algunos quistes negros, esto debido a que gran cantidad de micelio estaba desarrollado en el interior del quiste, posteriormente entre los 18-20 días se observó su esporulación. A. incrustatum y P. carneus pueden ser considerados buenos candidatos para usarlos en pruebas de control biológico a nivel de parcelas experimentales, por la velocidad para infectar y destruir los quistes.
Palabras clave: Control biológico, papa, nematodo enquistado, Globodera rostochiensis,
hongos nematofagos.
1
Isolation and evaluation of nematophagus fungi associated to cyst of Globodera rostochiensis in the region Cofre de Perote.
Núñez Sánchez, Angel Enrique. Facultad de Ciencias Biológicas Agropecuarias, Universidad de Colima.
ABSTRACT
The golden cyst nematode Globodera rostochiensis is one of the main pest in the crop potato Solanum tuberosum to world level; in Mexico is extended practically in the whole regions where it cultivated. Diverse species of fungi work in the nature like controllers of populations, however on this nematode few species know. The objectives of this work were isolate and determine parasites fungi parasites of G. rostochiensis in cultivation potato of the region of Cofre de Perote, Veracruz, México and describe the process of infection on the cysts of selected species. Were taken samples of soil of six localities (Conejos, Tembladeras, Rancho Nuevo, Escobillo, Pescados and Los Altos). The cysts were obtained by means of the technique of the float of Fenwick, were quantified. The amount of obtained cysts was from 300 up to 2216 cysts/kg soil. From each sample taken 100 young cysts at random in order to isolate parasites fungi . The natural parasitism obtained of the total of worked samples was from 3.5%. 21 stumps were obtained: Aspergillus sp. (1), Chetomidium sp. (1), Cladosporium sp. (3), Drechslera sp. (1), Fusarium sp. (1), Micelia sterilia (1), Pteroconium sp. (1), Trichocladium asperum (2), Ulocladium atrum (1), Acremonium incrustatum (1), Paecilomyces carneus (5), Phialophora malorum (1), Phialophora sp. (2).
Acremonium incrustatum, Paecilomyces carneus and Phialophora malorum, were selected to study the process of infection. In the cysts inoculated with A. incrustatum and P. carneus was evidence of germination, penetration and mycelium was development on the chorion and in the eggs, the vitelline membrane separated and was observed vacuolization in the surface of the eggs and the mucilage disappeared; the conidiophore emerged of the cyst, and they were formed the first spores to the 72hrs. However, in the cysts inoculated with P. malorum was not observed the germination of the spores up to 5 days after the inoculation, the mycelium inside the cysts continued its growth and 15 days later were some black cysts, this because great amount of mycelium was developed inside the cyst, later on between the 18-20 days their sporulation was observed. A. incrustatum and P. carneus could be considered good candidates to use them in tests of biological control to level of experimental parcels, for the speed in order to infect and destroy the cysts. Key words: Biological control, potato, golden cyst nematode, Globodera rostochiensis, nematophagus fungi.
2
I.- INTRODUCCIÓN
La papa, Solanum tuberosum L., es originaria de Sudamérica de la región de los
Andes y es uno de los cultivos más extendidos en el mundo (FAO, 1996). Entre los
parásitos que la afectan, los nematodos son muy importantes; en Norteamérica más de
20 especies de nematodos han sido registrados asociados al cultivo de papa
(MacGuidwin, 1993). Globodera rostochiensis (Woll.) es uno de los nematodos que
causa más estragos en la mayoría de las zonas productoras de papa (Eppo, 1994).
Globodera rostochiensis es un nematodo endoparásito sedentario, con alta
capacidad de reproducción y sobrevivencia ya que las hembras están cubiertas por una
capa dura (corión) formando un quiste, de manera que los huevos están bien
protegidos. Los quistes permanecen normalmente en el suelo hasta 20 años. Cada
quiste joven contiene entre 200-500 huevos (Evans y Trudgill, 1993; Franco, 1994).
Este nematodo se ha registrado en más de 90 especies de Solanáceas, aunque los
hospederos más susceptibles, además de la papa, son el tomate, Lycopersicum
esculentum Mill. y la berenjena, Solanum melongena L. (Greco y Moreno, 1992).
Afecta el sistema radicular de la planta, disminuyendo la cantidad de minerales
absorbidos (fósforo, potasio, magnesio y calcio) y su translocación; además aumenta la
concentración de sodio (Perry, 1996; Trudgill, 1991). De manera que al dañar a las
membranas de la raíz de la planta, facilita la entrada de hongos y bacterias (Evans y
Trudgill, 1992). El efecto de este nematodo en el rendimiento del cultivo, varía de
acuerdo a la densidad de población. El límite de tolerancia establecido en Europa hacia
los nematodos formadores de quistes, para no afectar el rendimiento, es de 1.9
huevos/g de suelo o de hasta 40 quistes/kg de suelo.
3
Cuando el nivel poblacional del nematodo en el suelo alcanza 16 y 32 huevos/g
de suelo, el rendimiento de la papa puede ser reducido entre 20 y 50%
respectivamente; y puede disminuir completamente cuando la población inicial del
nematodo es de 64 huevos/gr de suelo (EPPO, 1994; Perry, 1996; Greco, 1993).
Debido a la fuerte infestación de G. rostochiensis, en la región de Perote, donde
se han registrado en promedio 1000 quistes/kg de suelo, la Secretaria de Agricultura
estableció la Cuarentena Interior Permanente No. 17 (SARH, 1987), que comprende
6,000 hectáreas dedicadas al cultivo de la papa. La alta densidad de la población del
nematodo, obliga a la aplicación de agroquímicos, utilizando hasta 50 kg de nematicidas
por hectárea al momento de la siembra; las consecuencias son: el incremento en los
costos de producción, aumento de los riesgos de la salud humana por los residuos
químicos (Gommers et al., 1992), la contaminación del suelo y mantos freáticos y el
desarrollo de resistencia del nematodo a los nematicidas (Whitehead et al., 1994).
El control de los nematodos enquistados sobre el cultivo de la papa, se realiza con
el uso de los nematicidas químicos, sin embargo, por razones del peligro que
representan para la salud y las dificultades en el desarrollo comercial han llevado a la
búsqueda de alternativas de control que reduzcan los riesgos del uso de los productos
químicos. Un acercamiento lógico a esta alternativa, es la implementación de prácticas
que incluyan la aplicación de microorganismos antagonistas, que suceden de forma
natural o que pueden ser establecidos en el desarrollo de un ecosistema (Sikora, 1992).
El hecho, de que los niveles de parasitismo de hongos sobre los nematodos
enquistados, donde son introducidos, sea mucho menor, que en los centros de origen,
pareciera indicar, que estos fitopatógenos no tienen enemigos naturales y que el control
biológico para ellos no tendría grandes expectativas (Sayre et al., 1991; Sikora, 1992;
Dackman y Norbring-Hertz, 1992).
4
Sin embargo en la naturaleza las poblaciones de los animales mantienen una
fluctuación cíclica, cuyo número varia año con año y de generación en generación. Los
nematodos son muy pequeños y sus hábitats han sido raramente estudiados. En este
aspecto los nematodos no se diferencian de los animales (Varley et al. 1973; Knipling,
1979; Berryman, 1981).
Hay dos factores que gobiernan la abundancia de los animales; una, que opera
independientemente de la densidad y otra, que depende de la densidad. Pero en el
suelo, la más común, son los factores que actúan independientemente de la densidad.
Los factores que más influyen sobre las poblaciones de los nematodos fitoparásitos son
la humedad y la temperatura, así como, las prácticas agrícolas, además de los parásitos
facultativos y depredadores (Stirling, 1991; Varley et al., 1973; Knipling, 1979;
Berryman, 1981).
Estas fuerzas son impredecibles, pero juegan un importante papel en la
determinación de las áreas ecológicas, en las cuales estos organismos pueden existir
permanentemente, y determinan la fluctuación de la población (Stirling, 1991). Los
factores densodependientes son la clave para los procesos regulatorios del tamaño
poblacional de las especies. Esta acción tiende a crear un efecto estabilizador sobre una
población que esta arriba de su punto de equilibrio, de manera que la reduce y si la
población está por debajo de ese punto, la aumenta.
Como consecuencia de lo anterior, los hongos habitantes del suelo de la Clase,
Hyphomycetes, consistentemente colonizan quistes de nematodos fitoparásitos y que
son, en gran medida, la causa del control de las poblaciones de estos nematodos,
logrando penetrar al quiste, destruir los huevecillo y a las larvas, por varios medios
(Dackman y Nordbring-Hertz, 1985; Gintis et al., 1983; Morgan-Jones y Rodriguez-
Kabana, 1988).
Esto, hace suponer, que si bien es cierto, que el nematodo en quistado G.
rostochiensis, no se le han reportado enemigos naturales fuera de su centro de origen,
5
según Tribe (1980), no se puede concluir que este exento de microorganismos parásitos
y depredadores.
El uso de microorganismos para el control de plagas y enfermedades de las
plantas por otros microorganismos es una alternativa al uso del control químico; y
estimula la búsqueda de agentes de biocontrol (Inbar y Chet, 1997; Lindow y Wilson,
1998). Los organismos que abundan en el suelo, particularmente con potencial
antagonista, han sido propuestos como un marcador biológico útil para la sanidad del
ecosistema (Niles y Freckman, 1998; Stork y Eggleton, 1992; Yeates, 1994) y han
impulsado el estudio de los enemigos naturales para el control de nematodos (Sayre et
al., 1991), y que en alguna etapa del ciclo de vida los utilizan como una fuente de
nutrientes, y desempeñan un importante papel en el reciclaje del carbono, nitrógeno y
otros elementos de la biomasa.
El aumento de la población de nematodos en el suelo va acompañada por
epizootias de hongos antagonistas (Sikora, 1992; Stirling et al., 1990); de esta forma
atacan a los nematodos continuamente en todos los suelos (Uziel y Sikora, 1992). Las
plagas de la raíz son generalmente raras en los ecosistemas no perturbados o naturales,
mientras que en los sistemas de producción convencionales, los patógenos del suelo y
las enfermedades que causan, son severas y a menudo, un factor limitante de la
producción (Cook y Baker, 1983). Los hongos nativos son reconocidos como
contribuidores comunes para la supresión de plagas en sistemas de cultivo (Dackman y
Norbring-Hertz, 1992).
El control biológico es efectivo cuando un antagonista tiene un alto grado de
adaptabilidad al medio donde se va a establecer (Lindow y Wilson, 1998).
Generalmente, el suelo no estéril, es considerado un ambiente hostil para la
introducción de microorganismos, incluyendo agentes de control biológico, ya que los
microorganismos nativos frecuentemente son rivales superiores ó de lo contrario son
antagonistas (Cook y Baker, 1983).
6
El nematodo dorado de la papa Globodera rostochiensis representa un grave
problema en la Región Cofre de Perote, sin embargo poco es el conocimiento, sobre la
diversidad de especies de hongos nematofagos asociados y el potencial de estos como
agentes de control biológico.
De tal forma que la investigación parte de la siguiente hipótesis
HIPÓTESIS Las poblaciones de hongos nativos de la zona productora de papa en el Cofre de
Perote tienen actividad nematofaga contra G. rostochiensis.
OBJETIVOS
Evaluar el estado actual de la población de G. rostochiensis en las localidades de
estudio en la región Cofre de Perote.
Aislar e identificar hongos nativos parásitos de quistes de G. rostochiensis en la
región del Cofre de Perote, Veracruz.
Evaluar la patogenicidad de hongos nativos sobre quistes de G. rostochiensis, in
vitro.
7
II.-ANTECEDENTES El nematodo dorado se considera originario de los países andinos (Perú y Bolivia).
Se detectó por primera vez en Alemania en 1881 y fue descrito en 1923 por
Wollenweber (Franklin, 1971). La introducción original del nematodo a Europa fue muy
probablemente durante el establecimiento del cultivo en 1850 y se dispersó a países de
Asia (India, Pakistán Japón y Malasia), África (Egipto, Marruecos, Sierra Leona y
Sudáfrica), Australia y centro y norte de América, probablemente con el comercio de
tubérculos de papa para semilla. Actualmente se registra en 65 países (Jones, 1976)
(Fig.1).
Otro aspecto que influye en la magnitud del daño ocasionado por este nematodo,
son los cinco patotipos identificados; (Ro1, Ro2, Ro3, Ro4, Ro5) a nivel mundial (Evans
y Trudgill, 1993; Greco, 1993).
Globodera pallida (Stone) es otra especie de nematodo que forma quistes,
llamada quiste blanco de la papa y al igual que G. rostochiensis causa graves daños. Se
ha registrado en el centro y oeste de Europa. En América se le conoce de Colombia,
Ecuador y gran parte del Perú. (Evans y Trudgill, 1993; Greco, 1993). Seis patotipos se
han determinado en G. pallida: tres en Europa (Pa1, Pa2, Pa3) y tres en la zona andina
(P4A, P5A, P6A). Ambas especies se tienen registradas para el sur del Perú, Bolivia, y
Argentina, donde han cohabitado con sus hospederos por cientos de años (Stone,
1986). Sin embargo solo se ha registrado G. rostochiensis en Chile, Venezuela, Centro
América, México y EUA (Stone, 1979; Sosa-Moss, 1986).
8
9
La papa que se produce en México se siembra en 25 estados de la República en
tres ciclos agrícolas otoño-invierno, invierno-primavera y primavera-verano en este
último se hace el 80% de la siembra. La superficie cultivada es de alrededor de 70 mil
hectáreas aproximadamente, con una producción de 1’200,000 toneladas los principales
estados productores de papa son: Chihuahua, Sinaloa, Sonora, Guanajuato, México,
Nuevo León, Coahuila, Puebla y Veracruz (ASERCA, 1999).
La producción comercial en la región montañosa de México se concentra entre los
2,000-3,000 m de altitud, en zonas de temporal y se distingue en seis áreas: Puebla,
Toluca, Sierra Tarasca de Michoacán, La Malinche en Tlaxcala, Pico de Orizaba y Cofre
de Perote, que en conjunto comprenden una superficie de 25,000 hectáreas
aproximadamente (CONPAPA, 1994).
Se tienen registros de Globodera spp. de muestras de suelo tomadas de un carro
de carga americano utilizado para transporte de papas en el centro de México en 1953.
Sin embargo la presencia de G. rostochiensis fue confirmada en Guanajuato por Iverson
(1972); por lo cual se inició la inspección de las zonas productoras de papa. Hasta 1986
se tenía registrado el nematodo dorado en 46 zonas de 9 estados; México, Puebla y
Tlaxcala son los estados más infectados (Sosa-Moss, 1986). Actualmente esta disperso
en la mayoría de las zonas en las que se cultiva papa en México (Cuadro 1).
10
Cuadro 1. Zonas más infestadas con nematodo dorado de la papa Globodera rostochiensis en México.
ESTADO MUNICIPIO Coahuila Arteaga
Distrito Federal Delegación Tlalpan y Delegación Milpa Alta
Hidalgo Metztitán
Guanajuato León, San Francisco del Rincón, Silao, Romita, Purísima del
Rincón. Estado de México Zinantepec, Temascaltepec, Calimaya, San Antonio de la Isla,
Santa María Rayón, Amanalco de Becerra, San Bartolo Morelos, Naucalpan, Donato Guerra, Lerma, San Felipe del Progreso, Valle de Bravo, Joquincingo y Metepec.
