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LOS RESULTADOS SEROLÓGICOS. LIMITACIONES Y APLICACIONES PRÁCTICAS PARA LA ENFERMEDAD DE GUMBOROLOS RESULTADOS SEROLÓGICOS. LIMITACIONES Y APLICACIONES PRÁCTICAS PARA LA ENFERMEDAD DE GUMBOROLOS RESULTADOS SEROLÓGICOS. LIMITACIONES Y APLICACIONES PRÁCTICAS PARA LA ENFERMEDAD DE GUMBOROLOS RESULTADOS SEROLÓGICOS. LIMITACIONES Y APLICACIONES PRÁCTICAS PARA LA ENFERMEDAD DE GUMBOROLOS RESULTADOS SEROLÓGICOS. LIMITACIONES Y APLICACIONES PRÁCTICAS PARA LA ENFERMEDAD DE GUMBOROPATOLOGÍA

Los resultados serológicos. Limitaciones yaplicaciones prácticas para la enfermedadde Gumboro

Pruebas serológicas cualitativas

Las pruebas serológicas pueden ser cuantitativas ocualitativas. En las pruebas cualitativas, como la aglu-tinación en placa o la inmunodifusión en gel de agar, elresultado se expresa como positivo o negativo. En gene-ral, estas pruebas suelen ser poco sensibles y el sueronormalmente no se diluye para ser procesado.

Pruebas serológicas cuantitativas

Las pruebas cuantitativas permiten detectar la can-tidad de anticuerpos que hay en la muestra; en el casode la inhibición de la hemoaglutinación, lamicroaglutinación y la seroneutralización los sueros sediluyen en diluciones dobles seriadas y el resultadousualmente se expresa como el «título», que indica la

dilución mayor en la que se observa una reacciónpositiva. El título es proporcional a la cantidad deanticuerpos que hay en la muestra y el resultado seexpresa como la dilución, ej. 1:256 o su inverso ej. 256,aunque también se pueden expresar en forma deLogaritmo en base 2, por ejemplo, 1:256 = Log2 8.

En otros casos, como en las pruebas ELISA, el suerosólo es diluido una vez antes de ser procesado y se utilizaun antisuero marcado con una enzima. El resultado sebasa en una reacción colorimétrica que es medida conun espectrofotómetro, cuya intensidad es proporcionala la cantidad de anticuerpos de la muestra y el titulo escalculado matemáticamente haciendo una compara-ción con los títulos de los controles positivos y negati-vos. Los resultados son además clasificados en «gruposo perfiles» en un histograma, ya que la expresióngráfica de los resultados facilita en gran medida suinterpretación.

IntroducciónIntroducciónIntroducciónIntroducciónIntroducción

La serología es una herramienta fundamental y clásica en un programa de medicina preventiva;los datos obtenidos deben ser comparados frecuentemente, de forma que sea una herramientadinámica que nos pueda mostrar los cambios de situación en cada granja o explotación relativosal nivel y al tipo de desafío.

Las pruebas serológicas detectan las respuestas humorales de anticuerpos en el huésped frentea diferentes antígenos; las pruebas usualmente detectan anticuerpos séricos -de ahí su nombre-pero eventualmente pueden ser utilizadas para detectar anticuerpos en yema o en cualquier otrolíquido corporal. Una prueba positiva indica que el ave posee anticuerpos contra el antígenoevaluado, lo que puede tener significados diversos. En caso de algunas enfermedades en las quela inmunidad es primordialmente de base celular, apenas se realizan pruebas serológicas paramedir anticuerpos (por ejemplo, Marek, viruela, etc)

Artículo patrocinado por

Javier Torrubia Díaz

Director Técnico Avicultura, Merial laboratorios S.A.

