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EVALUACIÓN DEL CRECIMIENTO IN VITRO DE MARACUYÁ AMARILLA (Passiflora

edulis SIMS FORMA FLAVICARPA) A PARTIR DE SEGMENTOS NODALES MEDIANTE LA TÈCNICA DE ORGANOGÈNESIS

LIZETH PAOLA ORTIZ RODRIGUEZ

UNIVERSIDAD DE SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y AGROPECUARIAS

PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

BUCARAMANGA

2019

ii

EVALUACIÓN DEL CRECIMIENTO IN VITRO DE MARACUYÁ AMARILLA (Passiflora

edulis SIMS FORMA FLAVICARPA) A PARTIR DE SEGMENTOS NODALES MEDIANTE LA TECNICA DE ORGANOGENESIS

LIZETH PAOLA ORTIZ RODRIGUEZ

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito Para optar al título de

MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL

Director

CHRISTIAN ANDREI CHACIN ZAMBRANO

Ing. MSc en Biotecnología Microbiana

UNIVERSIDAD DE SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y AGROPECUARIAS

PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

BUCARAMANGA

2019

iv

.

AGRADECIMIENTOS

A Dios por darme la vida, sabiduría en este camino. A mis padres y mis hermanos y sobrino, que

más que una inspiración, se han convertido en mis asesores académicos y personales brindándome

en todo momento para convertirme en un gran ser humano. A John Edward Montes por su respaldo

y apoyo incondicional

Agradezco a mi tutor Christian Andrei Chacín Zambrano y María Cañas por brindarme el apoyo y

guiarme en este proceso, por hacerme parte de este proyecto por brindarme todo su apoyo y

comprensión.

Al SENA Tecnoparque nodo Bucaramanga por su apoyo financiero para el desarrollo de este

proyecto.

v

DEDICATORIA

A Dios por la sabiduría y la paciencia para continuar trabajando con esfuerzo alcanzando triunfos

a mis padres a quienes agradezco todas sus enseñanzas, por guiarme en cada paso a dar y ese apoyo

en cada una incondicional, a mis hermanos y sobrino por acompañarme y alegrarme la vida en esta

etapa culminada. Y a mi familia por su apoyo incondicional.

vi

TABLA DE CONTENIDO

1 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 1

2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................................. 4

3 PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN ....................................................................................... 6

4 JUSTIFICACIÓN ..................................................................................................................... 7

5 MARCO TEÓRICO .................................................................................................................. 8

5.1 Descripción botánica ......................................................................................................... 8

5.2 Origen y taxonomía ........................................................................................................... 8

5.2.1 Clasificación taxonómica ......................................................................................... 9

5.3 Cultivo ............................................................................................................................... 9

5.4 Fenología ......................................................................................................................... 10

5.4.1 Etapa vegetativa ..................................................................................................... 10

5.4.2 Etapa reproductiva ................................................................................................ 10

5.4.3 Etapa productiva .................................................................................................... 10

5.5 Morfología ...................................................................................................................... 11

5.6 Raíz ................................................................................................................................. 11

5.7 Tallo ................................................................................................................................ 11

5.8 Hojas ............................................................................................................................... 11

5.9 Zarcillos .......................................................................................................................... 12

5.10 Flores ............................................................................................................................... 12

5.11 Fruto ................................................................................................................................ 12

5.11.1 Exocarpio ................................................................................................................ 12

5.11.2 Mesocarpio .............................................................................................................. 13

5.11.3 Endocarpio .............................................................................................................. 13

5.12 Cultivo de Tejidos Vegetales .......................................................................................... 13

5.13 Etapas de la micropropagación ....................................................................................... 14

5.13.1 Etapa 0 ..................................................................................................................... 14

5.13.2 Etapa 1 ..................................................................................................................... 14

vii

5.13.3 Etapa 2 ..................................................................................................................... 15

5.13.4 Etapa 3 ..................................................................................................................... 15

5.13.5 Etapa 4 ..................................................................................................................... 15

7 HIPÓTESIS ................................................................................................................................. 19

8 OBJETIVOS ................................................................................................................................ 20

9 METODOLOGÍA ................................................................................................................... 21

9.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN ......................................................................................... 21

9.2 Fases de investigación. .................................................................................................... 21

9.2.1 FASE I. Estandarización del proceso de desinfección ........................................ 21

9.2.1.1 Obtención y preparación del material vegetal ....................................................... 21

9.2.1.2 Obtención y preparación del material vegetal ....................................................... 21

9.2.2 FASE II. Establecimiento del cultivo .................................................................... 24

9.2.3 Análisis Estadístico. ................................................................................................ 24

