San Cristóbal de las Casas, Chiapas a 26 de enero del 2009

Dra. Carmen Pozo de la Tijera Dirección de Posgrado, Por este medio hacemos de su conocimiento la forma en la que las observaciones de los revisores externos del protocolo Estructura y flujo genético de poblaciones de poblaciones de la mosca mexicana de la fruta (Anastrepha ludens Loew). Agradecemos las observaciones de los revisores y respondemos en azul a cada una de sus observaciones. Respuesta a los comentarios del Dr. José Luis Rangel 1. Antecedentes del proyecto (marco teórico, sustento, justificación). La propuesta presenta un marco teórico adecuado, sin embargo este marco no esta conectado al problema que se aborda. Esto es, como se conecta el manejo diferencial de especies con una evaluación genética y demográfica? No hay un sustento claro de literatura que ubique la controversia de un manejo diferencial en función de distinciones genéticas y demográficas. Al parecer el conocimiento genético esta tomando tal "moda" que es justificable para todo, mas no se destacan las implicaciones en manejo.

El objetivo no es demostrar que existen diferencias genéticas por las diferentes estrategias de manejo, sino por el aislamiento o conexión que existe entre ellas. Sin embargo, es válida la observación ya que se menciona pero no se profundiza al respecto, se hacen algunas aclaraciones sobre el documento y en el transcurso del año se espera aclarar este punto. 2. Objetivos y metas, claramente definidos y viables de lograrse en un año de investigación. Claro, aunque es necesario que las predicciones sean mas precisas. No es claro el concepto de población cuando se considera a las poblaciones como estados. Y las predicciones no se pueden establecer por distancias ya que hay una variación de distancias entre y dentro de los diferentes estados que se están considerando como "poblaciones".

Los individuos colectados por localidad se considerarán como una subpoblación y la población será considerada como el total de localidades por estado. Sin embargo, esto será definido en función de las localidades que se obtengan por estado, ya que si se obtienen individuos de una sola localidad por estado, ésta localidad sería considerada como la población total. Las distancias geográficas serán estimadas como el total de kilómetros que separan a una localidad de colecta de la otra, la variación de distancias entre las poblaciones es muy importante ya que se predice que a mayor distancia menor flujo genético entre las poblaciones, por lo cual es una de las variables más importantes para la predicción. 3. Metodología de la investigación apropiada a los objetivos y factible de realizarse en un año de investigación.

Me parece adecuada. Aunque no estoy seguro de que le alcance el tiempo para hacer lo que se propone. 4. Calidad y relevancia científica del proyecto o impacto del mismo. Tomando en cuenta si los resultados del proyecto representarán una aportación nueva a los conocimientos del área. La propuesta es clara, aunque comente con anterioridad la falta de conectividad entre el fundamento teórico y las implicaciones de manejo para este fundamento. Se proporcionaron argumentos que esperamos puedan ser suficientes, aunque reconocemos que no son exhaustivos. 5. Justificación y pertinencia del presupuesto solicitado. No aplica Respuesta a los comentarios del Dr. Eduardo Medinilla Le agradezco por la atención prestada a este trabajo, por medio de la presente me permito responder y argumentar a sus comentarios, esperando poder seguir en comunicación para cualquier observación adicional que desee hacerme.

1. Los trabajos de Rodrigo Verónica y Rafael Cancino demostraron que hay mejor evidencia de flujo génico mediante el análisis por microsatélites que los ofrecidos por isoenzimas y eso preocupa por la magnitud de este estudio.

Las isoenzimas han sido usadas para este tipo de estudios en Ceratitis capitata,(Villardi et al., 1990; Krafsur, 2005) obteniéndose buenos resultados, sin embargo, también se consideró la posibilidad de usar microsatélites, pero debido a que se estarán evaluando parámetros demográficos en las instalaciones de la Planta Moscafrut en Metapa de Domínguez, Chiapas y a que el Laboratorio no cuenta con el equipo adecuado para realizar PCR, se optó por realizar análisis electroforéticos.

2. En los objetivos se menciona que se determinará la variación fenotípica y en el método no se encuentra aclarado este punto o como se va a desarrollar.

Esto se corrigió en el escrito, ya que se pretende determinar parámetros de historia de vida. 3. La tasa intrínseca de crecimiento (r) depende directamente desde la selección del

fruto por el tamaño del ovopositor de la hembra, al hacerlo en medio de cultivo será muy favorecida la reproducción, por lo que yo recomendaría hacerlo directo en los frutos ofreciendo las alternativas de los mismos frutos de los que fueron obtenidos en campo.

La mejor opción es la que se menciona, sin embargo, se eligió ponerlas en dieta porque el numero de moscas adulto que se obtienen de las muestras enviadas de campo es muy bajo, así se pretende que por medio de esferas de fucellerone la colecta de huevecillos sea más eficiente. Con respecto a lo de microsatélites, si hubiese tiempo me gustaría poder realizar esta evaluación también, como algo adicional, ya que sería muy interesante comparar los

resultados obtenidos con ambas técnicas. Me daré a la tarea de ver esta posibilidad con mi comité tutelar. Agradezco la atención que preste a este documento.

