los contaminantes emergentes en los sistemas de...
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Los contaminantes emergentes en los sistemas
de saneamiento y sus efectos ambientales
Damià Barceló, M. José Lopez de Alda, Mira Petrovic, Silvia Lacorte, Benjamí Piña, M.D. HernandoDepartment de Quimica Ambiental, IIQAB-CSIC, Barcelona
Antoni GinebredaAgencia Catalana de l’Agua
Resumen
§ Contaminantes emergentes§ Clases y compuestos§ Disruptores endocrinos (EDCs)
§ AnálisisIntegración de análisis químicos y biológicos (RYA)§ Ensayo con cepas de levaduras recombinantes§ Inducción de la síntesis de vitelogenina en peces
§ Aplicación del método§ Integración del análisis químico de EDCs y de la actividad estrogénica medida
por RYA en la cuenca del Llobregat§ Integración del análisis químico de EDCs y de la inducción de la síntesis de
vitelogenina en carpas en los ríos Cardener and Anoia
§ Conclusiones
Def.: contaminantes previamente desconocidos o no reconocidos como tales cuya presencia en el medio ambiente no es necesariamente nueva pero si la
preocupación por las posibles consecuencias de la misma
Nuevos y más sensibles métodos de análisis químicos y biológicos
Línea prioritaria de investigación (OMS, EPA, UE)
Nuevos Contaminantes Orgánicos (Emergentes)
...........No regulados...........
Poco o no investigadosEscasez/ausencia de datos ambientales
Falta de métodos analíticos
Elevada producción y consumo → continua introducción en el medio ambiente: no necesitan ser persistentes para ocasionar efectos negativos.
Contaminantes orgánicos emergentes
< Retardantes de llama (difenil éteres polibromados)< Detergentes de tipo alquilfenol etoxilado y derivados
Parafinas cloradas< Ftalatos
< Compuestos organoestánnicosSubproductos de desinfección del agua potable
< Productos de transformación de pesticidas
Metil tert-butil éter y otros aditivos de la gasolinaSurfactantes perfluorados (PFOA, PFOS)
< FármacosProductos para el cuidado y la higiene personalToxinas de algas
< Bisfenol A. . . .
*Susan D. Richardson (2004) Anal. Chem. 76, 3337-3364.
< Disruptores endocrinos
2455/2001/EC
Ya legisladosDatos nuevos
No legisladosDatos insuficientes
Compuestos disruptores endocrinos (EDCs)
§ Los EDCs son compuestos sintéticos o productos naturales que interfieren en el sistema endocrino(hormonal)
§ El Sistema Endocrino produce hormonas que guíanel desarrollo, crecimiento, reproducción, y comportamiento de humanos y animales
• Malformaciones en recién nacidos• Problemas en los testículos• Esperma anormal y pobre• Funcionamiento tiroideo anormal• Posible cáncer de testículos• Cáncer de próstata• Otros efectos
Efectos sospechosos en humanos:
• Disminución de la fertilidad y el crecimiento
• Alteraciones sexuales• Problemas en las cáscaras de los
huevos• Funcionamiento tiroideo anormal
Mucha documentación de efectos en organismos del medio natural:
Surfactantes de tipo alquilfenol etoxilados
Alquilfenoletoxilados(APEOs)
- Detergentes en formulaciones industriales (textil, curtidos, papeleras)- Coadyuvantes de pesticidas- Ingredientes de pinturas- Agentes humectantes
Efectos Efectos estrogénicosestrogénicos:1-20 µg/L (NP and NP1EO)
Niveles en Niveles en - aguas: ng-µg-mg/L- sedimentos: µg/Kg- lodos: mg/Kg- biota: ug/Kg
OOH
Rn
n=1-20
Alquilfenoles(APs)
APEOs de cadena corta
Alquilfenoxicarboxilados
(APECs)
OH
R
OOH
R
n
n=1-2
nOCH2COOHO
R
Productos de degradación Productos de degradación aeróbica y anaeróbica aeróbica y anaeróbica
Directiva 2455/2001Directiva 2455/2001Nonilfenoles; 4-p-NonifenolOctilfenoles, p-t-Octilfenol
Análisis:Análisis: GC-MS-MS (deriv.), LC-MS-MS
Petrovic M y col. (2003) Environ. Sci. Technol. 37, 4442-4448
Heberer T (2002) Toxicol. Lett. 131, 5-17.