LOS RESULTADOS SEROLÓGICOS. LIMITACIONES Y APLICACIONES PRÁCTICAS PARA LA ENFERMEDAD DE GUMBOROLOS RESULTADOS SEROLÓGICOS. LIMITACIONES Y APLICACIONES PRÁCTICAS PARA LA ENFERMEDAD DE GUMBOROLOS RESULTADOS SEROLÓGICOS. LIMITACIONES Y APLICACIONES PRÁCTICAS PARA LA ENFERMEDAD DE GUMBOROLOS RESULTADOS SEROLÓGICOS. LIMITACIONES Y APLICACIONES PRÁCTICAS PARA LA ENFERMEDAD DE GUMBOROLOS RESULTADOS SEROLÓGICOS. LIMITACIONES Y APLICACIONES PRÁCTICAS PARA LA ENFERMEDAD DE GUMBORO

Seroneutralización

Dentro de las pruebas serológicas cuantitativas, laseroneutralización está considerada de referencia paracualquier estudio serológico pues es la que más secorrelaciona entre la respuesta «in vitro» y la respuesta«in vivo». En esta prueba se puede valorar la capacidadque tienen los anticuerpos presentes en un suero proble-ma para neutralizar la actividad biológica de unantígeno. Se añade una mezcla de virus a una concen-tración constante que previamente ha estado en con-tacto con diferentes diluciones del suero problema sobrelas células. Se van observando las células sobre la que sehan añadidos las distintas diluciones para ver si el viruslas ha infectado o no mediante la tinción con un conju-gado o por el efecto citopático. De esta forma se puedemedir la capacidad de neutralización viral de un sueroproblema.

La prueba de seroneutralización es, sin duda algu-na, la más fiable, pero su complejidad, laboriosidad yelevado coste, hace que se deje para investigación otrabajos muy específicos. Se tiende a emplear pruebasmenos exactas, pero más sencillas y sobre todo, másfáciles de automatizar.

Inhibición de la hemoaglutinación

Esta prueba se basa en la característica de algunosmicroorganismos que son capaces de aglutinar eritrocitosde mamíferos o aves, lo que puede utilizarse para carac-terizar virus, o medir anticuerpos en suero, por ejemplo:Orthomyxovirus, Paramyxovirus y Coronavirus, así comoMycoplasma.

Consiste en enfrentar diluciones seriadas de unamuestra frente a un antígeno con un título determinadohasta que no se produce reacción -aglutinación de los

Fig. 1. Placa de Inhibición de la hemoaglutinación

eritrocitos-. Los resultados normalmente se expresancomo un título (la recíproca de la mayor dilución delsuero problema que inhibe completamente lahemoaglutinación).

Aunque es más laboriosa y menos automatizable queELISA, es preferida su utilización para algunas enferme-dades como EDS y bronquitis infecciosa en la que laabundancia de serotipos permite la aplicación de losdiferentes antígenos, frente a ELISA ya que los kitsdisponibles comercialmente, normalmente se restrin-gen a un solo antígeno.

ELISA

El término ELISA, acrónimo de «Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay», también conocido como EIA-enzimoinmunoanálisis- es similar a las pruebas deradioinmunoensayo -RIA-, más utilizadas en medicinahumana, excepto en que en este caso los anticuerposindicadores se unen a una enzima, en vez de hacerlo auna molécula fluorescente o un isótopo radiactivo.

Las enzimas sirven como marcadores debido a quecuando se combinan con su sustrato producen uncambio de color que hace la reacción visible, pudiéndosecuantificar bien por diluciones o por la lecturaespectrofotométrica de la intensidad del color y medir suintensidad. No requieren instrumentos sofisticados.

Los kits ELISA proporcionan varios valores, como sonla Media Geométrica del Titulo -GMT- que viene a ser laraíz cuadrada -elevada al número de elementos analiza-dos- de los valores, en este caso de los títulos. La ventajade este valor es que es menos sensible a valores extremosfrente a la media aritmética, por lo que este valor esrelevante para la interpretación de los resultados encualquier situación del coeficiente de variación -CV-.Otro valor es el título medio, que es la media aritmética

Fig. 1. Placa de ELISA


-suma y promedio- de los títulos. Este valor carece designificación cuando algunas de las muestras tienentítulos que corresponden al grupo 0, ó títulos con valoresexcepcionalmente altos. En todo caso, los extremospueden hacer variar la apreciación, por lo que en muchoscasos el criterio es eliminar estos valores ya que tambiénpueden suceder contaminación de las muestras y fallosde las pipetas que agregan los reactivos. Este valor esrelevante siempre y cuando tengamos un CV bajo.