Atentamente

Mayra Carolina Molina Nery Lorena Ruiz Montoya

Enero, 2009

Resumen

Las moscas de la fruta están consideradas dentro de los tres principales problemas de plagas para

la agricultura nacional. Anastrepha ludens (Mosca Mexicana de la Fruta) dentro del género

Anastrepha es la especie de mayor distribución en México. Hasta ahora no hay estudios con esta

especie que describan su diversidad y estructura genética a nivel nacional. En este estudio se

describirá la estructura genética y se estimará indirectamente la tasa de flujo genético (Nm), y su

tasa intrínseca de crecimiento (r) de poblaciones de A. ludens ubicadas en distintos estados de la

República Mexicana. El conocimiento de los patrones de flujo genético e historias de vida

permitirá dilucidar sobre la posibilidad de conexión o aislamiento entre poblaciones separadas

geográficamente por distancias considerables (60-80 km), que para fines de control podría

implicar un manejo de poblaciones diferenciado. A través del apoyo de la Campaña Nacional

contra Moscas de la Fruta, se harán colectas de frutos infestados con larvas de A. ludens de las

principales especies hospederas en los estados de Michoacán, Morelos, San Luis Potosí, Nuevo

León, Durango y Nayarit. Se evaluarán parámetros demográficos y se estimará la tasa intrínseca

de crecimiento con la elaboración de tablas de vida de A. ludens durante dos generaciones, los

parámetros genéticos se evaluarán mediante análisis de electroforesis de los individuos adultos

para machos y hembras por separado, esto permitirá conocer a su vez si existe un patrón de flujo

genético (Nm, numero de organismos que se dispersan entre pares de poblaciones por generación)

entre las poblaciones estudiadas.

Palabras clave: Demografía, Isoenzimas, Tephritidae, Variación Genética

Introducción

Anastrepha ludens Loew (Mosca Mexicana de la Fruta) representa un problema fitosanitario en

la actividad frutícola de mango (Mangifera indica) y naranja (Citrus cinensis) en México. Se han

registrado 30 especies del género Anastrepha (familia Tephritidae) en México y A. ludens es la

especie de mayor distribución. Se le conocen 22 plantas hospederas naturales; la especie

hospedera nativa es Sargentia greggii y Casimiroa edulis, ambos de la familia Rutacaeae.

Mientras que en los hospederos adquiridos recientemente están diversas especies o variedades

cultivadas de los géneros Citrus (Rutaceae) y Mangifera (Anacardiaceae) (Hernández-Ortíz,

1992).

En México se ha establecido una Norma Oficial Mexicana NOM-023-1995 que establece

1

procedimientos de control de la mosca y para el transporte de fruta de una región infestada a un

área libre de la plaga, además de que es necesario cubrir ciertos requisitos fitosanitarios para

poder trasladarla (SENASICA, 2008). En la Norma se establecen una serie de estrategias de

combate de la mosca de la fruta, entre ellas están medidas de tipo cultural y biológico, resalta la

Técnica del Insecto Estéril (TIE). Las medidas de control de tipo cultural son la recolecta de

frutos después de cada cosecha. Las de control biológico se basan en la liberación de parasitoides

como Diachasmimorpha longicaudata. La Técnica del Insecto Estéril (TIE) consiste en la

liberación de insectos criados en laboratorio y esterilizados mediante irradiación, para fomentar la

cruza en campo con insectos de la misma especie pero silvestres y así evitar la progenie

(Gutiérrez, 2003).

El diseño de métodos de manejo de plagas efectivos requiere generar un amplio y profundo

conocimiento sobre la biología de la especie (Roderik, 1996). Dentro de este conocimiento está el

determinar su diversidad genética y su estructura poblacional. Se han dedicado esfuerzos para

obtener conocimiento del ciclo de vida, preferencias de plantas hospederas y sobre un manejo

integrado (Aluja, 1994, Aluja y Mangan, 2008). Hasta ahora no hay estudios con esta especie que

describan su diversidad y estructura genética. De especial interés es conocer la existencia de los

patrones de flujo genético y de los patrones de variación en la historia de vida de poblaciones de

A. ludens. El flujo genético y parámetros de historia de vida pueden variar en función de factores

ambientales, de la historia geográfica del sitio ocupado y de los procesos macro y micro

evolutivos (Carey, 1982; Krainacker et al., 1987; Pérez, 1987; Celedonio et al., 1988; Liedo et

al., 1992; Hendrichs, 1993; Sivinski, 1993; Vargas et al., 1997). El conocimiento de los patrones

de flujo genético e historias de vida permitirá dilucidar sobre la posibilidad de conexión o

aislamiento entre poblaciones separadas geográficamente por distancias considerables (60-80

km), que para fines de control podría implicar un manejo de poblaciones dirigido.

Las tasas y dirección del flujo genético pueden proporcionar una estimación de la capacidad de

dispersión, especialmente del potencial para colonizar nuevas áreas geográficas, siempre y

cuando esté presente al menos una de las plantas hospederas. El origen geográfico de nuevas

infestaciones podría ser especificado lo que ayudaría a tomar medidas preventivas o de control

(Villardi et al., 1990; Krafsur, 2005).