10 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................ 25

10.1 FASE I. Desinfección de explantes de maracuyá amarilla ............................................ 25

10.2 FASE II. Establecimiento del cultivo de maracuyá amarilla ........................................ 31

11 CONCLUSIONES .................................................................................................................. 36

12 RECOMENDACIONES ......................................................................................................... 37

13 BIBLIOGRAFIA .................................................................................................................... 38

14 ANEXOS ................................................................................................................................ 42

viii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Porcentaje de contaminación de explantes de maracuyá . ............................................. 22

Figura 2 A.Descripción macroscópica: de color blanco, aspecto algodonoso con consistencia

blanda. B.Descripción microscópica: no se observa ninguna estructura reproductiva siendo

clasificado como Micelio esterilia. . .............................................................................................. 24

Figura 3 Porcentaje de oxidación de explantes de maracuyá. ...................................................... 24

Figura 4 A. Oxidación total de los explantes de maracuyá sin la aplicación de ácido cítrico en el

proceso de desinfección. B. Explantes de maracuyá con aplicación de ácido cítrico en el proceso

de desinfección. ............................................................................................................................. 26

Figura 5 Porcentaje de explantes vivos de maracuyá. .................................................................. 26

Figura 6 Porcentaje de formación de botes de maracuyá.. ........................................................... 27

Figura 7 Porcentaje de número de botes de maracuyá ................................................................. 29

Figura 8 Promedio largo de hojas de botes de maracuyá . ........................................................... 30

Figura 9 Explante de hoja de maracuyá del T4 ............................................................................ 31

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ix

LISTA DE TABLAS

Tabla 1 Componentes del tratamiento 1 de desinfección para explantes de maracuyá .............. 19




Tabla 5 Fórmula de los porcentajes de protocolos de desinfección (Braun & Zucari, 2014) .... 20

Tabla 6 Formulación del medio de cultivo a partir del medio basal MS (Murashige Skoog 1962).

Para los explantes del maracuyá in vitro ..................................................................................... 44

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x

LISTA DE ANEXOS

Anexo 1 Análisis de varianza del porcentaje de contaminación. .................................................. 38

Anexo 2 Análisis de varianza del porcentaje de oxidación. ......................................................... 39

Anexo 3 Análisis de varianza de la variable prósperos. ............................................................... 40

Anexo 4 Análisis de varianza de formación de brotes. ................................................................. 41

Anexo 5 Análisis de varianza de número de brotes. ..................................................................... 42

Anexo 6 Análisis de varianza de largo de hojas. .......................................................................... 43

Anexo 7. Formulación del medio de cultivo a partir del medio basal MS (Murashige Skoog 1962)

…………………………………………………………………...………….............................…44

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xi

RESUMEN

Titulo: Evaluación del crecimiento in vitro de maracuyá amarilla (passiflora edulis sims forma

flavicarpa) a partir de segmentos nodales mediante la técnica de organogénesis.

Autor: Lizeth Paola Ortiz Rodriguez

Palabras clave: Cultivo in vitro, maracuyá, segmentos nodales,6-BAP, desinfección, Arginina

Descripción:

Los cultivos de maracuyá se han logrado beneficiar gracias a su gran demanda de exportación a

nivel internacional. En Colombia los cultivos de maracuyá entre los años 2014-2018 han

aumentado de manera significativa. En el departamento de Santander se han presentado factores

como enfermedades causadas principalmente por Fusarium oxysporum y Fusarium solani.

Llevando esto a la baja producción en los cultivos de maracuyá generando pérdidas hasta una 60%

de la producción, con el fin de presentar una alternativa viable para la multiplicación de forma

sana, libre de patógenos y genéticamente uniformes, este trabajo tiene el objetivo evaluar el

crecimiento in vitro de maracuyá amarilla a partir de segmentos nodales mediante la técnica de

organogénesis.

Por esta razón se estableció un proceso de desinfección con diferentes tipos de compuestos y

tiempo de exposición donde se evidenció que T4 presento bajos índices de contaminación,

oxidación y explantes prósperos, de igual forma se estableció un medio de cultivo donde se

estableció que a bajas concentraciones 0,2 mg/l de 6-BAP se logra generar la formación de brotes

con un porcentaje de 97% y un promedio de número de hojas de 1,80 por segmento nodales, igual

manera la aplicación de arginina en concentración de 30 mg/l genera un mayor largo de las hojas

de 2,9 cm.

xii

ABSTRACT

Title: Evaluation of the in vitro growth of yellow passion fruit (passiflora edulis sims flavicarpa

form) from nodal segments using the organogenesis technique.

Author: Lizeth Paola Ortiz Rodriguez

Key words: In vitro culture, passion fruit, nodal segments,6-BAP, disinfection, arginine.