Analgésicos/antiinflamatorios: paracetamol, ác. acetilsalicílico, ibuprofeno, diclofenac
Antibióticos:- Macrólidos: claritromicina, dehydroeritromicina, roxitromicina, lincomicina
- Sulfamidas: sulfametoxazol, sulfadimetoxina, sulfametacina, sulfatiazol
- Fluoroquinolonas: ciprofloxacina, norfloxacina, enrofloxacina
- Tetraciclinas: clortetraciclina, oxitetraciclina, tetraciclina
... cloranfenicol, tilosin, trimetoprimAntiepilépticos: carbamazepina, primidona
β-Bloqueantes: metoprolol, propanolol, bisoprolol, betaxolol, nadolol, sotalol
Reguladores de lípidos: ácido clofíbrico, bezafibrato, gemfibrozil, ác. fenofíbrico
Medios de contraste en rayos-X: diatrizoato, iohexol, iopamidol, iopromide, iomeprol
Citostáticos (quimioterapia): ifosfamida, ciclofosfamida
Anticonceptivos orales: etinilestradiol, mestranolEsteroides: coprostanol, estradiol, progesterona, testosterona.Broncodilatadores, tranquilizantes, antihistamínicos, barbitúricos, antidiabéticos...
Fármacos en el medio ambiente acuático
NIVELES: ng-µg/L; µg-g/Kg
Análisis:LC-UV-FLLC-MS → LC-MS-MSGC-MS → GC-MS-MS
1Heberer T (2002) Toxicol. Lett. 131, 5-17.2 Thiele-Bruhn S (2003) J. Plant Nutr. Soil Sci. 166, 145-167.3 http://www.epa.gov/OGWDW/ccl/cclfs.html
Fármacosmás problemáticos/menos estudiados1
Anticonceptivos orales:N Efectos estrogénicos a ∼ 1ng/LsMedio marino, sedimentos y fangos
Antibióticos2:N Resistencia bacteriana- 2/3 en medicina humana: posición 3.- 1/3 en medicina veterinaria: 70%
Medios de contraste en rayos-X:N PersistenciaPoca eliminación en STPAguas subterráneassMetabolitos
Citostáticos:N Prop. CarcinogénicasPoca eliminación en STPsniveles, destino, y riesgos
U.S. EPA Contaminants Canditate List (CCL)3
Diclofenac (antirreumático) Carbamazepine (antiepiléptico)Chloramphenicol (antibiótico)
.
Procedimiento integrado de análisis químicos y ensayos biológicos
Extracción de componentes activos
Co
rrel
ació
n y
cuan
tifi
cac
ión
de
fact
ore
sca
usa
tivo
s
Environmental samples
Estrogenicity screeningRecombinant yeast assay (RYA)
Actividad positiva
HPLC fractionation
Estrogenicity screeningRecombinant yeast assay (RYA)
SPE -C18 (aqueous samples)PLE (solid samples)
Extractos
Environmental samplesMuestras ambientales
Estrogenicity screeningRecombinant yeast assay (RYA)
Medida de la estrogenicidad (vitelogenina)Ensayo levaduras recombinantes (RYA)
Fraccionamiento HPLC
Estrogenicity screeningRecombinant yeast assay (RYA)
Fracciones activas
SPE -C18 (aqueous samples)PLE (solid samples)
SPE-C18 (muestras acuosas)PLE (muestras sólidas)
Identificación de comp. desconocidos por LC-MS-MS
Análisis de compuestos diana
por LC-MS
Medida de la estrogenicidad (vitelogenina)Ensayo levaduras recombinantes (RYA)
Muestras agua
Filtración
SPE (ASPEC)LiChrolut RP-18
SPE (PROSPEKT)PLRP-s
Off-line On-line (steroids)
N2 evaporación
LC-MS/(MS)
Chemical analysis
Ultrasonic extractionExtracción con fluídos presurizados
Muestras sólidas(sedimentos/lodos)
Rotary evaporationRotavapor
LyophilizationLiofilización
N2N2 evaporación
LC DAD MSLC-MS/(MS)
Purificación (clean-up)
SPESep-Pak C18 Plus (esteroides)LiChrolut RP18 (alquilfenoles)
Análisis químico – compuestos diana
1. Detergentes no iónicos, nonilfenol etoxilado (NPEO), y octilfenoletoxilado (OPEO) y sus productos de degradación nonilfenol (NP), octilfenol (OP), y derivados carboxilados (NPEC y OPEC), respectivamente.