Nuevo León Galeana Puebla Ixtacamaxtitlán, Saltillo Lafragua, Tlapanala, Guadalupe
Victoria, Atzitzintla, Tehuacan, Chalchicomula de Sesna, Huitzilán, de Serdán y Tlachichuca.
Tlaxcala Cuapiaxtla, Altzayanca, El Carmen, Huamantla, Terrenate,
Tlaxco y Santa Ana Chiautempan Veracruz Altotonga, Ayahualulco, Perote y Xico 2.1. Síntomas y daño ocasionado por G. rostochiensis
El síntoma típico de la presencia de nematodo dorado de la papa en el suelo es la
marchites temprana en las plantas de papa asociado con estrés hídrico (Evans y Stone,
1977). Como consecuencia de la alimentación del nematodo, el daño histológico es
manifestado por necrosis de las células de las raíces, perforadas por los estados
juveniles larvarios, cuando éstos se detienen en el lugar definitivo de alimentación, las
células de las raíces alrededor de la cabeza del nematodo sufren una profunda
transformación.
11
La hembra se adhiere y alimenta cerca del cilindro vascular, dando origen a
unidades multinucleadas denominadas sincitio (hiperplasia de las células) cerca de la
cabeza del nematodo, las que se forman por incorporación de un conjunto de las células
adyacentes cuyas paredes se han disuelto.
La formación del sincitio ocasiona una interrupción de los vasos cribosos y leñosos
limitando notablemente la funcionalidad de las raíces. Las plantas de papa atacadas por
el nematodo presentan crecimiento y rendimiento reducidos, la senectud se anticipa y
en suelos muy infestados, el follaje presenta un ligero amarillamiento; las hojas
individuales de las plantas infectadas son pequeñas por la pobre división celular. Por
consiguiente las plantas infestadas tienen una mayor proporción de materia en la pared
celular, el volumen de materia seca es mayor que en las plantas sanas.
La presencia de nematodos enquistados causa la reducción fotosintética (por la
ruptura del translocamiento de nutrientes, la relación planta-agua); incrementa la
materia seca, la adhesión de raíces y por consiguiente la producción de menos tallos y
hojas pequeñas poco suculentas y mueren tempranamente, hay poca formación de
nuevas hojas, el número de tubérculos decrece.
Las altas densidades del nematodo reducen el rendimiento y es más difícil decir
debido a que combinación, la reducción del crecimiento de la planta es causado por una
reducción de la absorción, incrementando el contenido de materia seca, la necrosis del
follaje y la muerte temprana del mismo.
El decremento de agua absorbida por las plantas altamente infestadas por el
nematodo debido al mal funcionamiento del sistema radicular, tiene como consecuencia
el desprendimiento de las hojas. Finalmente la muerte ocurre cuando el nivel de agua
continua decreciendo y se prolonga la resistencia estomática (Evans y Trudgill, 1992).
12
Las larvas se vuelven activas a 10°C y la máxima invasión de las raíces se realiza
a 16°C. Temperaturas del suelo de 26°C, en períodos prolongados limitan el desarrollo
del nematodo y reducen su reproducción.
El nematodo dorado de la papa se desarrolla bien en los suelos arcillosos
medianos a pesados, bien drenados o arenosos con aireación, suelos sedimentados o de
musgo con un contenido de humedad de 50 a 75% de capacidad de campo. El pH del
suelo tolerado por la planta de papa, es aparentemente aceptado por los nematodos
(Stone, 1979). En ausencia del cultivo de la papa, en zonas de clima templado, el nivel
poblacional disminuye en un 50% cada año, mientras que en países con clima cálido,
como Marruecos, puede ocurrir una reducción de casi 100% (Schuster y Sikora, 1992a).
En países con clima cálido, la superficie del suelo, en el verano, se calienta mucho
y los nematodos que se encuentran en los primeros 5-10 cm mueren naturalmente. Por
lo tanto, las prácticas agrícolas en la preparación del suelo en esta época del año,
reducen sensiblemente el nivel poblacional del parásito. Los huevos enquistados toleran
la desecación y pueden sobrevivir 20 años o más en suelos bajo condiciones extremas
del medio ambiente. Cuando la cosecha se realiza al final del ciclo biológico de la papa,
todos los nematodos que han penetrado en las raíces alcanzan el estado de quiste,
logrando un nivel poblacional muy alto. No ocurre así cuando se cosecha temprano la
papa; de esta forma muchos nematodos se encuentran todavía en los estados juveniles
y el nivel poblacional en el suelo permanece bajo.
La diseminación local o a gran distancia se realiza por la movilización de suelo
infestado, como por ejemplo el que se adhiere a la maquinaria, semillas o envases para
almacenaje. Los tubérculos contaminados proporcionan durante la siembra, condiciones
ideales para la diseminación y constituyen el factor principal en la distribución mundial
del nematodo.
13
En la ausencia de un hospedero viable en suelos infectados los quistes del
nematodo de la papa pueden persistir por 20-30 años. Dentro del quiste pueden pasar
al segundo estado juvenil (J2) o bien entrar en extrema inactividad conocida como
letargo.
Generalmente el letargo se presenta algunas veces antes del establecimiento del
próximo cultivo de papa y la mayoría de los J2 solo entran en letargo durante el 1er
año. Después de esta estimulación la mayoría de los juveniles eclosionará. Así las
poblaciones del nematodo de la papa son introducidas a nuevas regiones y pueden
adaptarse a diferentes etapas de desarrollo del cultivo hospedante con 2-3 años de
establecimiento (Mulvey y Stone, 1976).
La cantidad de J2 que eclosiona es variable. En la ausencia de una planta
hospedante, algunos juveniles eclosionan espontáneamente en ciertas épocas del año,
cuando la temperatura del suelo y la humedad sean adecuadas. En suelos de Europa
estas eclosiones espontáneas son en promedio de 30-33% anualmente, pero esto es
influenciado por las condiciones ambientales (Mulvey y Stone, 1976).
En general se ha registrado mayor eclosión en suelos arenosos que en suelos de
turba y arcilla (Berry et al., 1977). La textura de suelos arcillosos sedimentados puede
estimular la eclosión de la población del nematodo en un 32%, cuando hay presencia de
restos de raíces de un cultivo, pueden estimular la eclosión de los J2 en un 60-80%.
Como parte de la estrategia de sobrevivencia del nematodo dorado de la papa,
nunca eclosiona el 100% de las larvas de los quistes, algunos juveniles llegan a
permanecer en letargo por varios años antes de eclosionar.
La raíz de la planta hospedante también influye en las proporciones de
multiplicación, generalmente sistemas radiculares grandes toleran altos niveles de
invasión.
14
En un campo, el primer foco de infección se manifiesta en una pequeña área
circular que luego se agranda hasta afectar toda la superficie. El nematodo, por acción
propia, puede moverse 1-2 m/año; sin embargo, el movimiento pasivo es más rápido. El
suelo adherido a los implementos agrícolas, zapatos y patas de los animales, puede
contener quistes, favoreciendo la diseminación de los nematodos dentro de la misma
unidad de producción o a otras unidades. Todo sistema de riego que favorezca la
escorrentía del agua, así como las inundaciones pueden ser importantes.
Sin embargo, el comercio de la papa, y especialmente los tubérculos utilizados
como semilla, son la forma más eficaz de diseminar los quistes entre estados, países y
continentes. La limpieza de la maquinaria agrícola, uso de tubérculos-semilla sanos y
medidas cuarentenarias son muy eficaces para evitar la diseminación de los nematodos
(Matos y Canto-Sáenz, 1993).
2.2. Clasificación taxonómica de Globodera rostochiensis (Mulvey y Stone, 1976).
Phylum: Nematelmintos
Clase: Nematoda
Subclase: Secernentea
Orden: Tylenchida
Suborden: Tylenchinae
Superfamilia: Tylenchoidea
Familia: Heteroderidae
Género: Globodera
Especie: rostochiensis
15
2.3. Características morfológicas de Globodera rostochiensis
Hembras cuerpo esferoidal a piriforme, sin cuello protuberante y carente de
protuberancia en el cono terminal; diámetro longitudinal de 420-640 µm y ecuatorial de
270-430 µm. Longitud del estilete de 22-24 µm, con un ángulo del nódulo dorsal del
estilete de 136°. Distancia del extremo de la cabeza al cono excretor de 105-175 µm.
Altura vulvar de 6-11 µm. Distancia del ano al margen más cercano de la fenestra
(áreas membranosas de pared delgada sobre el cono vulvar) de 39-80 µm.
Quistes color café dorado a oscuro, superficie arrugada, formando patrones
acanalados, lo cual puede ser diferente sobre el cono vulvar, circunfenestrados y con
ano subterminal, diámetro longitudinal de 450-999 µm, diámetro ecuatorial de 250-810
µm, diámetro longitudinal/ecuatorial de 1-1.4 µm; distancia del ano al margen más
cercano de la fenestra de 29-116 µm, y radio de Granek de 2-7 µm, con 16-31 estrías
entre el ano y fenestra vulvar (Figs. 2 a 5).
Huevos elipsoidales, hialinos de 95-115 x 42-48 µm. Larvas de 370-470 µm, cuya
anchura a la mitad del cuerpo de 19-26 µm. Longitud del estilete de 21-23 µm, distancia
de la base de los nódulos a la desembocadura de la glándula esofágica dorsal de 5-6.7
µm. Longitud de la cola de 44-57 µm, y la porción hialina de la cola 18-30 x 16-23 µm.
Glándula esofágica dorsal 2.2-2.5 µm disco oral subcircular con sectores labiales.
Machos con cuerpo vermiforme con torcedura axial de 890-1270 x 22-36 µm y de 31-
46 µm de ancho a la mitad del cuerpo, disco labial de bajo perfil. Estilete fuerte de 25-
27 µm con protuberancias bien formadas. Distancia de la base de los nódulos a la
desembocadura de la glándula esofágica dorsal de 5-7 µm. Cola de 1.6-6.7 µm; una
bolsa seminal, y una sola espícula en la punta (Franklin, 1971).
16
Figs. 2-5. Globodera rostochiensis. 2:Cuello y puntuaciones del quistes 750x; 3: Corte
transversal del quiste, corión y masa de huevos 750x; 4:Cono vulvar 500x; 5:Estrías del corión 1000x.
17
Después de la siembra, las raíces de la planta de papa, producen exudados
radicales que estimulan la eclosión de los huevos (cada quiste contiene de 200-500
huevos) de los cuales emergen los juveniles de segundo estadío. El nematodo al salir
del huevo, se encuentra en un estadio infectivo, migra hacia el ápice radical y después
de recorrer algunos milímetros de la raíz, el juvenil se fija a las raíces y continúa su
desarrollo como sedentario, pasando por tres estados juveniles (segundo, tercero y
cuarto) antes de lograr el estado adulto (Mulvey y Stone, 1976). El periodo de tiempo
que el nematodo necesita para cumplir una generación, desde la penetración del juvenil
de segundo estadío hasta la formación de quistes con huevos, es de 45-60 días, según
las condiciones ambientales. Si se considera una temperatura de 10°C como la mínima a
la cual el nematodo puede comenzar su desarrollo, puede desarrollarse una generación
después de 40 días (Fig. 6).
En Globodera rostochiensis existe un dimorfismo sexual muy marcado, el
segundo estado juvenil es móvil y vermiforme; en las hembras el tercero y cuarto
estado juvenil, así como las adultas, son inmóviles y abultadas. La hembra posee un
aparato reproductivo muy desarrollado y después de ser fecundada produce gran
cantidad de huevos que retiene en el interior del cuerpo. La hembra adulta adquiere
una coloración amarillenta, luego se transforma en quiste. El macho adulto es móvil y su
capacidad patogénica no ha sido demostrada. El tamaño de los individuos es afectado
por el huésped y por el nivel poblacional del nematodo, siendo más pequeños cuando la
población es elevada o el huésped se encuentra fuertemente dañado (Greco et al.,
1982).
Las hembras fecundadas aumentan de tamaño y se vuelven subesféricas, lo cual
depende probablemente de las características de la planta hospedante y de la nutrición
durante su desarrollo. En comparación con la hembra madura el quiste tiene una
cutícula más gruesa y de color castaño oscuro para proteger los huevos contenidos.
2.4. Biología
18
Fig. 6. Ciclo biológico del nematodo Globodera rostochienis.
19
Globodera rostochiensis posee un promedio de 21.6 estrías y G. pallida 12 (Stone,
1979). A veces, el número promedio puede ser de 15, lo cual causa confusión; en este
caso, es necesario identificar la especie. A la madurez tanto G. rostochiensis como G.
pallida se convierten en quistes redondeados de color castaño oscuro, con un diseño
irregular de puntuaciones en la superficie del cuerpo. El largo del cuerpo de las larvas,
del estilete y de la cola son generalmente mayores en G. pallida que en G. rostochiensis
(Mulvey y Stone, 1976).
Los quistes no se alimentan y se desprenden fácilmente de las raíces o de los
tubérculos. Los huevos, al final del desarrollo embrionario, aproximadamente después
de 2-3 semanas, contienen juveniles de segundo estadío.
Las condiciones que lo favorecen son una temperatura de 20-26°C, una humedad
en el suelo y pH de 2.6-4. Cuando las condiciones ambientales son desfavorables, como
en casos de alta temperatura (28°C), sequías, cuando la planta se aproxima al final del
ciclo, o bien las raíces están muy dañadas; las hembras se transforman temprano en
quiste y el ciclo es más corto; en cambio si la temperatura del suelo es menor de 20°C,
el ciclo de vida es más largo. Estudios comparativos han demostrado que G. pallida se
desarrolla mejor que G. rostochiensis a bajas temperaturas (Greco et al., 1982).
2.5. Métodos de control de nematodos fitoparásitos
Con el fin de evitar que el ataque de nematodos afecte el crecimiento y desarrollo
de las plantas cultivadas, es necesario efectuar una evaluación de los niveles de
población que desde un punto de vista económico y ecológico justifique, dependiendo
de la condición específica de cada sistema productivo, la inversión que implica la
utilización de uno o varios de los métodos de control.
20
2.5.1. Control químico
En países europeos donde se cultiva papa, la aplicación de nematicidas esta
dirigida a los nematodos formadores de quistes (Mulder et al., 1990). Winslow y Willis
(1972) indican que, en general, el tratamiento con nematicidas para el control de G.
rostochiensis no ha sido económicamente recomendable, debido a sus altos costos, los
implementos especiales requeridos para su aplicación y la fitotoxicidad de algunos de
ellos. Muchos de los nematicidas inician su actividad cuando el crecimiento de la planta
es avanzado, sin embargo, hacen notar que cuando el suelo esta mojado y frío los
materiales o substancias aplicadas tienden a difundirse menos, a degradarse y a
disminuir su efectividad aunque las condiciones sean óptimas, la eliminación de las
larvas casi siempre es incompleta.
Los principales nematicidas utilizados son el DD (1,3 dicloropropeno, 1,2-
diclopropano con hidrocarbono, el DB (etileno dibromo) y el DBCP (1,2 dibromo-3
cloropropano) los cuales son altamente tóxicos y solubles en agua. El DD ha sido el
nematicida mas ampliamente utilizado y es fitotóxico. El uso del DBCP fue suspendido
en California durante 1977 y cancelado su registro en diversos lugares de Estados
Unidos, ya que se demostró que los mantos freáticos estaban contaminados con
nematicidas como el EDP y el DD (Whitehead et al., 1994).