Description:

Passion fruit cultivation has been successful thanks to its great export demand internationally. In

Colombia, the cultivation of passion fruit between 2014-2018 has significantly increased the

production of passion fruit. In the department of Santander, factors such as diseases caused mainly

by Fusarium oxysporum and Fusarium solani have been presented.

Leading to low production in passion fruit crops, generating losses of up to 60% of crop production,

in order to present a viable alternative for the massive multiplication of progenies in a healthy way,

free of pathogens and genetically uniform, this project will be developed where the main objective

is to evaluate the in vitro growth of yellow passion fruit from nodal segments through the technique

of organogenesis.

For this reason, a disinfection process was established with different types of compounds and time

of exposure where T4 showed low levels of contamination, oxidation and prosperous explants, in

the same way a culture medium was established where it was established that at low concentrations

0.2 mg / l of 6-BAP is achieved generating the formation of shoots with a percentage of 97% and

an average number of leaves of 1.80 per nodal segment, the same way the application of arginine

in concentration of 30 mg / l generates a greater length of the leaves of 2.9 cm

1

1 INTRODUCCIÓN

Las Passifloraceae, pertenecen a una familia de plantas con una distribución geográfica tropical,

esta comprende de 17 géneros y de más de 660 especies esta es originaria de Brasil, donde llego a

ser extendida Australia. En América (Perú, Ecuador, Venezuela y Colombia) se encuentran

localizados más de 4 géneros y alrededor de 500 especies en su gran mayoría Passifloras (Marín,

Caetano, & Posada, 2009). La gran demanda presentada por exportación de estos cultivos a nivel

internacional, ha permitido que diferentes países extiendan las áreas de cultivos logrando aumentar

investigaciones referentes a la fisiología, control de plagas y enfermedades que afectan los cultivos.

(Delgado, Castaño, & Villegas, 2013). Colombia ha logrado destacarse como un país tropical con

gran diversidad de fuentes biológicas y frutales esto dado por sus diferentes climas y ecosistemas

presentes en los territorios colombianos, el crecimiento de la actividad fructífera en Colombia es

considerada como una actividad con mayor potencialidad, por su gran expansión a nivel

internacional esto dado por connotación y preponderancia en la dieta alimenticia de la población

(Hermandez, 2009)

El maracuyá (Pasiflora edulis Sims forma flavicarpa) que logran crecer en forma de enredadera su

crecimiento optimo oscila entre 24 y 28ºC, cuando se presentan temperaturas por encima el

crecimiento vegetativo de la planta es acelerada, pero logran disminuir su producción debido a que

las altas temperaturas donde logra deshidratarse el líquido estigmático, la cual no realiza una

fecundación de las flores (Fischer, Casierra, & Piedrahíta, 2009).

2

En Colombia los cultivos de maracuyá entre los años 2014- 2018 ha aumentado de manera

significativa la producción del maracuyá llegando a producir 241.393 toneladas y un área de 14,17

toneladas/área. El departamento de Antioquia se convirtió en el principal producto a nivel nacional,

con una producción de 33.500 toneladas, en segundo lugar, se encuentra el departamento del Meta

con una producción de 32.345 toneladas, en el tercer puesto el departamento del Huila con una

producción de 25.871 toneladas y en el cuarto lugar el departamento del Valle del Cauca con una

producción de 11,110 toneladas en quinto lugar el departamento de Santander con un 5,8% en

producción 5.791 toneladas (Minagricultura, 2018).

En el sector fructífero en el departamento de Santander, presenta un aumento en los últimos años

con un área de sembrada total 646.306 toneladas producidas, en la Provincia de Soto se encuentra

la mayor producción de cultivos de maracuyá donde Girón, Piedecuesta, Lebrija, Rionegro, El

Playón y Los Santos presenta un 75% de cultivos de maracuyá, la siembra de estos cultivos presenta

grande demanda gracias a que sus suelos presentan potencial para la siembra de cítricos

tecnificados (Asohofrucol, 2016)

El cultivo in vitro logra brindar posibilidades para la propagación y el mejoramiento de las plantas,

mejorando la calidad y garantizando una mejor producción, mostrándose como una alternativa,

para la producción de plantas uniformes con altos estándares de calidad para el establecimiento de

cultivos comerciales; por esto la propagación, logra ser una alternativa en cuanto a la producción

de material vegetal, el maracuyá se presenta como un cultivo con una diversidad genética, la cual

permita una micropropagación para la obtención de plantas libres de patógenos (Manjarrés &

Perea, Establecimiento de un protocolo de propagación de Gulupa (Passiflora edulis SIMS) a partir

3

de embriones cigóticos y yemas axilares, 2012) mediante el crecimiento de esta forma evaluar el

crecimiento in vitro de maracuyá amarilla (Pasiflora edulis Sims forma flavicarpa) a partir de la

técnica de organogénesis.