2. Bisfenol A (BPA)
3. Ftalatos (DMP- dimetil ftalato; DEP – dietil ftalato, DBP - dibutil ftalato, BBP - butil bencil ftalato, DEHP-di(2-etil-hexil) ftalato)
4. Hormonas sexuales esteroidales naturales y compuestos sintéticos relacionados (E1-Estrona; E2- β-estradiol , E3-Estriol, EE- etinilestradiol, DES-Dietilestilbestrol, PRO-Progesterona, NOR-Noretindrona, LEV-levonorgestrel)
5. Benzotiazoles (HOBT. 2-hidroxibenzotiazol)
Ensayo con cepas de levaduras recombinantes(Recombinant Yeast Assay, RYA)
§ Basado en una cepa de levadura que expresa el receptor humano de estrógenos (hER) y un gen de ensayo (ß-galactosidasa) cuya expresión depende de la activación del receptor del hER.
§ La actividad β-galactosidasa se mide fácilmente con substratos cromogénicos o fluorogénicos y depende de la presencia de ligandos del hER, por lo que puede ser tomada como indicadora de actividad estrogénica.
§ Todo el ensayo puede ser llevado a cabo en placas de ensayo de 96 pocillos
Concentration efectiva media (EC50) y factor de estrogenicidadrelativa obtenida para diferentes compuestos por RYA
Vitelogenina en plasma: Western blot
Extracción de sangre: 2 ml jeringa heparinizada + Aprotinina
Obtención plasma: Centrifugaciónn 1,000 g x5’
SDS-PAGE análisis: PAb anti-conejo (Biosense, Norway)
Cyprinus carpio
Integración de análisis químicos de EDCs y ensayos con cepas de levaduras recombinates para la determinación de actividad estrogénica
Análisis de EDCs en la cuenca del río LlobregatAnálisis de fármacos en la cuenca del río Llobregat
Integración de análisis químicos de EDCs e inducción de la síntesis de vitelogenina en carpas
Análisis de EDCs en estaciones de depuración de aguas residuales (EDAR) catalanas y en los ríos receptores de los efluentes (aguas y sedimentos fluviales).
APLICACIONES
Area de estudio: Cataluña
Mapa con los puntos de muestreo en la cuenca del Llobregat.
Números 1 al 10 indican los puntos de muestreo de aguas.Letras A a la D corresponden a la localización de las EDAR.
Zonas en gris indican la localización de las poblaciones próximas a las EDAR: A-Manresa; B-Terrassa , C-Igualada; D-Martorell.