En este estudio se describirá la estructura genética y se estimará indirectamente la tasa de flujo

genético (Nm), y su tasa intrínseca de crecimiento (r) de poblaciones de A. ludens ubicadas en

2

distintos estados de la República Mexicana. Se espera que esta información sea útil en los

programas de manejo de la mosca mexicana de la fruta. La influencia de los parámetros de

historia de vida de A. ludens permitirá reconocer posibles fuentes de variación genética dentro y

entre poblaciones. La estimación de r se estimará bajo condiciones estandarizadas de laboratorio.

Antecedentes

Importancia de Anastrepha ludens

En México en el año de 1997, se cultivaron aproximadamente un millón 700 mil hectáreas con 20

especies frutales de clima cálido y semi-cálido. Su producción se destinó al consumo en fresco o

procesadas, tanto en el mercado nacional, como en el internacional o extranjero (SAGAR, 1998).

Debido a la importancia de la fruticultura para México en el marco económico y ambiental, las

moscas de la fruta están consideradas dentro de los tres principales problemas de plagas para la

agricultura nacional (Aluja, 1994).

El norte de Sinaloa, todo el estado de Sonora, Chihuahua, Baja California Norte y Baja California

Sur, están catalogados como áreas libres de mosca de la fruta. Existen áreas catalogadas como

de baja prevalencia de la plaga como ocurre en Aguascalientes, Durango, Nuevo León, Sinaloa

(centro y sur), Tamaulipas (norte y centro) y 48 municipios de Zacatecas. Las entidades en donde

actualmente están bajo control fitosanitario son Colima, Distrito Federal, Guerrero, Jalisco,

Michoacán, Nayarit, San Luis Potosí, Veracruz, Campeche, Chiapas, Guanajuato, Hidalgo,

Estado de México, Morelos, Oaxaca, Puebla, Querétaro, Quintana Roo, Tabasco, Tlaxcala y

Yucatán (SENASICA, 2008).

Distribución y hospederos

A. ludens es la especie de mayor distribución en todo el país. Fuera de México se ha reportado en

el sur de E.U.A. (Texas, Arizona y California), en Guatemala, Belice, Honduras, Nicaragua, El

Salvador y Costa Rica (Hernández-Ortíz, 1992).

Según Hernández-Ortíz (1992) se han reportado 22 especies de plantas como hospederos de A.

ludens en México:

Annona cherimola

Annona reticulata

Annona squamosa

Casimiroa edulis

Citrus aurantiifolia

Citrus aurantium

Citrus limetta

Citrus maxima

Citrus medica

Citrus paradisi

Citrus reticulata

Citrus sinensis

3

Cydonia oblonga Prunus persica Spondias purpurea

Mammea americana Psidium guajava Syzygium jambos

Mangifera indica Punica granatum

Mastichodendron capiri Sargentia gregii

Estimadores de Flujo Genético

La genética de poblaciones estudia la estructura, cantidad y distribución de la variación genética

dentro y entre poblaciones naturales, comúnmente con base en las frecuencia alélicas (Hart y

Clark, 1997; Dobzhansky et al., 1977). La estructura genética (frecuencias genotípicas y alélicas)

de una población concreta, esta determinada por la historia evolutiva de esa población y es

consecuencia de las interacciones entre los cinco factores que ocasionan la evolución de las

poblaciones (cambios en las frecuencias alélicas y genotípicas): mutación, deriva génica,

selección, sistema de reproducción y flujo genético (Roderick, 1996).

El flujo genético se define como la transferencia de genes de una población a otra. La

transferencia en animales es básicamente a través de la dispersión de individuos de una población

a otra (Groom et al., 2006). El flujo genético, determina en parte, hasta qué punto cada población

de una especie es una unidad evolutiva independiente. Si existe una alta tasa de flujo genético

entre las poblaciones entonces estas poblaciones evolucionan juntas. Pero si hay poco flujo

genético, cada población evoluciona de forma independiente (Slatkin, 1994).

Hay un número de factores que afectan el ritmo del flujo genético entre poblaciones: entre los

que destacan la capacidad de dispersión de los organismos, las condiciones ambientales de las

áreas que tienen que recorrer los organismos, la distancias geográficas entre las poblaciones,

entre otros (Groom et al., 2006). El efecto del flujo genético puede llegar a ser tal, que puede

disminuir la diferenciación genética que resulta de la selección natural o de la deriva genética

Slatkin, 1994).

La estimación del flujo genético en animales puede efectuarse a través de métodos directos e

indirectos. Las estimaciones directas se basan en el conocimiento de los patrones de dispersión

(movimiento de individuos entre poblaciones), e incluye el reconocimiento de la fase en la

historia de vida de la especie en la cual ocurre la dispersión. La estimación directa tiene la

desventaja de basarse en estudios limitados por la escala. Es difícil obtener información sobre

dispersiones o movimiento de los individuos a largas distancias. Adicionalmente, los individuos

que se dispersan podrían no reproducirse dentro de la población receptora y por lo tanto no hacer

