Línea 6

Desarrollo y consolidación metodológicaen biología molecular

Programas

6.1 Construcción y caracterización de vehículos molecula-res para donación y expresión de DNA.

6.2 Aislamiento, caracterización y producción de enzimasutilizadas en ingeniería genética.

6.3 Elaboración y mantenimiento de colecciones biológicas.6.4 Síntesis química de oligonudeótidos.6.5 Desarrollo de bioensayos diagnósticos.6,6 Generación de señales fluorescentes para la detección

de agentes patógenos y empleos en otros bioensayos.

Programa 6.1 Construcción y caracterización de vehículosmoleculares para donación y expresión de DNA.

Las técnicas de recombiríación in vitro de DNA permitenel aislamiento, la caracterización y la expresión de DNA na-tivo y sintético. Se trabaja en el diseño y la construcción desistemas genéticos que permitan el aislamiento, la modifi-cación y la expresión de DNA específicos. Para ello se hanconstruído diversos vehículos moleculares de donación deDNA a partir de los cuales se trabaja para obtener vehículosde expresión, utilizando regiones de DNA que permitan latranscripción de DNA en la bacteria E. eoli. Entre estas re-giones se encuentra la de regulación de los operones lae ytrp de esta bacteria, la región del promotor PL del fago lamb-da y un promotor-operador sintético.

Como resultados iniciales, se han construido varios ve-hículos para la donación de DNA que son utilizados en mu-chos laboratorios del .mundo, donde se hace ingeniería ge-nética. Asimismo, se han construido vehículos que permi-ten una alta expresión del material genético donado.

65

Proyectos especíñcos

Construcción de vehículos moleculares con número de

copias regulable y efecto de diferentes loci de estabilidad.M. Zurita, M.E. Munguía y X. Soberón1983/T/S/DGBM

Diseño de un vehículo molecular para la producción deproteínas de fácil purificación.X. Soberón1983/T/S/DGBM/USQM

Construcción de vehículos moleculares para la síntesis deproteínas híbridas utilizando diferentes genes virales.N. Flores, R. de Anda, F. Valle y F. Bolívar1984/P/S/DGBM

Construcción de vehículos moleculares para la expresiónde DNA utilizando el promotor del operón del triptofano.P. Balbás, N. Flores, F. Valle y F. Bolívar1984/T/S/DGBM

Construcción de vehículos moleculares para la expresiónde DNA utilizando el promotor PL del fago lambda.N. Flores, P. Balbás, R. de Anda, F. Valle y F. Bolívar1984/T/S/DGBM

Programa 6.2 Aislamiento, caracterización y producción deenzimas utilizadas en ingeniería genética.

Se pretende estructurar una unidad de aislamiento y pu-rificación de enzima s utilizadas en ingeniería genética. Esteesfuerzo, junto con los desarrollados en otros programas deinvestigación, forma parte de una estrategia que permita dis-1\Jner en el Centro de herramientas moleculares y de meto-dologías específicas para el aislamiento, la caracterizacióny la expresión de DNA.

Como parte de estos propósitos, se ha logrado integrar una

66

colección de cepas microbianas para producir enzimas in-volucradas en el manejo in vitro de DNA. Se han utilizadovarias de ellas para la fabricación de estas enzimas.

Proyectos específicos

Purificación de la endonucleasa de restricción Pst I.I. Vichido1984/TIDGBM

Purificación de la endonucleasa de restricción PaZ I.I. Vichido1985/TIDGBM

Purificación de la endonucleasa de restricción SaZ I.I. Vichido1986/PIDGBM

Purificación de la enzima T4 DNA ligasa.I. Vichido1986/PIDGBM

Purificación de la endonucleasa de restricción Bam Hl.I. Vichido1986/PIDGBM

Purificación de la endonucleasa de restricción Cro I.I. Vichido1986/PIDGBM

Purificación de la endonucleasa de restricción Eco Rl.I. Vichido1986/PIDGBM

Programa 6.3 Elaboración y mantenimiento de coleccionesbiológicas.

Se trabaja en el establecimiento de varias colecciones bio-lógicas: a] cepas de microorganismo s de interés de laborato-

67

1!

rio, y b] material gen ético (DNA) de plásmidos y fagos. Setrabajará en un futuro en el establecimiento de una colec-ción de microorganismos de interés.

Proyectos específicos

Integración del banco de DNAs del Centro de Investiga-ción sobre Ingeniería Genética y Biotecnología I UNAM.I. Vichido1985/PIDGBM

Integración de una colección de pastas celulares de mi-croorganismos para la producción de enzimas y plásmidos.I. Vichido1985/PIDGBM

Integración de un banco de células competentes paratransformación.I. Vichido1986/PIDGBM

Integración de la colección de cepas microbianas del Cen-tro de Investigación sobre Ingeniería Genética y Biotecno-logía I UNAM.I. Vichido1986/PIDGBM

Programa 6.4 Síntesis química de oligonucleótidos.