Puntos Río OP NP BPA NPEO1 NPEO2 DEP DEHP DBPAguas superficiales
1 Llobregat < 0.09 0.22 0.09 < 0.22 < 0.06 1.45 < 0.20 0.62 Llobregat < 0.09 < 0.15 0.09 < 0.22 0.61 1.5 < 0.20 0.343 Cardener < 0.09 0.39 < 0.09 3.22 2.53 6.85 < 0.20 0.34 Llobregat < 0.09 0.26 < 0.09 1.19 1.2 0.54 < 0.20 0.47
5a Llobregat 0.09 0.5 0.27 < 0.22 0.39 1.26 0.82 15b Llobregat < 0.09 0.45 < 0.09 < 0.22 < 0.06 2.05 3.09 1.3
6 Anoia < 0.09 1.23 < 0.09 < 0.22 < 0.06 0.85 0.65 < 0.197 Anoia < 0.09 0.53 0.12 < 0.22 1.27 0.58 0.45 < 0.198 Llobregat 0.26 2.57 0.11 3.54 1.17 0.46 0.31 < 0.199 Rª de Rubí 21.9 37.3 0.85 6.87 3.17 0.4 0.77 < 0.19
10 Llobregat 2.57 13.9 2.97 < 0.22 < 0.06 0.22 < 0.20 < 0.19
Aguas resid. EDAREDAR A Inf Manresa 0.17 17.1 0.94 19.3 5.56 1.62 3.17 0.07EDAR A Efl Manresa < 0.09 2.99 0.34 9.53 8.97 0.93 1.34 < 0.19EDAR B Inf Terrasa 0.08 29.8 < 0.09 < 0.22 < 0.06 12.97 0.26 0.83EDAR B Efl Terrasa < 0.09 0.8 < 0.09 10.6 9.69 10.21 0.23 < 0.19EDAR C Inf Igualada 0.24 44.8 6.98 2.37 5.61 3.19 0.82 8.86EDAR C Efl Igualada < 0.09 1.24 < 0.09 < 0.22 < 0.06 2.25 1.12 < 0.19EDAR D Inf Martorell 0.18 11.9 < 0.09 3.8 0.82 1.06 1.9 0.35EDAR D Efl Martorell 0.09 0.89 < 0.09 < 0.22 3.87 0.56 0.33 < 0.19
LOD (µg L-1) 0.09 0.15 0.09 0.22 0.06 0.2 0.2 0.19
Concentraciones en µg/L de diferentes EDCs analizados por LC-MS
Cálculo de equivalentes de estradiol a partir de losresultados RYA.
Los círculos negros, losblancos, y los triángulosrepresentan los valoresrelativos de ß-galactosidasa, obtenidos a diferentesfactores de dilución, en el agua residual de entrada de la EDAR de Manresa, en el agua de salida, y en un puntode muestreo próximo a ésta(el 3), respectivamente.
Las funciones sigmoidales se calcularon mediante métodosde regresión no-lineal. Las líneas gruesas continua y discontinua corresponden a las aguas de entrada y de salida de la EDAR de Manresa, y la línea finadiscontinua a la muestra de agua en el punto 3.
Valores totales de estrogenicidad en equivalentes de estradiol para muestras de aguas residuales (izquierda) y de aguas de río (derecha).
Correlación entre los valores totales de estrogenicidad(en eq. E2) obtenidos por RYA (eje X) y los estimados a
partir de la composición química de las muestras (eje Y).
Integración de análisis químicos de EDCs y ensayos con cepas de levaduras recombinates para la determinación de actividad estrogénica
Análisis de EDCs en la cuenca del río LlobregatAnálisis de fármacos en la cuenca del río Llobregat
Integración de análisis químicos de EDCs e inducción de la síntesis de vitelogenina en carpas
Análisis de EDCs en estaciones de depuración de aguas residuales (EDAR) catalanas y en los ríos receptores de los efluentes (aguas y sedimentos fluviales).
APLICACIONES
Area de estudio: Cataluña
Detección de fármacos
ACIDO CLOFIBRICO
ACIDO ACETILSALICILICO
DICLOFENAC
N
0 25 km
Manresa