4

efectiva la transferencia de genes (Slatkin, 1985 y 1994). Las estimaciones indirectas se basan

principalmente en el comportamiento de las frecuencias alélicas que se obtienen usando algún

tipo de marcador molecular. Dependiendo del marcador y de la forma de muestrear los alelos se

puede identificar relaciones genéticas parentales que sugieren el movimiento de genes entre

poblaciones (Hedrick, 1997). Los modelos parten de la condición de Equilibrio de Hardy-

Weinberg (EHW) y cómo este equilibrio puede ser alterado por el flujo genético. La desventaja

es que dependen de los supuestos de EHW, que son tamaño de población grande, apareamiento

aleatorio, nula tasa de mutación, ausencia de selección, entre otros; y que sólo el flujo altera el

equilibrio. Estos supuestos pocas veces se cumplen (Slatkin, 1994)

Para estimar el flujo genético de manera indirecta se emplean los estadísticos F, los cuales

asumen una población homogénea (T) y llega a ser subdividida (S) hasta el nivel de individuo (I).

Dicho de otro modo reparte la variación genética a nivel de individuo, subpoblación y población

total. Se trata de una estimación de la probabilidad de que dos alelos sean idénticos por

descendencia, por lo que también son estimadores de la endogamia a diferentes niveles

jerárquicos Fst (subpoblación), Fit (población total), Fis, (individuos dentro de una población).

Estos estimadores están interrelacionados por la siguiente función 1-Fit=(1-Fst)(1-Fis). Fst es

especialmente importante ya que sugiere el nivel de diferenciación entre poblaciones cuyo valor

puede ser alterado por la tasa de flujo genético (Hedrick, 1997; Slatkin, 1985). Estos estadísticos

pueden ser expresados en términos de las frecuencias alélicas y frecuencias genotípicas

observadas y esperadas (Hartl y Clarck, 1997; Hedrick, 1997). La Fst puede ser modificada por el

número de individuos que se dispersa por generación (Nm) de la siguiente forma Fst=1/(4Nm+1);

y Nm puede ser interpretado como la tasa de flujo genético que ocurre entre pares de poblaciones

(Hedrick, 1997; Slatkin, 1994).

En los estudios que se han hecho para estimar el flujo genético usando métodos indirectos se ha

podido identificar los patrones de flujo genético y las barreras o las condiciones que facilitan el

flujo genético. Estudios sobre flujo genético en plantas (Lestani et al., 2005) y en insectos como

en Stegomyia aegypti, mosquito vector de la fiebre amarilla (Su et al., 2003), se reconoció la

existencia de barreras físicas que impiden el flujo genético entre poblaciones. En algunos casos el

alto flujo genético puede promover el mantenimiento de altos niveles de diversidad genética en

una especie. El flujo genético implica un aporte constante de genes en una población. Para el caso

de especies plaga, presentar altos niveles de diversidad genética puede ser en parte la razón de

5

porqué pueden superar las estrategias de control (Dávila et al., 2005).

Los estudios de genética de poblaciones con especies de Tephritidae muestran un intervalo

amplio de polimorfiso (P) y diversidad genética (H). Por ejemplo para Ceratitis capitata el

polimorfismo va de 12.5 a 100% y la heterocigosidad entre H=0.005 y H= 0.186 (Huettel et al.,

1980; Gasperi et al., 1986; Villardi et al., 1990).

Los estudios genéticos con poblaciones de A. ludens de Chiapas, han mostrado que existen

considerables niveles de variación genética, cuyo mantenimiento puede estar relacionado con el

hecho que se aplican diferentes métodos de control y a que A. ludens usa diferentes especies de

plantas (Verónica-Vallejo, 2006; Cancino, 2007). El hospedero promueve una diferenciación

genética considerable entre poblaciones, especialmente de mango (Mangifera indica) y naranja

(Citrus sinensis). Estas diferencias entre las poblaciones de acuerdo al hospedero disminuyen si

existe alto flujo genético. La alta disponibilidad de éstos hospederos, especialmente en el

Soconusco (Chiapas), puede facilitar el flujo genético entre poblaciones (Verónica-Vallejo,

2006). Así también, la estructura genética en A. ludens con relación a las distancias geográficas,

provoca que haya mayor flujo entre localidades más cercanas que entre localidades más alejadas,

independientemente de la especie hospedera (Cancino, 2007).

Parámetros demográficos

Algunos estudios con especies cercanas, como A. fraterculus, demuestran que los diferentes

orígenes geográficos pueden resultar en incompatibilidad sexual (Vera et al., 2006). Sin embargo

esto no se ha observado en A. ludens (Orozco et al., 2007).

En cuanto a los parámetros de historia de vida se han hecho estudios sobre la influencia que

ejerce el tipo de hospedero en fecundidad, sobrevivencia, desarrollo larval y adulto, incluyendo

tamaño del cuerpo de especies de Tephritidae (Carey, 1982; Krainacker et al., 1987; Pérez, 1987;

Celedonio et al., 1988; Liedo et al., 1992; Hendrichs, 1993; Sivinski, 1993; Vargas et al., 1997).

En Ceratitis capitata el hospedero en donde se desarrolla la larva afecta la sobrevivencia,

fecundidad y fertilidad, en este estudio se pretende analizar si las poblaciones presentan

diferencias en los parámetros antes mencionados, evaluados a través de la estimación de la tasa

intrínseca de crecimiento (r) en condiciones estandarizadas de laboratorio y su relación con un

patrón de flujo genético (Carey, 1982; Krainacker et al., 1987).