Este trabajo está estructurado en varios capítulos donde en la primera parte se realiza una

introducción acerca de la importancia de los cultivos de maracuyá logrando servir como base para

futuros estudios e investigaciones, como segundo capítulo se realiza la descripción del

planteamiento de problema, justificación, pregunta problema, antecedentes, se establecerán los

objetivos específicos y general del trabajo de investigación. Como tercer capítulo se planteará la

metodología implementada en tres fases y por último capítulo los resultados, discusión,

conclusiones, bibliografía y anexos.

4

2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En los últimos años los cultivos de maracuyá se han logrado beneficiar gracias a la gran demanda

de importación de 50 toneladas y exportación de 9.486 toneladas para el 2017 donde este es llevado

para el consumo fresco (supermercados, plazas de mercado) o incluso es llevado para procesos

agroindustriales (suplementos vitamínicos, néctares, jugos multivitamínicos). Dentro de los países

que es exportado la maracuyá se encuentra Alemania con 5691.5 toneladas, Bélgica 226,8

toneladas, Canadá con 217,2 toneladas entre otros, en cuanto a importación se encuentra Ecuador

188 toneladas (Minagricultura, 2018).

En nuestro país, el cultivo de maracuyá se ha visto afectando por el fenómeno de la niña generando

una serie de enfermedades fitosanitarias afectando de manera directa la calidad y el rendimiento de

la producción (Mora, 2011). En segundo semestre del 2010 al 2011 se generaron perdidas parciales

y totales en los cultivos de maracuyá, pasando de un rendimiento en el 2010 de 35 toneladas a 8.6

toneladas para el 2011 (Dane, 2011). Es de interés para el agrónomo implementar estrategias

alternativas para sus cultivos y evitar así la pérdida total de la producción de maracuyá (Pasiflora

edulis Sims forma flavicarpa) (Jaramillo, Cárdenas, & Orozco, 2009).

En el departamento de Santander hay factores que han contribuido a la baja producción en los

cultivos de maracuyá amarilla (Pasiflora edulis Sims forma flavicarpa); una de ellas son las

enfermedades causadas principalmente por Fusarium oxysporum y Fusarium solani, agentes de la

pudrición a nivel radicular que en su mayoría generando pérdidas hasta una 30% de la producción

en los cultivos.

5

El control de las enfermedades se basa en la práctica de manejo convencional que resulta costosa

para los agricultores, teniendo que recurrí a la aplicación de fungicidas que en ocasiones resulta ser

ineficientes y a su vez incrementando los costos de producción hasta de un hasta de 70% del cultivo

y contribuyendo a la contaminación ambiental de la biota del suelo (Cubillos, Paez, Valero, Mejia,

& Gámez, 2008) además disminuyendo la biodiversidad asociada del mismo y arriesgando la salud

del suelo , animales y seres humanos que se logren encontrar en su alrededor (Fao, 2015)

Por otro lado, la falta de apoyo gubernamental en la tecnificación de los cultivos y las inadecuadas

buenas prácticas agrícolas (BPA), como también la ausencia de bancos de germoplasma en el

departamento de Santander a nivel de campo que logren estar orientados en la masificación de

variedades con un interés agronómico y económico importante para el productor.

6

3 PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

¿Es posible realizar propagación in vitro a partir de maracuyá (Pasiflora edulis Sims forma

flavicarpa) a partir de segmentos nodales mediante de la técnica de organogénesis?

7

4 JUSTIFICACIÓN

Se desarrollará este proyecto con el fin de evaluar el crecimiento in vitro de explantes de maracuyá

amarilla (Pasiflora edulis Sims forma flavicarpa) a partir de la técnica de organogénesis, como una

alternativa viable para la multiplicación masiva de explantes de forma sana, libre de patógenos y

genéticamente uniformes.

Así mismo, se generará nuevo conocimiento por cuanto ésta es la primera investigación in vitro de

maracuyá en Santander quedando como guía para estudios posteriores mediante el desarrollo de

protocolos para los procesos de desinfección y micropropagación vegetal.