En México los nematicidas que más se utilizan son los carbamatos, aldicarb
(Temik) carbofuran (Furadan) y oxamyl (Vydate) (CONPAPA, 1994). Los nematicidas
además de ser costosos sus residuos pueden permanecer en el tubérculo hasta después
de la cosecha (Gommers et al., 1992).
21
2.5.2. Control físico
Una técnica no contaminante es el uso de la energía solar, la cual consiste en
calentar el suelo hasta una temperatura letal para los estados móviles del nematodo. El
efecto invernadero que se produce bajo el plástico permite que la temperatura del suelo
alcance valores de 5-12°C, superiores a los del aire, esto es letal para los nematodos
hasta 20-30 cm de profundidad. Este método es efectivo con niveles poblacionales
medios-bajos del nematodo del quiste de la papa (25 huevos/g de suelo).
Sin embargo es poco utilizado ya que se requiere que el terreno este libre de
cultivos en el verano y que la temperatura sea muy elevada, lo cual no es factible donde
se cultiva papa ya que las temperaturas a lo largo del año son muy bajas. El efecto
detrimente en otros agentes de control biológico en el suelo tiene que ser también
considerado (Mani et al., 1993).
2.5.3. Inundación Artificial y Natural
Las inundaciones matan a los nematodos del suelo, pero las inundaciones
artificiales resultan ser una herramienta costosa en el control de nematodos, aún para
los productores comerciales, y no es recomendable para los pequeños productores
(Bridge, 1996). En México, la mayoría de la superficie dedicada al cultivo de papa se
localiza en zonas de montaña bajo régimen de temporal (CONPAPA, 1994).
2.5.4. Rotación de cultivos
La rotación de cultivos es efectiva en la lucha contra G. rostochiensis, que tiene
un rango de hospedantes limitado, se pueden lograr buenos resultados cultivando papa
cada cuatro o cinco años en suelos infectados. Estudios dirigidos en Bolivia demostraron
que la mejor secuencia después de cultivar papa para reducir densidades de quistes, fue
cultivando cebada y frijol lima, por un año, posteriormente barbechar y sembrar papa
otra vez (Canto-Sáenz y Mayer de Scurrach, 1993).
22
Para poder recomendar una rotación efectiva, es necesario determinar el nivel
poblacional de los nematodos (Trudgill, 1991). El ciclo de siembra primavera-verano es
el más favorable para la reproducción del nematodo y ocasiona el daño más grave, la
tasa de reproducción de G. rostochiensis es en promedio de 39% con siembra de
primavera y el 8-9% con siembra en verano e invierno (Greco y Moreno, 1992).
2.5.5. Control genético
El cultivar de papa juega un papel importante sobre la dinámica de Globodera
pallida y G. rostochiensis. Se conocen cultivares susceptibles a ambas especies y
cultivares resistentes o parcialmente resistentes a una sola de ellas, que afectan la tasa
de reproducción de los nematodos. En presencia de cultivares resistentes los juveniles
de segundo estadío salen del quiste, penetran en las raíces, pero no se desarrollan. A
veces, la reducción poblacional, utilizando un cultivar resistente, puede ser mayor que
utilizando un cultivo no huésped o dejando el suelo en barbecho. El uso de cultivares
resistentes ejerce una presión selectiva sobre el nematodo, debido a que no existen
cultivares resistentes a ambas especies o a todos los patotipos de la misma especie
(Greco y Moreno, 1992).
La resistencia a G. rostochiensis ha sido buscada en Solanum tuberosum,
subespecies andigena y la resistencia de los híbridos resultantes de las cruzas con S.
andigena, lo que ha hecho necesario continuar con las investigaciones teniendo en
cuenta al patotipo presente en cada región, puesto que las variedades resistentes no se
comportan de igual manera con todos los patotipos existentes (Kirkham y Marshall,
1996).
23
incidencia de una especie o patotipo, pero favorece el desarrollo de la otra. Se ha
determinado que el uso continuo de un mismo cultivar resistente ocasiona la selección
de patotipos que antes no eran importantes.
Las razas se diferencian por su patogenicidad o por la habilidad que tienen de
multiplicarse en los clones con resistencia proveniente ya sea de S. tuberosum subsp.
andigena, S. multidissectum, S. vernei y S. kutzianum (Evans y Stone, 1977).
2.5.6. Plantas antagonistas y cultivos trampas
Muchas plantas poseen propiedades nematicidas; las más reportadas son las
Tagetes spp. como las caléndulas africanas T. erecta, caléndula francesa T. patula, la
caléndula sudafricana T. minuta, al igual que la mostaza y espárragos que al producir
elementos tóxicos son factibles para el control o reducción de nematodos y otros en
ciertas circunstancias (Sukul, 1992).
Sin embargo pocas veces las legumbres son utilizadas por los productores,
porque los abonos verdes no generan ganancia directa y al usarlos solo para el control
de quistes de nematodos no será económicamente viable (Prot et al., 1992).
2.5.7. Legislación del control
En los países donde se encuentra presente el nematodo dorado de la papa, una
de las primeras prácticas llevadas acabo son las cuarentenas, ya que es la manera
inmediata de prevención que impide la diseminación del parásito (EPPO, 1997).
en el mismo campo, de manera que el uso de un cultivar resistente puede reducir la
Por otro lado, ambas especies o diferentes patotipos de ellas, pueden encontrarse
24
Vegetal establece cuarentenas en regiones afectadas, la cual comprende aspectos
oficiales que deben cumplirse para fomentar y proteger contra el ataque del nematodo
dorado a la producción nacional de papa (siembra, cosecha, tratamiento, transporte y
movilización de semillas, entre otras).
Sin embargo, está cuarentena no se ha cumplido en la región del Cofre de
Perote, ya que se continua sembrando papa en los campos abiertos y se siguen
eliminando áreas de bosque para dicho cultivo.
El quiste de la papa puede difundirse con los tubérculos utilizados como semilla,
es necesario que la papa para semilla sea producida en áreas donde estos parásitos no
estén presentes y debe ser certificada como libre de nematodos y otros patógenos. En
muchos países el uso de semilla certificada es limitado; mucha semilla es producida por
los mismos agricultores o por otros de la misma zona, sin ningún tipo de control
fitosanitario (Trudgill, 1991).
2.6. Control biológico de nematodos fitoparásitos
Varios aspectos del control biológico de los nematodos parásitos de plantas han
sido revisados por Mankau (1981) y han impulsado, el estudio de los enemigos
naturales para el control de nematodos (Sayre y Walter, 1991). El manejo apropiado de
organismos antagónicos dispuestos a la protección de la planta contra patógenos
constituyen una forma de control biológico y una alternativa para el control de
nematodos (Azcon Aguilar y Barea, 1997).
Organismos como hongos, bacterias, virus y protozoarios han sido identificados
como parásitos o predadores de nematodos (Dackman et al., 1992; Adams, 1990;
Deacon, 1991; Stirling, 1991).
Fitopecuaria de los Estados Unidos Mexicanos y su Reglamento en materia de Sanidad Es por ello que la Secretaria de Agricultura, con base en la Ley de Sanidad
25
No obstante que las bacterias son el grupo más abundante dentro de los
microorganismos del suelo, poco esfuerzo ha sido dirigido a su estudio como agentes
potenciales de control biológico para nematodos (Sayre y Walter, 1991).
Diferentes bacterias se ha reportado asociadas con la cutícula, cavidad del
cuerpo, aparato digestivo y las gónadas de nematodos; sin embargo como lo señala
Sayre y Walter (1991) la naturaleza parasítica de tales asociaciones es dudosa debido a
la ausencia de la aplicación rigurosa de los postulados de Koch (Stirling et al., 1990).
Uno de los mayores problemas al utilizar bacterias como agentes de control
biológico, es la dificultad de cultivarlas “in vitro” en cualquiera de los medios
bacteriológicos estándar. Ni las células vegetativas ni las esporas del organismo pueden
ser cosechadas en cantidades suficientes para examinarlas extensivamente en el
laboratorio o para infestar suelos en los que se puedan realizar exámenes de campo a
gran escala con el fin de determinar la viabilidad del organismo como un agente de
control biológico contra nematodos (Mankau, 1981).
2.6.2. Rickettsias
Son microorganismos intracelulares que fueron encontrados en especies de
quiste de nematodos: Heterodera goettingiana (Woll.) y G. rostochiensis por Shepherd
et al. (1972).
2.6.3. Nematodos Depredadores
Son importantes en la dinámica de población de numerosas especies de
nematodos del suelo puesto que su biomasa en algunos suelos son sustanciales, sin
embargo, su papel en el control biológico de nematodos fitófagos es poco conocido.
Los nematodos Monochida, Dorylaimida y Diplogasterroidea son considerados
como predadores y posibles agentes de biocontrol de nematodos parásitos de plantas.
El género Monochida ha llamado más la atención que cualquier otro depredador que
2.6.1. Las bacterias en el control biológico de nematodos fitopatógenos
26
vive en el suelo, hay observaciones de laboratorio sobre la alimentación de los
monochidos que concluye que estos depredadores no tienen eficiente habilidad de
alcance o tropismo hacia la presa (Nelmes y Mculloch, 1975).
Ciertas especies de Dorylaimida son abundantes en suelos, aunque su diversidad
de números y especies parecen declinar en suelos removidos por frecuentes
operaciones agrícolas. Mientras muchas especies son omnívoras, un número sustancial
de especies son depredadoras. En general los hábitos alimenticios de este grupo de
nematodos son poco conocidos, su ciclo de vida tiende a ser relativamente largo y bajas
tasas de productividad por individuo.
2.6.4. Depredadores Heterogéneos
Otro grupo importante de depredadores de nematodos son los ácaros Sayre et al.
(1991). Los colémbolos y ácaros están entre los más numerosos artrópodos del suelo, la
mayoría de los colémbolos se alimentan de materia descompuesta de plantas, hongos,
humus y a veces son depredadores de nematodos (Mankau, 1981).
De manera similar, los ácaros de suelo muestran una variedad de hábitos
alimenticios, incluyendo la depredación. Se ha demostrado que los colémbolos se
alimentan vorazmente de Heterodera y nematodos que viven libremente (Gilmore,
1970).
Además su distribución en el suelo difiere de la de los nematodos parásitos de
plantas. Las densidades mas altas de microartropodos se encuentran en la capa superior
del suelo, particularmente en basureros o en capas orgánicas en la superficie y también
están restringidas, por su tamaño a suelos con aberturas de poros suficientemente
grandes para que se puedan mover (Mankau, 1981).
27
Diversos investigadores han agrupado a los hongos según el modo de infectar o
el estadío del nematodo que infecta: predadores o atrapadores de nematodos,
endoparásitos, parásitos de huevos, hembras y productores de toxinas.
2.7.1. Los Hongos predadores o atrapadores de Nematodos
Desarrollan hifas, ramificaciones, redes semejantes a una telaraña y
protuberancias pegajosas, o bien forman anillos que pueden ser constrictores o no-
constrictores, con los cuales atrapan las larvas de nematodos (Dackman y Norbring-
Hertz, 1992). Los mecanismos de adhesión de nematodos, las estructuras del hongo
infecciosas y la competencia por infección han sido también investigadas (Barron,
1992). Después de la captura, los hongos desarrollan un apresorio, el cual se ramifica y
crece a lo largo del cuerpo. Este tipo de hongos esta relacionado con los estados
larvarios y las especies de hongos pertenecen a grupos diversos como Zygomycetes,
Deuteromycetes y Basidiomycetes. Han sido considerados prometedores agentes
biológicos para control de nematodos.
Arthrobotrys oligospora (Corda) forma redes de hifas, Monacrosporium
cianopagun (Oudem) desarrolla ramificaciones, Dactylaria candida (Sacc.) produce
protuberancias y también es considerada como un hongo no constrictor. Stylopage sp. y
Cytopage sp. tiene hifas inmodificadas. Entre los formadores de anillos constrictores
están D. brochopaga y A. dactyloides. En hongos endoparásitos los conidios también
muestran sofisticadas adaptaciones morfológicas para habilitar su interacción con los
nematodos.
Su comportamiento predador en las placas de agar los convierte en fascinantes
organismos de estudio y especialización. Algunos de los primeros exámenes en
invernadero o en el campo probablemente tendieron a exagerar su potencial y no
fueron diseñados para evaluar críticamente los efectos sobre los nematodos. La mayoría
de esos experimentos consistieron generalmente en añadir un hongo en un suelo
modificado con materia orgánica, con el objetivo de que los hongos aumentaran en la
2.7. Hongos parásitos de nematodos
28
modificación y especialmente los parásitos atacan a los nematodos, antes o después de
haber utilizado el sustrato.
Todo lo que se conoce sobre el hongo examinado es que en algún punto, este
había atrapado a los nematodos. El criterio general que se empleó para escoger a un
hongo como agente de control fue que éste debía ser útil y fácilmente cultivado (Abawi
y Thurston, 1992).
Cook y Baker (1983) demostraron que la oportunidad de establecer especies
“foráneas” en la fase predatoria es pequeña. Ninguno de los hongos que examinaron
parecieron ser capaces de colonizar y explotar rápidamente el micro hábitat del suelo.
Fueron considerados saprofitos poco competitivos y fueron susceptibles al antagonismo
de otros organismos del suelo ; además demostraron persistencia en el suelo, incluso en
la presencia de fuentes de energía.
Así mismo Cook y Baker (1983) reexaminaron algunas de las relaciones
ecológicas en que se incluyen a los hongos predadores e identificaron algunos de los
problemas asociados al utilizarlos como agentes de control biológico antes de que
suceda la depredación, el crecimiento micelial y la formación de la trampa. Ambos
procesos requieren energía la cual puede ser proporcionada por una fuente de
nutrientes fácilmente disponible.
Por lo tanto la adición de modificaciones orgánicas en el suelo es seguida
generalmente por un corto periodo, en el cual aumenta la actividad de los hongos
predadores de nematodos. Cook y Baker (1983) indicaron que la captura de los
nematodos podría ser un medio de actividad en el microhábitat con sustratos orgánicos
fácilmente disponibles.
También notaron que la depredación no se relacionó aparentemente con la
densidad de la población del nematodo a pesar de que la adaptación de modificaciones
29
orgánicas en el suelo resulta en un aumento de la población de nematodos disolutos; de
hecho el incrementar el número de modificaciones podría resultar en una reducción en
la actividad de depredación de los hongos.
Esto sucede debido a la intensificación en la actividad de los microbios del suelo
que compiten con los hongos predadores por los nutrientes. Obviamente, las
interacciones complejas entre los hongos predadores, que descomponen sustancias
orgánicas y el remanente de la población microbiana del suelo determinan el final de
cada uno de ellos en el suelo.
Las capacidades nutricionales de los predadores del nematodo siguen siendo un
aspecto enigmático de su biología que se requiere de próximas investigaciones para
comprender que es lo que inicia la actividad predadora y cuanto tiempo puede durar.
El factor que requieren los hongos depredadores para ser activados cuando la
materia orgánica es adicionada al suelo ha sido auxiliar para mantener a los hongos de
interés como agentes biológicos (Mankau, 1981; Gray, 1988). Sin embargo los estudios
sobre ecología nutricional tienen poco interés en este grupo de hongos como mayores
contribuidores de un control biológico (Cook y Baker, 1983).
Además la actividad trampa fue descrita como un mecanismo utilizado por el
hongo para contrarrestar el estrés nutricional, asociados con efectos de competencia de
otros organismos saprofitos usando la materia orgánica como su principal substrato
(Quinn, l987).