6

Pregunta de investigación

¿Cuál es el nivel de variación genética y en caracteres de historia de vida entre y dentro de

poblaciones de mosca mexicana de la fruta Anastrepha ludens (Loew) separadas por una

distancia geográfica considerable (>60-80 km)?

Hipótesis

Se espera que todas las poblaciones muestren altos niveles de variación, tanto en sus caracteres

de historia de vida (CV>60%) como en la diversidad genética (0.013<H<0.392). Suponemos que

estos atributos le han permitido a A. ludens utilizar nuevos hospederos y ampliar su distribución

geográfica. Así mismo, se espera que la diferenciación genética y en historia de vida entre

poblaciones se relacione con la distancia geográfica, bajo el supuesto de que ocurre un bajo flujo

genético y un régimen selectivo diferencial entre poblaciones.

Objetivo general

• Determinar los niveles de variación genética y de parámetros de historia de vida de

poblaciones de A. ludens de los estados de: Michoacán, Morelos, San Luis Potosí, Nuevo

León, Durango y Nayarit.

Objetivos específicos

• Estimar el nivel de diversidad genética de seis poblaciones mexicanas de A. ludens

• Determinar el grado diferenciación genética de A. ludens y su asociación con la distancia

geográfica.

• Determinar la tasa intrínseca de crecimiento (r) de poblaciones colectadas en seis estados de

la República Mexicana.

• Determinar si existe correlación entre la variación genética y la tasa intrínseca de

crecimiento.

Materiales y Métodos

Sitios de colecta

A través del apoyo de la Campaña Nacional contra Moscas de la Fruta, se harán colectas en los

7

estados de Michoacán, Morelos, San Luis Potosí, Nuevo León, Durango y Nayarit.

Se colectará en las principales especies hospederas como son Mangifera indica (mango) y Citrus

sinensis (naranja). Se colectará en dos localidades por cada Estado, esto durante los meses de

septiembre 2008 a enero del 2009.

Procesamiento de muestras

Se elegirán los frutos en donde se encuentren larvas del 3er estadio. Estas larvas serán llevadas al

laboratorio en donde se depositarán en vermiculita para estimular el paso de larva a pupa y la

emergencia de adultos. Los adultos serán colocados en jaulas y a los 20 días se elegirán al azar 30

individuos adultos (15 machos y 15 hembras) por hospedero por localidad y serán almacenados

individualmente en viales y a una temperatura de -70°C hasta la realización de la electroforesis.

100 adultos (50 machos y 50 hembras) se usarán para la evaluación de atributos demográficos.

Los individuos que se usarán para el análisis de parámetros genéticos serán tomados de los

individuos en los que se evaluarán parámetros demográficos, esto se hará en los parentales, ya

que para la progenie solo se evaluarán parámetros demográficos.

Parámetros demográficos

En laboratorio, los frutos se disectarán con el fin de recuperar las larvas. Las larvas se colocarán

en vermiculita para que comiencen a pupar, a una temperatura de 26oC y HR de 70 a 80 %. Una

vez que los adultos emerjan serán colocados en cinco jaulas (10 parejas por jaula) y se evaluarán

atributos biológicos como la eclosión máxima, duración de cada estadio, y sobrevivencia de

larvas. Las jaulas serán de 30 x 30 x 30cm, cubiertas con malla y una de las caras cubierta con

tela de color blanco y luz fina para poder manipular el alimento de las moscas y los individuos

colocados en ellas. A los 10 días de haber colocado los adultos en las jaulas (tiempo en el que

alcanzan la madurez sexual), se les colocarán dispositivos para colectar los huevecillos. El

dispositivo que se usará serán esferas de fucellerone (ver anexo). A las 24 hrs de colocado el

dispositivo se hará la colecta de huevecillos, se alinearán 100 huevecillos en cinco cajas petri

para evaluar la fertilidad, o eclosión de huevecillos (esta lectura se hará a los 7 días) y el resto

serán usados para siembra, se colocarán en cajas petri con papel filtro y tela de organza negra, se

mantendrán a 26°C y 70 a 80% HR. Después de 4 días se hará la siembra. Las larvas recién

emergidas serán sembradas en dieta (ver anexo) para su desarrollo. Cuando las larvas hayan

madurado se recuperarán y serán colocadas en vermiculita para inducir pupación. Se evaluará

8

eclosión máxima, sembrando 100 larvas por recipiente y contando el número de ellas que llegan a

pupar. Una vez que se formen las pupas (lo que en promedio ocurre a los 14 días), las pupas serán

tamizadas y colocadas en jaulas para la emergencia de adultos. Se hará el conteo de adultos.

Estas evaluaciones se harán durante dos generaciones. Con estos datos se harán tablas de vida

para obtener la tasa intrínseca de crecimiento para cada población (Stiling, 2002). Se harán

análisis de correlación entre la variación genética y la tasa intrínseca de crecimiento (empleando

el paquete estadístico SPSS v. 15.0).