Santander cuenta, con una alta producción de maracuyá. Para ello el gobierno departamental y

asohofrucol departamental formulación en plan de desarrollo del año 2016-2019 que Santander

aplicará nuevas tecnologías tales como la propagación in vitro para la conservación de especies de

interés agrícola para la región de Santander como lo es el maracuyá amarillo (Pasiflora edulis Sims

forma flavicarpa), destacando que los primeros beneficiados sean los agricultores, y sus ingresos

en la producción del fruto serán elevados, reduciendo los costos en la aplicación de químicos

(fertilizantes, insecticidas e fungicidas), buscando aumentar así la producción para el año 2020,

logrando que Santander se convierta en la tercera potencia frutícola a nivel nacional.

A su vez, se seguirá alimentando el banco de germoplasma del laboratorio de tejidos vegetales

ubicado en la Universidad de Santander. Igualmente, se contribuirá en la formación del recurso

humano del área de cultivos in vitro de tejidos vegetales.

8

5 MARCO TEÓRICO

5.1 Descripción botánica

El maracuyá (Passiflora edulis Sims forma flavicara) se caracteriza por ser una planta trepadora

semileñosa, y de gran vigor vegetativo. Su propagación es sexual (hermafroditas) lograda mediante

semillas, la flor prospera a partir de las axilas de las hojas logrando ser vigorosa de color blanco

con rayas púrpuras de 7 cm de ancho; presenta sépalos y pétalos con finos vellos siendo suaves y

tupidos. El tallo es redondo, raíz ramificada, las hojas crecen de 5 a 11 cm de largo y el zarcillo

axilares largos enrollado en la parte superior son de color verde y presentan una apariencia rojiza

o incluso violeta. Así mismo, sus hojas son alternas trilobadas de base acorazonada y bordes

ligeramente cortantes.

El fruto es de forma de ovoide de 4 a 10 cm de largo y un diámetro de 4 a 20 cm, lo que logra

equivaler entre 100 g y 130 g. La base y el ápice son redondos su corteza de color amarillo, de

consistencia dura, lisa y cerosa, la semilla en forma ovalada de 5 a 6 mm de largo y de ancho 3 a 4

mm con retículas de color negro o incluso marrón. La floración o apertura de la flor logra ser dada

únicamente en las tardes, y de acuerdo a las condiciones ambientales inicialmente la lluvia durante

el periodo de floración de la planta y a su adecuado manejo (Jaramillo, Cárdenas, & Orozco, 2009)

5.2 Origen y taxonomía

El maracuyá (Passiflora edulis Sims forma flavicara) es originario de América específicamente de

Brasil, aunque fue difundida a Australia, y pasando luego por Hawái, este tipo de cultivo se ve en

gran extensión en climas tropicales, es casual encontrar en climas fríos. (Amaya, 2009)

9

5.2.1 Clasificación taxonómica

División Espermatofita

Subdivisión Angiosperma

Clase Dicotiledónea

Subclase Arquiclamídea

Orden Perietales

Suborden Flacourtinae

Familia Plassifloraceae

Genero Pasiflora

Especie Edulis

Variedad Flavicarpa

Fuente: (Amaya, 2009)

5.3 Cultivo

En Colombia, la maracuyá se cultiva desde una altura entre los 800 y 1.200 msnm; sin embargo las

mejores condiciones para el desarrollo del cultivo esta los 400 y 800 msnm, con temperaturas que

varían entre 21 y 25Cº, el clima es un factor importante para este tipo de cultivo este se desarrolla

en un clima cálido (Jaramillo, Cárdenas, & Orozco, 2009).

El área destinada para la producción de maracuyá en Colombia, en el año 2011, fue de 5.950

hectáreas, de las cuales 3.065 hectáreas se encontraban en edad productiva. Huila, contribuye con

el 26% de hectáreas siendo el principal departamento productor de este fruto (Dane, 2011).

10

5.4 Fenología

En cultivo de maracuyá en su desarrollo fenológico resalta la polinización como una práctica

exigida, por genética las plantas de maracuyá presentan una condición de autoincompatibilidad por

lo que las flores no polinizan solas; dado esto por la posición de anteras, éstas solo logran

permanecer viable en el día en ese momento se realiza la polinización artificial llevando el polen

de una flor a otra con los dedos o por insectos siendo este el método más efectivo. La etapa de

desarrollo del cultivo de maracuyá es de 20 meses y presenta 3 etapas en condiciones óptimas que

son: etapa vegetativa, reproductiva y productiva (Betancur, y otros, 2014)

5.4.1 Etapa vegetativa

Inicia con la germinación de manera sexual (semillas) siendo trasplantada, y llevada a siembra

hasta el momento de la floración, tiene un tiempo de duración de 180 días (Betancur, y otros, 2014)

5.4.2 Etapa reproductiva

Esta inicia con la formación de la yema floral hasta la polinización, esta etapa es de 420 días,

equivalentes a 14 meses, se considera que la cosecha grande tiene una duración de dos meses,

intercalados con dos cosechas pequeñas de cuatro meses (Betancur, y otros, 2014)

5.4.3 Etapa productiva

Inicia con la polinización hasta la cosecha del fruto, comprendiendo así la etapa completa del

cultivo que esta entre dos a tres años, donde si las buenas prácticas agrícolas son adecuadas este

logra una vida útil de cuatro años en producción (Betancur, y otros, 2014).