El tercer valor es el coeficiente de variación -CV- querepresenta la dispersión de los títulos e indica cómo devariable es la respuesta del título medio en un plantel.Cuanto menor sea el CV más uniformes serán los títulosy mejor la vacunación. En la mayoría de los casos, trasla aplicación correcta de una vacuna inactivada, el CVdebería ser menor del 40%. Tras la aplicación de vacunasvivas, el CV debería ser menor del 60%. Pero tras laprimovacunación, más importante que el CV, es quetodas las aves sean positivas.

La principal ventaja de la prueba ELISA es la capacidadde automatización y de procesamiento de grandes can-tidades de muestras, así como la disponibilidad de dife-rentes kits comerciales, por lo que es la prueba másutilizada. Sin embargo también muestra limitaciones,como son su poca aceptación o difícil correlación enalgunas enfermedades como EDS, pneumovirus,laringotraqueitis, etc.

Sin embargo, a excepción de la seroneutralización,ninguna de las pruebas serológicas por sí mismas indicagrado de protección, sino que indican el nivel deanticuerpos específicos contra un antígeno en particu-lar. Este nivel de anticuerpos debe ser racionalmenteinterpretado para poder decir si indica protección, expo-sición de campo o infección activa. La evaluación ruti-naria y periódica del título de anticuerpos deberácorrelacionarse con los calendarios de vacunación, elcomportamiento clínico y el rendimiento productivo dellote para establecer los parámetros esperados de acuerdoa la edad y a la función zootécnica de las aves paraestablecer los niveles considerados «normales» e inter-pretar adecuadamente las variaciones de la «normali-dad» como inmunidad insuficiente, la exposición decampo no controlada o la enfermedad clínica aparen-te. Las llamadas «líneas de base» indican el nivelnormal esperado de anticuerpos en un lote a una edaddeterminada, permiten identificar con facilidad loscambios en el nivel de anticuerpos debidos a cambiosen las vacunaciones o a exposiciones de campo y sepueden correlacionar con los objetivos de rendimien-to productivo.

En el caso de las pruebas serológicas, lo normal es quese requiera de un muestreo seriado del lote para detectar

seroconversión o bien, un incremento en el título deanticuerpos de las aves, lo cual es muy sugestivo de unaexposición de campo hacia el agente evaluado.

Se ha de ser muy cauto a la hora de hacer prediccio-nes sobre títulos protectivos. En primer lugar porque elgrado de protección depende de muchas variables, comolas cepas vacunales utilizadas, la virulencia de las cepasde campo involucradas, el tipo de ave, el programa ymétodo de aplicación de la vacuna y otras variableslocales. Así por ejemplo, un título ELISA de 4000 frentea ND puede ser protectivo en una granja y no en otras.

Limitaciones y aplicaciones prácticaspara la enfermedad de Gumboro

En el caso particular de la enfermedad de Gumboro,existen diferentes kits ELISA comerciales, cada uno deellos con sus características especiales. Así, por ejemplo,el kit comercial seguramente más ampliamente utiliza-do, de origen americano, utiliza como antígeno el mismoque se utiliza en una vacuna intermedia clonada -tam-bién muy utilizada en la práctica-, pero la consecuenciaes que al utilizar ese kit, los títulos conseguidos si se haempleado esa vacuna son mayores que si se ha vacuna-do con otras cepas como las derivadas de la cepa Lukerto la S-706 por ejemplo.

Otro ejemplo es un segundo kit ELISA comercial,bastante utilizado en Europa, de origen holandés, que encondiciones normales alcanza títulos algo más altos queel primer kit mencionado, por lo que es difícil hacercomparaciones entre títulos provenientes de laborato-rios que utilicen estos 2 tipos de kits. Hay que tener encuenta, además, que en muchas empresas e integracio-nes se emplea a menudo la conocida fórmula de Deventer,la cual proporciona una herramienta útil para estimar elmomento óptimo de vacunación de un plantel especí-fico, basándose en el nivel y la vida media de losanticuerpos maternos, la edad de los pollos a la toma demuestras, los antecedentes genéticos de los pollos y lacepa de la vacuna de IBD -de Witt, 2001-. Pero la fórmulade Deventer se elaboró con los valores proporcionadospor un determinado kit.