Se aplican los métodos recientes de síntesis de DNA paraactualizar la Unidad de Síntesis Química de Macromoléculas.

Se trabaja en la optimización del sistema de síntesis paraagilizar el servicio que presta a la comunidad académica delpaís, utilizando un equipo de síntesis automatizado.

68

Proyectos específicos

Estandarización y optimización de las técnicas de sÍnte-sis automatizada de oligonucleótidos.X. Soberón1986/PIDGBM

Programa 6.5 Desarrollo de bioensayos diagnóstico.

El uso de la replicación exponencial de RNA para la ge-neración de señales en ensayos de hibridación tiene gran po-tencial para pruebas diagnósticas de enfermedades infeccio-sas. Se espera que en el futuro este método llegue a ser tanútil como los métodos inmunológicos para detección de pa-tógenos.

Con este propósito se ha iniciado un proyecto para explo-rar el uso de sistemas de amplificación de RNA por replica-ción exponencial, y su aplicación a ensayos de hibridación.El sistema que se propone utilizar se deriva del fago Q-beta,en el cual se ha demostrado la construcción de RNA recom-binante con capacidad de replicación autocatalítica in vitro.

69

En colaboración con Donald Millis y Fred R. Kramer, de laColumbia University, se han desarrollado nuevos plásmidosque facilitan la construcción de RNA recombinante. Con es-tos plásmidos, que contienen un promotor para transcrip-ción específica de RNA, se puede generar RNA recombinanteen condiciones de rendimiento y pureza óptimos.

En los experimentos iniciales se está utilizando como mo-delo el DNA repetitivo de malaria, cuya secuencia se inser-ta en el lugar apropiado dentro del vector Q-beta, al nivelde DNA, utilizando los plásmidos mencionados. La trans-cripción de la secuencia recombinante deseada se obtieneutilizando el promotor de fago T7, en un sistema in vitro conRNA polimerasa T7. El RNA se utiliza como sonda y luegoes replicado exponencialmente por la Q-beta replicasa. Enun esquema alternativo, el RNA replicante no contiene lasecuencia de la sonda; ésta es acoplada al RNA por unióncovalente 5' -5' vía disulfuro, de modo que la secuencia son-da y el RNA se pueden separar por reducción después dela hibridación.

Se espera que alguno de estos sistemas de generación deseñales por medio de replicación exponencial, resulte mássensible y más barato en su aplicación que otros métodosque se han estado utilizando hasta ahora. Si resulta exitosoel uso de los recombinantes RNA en los ensayos diagnósti-cos de malaria, se intentará la utilización de sistemas análo-gos para ensayos en otros sistemas de importancia médicao veterinaria.

Proyectos específicos

Estudio de nuevos RNAs recombinantes replicables y suaplicación a amplificación de señales.H. Lomelí, C. Guerra, 1. Tusie, F.R. Kramer y P.M. Lizardi1986/P/S/DBQ

Desarrollo de sondas bifuncionales que contienen RNAreplicable en unión covalente con moléculas de afinidad.

70

J. Martín-Polo, C. Guerra, H. Lomelí, A. Alagón, C. Gonzá-lez, C.B. Chu, L. Orgel y P.M. Lizardi1986/P/S/DBQ

Desarrollo de un método para detección de P. falciparumbasado en hibridización de DNA con generación de señalesde RNA replicable.H. Lomelí, C. Guerra, I. Tusie, A. Alagón, F. R. Kramer yP.M. Lizardi1986/P/SIDBQ

Utilización de DNA de elementos repetitivos de Trypano-soma cruzi para un ensayo diagnóstico de la enfermedad deChagas.I. Tusie y P.M. Lizardi1987/P/SIDBQ

Utilización de DNA de elementos repetitivos de Plasmo-dium vivax para un ensayo diagnóstico de paludismo.I. Tusie, A. Alagón, M.H. Rodríguez y P.M. Lizardi1987/P/SIDBQ

Construcción de un nuevo vector para la generación deRNAs replicables basados en el cDNA del microvariante deQ-beta.G. Estrada, H. Lomelí y P.M. Lizardi1988/I1SIDBQ

Programa 6.6 Generación de señales fluorescente s para ladetección de agentes patógenos y empleo en otros bioen-sayos.