11

5.5 Morfología

El maracuyá se caracteriza por ser una planta trepadora que llega a alcanzar unos 9 metros de altura,

de igual forma, por tener raíz ramificada, tallos redondos, zarcillos, hojas ovaladas, flores

hermafroditas, frutos redondos y semillas de color negro o incluso marrones (Betancur, y otros,

2014).

5.6 Raíz

Su sistema radicular es totalmente ramificado, superficial y distribuido en un 90% a los 0.15 a 0.45

cm de profundidad, por esta razón es importante el realizar cuidadosamente al realizar deshierbadas

y demás labores que remuevan el suelo para no causar daño al sistema radicular (Betancur, y otros,

2014).

5.7 Tallo

Esta planta se caracteriza por ser trepadora, la base del tallo es leñoso a medida que se acerca al

ápice logra perder consistencia (EnColombia, 2018).

5.8 Hojas

Son de color verde profundo, brillantes en el haz y pálidas en el envés, simples, alternas

comúnmente trilobuladas con márgenes finamente dentados, néctares redondos en la base del

foliolo, lamina foliar palmeada y mide entre 7 a 20 cm de largo (Betancur, y otros, 2014).

12

5.9 Zarcillos

Son redondos y en forma espiral, algunos alcanzan longitudes de 0.30 a 0.40 cm, una parte se

origina en las axilas de las hojas junto a las flores estos son las responsables de que la planta tenga

crecimiento trepador (EnColombia, 2018).

5.10 Flores

Son hermafroditas y auto incompatibles, dentro del androginóforo se encuentra el órgano

masculino (androceo), siendo formado por 5 estambres con anteras, los cuales obtienen granos de

polen de color amarillo una de sus desventajas es muy pesado lo cual dificulta la polinización con

el viento, nacen solitarias en las axilas sostenidas por 3 brácteas verdes, con 3 pétalos de color

blanco verdoso 5 pétalos y una corona formada por un abanico filamentoso de color púrpura en la

base y blanca en el ápice la cual atrae insectos para la polinización. La estructura gineceo

(femenina) está ubicada en la parte superior de los estambres (En Colombia 2018).

5.11 Fruto

Es una baya redonda u ovalada de color entre verde intenso a amarillo al momento de la

maduración, posee pequeñas semillas miden entre 6 a 7 cm de diámetro y entre 6 a 12 cm de

longitud por fruto, de color oscuro estas semillas contienen alto contenido de aceite con grandes

valores nutricionales este fruto se diferencia en 3 partes:

5.11.1 Exocarpio

Cascara o corteza, su característica es lisa y brillante por la cera natural, el color puede llegar variar

desde verde a amarillo de acuerdo al estado de maduración.

13

5.11.2 Mesocarpio

Es aquella parte blanca y porosa y de color blanco, compuesta principalmente de pectina, al entrar

en contacto con el agua, se reblandece con facilidad.

5.11.3 Endocarpio

Es aquella envoltura que cubre la semilla generalmente de color pardo oscuro, el jugo es de color

amarillo caracterizado por ser acido, aromático, y de gran sabor agradable (Amaya, 2009).

5.12 Cultivo de Tejidos Vegetales

El cultivo de tejidos, cosiste en tomar una fracción de planta (explante) el cual es cultivado de

manera aséptica logrando así, explantes libres de contaminantes, estos cultivados en un medio

artificial en condiciones físicas y químicas donde la célula logra su potencial intrínseco siendo

llevados condiciones ambientales controlas (Roca & Mroginski, 1991). En los últimos años la

técnica del cultivo “in vitro” ha logrado posicionarse con gran interés para el establecimiento de

diversas plantas; la producción de compuestos útiles, incrementado así la variabilidad genética,

para la obtención de plántulas libre de patógenos, propagación de plantas y conservación e

intercambio de germoplasma (Roca & Mroginski, 1991).