Pero también hay algunas diferencias entre los kitsy los anticuerpos detectados. Recordemos que el genomadel virus de la enfermedad de Gumboro codifica 5proteínas diferentes, de VP1 a VP5. Las proteínas VP2 yVP3 son las principales proteínas estructurales, queconstituyen el exterior e interior de la cápside del virus,respectivamente. Los epítopos localizados en la proteínaVP2 son capaces de provocar los anticuerposneutralizantes protectivos frente al IBDV y son determi-


nantes del serotipo. El sitio antigénicoresponsable de la inducción deanticuerpos neutralizantes se encuen-tra dentro de una región muy pequeña,conocida como dominio variable de VP2,y es altamente dependiente de la con-formación. Por el contrario, VP3 es unantígeno específico de grupo que esreconocida por anticuerpos noneutralizantes, que puede reaccionarde forma cruzada con los dos serotipos.

Recientemente se ha lanzado unnuevo kit ELISA, el kit PROFLOK Plus IBDAb test -Synbiotics, San Diego,California-. La diferencia entre los kitsclásicos utilizados hasta ahora y estenuevo kit se encuentra en la naturalezadel antígeno IBDV que recubre las pla-cas. Los kits clásicos utilizan general-mente antígenos derivados de cepasclásicas replicadas en cultivo de tejidos.El test PROFLOK Plus IBD Ab utiliza unantígeno de una cepa clásica derivadade bolsas nativas. Este último permiteuna detección más precisa de losanticuerpos VP2 protectivos del IBDV.Este test mejorado es más sensible que lostests clásicos y muestra una alta correla-ción con la prueba VN. Los kits clásicosaunque detectan casi todos los anticuerposfrente a las diferentes VP, sobre tododetectan los anticuerpos anti VP3.

El advenimiento de vacunas de úl-tima generación contra la enfermedadde Gumboro, como son las vacunasvectoriales que por su conformaciónproducen una respuesta de anticuerposVP2 -Vaxxitek HVT+IBD, Merial Labora-torios SA-, ha provocado una nuevasituación en relación a los kits ELISAdisponibles hasta ahora, ya que conestos kits clásicos, la respuesta deanticuerpos es menor que los conse-guidos con las vacunas vivas clásicas,pero con el kit PROFLOK Plus IBD Ab, seha demostrado que la respuesta es mástemprana y bastante mayor.

En varios ensayos recogidos porPrandini y col. -2008- utilizando dife-rentes vacunas y diferentes kits ELISA,se demostró que después de una dismi-nución inicial de anticuerpos maternos

Fig. 3. Títulos medios de anticuerpos ELISA IBDV (± desviación estándar) en pollosvacunados con vacunas intermedias o con vacuna vectorial (De Prandini F. y col., 2008).

Fig. 4. Títulos medios de anticuerpos ELISA IBDV (± desviación estándar) en pollosvacunados con una vacuna intermedia Plus o con vacuna vectorial (SC al día 1)(De Prandini F. y col., 2008)

Fig. 5. Títulos medios de anticuerpos ELISA IBDV (± desviación estándar) en pollosvacunados con una vacuna de Inmuno Complejos o con vacuna vectorial (in ovo)(De Prandini F. y col., 2008)

Fig. 6. Títulos medios de anticuerpos ELISA IBDV (± desviación estándar) en pollitasvacunadas con una vacuna intermedia o con vacuna vectorial (SC al día 1)(De Prandini F. y col., 2008).


