PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIFUNGICA PARA LEVADURAS POR DISCO DIFUSION M44-A2, M44-S3 (2009)

Lic. ROBERTO E. ROJAS LEON Instituto Nacional de Salud del Niño

rerojasle@yahoo.com 2013

Practical handbook of microbiology, 2008

EVOLUCION TAXONOMICA DE LAS LEVADURAS

Fuente Referencia

Nº Géneros

Nº Especies

Incremento %

Incremento % Año

Epidemiología

• Levaduras en IIH del torrente sanguíneo – 41.4%, comunicación personal (INSN, 2006-

2008) • Entre 1999 y 2000, casos de sepsis por

hongos se incrementa en 207% (USA) – Candida spp, Aspergillus spp y Cryptococcus

spp

CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, 20(1):133-163, 2007

CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, 20(1):133-163, 2007

Normas CLSI

• Incremento de IFI y de antifúngicos – Pruebas de susceptibilidad antifúngica

GANAN reconocimiento • Métodos de referencia tanto macro y

microdilución de CLSI – Levaduras, M27

• P (1992); T (1995); A (1997); A2 (2002) – Mohos, M38

• P (1998); A (2002)

P 2003 A 2004

Método disco difusión

• Solo para levaduras – Solo para Candida spp.

• No abarca otros géneros de levaduras ni dimórficos en su fase de levadura

• Azoles y equinocandinas • Resultados, 20 a 24 h. de incubación • Mueller-Hinton en lugar de RPMI

– Disponibilidad – Bajo costo

Método disco difusión

• Punto de corte – Caspofungina – Fluconazol – voriconazol

Método disco difusión

• Parámetros de QC – Caspofungina – Fluconazol – Posaconazol – voriconazol

Selección de los antimicrobianos en disco para pruebas de rutina y reporte

• Pese a criterios interpretativos, no recomendado en rutina: – Decisión tomada por médico infectólogo,

comité de farmacia y terapéutica, personal de microbiología clínica y el comité IIH.

• Para minimizar confusión, emplear nombres genéricos.

• Número de agentes testados, deben ser limitados, aún con pocos antifúngicos.

Equipo y materiales

• Incubadora a 35 ºC (±2 ºC), con ambiente aeróbico.

• Estándar de turbidez McFarland 0.5 • Hisopos de algodón estériles • Solución salina fisiológica estéril (8.5 g/L

NaCl; 0.85%).

Reactivos

• Medio Agar Mueller-Hinton + Glucosa 2% + Azul de Metileno 0.5 μg/mL (MHS) – Fácil disponibilidad – Aceptable reproducibilidad lote a lote – Suplemento

• Glucosa 2%, apropiado crecimiento • Azul de metileno 0.5 μg/mL, incrementa zona de

definición – Puede ser suplementado ya sea pre o pos

producción

Guía Práctica de Identificación y Diagnóstico en Micología Clínica, Pemán. 2007

Preparación del medio de Mueller-Hinton agar suplementado (1) y suplementación de las placas de MHA (2).

Reactivos

• pH de MHS – 7.2 – 7.4, Tº amb. después de solidificado

• Macerar medio para sumergir el electrodo • Dejar que una pequeña cantidad de agar se

solidifique alrededor del electrodo en un recipiente de vidrio

• Usar electrodo de superficie calibrado

• Humedad – Exceso en la superficie, secar en incubadora

o cabina de flujo laminar, tapa entreabierta (10-30 min).

Reactivos

• Almacenamiento de discos – Refrigerar los recipientes a ≤ 8 ºC o

congelación a -14 ºC, hasta ser utilizados. • Preparación del estándar de turbidez

– Estándar de turbidez McFarland 0.5

PROCEDIMIENTO

• Preparación del inóculo – Cepas subcultivadas, sobre AS ó ASD

(pureza y viabilidad). Tº 35 ºC (±2 ºC) – Inóculo preparado picando 5 colonias

distintas de aprox. 1 mm de Ø, 24 h, 5 ml de SSF estéril

– Agitar por 15 s y ajustar turbidez (1x106 a 5x106 cel/mL

Preparación inóculo levaduras (M44-A2).

Guía Práctica de Identificación y Diagnóstico en Micología Clínica, Pemán. 2007

Desarrollo de Levaduras sobre ASD 2%: Gold Standar

Verificar pureza del aislamiento: evita dolores de cabeza

bacterias

Chrom Agar: excelente alternativa

Coinfección

PROCEDIMIENTO • Inoculación de las placas

– Dentro de los 15 min después de ajustar la turbidez del inóculo, embeber el hisopo en la suspensión, rotar varias veces y presionar firmemente contra la pared interna del tubo evitando el nivel del fluido.

– Agar MHS es inoculado por estriado uniforme del hisopo en toda su superficie, dos o mas veces, rotando la placa aprox. 60º cada vez, finalmente el borde del agar.

– Tapa entreabierta, 3-5 min., no mas de 15 min

PROCEDIMIENTO • Aplicación de los discos

– Los discos son dispensados sobre la superficie de la placa inoculada, ligera presión, aproximación entre discos no menor de 24 mm de centro a centro

– Invertir las placas e incubar dentro de los 15 min después que los discos son aplicados

DISCOS DE FLUCONAZOL

25 μg

DISCOS DE VORICONAZOL

1 μg

PROCEDIMIENTO • Lectura de las placas e interpretación

– Examinar después de 20-24 h de incubación – Zonas de inhibición uniformemente circulares y

desarrollo semiconfluente – Sobre fondo negro no reflejante, iluminado – Medir el diámetro de prominente reducción de

crecimiento – Ignorar microcolonias en los bordes o grandes

colonias dentro de la zona de inhibición. – Leer a las 48 h solo cuando insuficiente

desarrollo es observado a las 24 h

M44-S3 2009

INTERPRETACION

J Clin Microb; 2008, 46(6):1927-1929

CONTROL DE CALIDAD

• Propósito (monitorear) – Precisión (repetitibilidad) y exactitud – Performance de reactivos – Performance de la persona que realiza la

prueba y lee los resultados

CONTROL DE CALIDAD

• Utilizar cepas de referencia para el QC – Candida albicans ATCC 90028 – Candida parapsilosis ATCC 22019 – Candida tropicalis ATCC 750 – Candida krusei ATCC 6258.

CONTROL DE CALIDAD • Almacenamiento de cepas para el QC

– Minimizar posibilidad de mutación – APD a -70 ºC – Cepas de trabajo, AS o ASD a 2-8 ºC,

subcultivadas cada semana, no mas de tres semanas

– Cepas congeladas o liofilizadas, subcultivadas al menos dos veces antes de su uso

CONTROL DE CALIDAD • Diámetros límites del control de calidad

– Diario, si es satisfactorio semanal

CARTILLA DE MICOTECA

MUCHAS GRACIAS