Barcelona
Igualada
Cardona
Martorell
Llobregat river
Llobregat river
Cardener river
Anoia river
Abrera
Sant Joan Despí
(1)
Mediterranean Sea
(2)
RIO LLOBREGAT
(3)
(4)
EDAR ABRERA
050
100150 ng/L
EDAR RUBI
0
50
1001200 ng/L
RIO ANOIA
050
100150
ng/L
050
100150
ng/L
Area de estudio: Cataluña
Detección de fármacos
ACIDO CLOFIBRICO
ACIDO ACETILSALICILICO
DICLOFENAC
N
0 25 km
Manresa
Barcelona
Igualada
Cardona
Martorell
Llobregat river
Llobregat river
Cardener river
Anoia river
Abrera
Sant Joan Despí
(1)
Mediterranean Sea
(2)
RIO LLOBREGAT
(3)
(4)
EDAR ABRERA
050
100150 ng/L
EDAR ABRERA
050
100150 ng/L
EDAR RUBI
0
50
1001200 ng/L
EDAR RUBI
0
50
1001200 ng/L
RIO ANOIA
050
100150
ng/L
050
100150
ng/L
050
100150
ng/L
---Aigua tractada ETAP SJD ---Llobregat captació ETAP SJD---Aigua tractada ETAP Abrera
501071200Edar Rubí-14-Llobregat després Anoia-35-Llobregat abans Anoia---Anoia final
31.540-EDAR Abrera-24.5-MPATSA---Distribució zona Ter
Ac.acetilsalic ílico
Ac.clofíbricoDiclofenacMuestras
Fármacos
Area de estudio: Cataluña
Concentraciones en ng/L de fármacos
à Octubre 2003
----Aigua tractada ETAP SJD
---17.46Captació ETAP SJD, 28-04-04, 17:00
----Abocament ETAP (SJD), 28-04-04, 15:15
--14.4030.50Llobregat després Anoia, 28-04-04, 14:30
----ETAP Abrera (aigua tractada), 28-04-04, 12:40
--13453.70EDAR Martorell, 28-04-04, 12:00
--31127.20Anoia final, 28-04-04, 11:30
--11.827.42Llobregat abans Anoia, 28-04-04, 11:00
--240.68134.30EDAR de Abrera, 28-04-04, 10:30
----MPATSA, 28-04-04, 10:00
----ETAP Cardedeu aigua tractada
---Muestras
AtenololÁcido clofíbrico
DiclofenacIbuprofen
Area de estudio: Cataluña
Concentraciones en ng/L de fármacos
à Abril 2004
Area de estudio: Cataluña – Ensayo RYA
MUESTRAS pH ACIDO
0
5
10
AIGUA TR
ACTADA ET
AP ABRER
A 3
EDAR SO
RTIDA ABRER
A 3
DISTRIBUC. Z
ONA 3
MAPTSA
3
LLOBREG
AT ABANS A
NOIA 3
ANOIA FI
NAL 3
EDAR RUBI 2
AIGUA TRACTA
DA ETAP S
JA 3
LLOBREG
AT DES
PRES
2 BLANC
BLANC OH-
BLANC H+
UN
IDA
DE
S 1:30
1:90
1:270
1:500
Fig. Gráfico de unidades ß- galactosidasa de las muestras extra ídas a pH ácido.
Area de estudio: Cataluña – Ensayo RYA
CONTROL POSITIVO
0
500
1000
1500
0 0 0 0
GENIST
EINA 228
ENTE
ROLACTO
NA
UN
IDA
DE
S
1:30
1:90
1:270
1:500
Fig. Gráfico de unidades ß- galactosidasa de control positivo (Genisteína 1.9 mM) y negativos (0). Véase la diferencia de escala con respecto a la anterior figura.
Integración de análisis químicos de EDCs y ensayos con cepas de levaduras recombinates para la determinación de actividad estrogénica
Análisis de EDCs en la cuenca del río LlobregatAnálisis de EDCs en la cuenca del río Llobregat
Integración de análisis químicos de EDCs e inducción de la síntesis de vitelogenina en carpas
Análisis de EDCs en estaciones de depuración de aguas residuales (EDAR) catalanas y en los ríos receptores de los efluentes (aguas y sedimentos fluviales).