durante las 2 primeras semanas de edad, la respuestamedia de anticuerpos ELISA depende del tipo de vacunaadministrada -figuras 3 a 5-. Utilizando el test ELISAclásico de IBD, los títulos de anticuerpos se mantuvierona bajo nivel en los pollos entre los 15 y 21/28 días de edad,y a partir de ahí, subieron. Con estos test clásicos, laseroconversión observada fue menor en el grupo devacuna vectorial que en los otros grupos vacunados. Encambio, utilizando el test ELISA IBD Plus, la media de lostítulos de anticuerpos en los grupos de vacuna vectorialpermanecieron altos (> 6000) desde el día 15/17 hastalos días 26/29. En contraste, la media de títulos en lasaves vacunadas con las vacunas de virus vivos clásicas,disminuyó hasta el día 21/28 y, a continuación, aumen-tó al día 42/45, lo que sugiere un vacío inmunitario enestas aves. El patrón de respuesta de anticuerpos des-pués de la vacunación en el campo con vacunas inter-medias y la vacuna vectorial fue muy similar en broilersy pollitas (comparar las figuras 3 a 5 con la figura 6).

Una segunda y muy importante ventaja de la vacunavectorial es que es independiente de los anticuerposmaternos -MDA-. La presencia de MDA en pollos es unproblema importante, ya que pueden interferir con lasvacunas clásicas de virus vivos de IBD, sean intermedias,intermedias plus o de inmuno-complejos. En presenciade anticuerpos maternos, la inmunización activa convacunas clásicas sigue siendo arriesgada. Después de ladisminución de los anticuerpos maternos, las aves queno responden a la vacunación son susceptibles a lainfección por IBDV. Los resultados ELISA ilustran el vacíoinmunitario observado en los grupos vacunados convacunas de virus vivos -incluyendo las vacunas deinmuno complejos- entre aproximadamente los 15 y 28días de edad. En cambio, tras la vacunación con lavacuna vectorial y utilizando la prueba ELISA IBD Plusespecífica -que se correlaciona bien con la prueba deneutralización- se observó una respuesta activa yfuerte anti VP2 desde el día 15 de edad en los pollosvacunados con la vacuna vectorial. Por lo tanto, no seprodujo vacío inmunitario durante el período de edad de3 a 5 semanas, el más importante para el desafío conIBDV de campo.

Una última ventaja para la vacuna vectorial es queel uso combinado de los kits ELISA clásicos e IBD Plus,permite diferenciar las aves vacunadas con la vacunavectorial de las aves infectadas o vacunadas con vacu-nas de virus vivos.

Resumen y conclusiones

• La técnica que más ampliamente se emplea en elcaso particular de la enfermedad de Gumboro esla prueba ELISA.

• Los títulos ELISA conseguidos con los kits clásicosno indican grado de protección, sino el nivel deanticuerpos específicos contra un antígeno enparticular.

• Para IBD existen diferentes kits ELISA comercia-les, cada uno de ellos con sus característicasespeciales en lo referente a valores.

• Los kits clásicos aunque detectan casi todos losanticuerpos frente a las diferentes VP, sobre tododetectan los anticuerpos anti VP3.

• Un nuevo kit ELISA IBD Plus, permite una detec-ción más precisa de los anticuerpos VP2 protectivosdel IBDV y se correlaciona bien con la prueba deneutralización, la única prueba serológica queindica títulos protectivos.

• Tras la vacunación con una vacuna vectorial, conlos kits ELISA clásicos la respuesta de anticuerposes menor que los conseguidos con las vacunasvivas clásicas, pero con el kit ELISA IBD Plus, larespuesta es más temprana y mayor.

• Con el test ELISA IBD Plus, la media de los títulosde anticuerpos en los grupos vacunados convacuna vectorial permanecieron altos desde eldía 15/17 hasta los días 26/29. En contraste, enlas aves vacunadas con las vacunas de virus vivosclásicas, disminuyó hasta el día 21/28 y, a con-tinuación, aumentó al día 42/45, lo que sugiereun vacío inmunitario en estas aves.

• Tras la vacunación con la vacuna vectorial no seprodujo vacío inmunitario durante el período deedad de 3 a 5 semanas, el más importante para eldesafío con IBDV de campo.

• El uso combinado de los kits ELISA clásicos e IBDPlus, permite diferenciar las aves vacunadas conla vacuna vectorial, de las aves infectadas ovacunadas con vacunas de virus vivos.

Referencias bibliográficas

Se enviarán a quienes las soliciten.

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