Micropropagación

Es una aplicación más generalizada del cultivo “in vitro” la cual permite cultivar células, tejidos,

órganos, semillas embriones y de esta manera generar explantes de manera rápida y de

descendencia uniforme. Por otra parte, el medio a utilizarse se compone de una mezcla de sales

minerales, vitaminas, reguladores de crecimiento, azúcar, agua y agar y condiciones ambientales

14

controladas (temperatura, humedad y luz). Esto de acuerdo a la especie vegetal y de la etapa del

proceso, logrando ser una herramienta muy útil para el mejoramiento, y la producción de plantas

con calidad uniforme a escala comercial, partiendo de un genotipo selecto y una tasa de

multiplicación ilimitada, todo esto es dado gracias a la propiedad totipotencial que presentan las

células vegetales generando plantas completas. (Aguinaga, 2013).

5.13 Etapas de la micropropagación

5.13.1 Etapa 0

5.13.1.1 Preparación de la planta madre

Para establecer el cultivo en condiciones de asepsia, los explantes deben tener las siguientes

características; sanas, vigorosas, fuera de estrés, nivel nutricional adecuado y un grado de

desarrollo adecuado para lograr así explantes en condiciones sanitarias óptimas, con un crecimiento

vigoroso y libre de contaminantes (Castillo, 2014).

5.13.2 Etapa 1

5.13.2.1 Establecimiento de un cultivo aséptico

Una vez elegida la planta madre, seleccionar los fragmentos (yemas, trozos de hojas, porciones de

raíces, semillas, entre otros), la asepsia de los explantes y las condiciones de esterilidad, son de

vital importancia para el cultivo. Una vez extraído el material de los explantes la realización de una

adecuada desinfección de los fragmentos de la planta, logrando la eliminación de contaminantes

15

(hongos, bacterias) que habitan de forma natural en el ambiente. Una vez realizada la desinfección

del material vegetal, se deben mantener en condiciones de asepsia controladas (Castillo, 2014).

5.13.3 Etapa 2

5.13.3.1 Multiplicación

Mantener y aumentar la cantidad para los nuevos ciclos de multiplicación de brotes, puede llevarse

a cabo, partiendo de tres enfoques: proliferación y crecimiento de meristemos de brotes y axilares

de la planta de la madre, inducción de meristemos adventicios a través de organogénesis (directa o

indirecta) o incluso por embriogénesis somática, o explantes directamente de órganos, tejidos o

células (Castillo, 2014).

5.13.4 Etapa 3

5.13.4.1 Enraizamiento

Durante esta fase se espera que los brotes derivadas de las etapas 1 y 2 que se logren desarrollar

raíces adventicias, el enraizamiento in vitro puede llegar a emplear diferentes tipos de sustratos

(medios solidificado y reguladores de crecimiento (Auxinas) promoviendo la rizogénesis (Castillo,

2014).

5.13.5 Etapa 4

5.13.5.1 Aclimatación de los explantes

Los explantes enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, los brotes se han

desarrollado en condiciones de alta humedad y baja intensidad de luz las características de las hojas

16

obtiene menos ceras epicuticulares, en comparación con las sembradas en condiciones externas.

En pocos días son capaces de adaptarse para así producir su propio recurso de carbono, ya que al

ser cultivadas de manera in vitro logran ser suplementadas con sacarosa y se mantiene en poca luz,

por lo que no dependerá totalmente de su fotosíntesis. (Felix, 2018).

17

6 MARCO REFERENCIAL

En los últimos años el estudio de la biotecnología vegetal se ha logrado generar gran interés en

investigaciones buscando respuestas a las necesidades según el material vegetal a evaluar. Por esto,

la Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado a través investigador Víctor Otahola (Otahola,

2000) con el fin de determinar la regeneración de la maracuyá, Passiflora edulis flavicarpa a partir

de explantes foliares donde se trabajó con diferentes concentraciones de 6-BAP (0; 0,3; 0,6; 0,9 y

1,2 mg/l) en medio MS utilizando explantes foliares circulares utilizaron un diseño estadístico de

bloque al azar con cinco repeticiones, se encontraron diferencias significativas en la formación de

callos a los 15,25 y 35 días y a su vez la formación de yemas a los 25 y 35 días la mayor formación

de yemas se presentó con la dosis de 0.6 mg/l.

La revista colombiana de biotecnología (Cecilia Severin, 2011) observó la respuesta in vitro de

diferentes biotipos y explantes de Passiflora caerulea L. Utilizando dos tipos de explantes

(entrenudos y segmentos nodales), en medio de cultivo MS, suplementado con vitaminas y 1mg/l-

1 de 6-BAP. Las respuestas fueron diferentes según el genotipo y el explante, los entrenudos

ubicados tanto horizontal como verticalmente en medio de cultivo generaron callos como única

respuesta. A través de estudios histológicos se determinó que en medio de cultivo MS con 1 mg/L-

1 de 6-BAP, los segmentos nodales de P. caerulea originan brotes a partir de las yemas axilares

preformadas y raíces que parten de callos en la base de los mismos. En iguales condiciones, los

entrenudos originan callo como única respuesta.