Parámetros genéticos

Para llevar a cabo el análisis por electroforesis se hará uso del Laboratorio de Genética del área

de Sexado Genético en la Planta Moscafrut, ubicada en Metapa de Domínguez, Chiapas.

La estructura genética se describirá a través del análisis enzimático utilizando la técnica de

electroforesis en acetatos de celulosa (Herbet y Beaton, 1994). La electroforesis es una técnica

rápida y sencilla que permite obtener estimaciones de las frecuencias génicas y de la variación

genética existente entre poblaciones.

Es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de éstas en un campo eléctrico

a través de una matríz porosa, la cual finalmente las separa por tamaños moleculares.

Cada individuo adulto de los parentales se macerará con 250 microlitros de una solución

extractora, y se centrifugará a 13 000 rpm (revoluciones por minuto) por 3 minutos y el

sobrenadante se usará para la separación de las enzimas por electroforesis. En las isoenzimas, las

sustituciones de aminoácidos que cambian la carga eléctrica de la enzima son fáciles de

identificar por electroforesis en gel y esto constituye la base para el uso de las isoenzimas como

marcadores moleculares.

Se usarán acetatos de celulosa, previamente remojados durante 40 minutos en el buffer de

corrimiento CAAMP (Herbet y Beaton, 1994). Los corrimientos se llevarán a cabo en

condiciones de temperatura ambiente, a 50 V y 30 mA durante 2 horas y 30 minutos.

Se revelarán 6 loci enzimáticos: MDH, IDH, GOT, ME, GPI y 6PGDH. Se obtendrán las

frecuencias genotípicas, alélicas y el porcentaje de polimorfismos.

Análisis

Se hará uso del programa Tools For Genetic Populations Analisis (TFPGA) para obtener los

parámetros descriptivos de la diversidad y estructura genética, en los cuales se consideran

9

únicamente los loci con al menos dos alelos. Se obtendrán las frecuencias genotípicas y alélicas,

con estos datos se obtendrá el porcentaje de polimorfismo, en una escala de 0 a 1, si el total de los

loci son polimorficos (con dos o más alelos) es igual a 1 y cuando la variación genética es nula

igual a 0 (un solo alelo). Se calculará la heterocigosidad y el EHW (mediante una prueba de χ2 ),

la heterocigosidad esperada y observada de las poblaciones (conjunto de organismos que se

colecten por hospedero por localidad y Estado). Para determinar el grado de similitud entre las

poblaciones se usará un análisis de agrupación (UPGMA) con base en una matríz de distancias

genéticas de Nei (1972). La diferenciación entre poblaciones y subpoblaciones se estimará a

través de los estadísticos F´s de Wright (Hedrick, 1997). Los análisis se harán para hembras y

machos por separado.

El análisis de Flujo Genético entre poblaciones se hará mediante la relación Nm = (1/Fst -1)/4.

Para estimar si el patrón de flujo genético se debe al aislamiento por distancia se hará una

regresión de Nm (número de individuos que migran entre pares de poblaciones por generación)

contra la distancia geográfica que hay entre pares de poblaciones (Hedrick, 1997).

10

Literatura citada

Aluja S. M. 1994. Manejo Integrado de la Mosca de la Fruta. Edit. Trillas. México. 251 p

Aluja S. M. y R. L. Mangan. 2008. Fruit fly (Diptera: Tephritidae) Host Status Determination

Critical Conceptual, Methodological, and Regulatory Considerations. Annual Review

Entolomololgy, 23:473-502.

Cancino T. R. J. 2007. Estructura Genética de Anastrepha ludens Loew (Diptera:

Tephritidae), en poblaciones del estado de Chiapas (Tesis Licenciatura). Universidad de

Ciencias y Artes de Chiapas. Tuxtla Gutiérrez, Chiapas. 47 p.

Carey J. R. 1982. Demography and population dynamic of the Mediterranean fruit fly. Ecol.

Model., 16:125-150.

Celedonio H., P. Liedo, M. Aluja, J. Guillen, D. Berrigan y J. R. Carey. 1988. Demography of

Anastrepha ludens, A. obliqua and A. serpentina (Diptera: Tephritidae) in México. Fla

Entomol., 71:111-120.

Dávila O. G., G. G. Andraca, M. L. Ruíz, R. A. Castro y C. Ramírez. 2005. Genética poblacional

de Phyllophaga obsoleta (Coleoptera: Melolonthidae) en Amatenango del Valle, Chiapas.

Entomología Mexicana, 4: 857-862.

Dobzhansky, F. J. Theodosius, G. L. Ayala, Stebbins y J. W. Velentine. 1977. Evolution.

Freeman. 1era Edición. EUA. 132 p

Gasperi G., A. R. Malacramida y R. Milani. 1986. Protein variability and population genetics of

Ceratitis capitata. En: Procesing of the II International Symposium. Elsevier. Pp 149-175.

Groom J. M., G. M. Meffe y C.R. Carroll. 2006. Principles of Conservation Biology. Sinauer

Associates, Inc. Publishers. Massachusetts, E. U. A. 779 p

Gutiérrez R. J. M. 2003. Campaña Nacional contra Moscas de la Fruta: Situación Actual y

Perspectivas. En: Memorias del XV Curso Internacional sobre Moscas de la Fruta .