Los sistemas sensibles de detección de agentes patógenosbasados en técnicas inmunológicas o en hibridación de áci-dos nucleicos revelan la interacción específica, por mediode dos modalidades: la radiactividad (i.e. autorradiografía,radioinmunoensayo) y la actividad de alguna enzima quetransforma un sustrato incoloro en producto colorido (i.e. in-

71

munoensayo enzimático, método de Ward para detectar hi-bridación de ácidos nucleicos en nitrocelulosa). Los sistemasque emplean radiactividad son muy sensibles pero muy cos-tosos y tienen vida de almacenamiento muy corta. Los sis-temas enzimáticos que generan color, difícilmente alcanzanel nivel de sensibilidad que tienen los anteriores, aunque pre-sentan la ventaja de que pueden ser automatizados en granmedida. Resulta clara la necesidad de desarrollar alternati-vas para generar señales de altísima sensibilidad, de bajo cos-to, simples de realizar, susceptibles de ser automatizadas yaplicadas masivamente.

Actualmente, una buena parte de los esfuerzos que se rea-lizan están encaminados a establecer estrategias para gene-rar señales fluorescente s que permitan la visualización y lacuantificación de la interacción de una secuencia de DNAespecífica (sonda detectora) para Plasmodium vivax y el DNAparasitario en muestras de sangre sobre un soporte sólido(i.e. membranas de nitrocelulosa). En caso de tener éxito elprocedimiento podría extenderse a otras pruebas diagnósti-cas, independientemente de que se basen en hibridación deácidos nucleicos o en interacciones de otro tipo (i.e.antígeno-anticuerpo) .

Para lograr el objetivo descrito en el párrafo anterior seestán aprovechando las propiedades fluorescentes de las fi-cobiliproteínas y en particular de la ficoeritrina. En este ca-so se cuenta con la colaboración de L. Strayer y A. Glazer,de las universidades de Stanford y Berkeley, respectiva-mente.

Con el mismo objetivo y con la colaboración de la Geren-cia General de Biológicos y Reactivos de la Secretaría de Sa-lud, se están desarrollando sustratos peptídicos sintéticos nofluorescentes, que mediante una transformación enzimáti-ca resulten en productos insolubles y altamente fluorescen-teso Con los dos tipos de fluoróforos se están evaluando tresformas de proceder. En la breve descripción que sigue, lapalabra "proteína" significa, indistintamente, ficobiliproteínao enzima proteolítica: a] la proteína se acopla directamentey en forma covalente a la sonda detectora; b] la proteína bio-tinilada es reconocida por estreptavidina previamente ancla-

72

da a la sonda detectora también biotinilada; c] la proteínaderivatizada con un hapteno es reconocida por un anticuer-po polimérico antihapteno que haya reaccionado previamen-te con el mismo hapteno unido covalentemente, a su vez,a la sonda detectora.

El caso de la proteasa involucra un paso más, en el quese agrega el sustrato para obtener la señal fluorescente. Elregistro permanente de señales generadas puede obtenersemediante una fotografía de la membrana con las muestrasbajo excitación, con luz ultravioleta de onda larga, en pelí-cula Polaroid de alta sensibilidad.

Proyectos específicos

Desarrollo de métodos para la precipitación in situ de ami-nas aromáticas fluorogénicas.J. Martín-Polo y A. Alagón1986/P/S/DBQ

Síntesis de péptidos ad hoc fluorogénicos.J. Martín-Polo y A. Alagón1986/P/S/DBQ -

Desarrollo de membranas derivadas de celulosa con car-

gas positivas rasurables, y su aplicación en la manipulaciónde macromoléculas en bioensayos.C. González, M.A. Torti, J. Martín-Polo, P.M. Lizardi y A.Alagón1986/P/S/DBQ

Desarrollo de esquemas para acoplamiento de proteasasa sondas de oligonucleótidos.A. Alagón, P.M. Lizardi, X. Soberón y J. Martín-Polo1986/P IS/DBQ/DG BM

Desarrollo de métodos para detección de patógenos ba-sados en el uso de hibridación de DNA con generación deseñales fluorescentes.

73

J. Cruz, I. Tusie, C. González, G. Gurrola, P.M. Lizardi, X.Soberón yA. Alagón1986/P/S/DBQ!DGBM

Desarrollo de esquemas para acoplamiento de ficobilipro-teínas a sondas de oligopéptidos.A. Alagón, J. Martín-Polo, X. Soberón, y P.M. Lizardi1987/P/S/DBQ!DGBM

Purificación de la proteína de la cápside del fago R17 ysu acoplamiento covalente a ficoeritrina.M. Herrera, A. Alagón, J. Martín-Polo y P.M. Lizardi1988/I/S/DBQ

74