Las adaptaciones de las hifas que hacen las trampas de hongos predadores son
comunes, sin embargo, estudios recientes han demostrado que especies que producen
30
trampas o clavijas de infección que penetran a los nematodos capturados, despiden una
sustancia o toxina que inmoviliza al nematodo casi inmediatamente. Algunos hongos
predadores tienen órganos que expulsan sustancias atractivas para los nematodos
(Jansson, 1982).
2.7.2. Los hongos endoparásitos
Estos hongos no forman hifas para atrapar los nematodos, en estos hongos las
esporas hacen contacto con la cutícula del nematodo o por la ingestión de ellas,
posteriormente germinan en el esófago y desarrollan su micelio en el interior del
nematodo, hasta que las estructuras reproductoras de los hongos rompen su pared
debido a la esporulación. Pueden parasitar larvas, hembras, quistes y huevos. Los
grupos a los que pertenecen son Chytridiomycetes, Oomycetes, Zygomycetes,
Deuteromycetes y Basidiomycetes. La habilidad saprofitica/parasitica de los hongos
nematófagos es importante en la relación de biocontrol de nematodos por hongos
(Kerry y De Leij 1992; Barron, 1992).
Esto sugiere que poseen similitudes que los habilitan para alimentarse sobre los
nematodos y sobrevivir en el ecosistema del suelo (Nordbring-Hertz et al., 1993).
Más que hongos endoparásitos son considerados como específicos para
desarrollarse sobre nematodos, aunque varían en la especialidad del hospedero atacan
quistes y huevos de nematodos (Barron, 1977; Bird, 1987). Los endoparásitos han sido
estudiados principalmente en laboratorio e invernadero y aunque se han hecho
aplicaciones de este tipo de hongos directamente en suelos para el control de
nematodos, los resultados han sido variados (Jaffee y Zehr, 1982; Jansson, 1982; Kerry,
1990a; Schuster y Sikora 1992b; Sikora, et al., 1990; Uziel y Sikora, 1992; Roessner,
1987; Morgan-Jones et al., 1986).
31
Aunque el interés en los endopatógenos ha sido poco por la búsqueda de
antagonistas comercialmente viables; el potencial antagonista de los endoparásitos
puede ser manejado.
Las relaciones bioquímicas, parásitas y predadores con los nematodos han
evolucionado entre los diferentes grupos de hongos del suelo (Gray, 1988). La función
de estos hongos juega un papel en el control natural y también por el interés biológico y
bioquímico asociado con los procesos de captura, penetración y digestión (Dackman et
al., 1992; Barron, 1992).
Las esporas de los hongos se han adaptado y especializado en la captura o
penetración de los nematodos. Entre los hongos inferiores, las zoosporas móviles
parecen tener tropismo positivo hacia los nematodos. La mayoría de las especies con
zoosporas no móviles poseen propiedades adhesivas especiales para adherirse
instantáneamente a las cutículas de los nematodos transeúntes.
También parece ser buena evidencia que las hifas asimilativas o haustorios de los
hongos predadores encontrados dentro del nematodo liberan un antibiótico que impide
el desarrollo de microorganismos competidores en el nematodo capturado (Barron,
1977). El contenido de los cuerpos de los nematodos capturados es consumido
solamente hasta que una cutícula llena de hifas asimilativas lisas, permanece.
Existen aberturas naturales tales como la cavidad bucal, poro excretorio, vulva, y
ano, a través de las cuales microorganismos secundarios pueden introducirse. No
obstante, los organismos competidores rara vez se desarrollan en los nematodos
capturados en las trampas de hifas de la mayoría de las especies de hongos predadores.
32
Los conidios de los hongos predadores de nematodos son de mayor tamaño que
la mayoría de saprofitos del suelo y tienen abundantes reservas de nutrientes que
pueden ser utilizados para producir inmediatamente una o más trampas de las cuales
los hongos dependerán para así alimentarse y desarrollarse en un medio predatorio.
Muchas especies tienen conidios que no toleran la desecación y por lo tanto no
son el escenario en el cual la mayoría de estos hongos sobrevive en condiciones
adversas en el suelo, también parecen ser fácilmente disueltas o destruidas por acción
de las lisinas, aparentemente los conidios proporcionan un método de propagación a
más corto plazo y podría ser la manera en que el hongo puede convenientemente,
cambiar de modo nutricional predatorio a saprofítico o viceversa.
Los hongos mas estudiados han sido los que se presentan en larvas; Barron
(1977) registró 19 especies de hongos predadores y 19 de hongos endoparásitos
(cuadro 2).
Cuadro 2. Hongos predatores y endoparásitos de larvas de nematodos (Barron, 1977).
Predatores Endoparásitos
Arthrobotrys anchonia Acrostalagmus goniodes A. arthrobotryoides A. obocatus A. conoides A. zeosporus A. dactyloides Cephalosporium balanoides A. fragans Gonimochaete horridula A. musiformis Haptoglossa heterospora A. oligospora Harposporium anguillulae Dactilaria candida H. baculiforme D. haptospora H. crassum D. megalospora H. diceraeum D. thaumasia H. helicoides D. brochopaga H. sicyodes Dactylella bembicodes Meria coniospora D. cionopaga Nematoctonus leiosporus D. gephyropaga N. leptosporus Nematoctonus campylosporus N. pachysporus N. concurrens N. tylosporus N. haptocladus Paecilomyces coccospora N. robustus Verticillium sphaerosporum
33
2.7.3. Productores de toxinas
Son hongos que se desarrollan dentro de los tejidos de las plantas, como las
endomicorrizas, y manifiestan tener influencia en la relación de parasitismo para
nematodos endoparásitos sedentarios y migratorios.
2.7.4. Hongos facultativos antagonistas de nematodos
Los hongos que infectan a los huevos de nematodos parásitos de plantas han
sido clasificados como patógenos facultativos, u hongos facultativos oportunistas
(Morgan-Jones y Rodríguez-Kabana, 1985; Sikora et al., 1990).
Muchos hongos colonizadores de quistes y huevos de nematodos, también se han
estudiado a nivel de laboratorio e invernadero, y en menor medida en pruebas
experimentales de campo. (Jatala, 1986; Kerry, 1990a; Morgan-Jones y Rodríguez
Kabana, 1988; Nicolay y Sikora 1989; Roessner, 1987; Schuster y Sikora 1992a; Sikora
et al., 1990; Uziel y Sikora, 1992).
El manejo de saprofitos facultativos es más complicado en el ecosistema del
suelo porque son parásitos obligados, los saprofitos no dependen de los nematodos
como una fuente de nutrientes.
Obstáculos adicionales son el manejo, insuficiente conocimiento de la etiología,
biología de muchos patógenos y los bajos métodos convenientes para determinar como
manipular los efectos y sus niveles del potencial antagonista (Nicolay y Sikora, 1991;
Jatala, 1986; Kerry, 1987).
34
2.7.5. Hongos parásitos de huevos, hembras y quistes
El descubrimiento de hongos parásitos en los huevos de nematodos parásitos de
plantas ha sido reciente. Barron (1977) consideró que solo Rhopalomyces elegans
(Corda) era un parásito de huevos declarado; sin embargo, este nunca ha sido
relacionado con los huevos de nematodos plaga.
Los huevos y quistes de nematodos de Heterodera spp. debido a su importancia
como principales parásitos de plantas, han sido frecuentemente examinados y
ocasionalmente buscados para ser infestados. La viabilidad de los huevos de Heterodera
declina cuando el tiempo pasa y estos permanecen en el suelo, se sospecha que los
hongos están implicados en esto.
La mayoría de los hongos atacan a los huevos y parecen producir hifas internas
bastante similares y solo pueden ser identificados después del aislamiento y la
subsecuente esporulación (Kerry y De Leij, 1992).
Las especies encontradas comúnmente asociadas con los quistes de Heterodera
corresponden al género Exophiala spp., Fusarium spp., Gliocladium spp., Paecilomyces
spp., Phoma spp. y Verticillium spp. (Dackman et al., 1992; Nigh et al., 1980).
Goswami y Rumperhorst (1978) reportaron unos hongos no identificados junto
con Fusarium oxysporum (Link) y F. solani (Mart) asociados con quistes de G.
rostochiensis en Alemania Occidental, los cuales no fueron aislados de un cultivo puro:
probablemente corresponden a Exophiala, posiblemente E. jeanselmei (Carmich.) E.
mansonii (Castell) E. pisciplila (Mc Ginntis), los hongos fueron reportados por infectar
varios patotipos de G. rostochiensis .
35
Es importante hacer notar que Pseudoeurotium ovale y Humicola grisea (Traaen)
también han sido reportados por encontrarse sobre quistes de H. glycines (Ichioche)
(Gintis et al., 1983).
Dos hongos zoosporicos los cuales son Catenaria auxiliaris (Sorokin), y
Nemathophora gynophila (Kerry) Kerry y Crump no han sido encontrados en laboratorio
en poblaciones de G. pallida.
Las hembras adultas de nematodos parásitos de plantas son objeto de infección
por hongos facultativos y parásitos obligados. De los parásitos obligados más
importantes esta N. gynophila que parásita quistes de nematodos de Heterodera la
densidad de N. gynophila pudo establecerse por los restos de la cosecha, manteniendo
el incremento y la disponibilidad de hembras adultas en el suelo (Kerry, 1987). La
patogenicidad más registrada ha sido en H. avenae y la patogenicidad del hongo no se
extiende para G. rostochiensis (Jones, 1976; Kerry y Crump, 1980; Kerry, 1990b). En el
caso de el parasitismo obligado tiene límites, las prácticas y el manejo de sistemas de
cultivos favorecieron al nematodo.
Aún cuando en Europa se realizan continuamente rotaciones de cultivos, la
mezcla de Heterodera schachtii y H. avenae es común, ambos nematodos son
hospederos, y los parásitos deben aumentar si las rotaciones de los cultivos han sido
desarrollados con cierta tolerancia. En algunas rotaciones la irrigación puede ser usada
para incrementar la actividad de las zoosporas que infectan a la hembra. Los parásitos
facultativos de hembras pueden ser manejados efectivamente con una correcta
integración de nematicidas, cultivos tolerantes y rotaciones de cultivos cortos.
Estos componentes combinados pueden tener un control efectivo sobre la
primera generación de H. schachtii con Verticillium chlamydosporium (Goddard) y la
segunda generación con Cylidrocarpon destructans (Woll.) (Crump, 1989; 1991; Yu O y
Coosemans, 1998).
36
Verticillium chamydosporium ha sido recientemente seleccionado por ser
competente en la rizosfera (De Leij y Kerry, 1991). Esta afinidad por las raíces pudo ser
utilizada para intensificar el control sobre las hembras. La selección del cultivo y la
manipulación, tratamientos físicos y biológicos del hospedero son factores que pueden
incrementar la colonización y control en la rizosfera.
La relación de los hongos con la patología del quiste fue reexaminado por Tribe
(1980), quien enlisto a V. chlamydosporium y otros “hongos contorsionistas” no
esporuladores. Como resultado de sus estudios Tribe (1989) encontró a C. destructans
en quistes de Heterodera schachtii en Inglaterra y Alemania.
Tribe, discutió también la relación de un número relativamente común de hongos
en el suelo, que se reportan frecuentemente por estar en asociación con los quistes de
Heterodera. Analizó 112 poblaciones de H. schachtii de varios países, un poco más de
un cuarto de esta población constaba de hembras y quistes tomados de las raíces.
En términos generales, el 14% de todos los quistes tomados del suelo estaban
enfermos, sin embargo, en monocultivos de remolacha azucarera poco más del 50%
estuvieron enfermos y observó una gran viabilidad entre las muestras con algunos que
no contenían ningún quiste enfermo.
Las hembras tomadas de las raíces tenían mas o menos porcentajes similares de
ataque de hongos, pero fueron infestados por parásitos específicos en Catenaria
auxiliaris y algunos de los parásitos de huevos ya mencionados estuvieron involucrados.
Tribe reconoció dos clases de hongos en quistes y huevos, la primera se presenta
en la raíz del hospedante entre las hembras y quistes jóvenes, la segunda en quistes en
el suelo durante un largo periodo de tiempo.
37
Muchos hongos que habitan el suelo colonizan constantemente quistes de
Heterodera, sin embargo no se tiene una percepción en el control e influencia sobre la
población (Morgan-Jones y Rodríguez-Kabana, 1988).
Del pequeño y selecto grupo que son los patógenos de nematodos enquistados,
Verticillium spp. es uno de los más importantes; más especies en este género, se han
registrado ocurriendo en quistes y en huevos de Globodera, Heterodera y Meloidogyne
(Morgan-Jones y Rodriguez-Kabana, 1988).
Godoy et al. 1983, examinó in vitro 14 especies de Verticillium, sobre huevos de
Meloidogyne arenaria (Ichonohe) los parásitos de huevos más efectivos fueron V.
leamellicola y V. leptobactrum. Verticillium chlamydosporium es un importante parásito
de quistes (Kerry y Crump, 1991); y es una de las principales causas de la disminución
del número de quistes de nematodos de cereales (Schennk y Hinson, 1997). Coloniza
frecuentemente a las hembras y al nematodo enquistado y reduce su fertilidad, dando
paso a pequeños quistes conteniendo pocos huevos saludables (Kerry, 1990b; Schuster
et al., 1992b).
Algunas especies del género Paecilomyces, que penetra la cutícula de la cáscara
del huevo por medio de hifas, produciendo un crecimiento ó hinchazón; por medio de
un apresorio, se distribuye totalmente en el contenido del huevo; los mecanismos que
se consideren para la habilidad del hongo pueden ser, primero una alteración enzimática
que afecta la permeabilidad del huevo incluso causar desordenes fisiológicos antes de la
penetración de la hifa, y segundo, toxinas fungosas, las cuales podrían afectar los
huevos deteriorándolos y finalmente matar la larva. Paecilomyces nostocoides
morfológicamente similar a P. lilacinus ha demostrado ser capaz de colonizar huevos de
H. zeae in vitro (Godoy et al., 1983). Un antibiótico péptido puede ser responsable para
la exitosa habilidad saprofitica del hongo (Davide y Zorrilla, 1995). P. lilacinus se ha
encontrado provocando desordenes fisiológicos, que conducen a un crecimiento y
maduración vacilante de etapas juveniles. Por lo tanto, es capaz de mantener contacto
38
con nematodos parásitos de plantas por el establecimiento del mismo en las especies de
nematodos de la raíz, pero ese comportamiento de colonización requiere confirmarse en
un ambiente más natural.
Hirsutella rhossiliensis (Minter y Brady) también ha sido reportado como un
parásito común en el segundo estado juvenil de Globodera rostochiensis en Holanda
(Velvis y Kamp, 1995). El valor de H. rhossiliensis radica en su capacidad de infestar
nematodos parásitos de plantas como Globodera, Heterodera, Meloidogyne,
Pratylenchus y Datylenchus , también parásita nematodos como H. schachtii (Jaffee et
al., 1991) y otros nematodos parásitos más o menos específicos (Núñez-Fernández,
1992; Timper y Brodie, 1993; Jaffee et al., 1994).
Hasta la mitad de la década de los setenta, no se tenían registros de hongos que
parasitaran a quistes de G. rostochiensis, y se llegó a plantear que no tenía antagonistas
fungosos en suelos agrícolas de regiones templadas como en Inglaterra, (Willcox y
Tribe, 1974; Kerry y Crump, 1991), lo anterior debido a la reducida apertura del cono
vulvar y la presencia de una capa de cutícula adicional que funcionan como barreras
para la penetración de los hongos parásitos y depredadores (Tribe, 1980).