APLICACIONES
Mar Mediterráneo
Río Anoia
Río Cardener
Río Llobregat
A1
A2 A3
C1 C2
C3
Barcelona
EDAR1EDAR2
EDAR3
EDAR4
0 30 60 km
lN
Spain
A1-A3, C1-C3Agua
SedimentoPez (Cyprinus carpio)
sangre, hígado, bilis, tejido(130 machos adultos, 116 hembras de carpas)
Area de estudio: Cataluña
Río Anoia
Río Llobregat
A1A2 A3 Barcelona
EDAR1EDAR2
EDAR3NPEONP1ECNP
0
10
20
30
40
50
I III V VII
µg/L
AGUA
0
200
400
600
800
µg/kg
SEDIMENTo AGUA
SEDIMENT
0
200
400
600
800
µg/kg
SEDIMENTO
0
1020
30
40
50
I III V VII
µg/L
Variación temporal de las concentraciones de compuestos
nonilfenólicos en aguas y sedimentos del río Anoia
800
0
10
20
30
40
50
I III V VII
µg/L
0
200
400
600
µg/kg
AGUA
SEDIMENTO
NPEONP1ECNP
Río Cardener
Río Llobregat
C1
C2 C3
Barcelona
STP
µ
400SEDIMENTO
0
100
200
300
g/kg
0
2
4
6
8
10
I III V VII
µg/L
AGUA
0
2
4
6
8
10
I III V VII
µg/L
AGUA
0
100
200
300
400
µg/kg
SEDIMENTO
02468
10
I III V VII
µg/L
AGUA
0
100
200
300
400
µg/kg
SEDIMENTO
Variación temporal de las concentraciones de compuestos
nonilfenólicos en aguas y sedimentos del río Cardener
0
5
10
15
20
25
A1 A2 A3 A1 A2 A3 A1 A2 A3 A1 A2 A3
ng/L
E3 E2EE E1DES NORLEV PRO
Enero 2000 Marzo 2000 Mayo 2000 Julio 20000
1
2
3
4
ng/g
E3 E2EE E1DES NORLEV PRO22.8
Variación temporal de las concentraciones de esteroides en aguas y
sedimentos del río Anoia
0
5
10
15
20
25
30
C1 C2 C3 C1 C2 C3 C1 C2 C3 C1 C2 C3
ng/L
E3 E2EE E1DES NORLEV PRO
71.1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
ng/g
E3 E2EE E1DES NORLEV PRO11.8
Enero 2000 Marzo 2000 Mayo 2000 Julio 2000
Variación temporal de las concentraciones de esteroides en aguas y
sedimentos del río Cardener
Niveles de vitelogenina, en µg/mL de plasma, en carpas macho (Cyprinus carpio) del río Anoia
Anoia
(4)
(7:3)
(6)(4)
(9) (6) (3)
(6)
x100
* **
(10:4)
(4) (5)
(6)
0
40
80
120
VTG
(g/
ml p
lasm
a)
Enero Marzo Mayo Julio
A1A2A3
Control
Correlación entre la concentración de VTG en plasma y la concentración de NP en agua de río
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 20 40 60 80
µg VTG/mL plasma
µg NP/L
R = 0.82
Cromatograma obtenido en el análisis off-line de etinil estradiol porLC-NI-ESI-MS-MS (295>145) en un sedimento tomado en una
zona en donde se observó una alta incidencia de peces intersex y de niveles de vitelogenina.
21 22 23 24 25 26
6500
7000
7500
8000
8500
9000
9500 Etinil estradiol
Tiempo (min)
Abu
ndan
cia 22.8 ng/g sedimento A2
MRM
Anoia
(4)
(7:3)
(6)(4)
(9) (6) (3)
(6)
x100
* **
(10:4)
(4) (5)
(6)
0
40
80
120V
TG (
g/m
l pla
sma)
January March May July
A1A2A3
ControlVTG-Anoia
(4)
(7:3)
(6)(4)
(9) (6) (3)
(6)
x100
* **
(10:4)
(4) (5)
(6)
0
40
80
120V
TG (
µg/m
l pla
sma)
Enero Marzo Mayo Julio
A1A2A3
Control
Conclusiones/propuestas para la mejora de la calidad del agua en Cataluña
- Mejor depuración de las aguas residuales urbanas- Incremento significativo del tratamiento terciario en la depuración de
aguas residuales urbanas- Reutilización creciente de aguas depuradas- Tratamiento separado, y diferenciado desde el origen, de las aguas
de procedencia industrial- Máxima reutilización del agua industrial mediante circuitos cerrados y
autodepurados- Implementar la calidad integral de las aguas promoviendo programas
de vigilancia ambiental para los contaminantes emergentes de forma que se garantice la conservación del medio acuático natural, la gestión integral de los recursos hídricos, la eficacia en el uso del agua y la reutilización de la misma.
Projecto de la UE P-THREE (EVK1-CT-2002-00116)(Removal of Persistent Polar Pollutants ThroughImproved Treatment of Wastewter Effluents)
Ministerio de Ciencia y Tecnología (PPQ2002-10945-E)
AgradecimientosAgradecimientos