Programa MOSCAMED-MOSCAFRUT SAGARPA-IICA. 2003. Metapa de Domínguez.

Chiapas, México. Pp 7-10

Hart D. L. y A. G. Clark. 1997. Principles of Population Genetics. Sinauer Associates Inc. E. U.

A. 682 p

Hendrichs J. 1993. Contribution of natural foods sources to adult longevity and fecundity of

11

Rhagoletis pomonella (Diptera: Tephritidae). Ann Entomol Soc Am, 86:250-264.

Hedrick W. P. 1997. Gene Flow and Populations Structure. Chapter 7. En: Hedrick W. P.

Genetics of Populations. 2a Edición. Jones and Bartlett Publishers. Sudbury, Massachusetts.

Pp 265-300

Herbert P. D. N. and Beaton M. J. 1994 Methodologies for Allozyme Analysis Using Cellulose

Acetate Electrophopresis Helena Laboratories.

Hernández-Ortíz V. 1992. El género Anastrepha en México (Diptera-Tephritidae) Taxonomía,

distribución y sus plantas hospederos. Instituto de Ecología. Sociedad Mexicana de

Entomología. Xalapa, Veracruz, México. 162 p

Huettel M. D., P. A. Fuerst, T. Maruyama y R. Chacraborty. 1980. Genetics effects of multiple

population botlenecks in the Mediterranean fruit flies (Ceratitis capitata) Genetics, 94:

43-47.

Krafsur E. S. 2005. Role of Population Genetics in the Sterile Insect Technique. En: Dyck, V. A.,

J. Hendrichs, y A. S. Robinson. Sterile Insect Technique: Principles and Practice in Area-

Wide Integrated Pest Management. Springer – The Netherlands. Pp 389-406

Krainacker D. A., J. R. Carey, R. I. Vargas. 1987. Effect of larval host on life history traits of the

Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitata). Oecologia (Berlin), 73: 583-590

Lestani E. A., G. C. Rossi, S. A. Tonon y D. J. Liotta. 2005. El intercambio Estimación del flujo

génico entre dos poblaciones de Stegomyia aegyti en el cruce fronterizo Puerto Rico

(Argentina) - El Triunfo (Paraguay) mediante marcadores moleculares rapd. Congreso

Nacional de la Sociedad Entomológica Argentina. Tucumán.

Liedo P., J. R. Carey, H. Celedonio y J. Guillén. 1992. Size specific demography of three species

of Anastrepha fruit flies. Entomol Exp Appl, 63:135-142

Orozco D. D., R. Hernández, S. Meza, y J. Domínguez. 2007. Sexual Competitiveness and

Compatibility between mass-reared sterile flies and wild populations of Anastrepha

ludens (DIPTERA: TEPHRITIDAE) from different regions in México. Florida

Entomoligist, 90(1): 19-26.

Pérez R. A. 1987. Tasas de supervivencia y reproducción de Anastrepha ludens (Loew) en

diferentes hospedantes (Tesis de Maestría). Colegio de Posgraduados, Montecillo, Estado

de México. 40 p

Roderik G. 1996. Geographic Structure of Insect Population: Gene, flow, phylogeography, and

12

their uses. Annual Review Entomology, 41:325-352.

Secretaria de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rutal (SAGAR). 1998. Inocuidad Alimentaria:

Propuesta de Estrategia. Secretaria de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rural. México,

D. F.

SENASICA. 2008. Campaña nacional contra moscas de la fruta. México D. F., México. En:

www.senasica.gob.mx

Sivinski J. M. 1993. Longevity and fecundity in the Caribbean fruit fly (Diptera: Tephritidae):

effects of mating, strain and body size. Fla Entomol, 76:635-644

Slatkin M. 1985. Gene flow in Natural Populations. Ann Rev Ecol Syst, 16:393-430

Slatkin M. 1994. Gene flow and population structure. En: Slatkin M. Ecological Genetics,

Editado por L. Real. Princeton. Pp 1-11.

Stiling P. 2002. Ecology, Theories and Applications. Prentice Hall. Upper Saddle River, Nueva

Jersey. 347 p

Su H., L. J. Qu, K. He, Z. Zhang, J. Wang, Z. Chen y H. Gu. 2003. The Great Wall of China: a

physical barrier to gene flow. Heredity, 90: 212–219

Vargas R. I., W. A. Walsh, D. Kanehisa, E. B. Jang y J. W. Amstrong. 1997. Demography of four

Hawaiian fruit flies (Dipthera: Tephritidae) reared a five constants temperatures. Ann

Entomol Soc Am, 90:162-168

Vera M. T., C. Cáceres, V. Wornoayporn, A. Islam, A. S. Robinson, M. H. De La Vega, J.

Hendrichs y J. P. Cayol. 2006. Mating incompatibility among populations of the South

American fruit fly Anastrepha fraterculus (Diptera: Tephritidae). Ann Entomol Soc Am,

99: 387-397

Verónica-Vallejo R. 2006. Diversidad y estructura genética de poblaciones de Anastrepha ludens

(Loew) asociadas a diferentes especies huésped en el Soconusco, Chiapas (Tesis

licenciatura). Universidad Autónoma Metropolitana. 37 p

Villardi J. C., A. Civetta, B. O. Saidman y J. L. Cladera. 1990. Caracterización de tres sistemas

isoenzimáticos de adultos de una población de Ceratitis capitata Wied.