2.7.6. Distribución de hongos parásitos de nematodos
Con los estudios realizados en muchas áreas del mundo se ha comprobado que
las especies conocidas de los hongos endoparásitos, depredadores de nematodos son
cosmopolitas. Lo que ahora se requiere con respecto a la distribución son
investigaciones sobre: las relaciones de varías especies con los factores bióticos y
abióticos en el suelo, efectos de cosecha, diferentes tipos de suelo y microhábitats. Se
han observado algunas diferencias en la distribución vertical en el suelo; sin embargo, la
mayoría de las especies parecen acontecer en las capas superiores de cualquier tipo de
suelo (Kerry y De Leij, 1992).
39
Algunos hongos depredadores asemejan ser organismos que habitan la rizósfera,
mientras que otros pueden ser clasificados como no-rizósferos. Las relaciones con las
plantas rizósferas podrían ser aspectos importantes de las capacidades de control
biológico de dichos hongos. Las especies que suceden en la rizósfera pueden estar
mejor situados para influir en las poblaciones de nematodos parásitos de plantas.
Por experiencia, Arthrobotrys dactyloides, Dactylaria brochopaga,
Monacrosporium ellipsosporum, y M. gephyropagum, que se encuentran entre las
especies con capacidades saprofíticas restringidas, están todas estrechamente
relacionadas con raíces de plantas muy consistentes y, por lo tanto, se encuentran en
una posición favorable para atrapar los nematodos parásitos de plantas.
Un resumen de los hongos encontrados sobre diferentes especies de nematodos
parasitando hembras, huevos y quistes se presenta en el cuadro 3. En particular sobre
las especies de G. pallida y G. rostochiensis se encontraron 28 especies en Perú,
considerado como centro de origen (cuadro 3).
40
Cuadro 3. Reportes de hongos parásitos de hembras, huevos y quistes de nematodos en diferentes regiones en el mundo.
NEMATODOS HONGOS PARASITOS INTERACCIÓN AUTOR
Heterodera ave nae
Heterodera schachtii Cylindrocarpon destructans
Verticillium ChlamydosporiumAcremonium strictumFusarium oxysporum
Caternaria auxiliarisPhialphora malorum
Heterodera glycines Acremonium strictumFusarium oxysporumFusarium solaniPhoma spExophiala pleociphilaStegonospora heteroderaePaecilomyces lilacunus
Verticillium chlamydosporium
Microdochium bolleyiCatenaria auxiliarisHongos no identificadosBispora spp.Periconia macroaphoneasCylindrocarpon destructansNematophthora gynophila
Heterodera mediterránea Cyliindrocarpon destructans
Heterodera avanaeH. cajani, H, graminisH. mothi, H. zeae
Globodera rostochiensisGlobodera rostochiensisy G. pallida
Catenaria auxiliarisC. vermicola
Quistes no enfermosAspergillus sydiwiiCladosporium cladosporoidesCylindrocarpon destructansC. didymunC. gracileDrechslera australiensisExophiala pisciphilaFusarium. oxysporumF. semitectumF. solani,F. moniliformeGliocladium catenulatumG. roseumHumicola griseaPaecilomyces lilacinusP. variottiiPenicillium chrysogenumP. restrictumP. rubrumPhoma americanaRamichloridium schulzeriScolecobasidium tscha wytschaeStachybotrys chartarumTrichocladium asperumTrichoderma harzianumT. longibrachiatumUlocladium atrum
Endoparásito
---Endoparásito- - -- - -
Willcox y Tribe (1980); Kerry(1990); Tribe (1980); Stirling yKerry (1983)de Hoog y Hermanides-Nijhof (1977)Stirling y Kerry (1983) Keny (1990)Rogers (1987)
- - -Parásito de huevosEndoparásito
Endoparásito y parásitode huevosEndoparásitoParásito de huevosParásito de huevos
y hembrasEndoparásito--------
Parásito de huevosParásito de huevosParásito de huevos
Kerty (1990)Kerry y Crump (1980)
Willcox y Tribe (1980)
Bursnall y Tribe (1974)Nigh et al.( 1980)
Tribe (1980)
Morgan-Jones y RodríguezKabana(1981;1984
---------Parásito de huevosParásito de huevosParásito de huevos
EndoparásitoEndoparásito
Gintìs (1983); Cabanillas et al. (1989)Vovlas y Frisullo (1983)
Sharma y Swarup (1988)
------------------Parásito de huevos
Willcox y Tribe (1980)Morgan-Jones et al. (1986)
41
III. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Ubicación y descripción del área de estudio
La presente investigación se llevó en los laboratorios de la Universidad
Veracruzana y en de Fitopatología y control biológico del Instituto de Ecología en
Xalapa, Veracruz. Con muestras de suelo tomadas de cultivos de papa en seis
localidades: Los Pescados, Tembladeras, El Conejo, Rancho Nuevo, Escobillo y Los Altos
de la Región del Cofre de Perote, ubicada en la parte central montañosa del Estado de
Veracruz, el cual tiene una altitud de hasta 4,282 msnm. La región esta ubicada entre
los 19º19’30’’-19º48’58’’ de latitud Norte y 01º40’00’’-02º24’58’’ de longitud Este.
Comprende los municipios de Ayahualulco, Perote y Xico, en la vertiente oriental de la
Sierra Madre Oriental (Medina y Angulo, 1990). (Fig. 7).
3.1.1. Clima
El clima en el área de estudio se clasifica como C(W2”)B que varía desde
templado subhúmedo a semifrío; que tiene una temperatura media anual entre 5 y
12ºC, con un verano fresco y subhúmedo, con lluvias en verano; la precipitación media
anual es de 600 mm (Medina y Angulo, 1990).
3.1.2. Geología
El Cofre de Perote es un volcán cuyo origen data posiblemente del Mioceno o
Plioceno, formado en un solo periodo de erupciones y dependiendo de un foco volcánico
importante. Hay rocas cretácicas y sobre las mismas se encuentra un grueso manto de
material cinerítico de rocas riolíticas. El material madre de la zona de estudio es de la
Era Cenozoica, Periodo cuaternario y la roca es ígnea extrusiva básica (INEGI, 1990a).
42
Fig. 7 Ubicación geográfica de la zona de estudio.
43
3.1.3. Suelos
Predominan los andosoles húmicos, mólicos y feozem haplico y también se
encuentran zonas cuya unidad principal es regosol calcáreo y luvisol crómico. (INEGI,
1990b).
3.1.4. Hidrografía
Debido a las condiciones climáticas, topográficas y latitudinales en las que se
encuentra la montaña, en ella se originan varias corrientes de agua, principalmente en
la parte sur y oriental (ladera húmeda) que en ocasiones se convierten en grandes ríos
y afluentes. Entre los principales ríos se encuentran el río Actopan, el cual se origina a
una altitud de 3,000 msnm, cuya parte inicial de su recorrido se le conoce como río
Sedeño.
3.1.5. Topografía
En la región del Cofre de Perote se presentan acentuados cambios de altitud que
van desde 1200 a 4240 msnm. Como consecuencia de los derrames del volcán sobre
una porción de la Sierra Madre Oriental se ha conformado un paisaje abrupto con
pendientes que varían de 5-30°.
3.1.6. Vegetación
La vegetación original del área son: pinares (Pinus hartwegii, P. patula, P.
ayacahuite), bosque de Oyamel (Abies religiosa y A. hickelii), bosques de encinos
(Quercus crassifolia y Q. laurina), bosques caducifolios y sus respectivos ecotonos
generalmente se desarrollan sobre suelos de tipo andosol (Narave, 1985).
El bosque de oyamel A. religiosa se encuentra como un cinturón que rodea al
Cofre de Perote de la cota de los 3000-3500 msnm, pero debido a que se desarrolla
44
sobre suelos apropiados para el cultivo de la papa, Solanum tuberosum, se han talado
grandes áreas para el cultivo. En la actualidad solo se encuentran manchones
representativos del bosque alrededor de la montaña, mejor conservados hacia el
noroeste, al sur de la congregación del Escobillo y en los alrededores de El Conejo.
Conejos. Esta comunidad se localiza a una altura de 3140 msnm. El clima es
subhúmedo semifrío; cuya temperatura media anual varía entre 5 y 12º C y la más fría
se presenta entre -3 y 18º C; en un verano fresco con lluvias. La vegetación original
dominante es Abies spp. (oyamel); el uso del suelo de los predios es agrícola y de
pastoreo; el tamaño de la superficie destinada a uso agropecuario no es mayor de dos
hectáreas; la actividad pecuaria esta principalmente destinada a la explotación ovina.
Las labores culturales son realizadas con yunta (barbecho y surcado) y con azadón
(limpias y atierres); la rotación de cultivos generalmente es papa, avena y en pequeña
escala haba y ajo. Los factores limitantes en el cultivo de papa son las heladas y el tizón
tardío causado por el hongo Phytophthora infestans (Mont.) de Bary. El consumo de
plaguicidas es considerado como moderado.
Tembladeras. Se localiza a 3110 msnm; en comparación con los otros sitios de estudio
son los suelos más húmedos; el clima predominante es frío húmedo; con una topografía
irregular con inclinación que varía de 15 a 25º de pendiente. En el sitio de estudio el
cultivo se encuentra intercalado con árboles de Abies spp. (oyamel). La variedad de
papa más sembrada es San José, en esta localidad solo cultivan papa (monocultivo) y
después de la cosecha se utiliza para pastoreo de ovejas; las labores culturales se
realizan con arado de yunta y con azadón. Las enfermedades de la papa más
importantes son el tizón tardío causado por el hongo Phytophthora infestans y la
pudrición del tubérculo causado por el mixomiceto Spongosptera subterránea (Wall.
Lag.). El consumo de agroquímicos es considerado alto.
Rancho Nuevo. Se localiza a 3040 msnm; son frecuentes los vientos de suaves a
moderados; los suelos presentan alta erosión con pendientes aproximadas de 20° con
45
textura arenosa y alta pedregocidad. La vegetación arbórea que se localiza en los límites
de los predios son pinos y encinos; aunque son considerados suelos pobres, ácidos y
con poca fertilidad, se cultiva papa y se rota el cultivo con maíz o haba. El consumo de
plaguicidas se considera moderado.
Escobillo. Esta comunidad se encuentra a 3040 msnm; con presencia de vientos de
leves a moderados; con buena iluminación solar; la característica de los suelos es su
textura arenosa con alta pedregocidad y presentan fuerte erosión. La vegetación
colindante es bosque de pino-encino; la rotación de cultivos posterior a papa es maíz o
haba.
Pescados. Esta localidad se ubica a los 2980 msnm; y los terrenos destinados a la
agricultura en general tienen una topografía plana, son suelos con buen drenaje. El tipo
de clima corresponde a un templado húmedo con lluvias casi todo el año; la vegetación
dominante son especies de pinos. Los productores cultivan variedades de papas blancas
y de color, como son: Alfa, Atlantic, Atzimba, Diamante, Gema, Gigant, Marciana y San
José; la secuencia en la rotación de cultivos es papa, haba o maíz. En lo general los
productores aplican elevadas dosis de agroquímicos.
Los Altos. En esta comunidad el cultivo de papa se siembra desde hace mas de 50
años, se ubica a 2800 msnm. Aunque son considerados suelos pobres con poca
fertilidad en ellos se puede cultivar papa, maíz y haba. La textura del suelo es franco
arenosa con buen drenaje, son suelos con severa erosión eólica. La vegetación en este
sitio esta severamente afectada, debido al cambio de uso de suelo de bosque a uso
agrícola; las variedades de papa más utilizadas son Alfa, Gema y San José y el factor
limitante es la falta de humedad. La utilización de fertilizantes y plaguicidas es elevada.
46
Para llevar acabo este trabajo de investigación se programo el siguiente diagrama
de flujo de materiales y métodos (Fig. 8).
En cada una de las localidades y de suelos cultivado con papa, se tomaron cinco
submuestras (1 kg cada/una), distribuidas en forma de “cinco de oros”, durante el mes
de octubre del año 2000. Las submuestras se tomaron de los primeros 20 cm de
profundidad, con pala recta, eliminando la materia orgánica superficial. Cada muestra se
etiquetó con los datos de la localidad, municipio, predio, nombre del productor, variedad
de papa y fecha de colecta. En el laboratorio, las submuestras de cada localidad, se
extendieron en charolas de poliuretano para su secado en la sombra. Posteriormente las
submuestras se homogeneizaron y se obtuvo una sola muestra de cada localidad. Una
parte del suelo se utilizó para la evaluación de la materia orgánica y el pH, la otra parte
de la muestra sirvió para la extracción de los quistes del nematodo dorado de la papa.
3.1.8. Extracción de quistes
La extracción de quistes se realizó por el método de Flotador de Fenwick (1940),
el cual consiste, en vertir la muestra de suelo por un tamiz de 20 mallas/cm2, para
eliminar terrones y piedras al embudo, el cual debe de tener agua a dos tercios de su
capacidad; con ayuda de agua corriente se provoca la salida de material que por su bajo
peso flota, el cual es recuperado en un tamiz de 60 mallas/cm2 para materia orgánica y
125 mallas/cm2 para los quistes de G. rostochiensis. El material obtenido en el tamiz de
125 mallas/cm2 se vierte a un vaso de precipitado el cual en su interior contiene una
tira de papel filtro humedecido procurando no desprender la tira de papel. Finalmente
se agrega un poco de detergente en polvo, para romper la tensión superficial y de esta
manera los quistes se adhieran al papel filtro; una vez que el material se adhirió al
papel, este se saca y se coloca en una tapa de caja Petri para observarla al microscopio
estereoscopio (Fenwick, 1940).
3.1.7. Toma de muestras
47
Con el propósito de determinar la importancia del nematodo, G. rostochiensis, en
la zona productora de papa de la región Cofre de Perote, Veracruz, México; de los
quistes obtenidos y con ayuda de un microscopio estereoscopio, se cuantificaron y se
expresaron, como número de quistes/kg de suelo; en cada localidad de estudio.
De acuerdo a las condiciones morfológicas que presentaban los quistes obtenidos
fueron separados en tres categorías con base en su apariencia física: quistes jóvenes
(QJ): aquellos quistes con lozanía, al microscopio estereoscopio presentan brillo y se ve
la masa de huevos; quistes maduros (QM): quistes sin lozanía, no tienen brillo y la masa
de huevos presentaban diferentes manchas de color café oscuro-negro; quistes dañados
(QD): aquellos cuyo corión estaba afectado por causas no determinadas Roessner,
(1987).
Con el propósito de determinar si la densidad de población de G. rostochiensis, es
significativa entre las localidades estudiadas, a los datos de quistes, se les realizó un
análisis no paramétrico, al aplicarles la Prueba “G” de Bondad de Ajuste con Repetición
(Robert et al., 1995).
3.2. Aislamiento de hongos asociados a quistes
Para cumplir con el primer objetivo (aislar e identificar hongos nativos parásitos
de quistes de G. rostochiensis en la región del Cofre de Perote, Veracruz) se procedió de
la siguiente manera: una vez seleccionados los quistes aparentemente jóvenes y sanos
de cada localidad, se tomó un grupo de 100 quistes, se desinfectaron primero con
hipoclorito de sodio al 3% y después con alcohol al 70%, ambos durante un minuto,
posteriormente se lavaron tres veces con agua destilada estéril y se colocaron en papel
estéril para secarlos. La metodología de lavado aquí usada difiere con la de Morgan-
Jones et al. (1986), ya que ellos desinfectaron la superficie de los quistes únicamente
con alcohol al 70%. Cada quiste fue colocado en cajas Petri (56x15 mm) con placas de
3.1.9. Densidad de la población de quistes
48
agar con dextrosa y papa (PDA) a la que se le agregó un antibiótico (tetraciclina al 5%)
para evitar el crecimiento de bacterias
Las cajas fueron selladas con cinta parafilm, se etiquetaron por localidad de
estudio y numeradas del uno al 100 (n=100), de manera que se obtuvo una muestra
total de 600 quistes de G. rostochiensis y se mantuvieron a temperatura ambiente 21+
2°C.
Los quistes fueron examinados diariamente para detectar la presencia de micelio.
Aquellos quistes que presentaron desarrollo de micelio, se utilizaron para generar los
cultivos puros en placas de PDA, para llevar cabo la determinación de los hongos y
reproducirlos para su conservación.
3.2.1. Identificación de hongos
Para la identificación taxonómica de los hongos se tomaron en cuenta las
características morfológicas de las cepas: forma, posición, color y tamaño de sus
estructuras (conidióforos, células conidiógenas y conidios) y se utilizaron claves
especializadas (Ellis, 1971; Gams, 1971; Samson, 1974). Para la determinación de los
colores de los micelios de las cepas aisladas se utilizó la carta de colores de Methuen
(Kornerup y Wanscher, 1989).
3.2.2. Conservación de los aislamientos
Las cepas obtenidas en cultivo puro se inocularon en granos de sorgo
esterilizado, el cual fue colocado previamente en crioviales con capacidad de 2 ml. Una
vez desarrollados los micelios sobre los granos de sorgo, se prepararon para su
liofilización e incorporarlos al cepario del Instituto de Ecología.
49
3.3. Bioensayo del proceso de infección de hongos sobre quistes de Globodera rostochiensis
Con el propósito de verificar el proceso de infección de algunos de los hongos
aislados de quistes en este trabajo y con base en la literatura de géneros de hongos que
tienen antecedentes nematófagos, se seleccionaron tres especies: Acremonium
incrustatum Gams, Paecilomyces carneus Duché y Phialophora malorum Mc Colloch.
3.3.1. Preparación del inóculo
Las cepas antes mencionadas se reprodujeron sobre placas de PDA, después de
cuatro semanas de inoculadas, se preparó una suspensión de esporas (10ml) de cada
una de las especies con agua destilada estéril al 0.01% de Tween 80. El conteo de
esporas se hizo utilizando el hemacitometro de Neubauer. La suspensión de esporas
utilizada fue de 1 X 106 de A. incrustatum, P. carneus y P. malorum como lo indican
Crump y Irving (1992).
3.3.2. Obtención de quistes sanos
Muestras de suelo de cada sitio de estudio fueron llevadas al laboratorio y se
esterilizaron en autoclave durante más de 1 hr, una vez aireada se colocaron en 40
macetas de plástico con capacidad de un kg en las cuales se sembraron tubérculos de
papas variedad San José, previamente lavadas y desinfectadas con hipoclorito de sodio
al 3%. Al momento de la siembra las plantas de papas se inocularon en las macetas 20
quistes jóvenes. Todas las macetas se mantuvieron en un invernadero fijo, construido
con tubo de acero de media pulgada y una cubierta de plástico calibre 16, en la región
de estudio, con el fin de proteger las plantas de posibles heladas y excesos de
humedad, durante 6 meses que comprendió el ciclo vegetativo de la planta.
Los quistes fueron extraídos de las macetas, cuando la planta terminó su ciclo
vegetativo. Los quistes se extrajeron con la técnica de Flotador de Fenwick antes
descrita y se cuantificaron, posteriormente se depositaron en viales.
50
3.3.3. Inoculación de los quistes de Globodera rostochiensis
Los quistes sanos obtenidos de las macetas se lavaron con hipoclorito de sodio al
3% durante 1 minuto y se enjuagaron 5 veces con agua destilada estéril. Una vez
desinfectados los quistes, se prepararon para cada especie de hongo seis cajas Petri con
papel filtro esterilizado, en cada caja se colocaron seis grupos (cinco quistes/grupo)
conjuntándose un total de 30 quistes por caja.
Los quistes fueron inoculados asperjando 1ml de la suspensión de esporas con un
atomizador manual de gota fina. Para cada hongo inoculado se colocó un testigo que
fue asperjado con agua destilada estéril.
Las cajas Petri se mantuvieron a temperatura ambiente (20±3°C). El proceso de
infección se detuvo con lactofenol a las 12, 24, 48, 72, 96 y 120 horas después de la
inoculación (Crump y Irving, 1992), se observaron al microscopio compuesto y al
microscopio electrónico de barrido con la técnica de oro paladio.
3.3.4. Pruebas de patogenicidad
Con el propósito de determinar el efecto parasitico de los hongos sobre los
quistes de G. rostochiensis se procedió de la siguiente manera: por cada hongo
seleccionado se utilizaron cinco cajas Petri conteniendo 20 quistes sanos cada caja. A
los quistes se les aplicó la concentración de esporas antes mencionada. Para observar el
porcentaje de esporulación se preparó por cada hongo de prueba igual número de cajas
con quistes que servirían como testigos.
Para este experimento los quistes inoculados y los quistes testigos se
mantuvieron en observación durante 30 días, registrando que los quistes presentaran
desarrollo de micelio y esporulación. La evaluación se realizó diariamente para obtener
el porcentaje y presencia de la esporulación durante un mes. El diseño experimental
51
utilizado fue completamente al azar con cuatro tratamientos y cinco repeticiones,
haciendo un total de 15 unidades experimentales; los datos obtenidos, porcentajes, se
les hizo la transformación al Arco-sen de la √x, y se lea hizo el análisis de varianza,
ANOVA, y pruebas de medias de Tukey con 0.05 de probabilidad.
Fig. 8. Diagrama de flujo de Materiales y Métodos
IV.- RESULTADOS 4.1. Densidad de la población de Globodera rostochiensis en las localidades de estudio
Toma de Muestras
Extracción de los quistes Análisis de
Suelos
pH Materia Orgánica
Número de quistes de G. rostochiensis
/kg de suelo
Extracción de hongos
Aislamiento de hongos
Cultivos puros
Determinación de hongos
Selección de hongos
Bioensayo Proceso de infección
Clasificación de los quistes
Inoculación de macetas
Obtención de quistes sanos
Pruebas de Patogenicidad
52
La densidad de población de quistes G. rostochiensis fue muy alta en todo los sitios
estudiados. La cantidad obtenida de quistes totales de quistes/kg de suelo en cada
localidad fueron los siguientes: Conejos 1220, Tembladeras 2216, Escobillo 360,
Rancho Nuevo 1856, Pescados 1656, Los Altos 1140. Estas cantidades son superiores al
límite de tolerancia considerado por EPPO (1997) que indica que hasta con una
densidad de 40 quistes/kg de suelo no hay pérdidas o afectación en el desarrollo del
cultivo (Fig. 9). La Prueba “G” de Bondad de Ajuste con Repetición mostró, que la
densidad de población en cada localidad es significativamente diferente (Cuadro 4).
0
500
1000
1500
2000
2500
CONEJOS
TEMBLADERAS
ESCOBILLO
R.NUEVO
LOS P
ESCADOS
LOS A
LTOS
No.
de
quis
tes/
kg. d
e su
elo
Fig. 9. Total de quistes obtenidos por kilogramo de suelo por cada localidad de estudio
en el Cofre de Perote.
Cuadro 4. Análisis de los datos de densidad de población de quistes en las localidades de estudio, con la Prueba ”G” de Bondad de Ajuste con Repetición.
PRUEBA g. l. G. Datos agrupados 2 775.556* Heterogeneidad 10 185.8069* TOTAL 12 961.3629
53
* Significativo x2
0.05 (3-1)= X20.05 (2)= 5.9915
De acuerdo a las condiciones físicas que presentaron los quistes, el número de
quistes dañados (QD) fue mayor en todas la localidades (Figura 10), y el porcentaje
varió de 40.6% a 50.3% (Cuadro 5).
El número de quistes jóvenes (QJ) fue mayor en las localidades de Escobillo y Los
Altos, que la de los quistes maduros (QM), con valores de 99 y 300, respecto a 87 y 266
respectivamente, (Figura 10); mientras que el número de quistes maduros (QM), en las
localidades de Tembladeras, Pescados, Rancho nuevo y Conejos fue mayor que la de los
jóvenes, con valores de 696, 557, 468 y 331, respecto a 620, 228, 451 y 317,
respectivamente (Figura 10).
0
200
400
600
800
1000
CONEJOS
TEMBLADERAS
ESCOBILLO
R. NUEVO
PESCADOS
LOS A
LTOS
No.
de
quis
tes/
kg. d
e su
elo
QJ Quistes Jóvenes QM Quistes Maduros QD Quistes Dañados
54
Fig. 10. Clasificación de los quistes obtenidos de acuerdo a condiciones físicas por localidad.
Cuadro 5. Porcentaje de quistes en suelo en las localidades estudiadas, separadas en
categorías de acuerdo a su condición física. Comunidad Quistes Quistes Quistes Jóvenes Maduros Dañados % % %
Conejos 25.98 27.13 46.88 Tembladeras 27.97 31.40 40.61 Escobillo 27.50 24.16 48.33 R. Nuevo 24.29 25.21 50.48 Pescados 13.76 33.63 52.59 Los Altos 26.31 23.33 50.35
El análisis de los datos mostró que existen diferencias significativas entre todas
las localidades y, que son independientes (Cuadro 6).
Cuadro 6. Análisis de los datos de densidad de población de quistes en las localidades
de estudio, con la Prueba ”G” de Bondad de Ajuste con Repetición. Localidades g.l. G Conejos 2 96.055* Tembladeras 2 55.6516* Escobillo 2 35.2618* R. Nuevo 2 231.622*
Pescados 2 401.472* Los Altos 2 141.914*
TOTAL 12 961.9764 * Significativo x2
0.05 (3-1)= X20.05 (2)= 5.9915
4.2. Análisis de suelo
55
De las muestras de suelo de las localidades de estudio se determinaron los
siguientes niveles de pH y contenido de materia orgánica (M O). El nivel de pH en los
suelos de estudio varió de 4.54 a 6.0 en las localidades de Los Pescados y Los Altos
respectivamente. (Cuadro 7). El contenido de materia orgánica de los suelos varió de
1.47% en la localidad de Los Altos y 13.80% en Tembladeras (Cuadro 7).
Cuadro 7. Niveles de pH y contenido de materia orgánica de las muestras de cada localidad.
LOCALIDAD pH MO
Conejos 5.61 5.89 Tembladeras 4.90 13.80 Escobillo 5.60 3.88 Rancho Nuevo 5.00 5.29 Los Pescados 4.54 4.82 Los Altos 6.00 1.47 4.3. Correlación entre materia orgánica y densidad de quistes
Para verificar si existe correlación entre la materia orgánica, ph y la cantidad total
de quistes, quistes jóvenes, quistes maduros, quistes dañados (Quistes jóvenes, Quistes
maduros, Quistes Dañados), de las seis localidades estudiadas se realizó mediante la
prueba de correlación de Pearson del paquete estadístico SAS (1997).
La Hipótesis planteada fue la siguiente:
H0 : No existe relación entre la cantidad de materia orgánica, el pH, la cantidad total de quistes, quistes jóvenes, quistes maduros, quistes dañados en las seis localidades estudiadas.
H1 : Existe relación entre la cantidad de materia orgánica, el pH, la cantidad total de quistes, quistes jóvenes, quistes maduros, quistes dañados en las seis localidades estudiadas.
56
Los resultados obtenidos en la correlaciones nos indican que no hay correlación
entre la cantidad de materia orgánica, el pH, la cantidad total de quistes, quistes
jóvenes, quistes maduros, quistes dañados en las seis localidades estudiadas (Cuadro
8).
Cuadro 8. Resultado de la correlación entre la cantidad de materia orgánica, el pH, la cantidad total de quistes, quistes jóvenes, quistes maduros, quistes dañados
en las seis localidades estudiadas. Variable Variable Coeficiente probabilidad dependiente independiente de correlación Total quistes Materia orgánica 0.067104 0.1445 ns pH - 0.67642 0.1401 ns Quistes Jóvenes Materia orgánica 0.77391 0.0709 ns pH - 0.33985 0.5098 ns Quistes Maduros Materia orgánica 0.73506 0.0960 ns pH - 0.75246 0.0658 ns Quistes Dañado s Materia orgánica 0.46710 0.3503 ns pH - 0.711152 0.1128 ns ns= no significativo con una confiabilidad del 95% 4.4. Hongos aislados de los quistes de Globodera rostochiensis en la región Cofre de Perote
La presencia de hongos en los quistes se manifestó en el 3.5% del total de la
muestra (n=600 quistes). Se obtuvieron 21 cepas asociadas con los quistes.
Una sola especie de hongos se encontró en cada una de los quistes con micelio.
Los 21 hongos obtenidos de los quistes corresponden a 16 especies (Cuadro 9).
Cuadro 9. Hongos nativos encontrados asociados a quistes jóvenes de G. rostochiensis
en la región Cofre de Perote. Localidad de Estudio Especie Aislada
CONEJOS Chaetomidium sp. Cladosporium sp. (1)
TEMBLADERAS Phialophora sp. (1)
57
ESCOBILLO Cladosporium sp. (2) Fusarium sp.
RANCHO NUEVO Phialophora sp. (2)
Phialophora malorum Kidd. *
LOS PESCADOS Aspergillus sp. Paecilomyces carneus Duché*
Trichocladium asperum Harz Paecilomyces carneus Duché*
Drechslera sp. Pteroconium sp.
Paecilomyces carneus Duché* Acremonium incrustatum Gams*
Paecilomyces carneus Duché* Micelia sterilia
LOS ALTOS Paecilomyces carneus Duché * Cladosporium sp. (3) Trichocladium asperum Harz Ulocladium atrum Preuss * (géneros reportados como nematófagos) Las cepas numeradas (1) (2) (3) corresponden al mismo género pero diferente especie.
Es probable que las tres cepas de Cladosporium sp. correspondan a diferentes
especies, ya que hay diferencia en el color del micelio de cada una; estas cepas se han
marcado con diferentes números.
En el caso de las cepas de Phialophora sp. la cepa de localidad de Tembladeras
tiene micelio verde oliva, y la de Rancho Nuevo es color crema, ambos totalmente
diferente a Phialophora malorum que es de color café-negro, por esta razón se han
marcado con números diferentes.
La especie con mayor frecuencia fue Paecilomyces carneus Duché (cinco cepas),
seguida de Cladosporium sp. (tres cepas), Phialophora sp. (dos cepas) y Trichlocladium
asperum Harz (dos cepas), de los demás hongos se obtuvo una cepa Acremonium
incrustatum Gams, Aspergillus sp., Chetomidium sp., Drechslera sp., Fusarium sp.,
58
Phialophora malorum Kidd, Pteroconium sp., y Ulocladum atrum. En el cuadro 10, se
presenta la a clasificación taxonómica de los géneros de las especies obtenidas.
Cuadro 10. Clasificación taxonómica de los hongos aislados de quistes de G
rostochiensis en la región del Cofre de Perote.