(Diptera:Tephritidae). Evolución Biológica. 4:107-118

13

ANEXOS

Esferas de oviposición

• Pesar 30 gr de fucellerone

• Medir un litro de agua

• Mezclar hasta que quede homogénea

• Calentar durante 30 min a punto de ebullición (80°C).

• Agregar un mililitro de colorante vegetal McCormick y mezclarlo bien.

• Vaciar el contenido en moldes para esferas de una pulgada de diámetro

• Dejar enfriar y separar del molde.

Cuadro 1. Ingredientes para dietas larvarias elaborada para A. ludens (Stevens, 1991)

Ingredientes g %

Polvo de olote 90 18

Harina de maíz 26.5 5.3

Azúcar 46 9.2

Lev. Lake-States 35 7

Ac.Cítrico 2.2 0.44

Benzoato 2 0.4

Nipagin 1 .2

Goma guar 0.5 0.1

Agua 296.8 59.4

Cuadro 2. Alimento de los adultos

Compuesto Proporción

Azúcar 3

14

Levadura hidrolizada

enzimáticamente

1

Componentes de Isoenzimas a usar en el análisis electroforético

IDH

Isocitrate Deshydrogenase

• 1.0 ml Tris HCl pH= 7.0

• 1.5 ml NADP

• 1.5 gotas DL-Isocitric acid.

• 8 gotas MgCl2

• 12 gotas MTT

• 5 gotas PMS

• 2 ml Agar.

ME

Malate Dehydrogenase NADP

• 0.6 ml Tris HCl PH= 8.0

• 1.5 ml NADP

• 12 gotas Malic Substrate

• 2 gotas MgCl2

• 5 gotas MTT

• 5 gotas PMS

• 2 ml Agar.

MDH

Malate Dehydrogenase

• 1.0 ml Tris HCl pH= 8.0

• 1.5 ml NAD

• 13 gotas Malic Substrate.

• 5 gotas MTT

• 5 gotas PMS

• 2 ml Agar.

GOT

Aspartate Amiro Tranferasa

• 3 ml Solucion # 1

• 5 gotas Fast Blue BB.

• 2 ml Agar.

GPI

Glucose-6-Phosphate Isomerasa

• 1.0 ml Tris HCl Ph= 8.0

• 1.5 ml NAD

• 10 gotas Fructose-6-phosphate

• 5 gotas MTT

• 5 gotas PMS

• 20 microlitros G6PDH

• 2 ml Agar.

G6PDH

• 80 microlitros G6PDH

• 1 ml H2O.

15

2

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

2008 2009

Mes D E F M A M J J A S O N D

Procesamiento y

almacenamiento de

muestras

.

.

Evaluación de

parámetros

demográficos.

Evaluación de

parámetros genéticos

Procesamiento y

análisis de datos

Revisiones de tesis

Lugar Metapa de Domínguez, Chiapas. San Cristóbal de las Casas,

Chiapas.

1

Resumen curricular

Nombre: Mayra Carolina Molina Nery

FORMACIÓN ACADÉMICA (A PARTIR DE LICENCIATURA)

Carrera: Ingeniero Agrónomo Especialista en Parasitología Agrícola Institución: Universidad Autónoma Chapingo Nivel: Licenciatura Modalidad de graduación: Tesis Título de la tesis: Sintomatología y Distribución espacial de los virus asociados a chile (Capsicum annuum híbrido Lorca F1) bajo invernadero en Texcoco, Estado de México.

EXPERIENCIA EN PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN (NO INCLUYENDO LA TESIS)

Tipo de participación (colaborador o responsable): colaborador Responsabilidades dentro del proyecto (no incluyendo su investigación de tesis): montaje y medición morfométrica de pulgones. Nombre del proyecto: Adaptación local de insectos fitófagos a sus especies hospederas, correlaciones y estructura genética, en el municipio de San Cristóbal de las Casas, Chiapas Investigador responsable: Lorena Ruíz Montoya Institución donde se desarrolló: ECOSUR unidad San Cristóbal Instancia financiadora: CONACyT Fechas de inicio y término: 1 de junio a 1 de diciembre del 2005.

CONGRESOS

Ponentes: Francisco Ponce González Año: Noviembre del 2003 Título de la ponencia: ENFOQUES ACTUALES EN LA PARASITOLOGIA AGRÍCOLA Nombre y lugar del congreso: Semana de Parasitología Agrícola, Universidad Autónoma Chapingo, Texcoco, México. Ponentes: Amalia Pérez Valdéz Año: Noviembre del 2005 Título de la ponencia: COMO COMPETIR PROFESIONALMENTE EN EL MERCADO FITOSANITARIO E IMPACTO DEL CONTROL BIOLÓGICO DE PLAGAS. Nombre y lugar del congreso: Semana científica, cultural y deportiva de Parasitología Agrícola, Universidad Autónoma Chapingo, Texcoco, México.

2