SUBDIVISIÓN DEUTEROMYCOTINA Clase Subclase Orden Familia Género Hyphomycetes Monilialies Moniliaceae Acremonium Aspergillus Paecilomyces Dematiaceae Pteroconium Cladosporium Drechslera Phialophora Trichocladium Ulocladium
Turberculariaceae Fusarium
SUBDIVISIÓN ASCOMYCOTINA Clase Subclase Orden Familia Género Euascomycetes Pyrenomycetidae Chaetomiales Chaetomiaceae Chaetomidium 4.5. Proceso de infección de tres hongos aislados de quistes de Globodera rostochiensis
Los tres hongos seleccionados para estudiar el proceso de infección parasitaron
los quistes. Para hacer notar la diferencia entre los procesos de infección de las especies
trabajadas se midieron las estructuras que los hongos iban formando tales como la
longitud, anchura de los tubos germinativos y células conidiógenas.
Acremonium incrustatum. Se observaron a las 12hrs de la inoculación algunas
esporas sobre el corión que desarrollaron tubos germinativos de 2 x1 µm, pero la
mayoría sin evidencia de tubos germinativos. Sin embargo, al observar la pared interna
del quiste a las 24 hrs con el microscopio electrónico de barrido (MEB) tubos
germinativos habían traspasado el corión (Figs. 11-12). Estos micelios se desarrollaron
en los huevos de los quistes entre las 48 y 72 hrs (Figs. 13-14). En la pared externa se
59
observaron a las 96 hrs, las hifas emergiendo desde el interior del mismo. Finalmente a
las 120 hrs había hifas y conidióforos esporulando en el exterior del quiste (Figs. 15-16).
Proceso de Infección de Acremonium incrustatum sobre quistes de G. rostochiensis
60
61
Figs. 11-16: Acremonium incrustatum. 11: Esporas sobre el corión 12 hrs después de la inoculación 2,000x; 12: Tubos germinativos vistos en la parte interna del corión 24 hrs después de la inoculación 1,500x; 13: Tubos germinativos a las 48 hrs 1,500x; 14: Huevos con micelio a las 72 hrs 1,000x; 15: Micelio
62
saliendo del corión 96 hrs 1,000x; 16: Conidióforo emergiendo del corión 120 hrs 2,000x.
Paecilomyces carneus. Las esporas germinaron a las 12 hrs sobre los quistes, en
general desarrollaron tubos germinativos cortos 2 X 1 µm (Fig. 17), así mismo en
algunas esporas se observaron apresorios después de desarrollar un pequeño tubo
germinativo. El tamaño de los tubos germinativos fue menor sobre los quistes que los
observados provenientes de la suspensión de esporas sobrante (5 X2 µm). A las 24 hrs
se continuó observando los apresorios, la mayoría de las esporas formaron hifas
ramificadas de 46 X 3 µm; en esta etapa hubo mayor desarrollo micelial en la zonas de
la boca y cono vulvar, que son aberturas naturales del quiste (Figs. 18-19). A las 48 hrs
hubo mayor desarrollo micelial en la parte externa e interna del quiste. El micelio
desarrollado en la parte media del quiste empezó a formar una célula conidiogena
(fialide) de 10 X 3 µm a las 72 hrs (Fig. 20) y posteriormente se diferenciaron las
estructuras reproductoras, se encontraron conidióforos con 3 fiálides de 20 X 3 µm ya
estaban esporulando. En un corte transversal del quiste se pudo observar el desarrollo
micelial en la masa de huevos así como en larvas que estaban apunto de eclosionar
(Fig. 22). A las 96 hrs se manifestaron los siguientes cambios, la capa vitelina se separó,
también se observó la vacuolización en la superficie de los huevos y el mucílago
desapareció. Se observaron también cambios análogos en la cutícula de algunos huevos
con larvas en estado J2. Las hifas endógenas en los huevos reemergieron pasando por
ambos lados, en cuya superficie se encontraron esporas provenientes de conidióforos
maduros. Los quistes se cubrieron de conidióforos maduros a las 120 hrs (Figs. 17-22).
Con esta prueba queda comprobada la capacidad nematofaga de P. carneus.
Figs.17-22: Paecilomyces carneus. 17: Grupo de esporas germinando 12 hrs después de la inoculación 3,500x; 18: Esporas con tubos germinativos inmersos y
superficiales 24 hrs después de la inoculación 1,500x; 19: Micelio desarrollado sobre el corión a las 72 hrs 500x; 20: Formación de fiálides y conidióforos esporulando a las 96 hrs 1,500x; 21: Cadenas de esporas sobre el corión 750X; 22:Huevos rodeados de micelio 100x.
63
Proceso de infección de Paecilomyces carneus sobre quistes de G. rostochiensis
Phialophora malorum. Se encontraron pocas esporas que germinaron a las 12 hrs
(Fig. 23); la mayoría de las esporas germinaron a las 48 hrs y se empezó a desarrollar
micelio. Los quistes cambiaron de color de sus tonalidades de café claro y brillantes a
café opaco ennegrecido a 72 hrs. Algunas esporas todavía estaban en proceso de
germinación a las 96 hrs y las que habían germinado desarrollaban su micelio sobre el
corión. El micelio invadió la masa de huevos a las 120 hrs. Después de este tiempo el
micelio siguió desarrollándose en el interior y fuera del quiste, sin ser conspicuo. El
crecimiento del micelio fue bastante lento; a los 18 días de haber sido inoculados se
observó en la parte bucal y el cono vulvar, mayor desarrollo de micelio (Fig. 28). Se
mantuvo en observación hasta los 28 días cuando los quistes estaban completamente
negros por el color del micelio (Figs. 23-28).
64
Proceso de infección de Phialophora malorum sobre quistes de G. rostochiensis
Figs. 23-28 Phialophora malorum. 23: Germinación de una espora 12 hrs después de
la inoculación 3,500x; 24: Tubos germinativos 72 hrs 1,500x; 25: Micelio desarrollándose sobre el corión a las 96 hrs 750x; 26: Micelio sobre huevos 120 hrs después de la germinación 750x; 27: Parte interna del corión con micelio a los 18 días 750x; 28: Quiste cubierto de micelio a los 28 días.
65
4.6. Patogenicidad y esporulación de tres hongos sobre quistes de Globodera rostochiensis
El ensayo de patogenicidad demostró que los tres hongos probados A.
incrustatum, P. carneus y P. malorum lograron infectar a los quistes de G. rostochiensis.
Los tres grupos de quistes utilizados como testigos se mantuvieron libres de los hongos
probados (Fig. 29). Ningún hongo fue encontrado como contaminante sobre los quistes.
0102030405060708090
100
% Q
uist
es c
on e
spor
ulac
ión
Acremonium incrustatum Phialophora malorumPaecilomyces carneus Testigo
4 7 11 14 18 22 30 Días
Fig. 29. Porcentaje de quistes infectados por hongos nematofagos.
Para este trabajo el diseño experimental utilizado fue completamente al azar;
quedando de la siguiente manera el concentrado de datos (cuadro 11).
Cuadro 11. Análisis de varianza de la esporulación de hongos nativos presentada sobre quistes de Globodera rostochiensis.
F.V. G. L. S.C. C.M. F Cal. Pr > F Tratamientos 2 392.933 196.466 20.25 0.0001 Error Exp. 12 116.400 9.700 Total 14 509.333 R2 = 0.7713 66 CV= 23.3586 MSE= 3.114482
66
La prueba de Tukey nos indicó que el desarrollo de Acremonium incrustatum y
Paecilomyces carneus es similar pero difieren del desarrollo de Phialophora malorum
(cuadro 12).
Cuadro 12. Porcentajes de quistes de G. rostochiensis con la esporulación de hongos nativos inoculados.
TRATAMIENTOS X Acremonium incrustatum 19.0 a Paecilomyces carneus 14.4 a Phialophora malorum 6.6 b Medias seguida de la misma literal son estadísticamente iguales. Tukey (P>0.05).
67
A. incrustatum. El 100% de los quistes fueron infectados. A los 7 días después de la
inoculación, el hongo esporuló sobre el 35% de los quistes; a los 11 días el 61 % de los
quistes estaban cubiertos por condióforos, aumentando a los 14 días a 64% y a los 18
días a 65%. La esporulación aumentó en el 82% a los 22 días, finalmente el 95% de los
quistes estaban cubiertos a los 30 días (Figs. 33-35).
Figs. 30-35: Acremonium incrustatum. 30:Conidióforo y micelio sobre el corión 2,000x; 31: Huevo enrollado de micelio 500x; 32: Micelio interior del quiste 500x; 33: Quiste cubierto de micelio 100x; Testigos 34: Quiste sano 750x; 35: Huevos en el interior del quiste 500x.
68
P. carneus. El 100% de los quistes inoculados, estuvo infectado por el hongo. La
esporulación se observó en el 20% de los quistes a los siete días, posteriormente la
esporulación aumentó lentamente a los 11 días a 32%, el 61% a los 14 días, el 63% a
los 18 días, 66% a los 22 días y 72% a los 30 días (Figs. 36-41).
Figs. 36-41 Paecilomyces carneus. 36: Conidióforo 2,000x; 37: Cadenas de conidios y micelio sobre el quiste 750x; 38: Micelio sobre la masa de huevos 750x; 39:Quiste cubierto por micelio y conidióforos 150x; Testigos 40: Quiste sano 100x; 41: Huevos en el interior del quiste 500x.
69
P. malorum. El micelio sobre los quistes inoculados con este hongo inició su desarrollo
hasta los 11 días, la esporulación se presentó en 8% a los 22 días y 33% a los 30 días
(Figs. 42-51).
Figs. 42-47 Phialophora malurum. 42: Grupo de esporas 1,500x; 43: Espora y micelio
sobre el quiste 100x; 44: Micelio sobre el corión 200x; 45: Micelio en la masa de huevos 750x; 46: Micelio en la masa de huevos y corión 500x; 47: Quiste cubierto por micelio 150x.
70
Pruebas de Patogenicidad de Phialophora malorum sobre quistes de G. rostochiensis
Figs. 48-49 Globodera rostochiensis. Testigos 48: Quiste sano 250x, 49: Conjunto de huevos en el interior del quiste 500x.
71
V. DISCUSIÓN
Los resultados obtenidos muestran que la densidad poblacional de quistes de
Globodera rostochiensis fue estadisticamente diferente en todas las localidades. Esto
puede ser debido a que en las localidades se realizan diferentes prácticas culturales
(Stirling, 1991); así tenemos, que en las comunidades de Tembladeras y Escobillo,
donde las poblaciones de quistes son de 2216 y 360 quistes/kg de suelo,
respectivamente; las prácticas culturales son: años de cultivo, 50 y 30; la rotación de
cultivo, monocultivo y rotación; aplicación de nematicidas químicos de 60 y 20 kg/ha
respectivamente. Esta variación en las prácticas culturales del cultivo, podrían explicar
las diferencias en las poblaciones de quistes de G. rostochiensis en la región de Cofre de
Perote, Ver.
La población de quistes de G. rostochiensis en la localidad de Tembladeras, según
nuestros datos, es de 2216 quistes/kg de suelo, mientras que en año 1987, esta misma
localidad, eran de 1000 quistes/kg de suelo (SARH, 1987). Sin embargo, se reporta que
en los suelos cuando las poblaciones de Heterodera avenae aumentan y disminuyen, se
debe a que el nematodos se reproduce normalmente y la causa parece ser debido a las
prácticas culturales (Kerry y Crump, 1977). También se ha considerado el efecto del
ataque de los hongos a las hembras (Kerry et al., 1982).
Los datos muestran que no existe correlación entre el número de quistes con la
materia orgánica y el pH del suelo. Este resultado no es raro ya que se menciona que
este factor no tienen efecto significativo sobre las poblaciones de los fitonematodos
enquistados (Stirling, 1991).
La infestación natural de nematodos enquistados por hongos, se reporta como los
hongos encontrados en hembras jóvenes y que pueden ser considerados como parásitos
(Stirling, 1991). Sin embargo, al parecer, los quistes de G. rostochiensis, fuera de su
centro de origen, no son atacados por hongos nematofagos (Willcox y Tribe, 1974;
72
Kerry y Crump, 1977; Jones, 1976; Willcox y Tribe, 1980; Stirling, 1991), lo anterior
debido a la reducida apertura del cono vulvar y la presencia de una capa de cutícula
adicional que funcionan como barreras, para la penetración de los hongos parásitos y
depredadores (Tribe, 1980).
Los resultados muestran, que los quistes de G. rostochiensis presentan una
infestación natural, por hongos nativos, del 3.5%. En Perú, que es el centro de origen
de este nematodo, se reportaron 32% de infestación natural sobre quistes de G. pallida
y G. rostochiensis (Morgan-Jones y Rodríguez-Kabana, 1986). En estudios similares
realizados por Willcox y Tribe en 1980 en quistes de G. rostochiensis procedentes de 20
campos de papa, en Inglaterra, y uno de Bolivia, no encontraron quistes enfermos, ni
tampoco quistes con huevos muertos; de la misma manera, los reporta Jones (1976) en
Inglaterra, por lo que se consideró, que G. rostochiensis no tenía enemigos naturales
fuera de su centro ce origen (Stirling, 1991).
Sin embargo, en la zona productora de papa de la Región, Cofre de Perote, Ver.,
el cultivo de la papa fue introducido y por consiguiente el nematodo. Los resultados
muestran, que los quistes de G. rostochiensis presente en esta zona, están infectados
por hongos oportunistas nativos. Esto contrasta con reportes anteriores (Willcox y Tribe,
1974; Kerry y Crump, 1977), ya que se consideraba, que en Europa, donde el
nematodos fue introducido, no se le han encontrado enemigos naturales y que solo se le
reportan en el Perú y Sudamérica, donde este nematodo es originario (Morgan-Jones, et
al., 1986).
Diversas investigaciones han sido enfocadas sobre la asociación entre los hongos
nativos, llamados oportunistas, en el suelo, y quistes de Heterodera específicamente H.
avenae; H. glycines, y H. schachtii (Tribe, 1980; Jones, 1976; Morgan-Jones, et al.,
1981; Gintis et al.,1983; Dackman, et al., 1985), pero investigaciones de la actividad de
hongos nematofagos sobre quistes de especies de Globodera, eran mínimas,
comparativamente (Stirling, 1991), sin embargo, a la fecha se puede decir que la
73
situación no ha cambiado, debido al uso de los nematicidas químicos, el problema de
resistencia de los fitonematodos a esos productos y la contaminación ambiental activará
los estudios sobre estos tópicos (Stirling, 1991).
La inclusión de organismos del suelo en teorías ecológicas es una moderna
aproximación que podría potencialmente proporcionar una mejor comprensión de la
estructura y función de los ecosistemas subterráneos (Lindow y Wilson, 1998). Todos
los organismos tienen enemigos naturales o antagonistas, que de alguna manera
regulan la densidad de las poblaciones de organismos; existen mecanismos reguladores
en el suelo, que mantienen las poblaciones de nematodos fitoparásitos, dentro de
ciertos niveles; los cuales están determinados por el equilibrio dinámico existente entre
las poblaciones de los organismos (Rodríguez-Kabana, 1991; Cook, 1993).
Pero Cook y Baker (1983) menciona que, cuando un microorganismo fitopatógeno
es introducido en un ambiente donde no se manifiestan enemigos naturales, éstos se
desarrollan sin competencia, y los límites del tamaño de su población es su propia
capacidad de adaptación al nuevo ambiente. Sin embargo, a los nematodos
enquistados, parece ser, que las prácticas culturales, como la rotación de cultivos, la
cantidad de años de cultivo y la aplicación de nematicidas químicos, son determinanates
en el desarrollo y control de las poblaciones de este tipo de fitonematodos (Stirling,
1991).
El haber obtenido solo el 3.5% de infestación natural de quistes por hongos en la
zona de Perote, Ver., demuestra una baja incidencia de quistes infectados de G.
rostochiensis lo que contrasta con los resultados reportados en Perú (Morgan-Jones, et
al., 1986) y pudiera asemejarse a lo encontrado en Inglaterra (Willcox y Tribe, 1974),
donde se considera niveles de infestación relativamente bajo.
Sin embargo, en ningún reporte se mencionan las pruebas de patogenicidad que
nos darían los elementos suficientes, para determinar, si estos hongos, con los nivel de
74
infestación mencionados, podrían tener potencial, como agentes de control biológico de
este nematodo.
Estos resultados indican, que en los suelos de la zona productora de papa del
Cofre de Perote, los quistes del nematodos dorado G. rostochiensis están asociados a
hongos nematofagos habitantes del suelo, y estos hongos pertenecen, en su mayor
parte, a la clase Hyphomycetes. En otros reportes se menciona, que los quistes de G.
pallida y G. rostochiensis, están asociados a varios hongos oportunistas, al menos a 28
especies (Morgan-Jones, et al., 1986); resultados similares se obtuvieron en otros
estudios (Morgan-Jones et al.,1988).
En este estudio, se aislaron los siguientes hongos nativos asociados a quistes de
G. rostochiensis: Paecilomyces carneus, Acremonium incrustatum, Phialophora malorum,
Fusarium sp., Aspergillus sp., Chaetomidium sp., Cladosporium sp., Drechslera
sp.,Micelia sterilia, Pteroconium sp., Trichocladium asperum y Ulocladium atrum.
Ninguna de estas especies de hongos nematofagos había sido reportada como asociada
a quistes de G. rostochiensis.
La especie Paecilomyces carneus, se encontró asociado a quistes de G.
rostochiensis. El género está estrechamente relacionado a Penicillium, es uno de los
principales géneros en estudios de control biológico (Godoy et al., 1983); típicamente,
este es un hongo habitante del suelo, pero también se conoce por colonizar esclerosios,
larvas de insectos, y también tejidos animales y humanos (Godoy et al., 1983). Otras
especies de Paecilomyces se reportan asociadas con quistes de nematodos del género
Heterodera en muchas localidades geográficas (Dackman y Nordbring-Hertz, 1992;
Stirling, 1991; Davide y Zorrilla, 1995; Rodríguez-Kabana et al., 1986).
La especie Paecilomyces lilacinus se aisló de quistes de H. glycines, de huevos de
M. arenaria (Cabanillas et al., 1989; Gintis, 1983; Morgan-Jones, 1984; Davide y Zorrilla,
1995); y se emplea como agente de control biológico, de Tylenchus semipenetrans
(Jatala, 1983).
75
También, parasita huevos (Jatala et al., 1983; Dunn, 1983) y hembras de M.
incognita (Godoy et al., 1983), y quistes de G. pallida, (Rodríguez- Kabana, 1986).
En una revisión exhaustiva de literatura no se encontró ningún reporte de este
hongo asociado a quistes de G. rostochiensis, por lo que al parecer, este es el primer
reporte.
En este estudio se aisló, también a la especie Acremonium incrustatum cabe
destacar que, en una búsqueda exhaustiva de literatura, no se encontró ningún reporte
de esta especie asociado a quistes de G. rostochiensis; sin embargo, varias especies de
este género ya se han reportado como hongos oportunistas asociados a quistes de
Heterodera spp.. A. strictum Gams sobre huevos y quistes de Heterodera schachtii,
(Nigh, 1979); Acremonium sp. fue aislado de quistes de H. avenae en Suiza (Dackman y
Norbring-Hertz, 1985); A. persicinum Nicot y Gams, fue aislado en el segundo estado
juvenil de Meloidogyne javanica (Klopper, 1980); y A. coenophiclum sobre nematodos
ectoparásitos y endoparásitos, M. meryland, y Pratylenchus scribneri (Pedersen, 1988;
Yu O y Cooserman, 1998).
En esta investigación otro hongo aislado fue Phialophora malorum, asociado a
quistes de G. rostochiensis; de esta especie no se encontró ningún reporte que la
mencionara asociado a quistes de G. rostochiensis; sin embargo, esta especie ya ha sido
reportada como un parásito importante sobre quistes de Heterodera schachtii, en
diferentes países: Alemania, Bélgica, Checoslovaquia, Dinamarca, Holanda, Inglaterra,
Italia, Noruega y Suiza (Van der Laan, 1986; Dove, 1969; Bursnall y Tribe, 1974). Al
parecer este es el primer reporte de P. malorum asociado a G. rostochiensis.
La especie Fusarium oxysporum se encontró asociado a quistes de G.
rostochiensis. Las especies de Fusarium spp. también han sido reportadas como
parásitos de huevos y quistes de H. schachtii (Nigh et al., 1980 Morgan-Jones et al.,
1981; West et al., 1988), sobre quistes y huevos de H. glycines (Gintis et al., 1983;
Morgan-Jones et al., 1984); también, se ha encontrado atacando huevos de varias
76
especies de nematodos sobre placas de agar in vitro, y creciendo saprofiticamente sobre
huevos muertos. Sin embargo en diversos estudios han concluido, que otro saprofito
facultativo común era causante de la afectación de algunos huevos de H. schachtii bajo
ciertas condiciones en los campos (Nigh, 1979).
Aunque F. oxysporum y F. solani están asociado con quistes y huevos de
nematodos fitoparásitos en varios países del mundo, también se reporta asociados a
quistes de G. rostochiensis (Goswami y Rumpenhorstt, 1978). Sin embargo, se señala
que aunque Fusarium sp. es un parásito de las plantas, éste no puede ser considerado,
para el uso de posibles prácticas de control biológico, contra quistes de Heterodera
(Tribe, 1980); no obstante este señalamiento, el género Fusarium spp. es tan variable
en sus formas especiales que difícilmente la especie que se asocia con lo quistes de G.
rostochiensis sea fitopatógeno.
Se reporta que en una exploración microscópica de huevos provenientes de
quistes, donde Fusarium está presente, arroja resultados confusos, principalmente en su
capacidad para penetrar el corión (Nigh et al., 1980), estos mismos autores
documentaron la habilidad de los hongos aislados de H. glycines, sin embargo, esto no
significa que los aislamientos de está especie logran la penetración de la cáscara del
huevo; ya que algunos quistes invadidos por Fusarium sp., contenían huevos que
aparentemente no son afectados por el hongo.
Las demás especies de hongos habitantes del suelo, asociados a lo quistes de G.
rostochiensis en la zona productora de papa de la región del Cofre de Perote, Ver.,
están reportadas como especies de hongos oportunistas que se asocian a los quistes de
Heterodera spp. o Globodera spp. (Morgan-Jones, et al., 1986; Morgan-Jones et
al.,1988).
77
El hecho de que estas especies de hongos, estén asociados con quistes de G.
rostochiensis en la región Cofre de Perote, están adaptados a las condiciones ecológicas
de esos suelos y son un potencial para usarse en el manejo integrado del nematodo
dorado de la papa.
Es poca la literatura científica que aborda el tema de los hongos nematofagos
asociados a los quistes de nematodos fitoparásitos, sobre todo, de los géneros
Heterodera spp. y Globodera spp.; lo anterior puede deberse a, que las estructuras de
las paredes, tanto de los quistes como de los huevecillos, de estos fitonematodos, les
permiten mantenerse casi invulnerables al ataque de enemigos naturales (Stirling,
1991); sin embargo, en los centros de origen de los nematodos enquistados, Heterodera
spp. y Globodera spp., se reportan varias especies de hongos asociados a quistes de
nematodos fitopatógenos (Morgan-Jones, et al., 1986; Morgan-Jones et al.,1988), y en
Inglaterra (Willcox y Tribe, 1974), sin embargo, en ningún reporte se mencionan el
grado de parasitismo, que los hongos presentan sobre los huevecillos y los quistes.
Los datos de nuestro estudio demuestran que las especies, Acremonium
incrustatum, Paecilomyces carneus y Phialophora malorum, presentaron infección sobre
los quistes de G. rostochiensis. Los tres géneros de hongos ya han sido reportados, que
contienen especies con características nematofagas; Acremonium spp. (Night, 1979;
Klopper, 1980; Pedersen, 1988; Yu O y Cooseman, 1998); Paecilomyces spp. (Godoy et
al., 1983; Dackaman y Nordbring-Hertz, 1992; Stirling, 1991; Davide y Zorrilla, 1995;
Rodríguez-Kabana et al., 1986; Cabanillas et al., 1989; Jatala, 1983); y Phialophora
spp., (Van der Laan, 1986; Dove, 1969; Bursnall y Tribe, 1974). Sin embargo, las
especies estudiadas en este trabajo, no han sido reportadas, infectando quistes de G.
rostochiensis.
78
En la literatura científica, se consideraba que este fitonematodo no tenía
enemigos naturales, excepto en los ambientes de su zona de origen (Tribe, 1980;
Stirling, 1991), aunque en Inglaterra, fuera de su centro de origen, ya se habían
reportado hongos asociados a los quistes de este fitopatógeno, y no se demostró
patogenicidad (Willcox y Tribe, 1974); en este estudio se demuestra que lo quistes de
G. rostochiensis son atacados por hongos nativos de la región del Cofre de Perote, Ver.
La patogenicidad mostrada por las tres especies de hongos nematofagos sobre
los quistes de G. rostochiensis, nos permiten suponer que estas especies tienen
potencial como agentes de control biológico para este fitonematodo y que es necesario
realizar mas estudios a este respecto, con el propósito de evaluar la virulencia de estos
hongos sobre el fitonematodo, y el potencial como agentes de control biológico del
mismo en la zona productora de papa del la Región, Cofre de Perote, Ver.
En revisiones exhaustivas de la literatura científica, no se encontró ningún reporte
de la patogenicidad de estas tres especies de hongos sobre quistes de Globodera
rostochiensis. Consideramos a éste, como el primer reporte.
79
VI. CONCLUSIÓN
Los datos soportan la hipótesis de que existen hongos nativos que parasitan a
quistes de Globodera rostochiensis en los suelos de la zona productora de papa del
Cofre de Perote, Veracruz.
La densidad de población de quistes de Globodera rostochiensis es alta, en todas
las localidades estudiadas. de la zona productora de papa del Cofre de Perote, Veracruz.
Las especies de hongos asociados a los quistes de G. rostochiensis en la región
del Cofre de Perote, Veracruz, México, son las siguientes: Paecilomyces carneus,
Cladosporium sp., Phialophora sp. Trichocladium asperum, Acremonium incrustatum,
Aspergillus sp., Chaetomidium sp., Drechslera sp., Fusarium sp., Micelia sterilia
Phialophora malorum, Pteroconium sp, y Ulocladium atrum.
Las especies de hongos, Acremonium incrustatum, Paecilomyces carneus y
Phialophora malorum, tienen capacidad para infectar quistes de G. rostochiensis.
Este es el primer reporte de hongos nativos patógenos de quistes de G.
rostochiensis en ambientes fuera de su centro de origen.
En este estudio, se aportan las bases, para continuar estudios de hongos, que
parasitan quistes de G. rostochiensis y el potencial de éstos, como agentes de control
biológico.
80
VII. LITERATURA CITADA Abawi, G. S. y Thurston, D. H. (1992). Efecto de coberturas y enmiendas orgánicas al
suelo y de los cultivos de cobertura sobre los patógenos del suelo y de las enfermedades radicales. Phytopathology Society Biological 7: 9
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INSTITUTO DEECOLOGIA, A.C.
DIVISIÓN DE SISTEMÁTICA
Xalapa, Ver. 7 de Junio de 2002
DR. SERGIO AGUILAR ESPINOSACOORDINADOR DEL POSGRADOFACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIASUNIVERSIDAD DE COLIMACOLIMA, COLIMA
Estimado Dr. Aguilar:
Por medio de la presente le comunico a Ud. de la manera más atenta, que el trabajo titulado“Aislamiento y Evaluación de Hongos Nematofagos Asociados a Quistes de Globoderarostochiensis (Woll.) en la Región Cofre de Perote”, realizado por el C. Ángel Enrique NúñezSánchez, alumno del posgrado en Biotecnología para optar por el grado de Maestro en Ciencias, hasido terminado satisfactoriamente desde mi punto de vista. Por esta razón, considero que puedecontinuar con los trámites correspondientes. que marca el reglamento del posgrado que Ud. dirige.
Sin otro particular agradezco de antemano su atención y aprovecho la oportunidad paraenviarle un cordial saludo.
A T E N T A M E N T E
M. en C. Gloria L. L. Carrión Villarnovo
Departamento Hongos Km 2.5 Antigua carretera a Coatepec, A.P. 63 Xalapa 91000, Veracruz, MéxicoTel. (228) 8-42-1 8-29 Fax (228) 8-18-78-09 Email: [email protected]
DR. SERGIO AGUILAR ESPINOSACOORDINADORPROGRAMA DE POSGRADO DE LA FCBA
Anexo a la presente. el manuscrito de Tesis de Maestria titulado: “AISLAMIENTO YEVALUACIÓN DE HONGOS NEMATOFAGOS ASOCIADOS A QUISTES DEGlobodera rostochiensis (WOLL) EN LA REGION COFRE DE PEROTE”. dichodocumento es presentado por el alumno del Progama de Maestría en Biotecnología: AngelEnrique Núñez Sánchez. Además informa a usted. que académicamente, este documentocumple con los requisitos suficientes. como tesis de maestría. Asimismo. autorizo para queeste documento sea sometido a revisión por expertos y se prosigan los tramites de titulacióncorrespondientes.
Sin más por el momento. aprovecho para saludarle afectuosamente y le reitero la mas altade mis consideraciones.
ATENTAMlENTETecomán Colima., a 07 de Junio de 2002.
DR OSCAR REBOLLEDO DOMÍNGUEZAsesor de Tesis
c.c.p.-Ing. Rodolfo V. Morentin Delgado.- M. Director de la FCBA.c.c.p.-Interesadoc.c.p. -Archivo
P R E S E N T E
UNIVERSIDAD DE COLIMAFACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS
Dr. SERGIO AGUILAR ESPINOSACOORDINADOR DEL POSGRADOPRESENTE.
Por este conducto, los abajo firmantes profesores-investigadores de la F.C.B.A. de laUniversidad de Colima, hacemos de su conocimiento, que después de haber revisado elborrador de tesis titulado “AISLAMIENTO Y EVALUACIÓN DE HONGOSNEMATOFAGOS ASOCIADOS A QUISTES DE Globodera rostochiensis (WOLL)EN LA REGION COFRE DE PEROTE”, que presenta el C. Angel Enrique NúñezSánchez, alumno del posgrado de esta Facultad, consideramos que reúne los elementossuficientes de contenido y forma de un documento de Maestría. Por ello, expresamosnuestra aprobación para que se imprima y se sigan los trámites académicos quecorrespondan.
Sin otro particular, le saludamos cordialmente
ATENTAMENTETecomán, Colima., a 23 de Julio de 2002
Dr. Alfonso PescadorDocente de la FCBA.
Rubio
ccp.- Ing. Rodolfo V. Morentín Delgado.- Director de la FCBA.ccp.- Interasadoccp.. Archivo personalccp.- Expediente correspondiente
Km 40 Autopista Colima-Manzanillo, Tecomán, Colima, México, Cp 28100Tels. (3) 324 42 37, 324 46 42 • [email protected]