Tiempo después en Colombia la Universidad Nacional con el trabajo de Manjares Hernández Elsa

y Perea Dallos Margarita (Manjarrés & Perea, 2012) con establecimiento del protocolo de

18

propagación de gulupa Passiflora edulis. Sims partiendo de embriones cigóticos y yemas axilares.

Donde evaluaron diferentes concentraciones de hipoclorito de sodio para desinfección de semillas

observando que a concentraciones de 1 y 2% logra ser eficientes para la desinfección.

En el establecimiento del cultivo de embriones cigóticos se observó que la imbibición de las

semillas es dada a concentraciones de 4,33 µm AG3 y además con 6,66 µm 6-BAP. La proliferación

de brotes y su elongación se observó que con la adición de tiamina 3 mg/L, AG3 0,58 µm, 6-BAP

4,44 µm y kinetina 4,65 µm.

19

7 HIPÓTESIS

Hipótesis nula

No se desarrolla propagación in vitro de Maracuyá amarilla (Pasiflora edulis Sims forma

flavicarpa) a partir de segmentos nodales mediante la técnica de la organogénesis

Hipótesis alterna

Se desarrolla propagación in vitro de Maracuyá amarilla (Pasiflora edulis Sims forma flavicarpa)

a partir de segmentos nodales mediante la técnica de la organogénesi

20

8 OBJETIVOS

Objetivo general.

General: Evaluar el crecimiento in vitro de maracuyá amarilla (Pasiflora edulis Sims forma

flavicarpa) a partir de segmentos nodales mediante la técnica de organogénesis.

Objetivos específicos

Estandarizar el proceso de desinfección de explantes de maracuyá amarilla (Passiflora edulis

Sims forma flavicarpa) para lo obtención libre de patógenos.

Establecer la fase de multiplicación de los explantes de maracuyá amarilla (Passiflora edulis

Sims forma flavicarpa) para la formación de brotes in vitro.

21

9 METODOLOGÍA

9.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN

El proyecto es experimental, lo cual permite evaluar el desarrollo de la investigación que se llevó

a cabo en el laboratorio de tejidos vegetales, ubicado en el la Universidad de Santander, Campus

Lagos del Cacique –Bucaramanga, Colombia.

9.2 Fases de investigación.

Para el desarrollo del proyecto se realizaron las siguientes etapas de investigación:

9.2.1 FASE I. Estandarización del proceso de desinfección

9.2.1.1 Obtención y preparación del material vegetal

La obtención de los segmentos nodales de maracuyá amarilla (Pasiflora edulis Sims forma

flavicarpa), fueron suministrados por el SENA seccional Rionegro, Santander con una temperatura

de 25°C y una altitud de 590 m.s.n.m. Para la recolección del material vegetal, se tendrá en cuenta

que el material no presentará daños aparentes en los tejidos y con una buena calidad fitosanitaria.

Dicho material se llevará al laboratorio de tejidos vegetales en bolsas ziploc a una temperatura de

10°C y almacenados en nevera hasta su utilización.

9.2.1.2 Protocolo de desinfección

Se evaluaron cuatro (4) protocolos de desinfección donde varió el tipo de desinfectante, las

concentraciones y tiempos de aplicación. De esta forma, se buscó asegurar la asepsia de los

explantes durante todo el proceso.

22

Tratamiento (1):

Compuesto Tiempo (min)

Agua 10

Alcohol al 70% 2

Hipoclorito de sodio 3% 15

Cloranfenicol 3

Tabla 1. Componentes del tratamiento 1 de desinfección para explantes de maracuyá

Tratamiento (2):


Hipoclorito de sodio 2% 20

10 gotas de Tween 80 15

Cloranfenicol 5


Tratamiento (3):


70 gotas de Yodopovidona 30

Alcohol al 70% 1

Timsen 10


23

Tratamiento (4):


Agua + Solución Jabonosa 5

Timsen 10

40 gotas Yodopovidona 10

Hipoclorito de sodio 5% +

2 gotas de Tween 80 10


Nota: Se realizaron lavados de agua destilada estéril para los tratamientos 1 y 2 en cada paso y los

tratamientos 3 y 4 se realizó el lavado con agua destilada + ácido crítico por 3 (min) con el fin de

eliminar residuos de las soluciones desinfectantes.

Para la lograr determinar el mejor tratamiento se tendrán en cuenta las variables de medición

como es el porcentaje de explantes oxidados, porcentaje de explantes contaminados y porcentaje

de explantes prósperos. (Ver tabla 5).

Variables de medición

Formula de variables

Porcentaje de explantes oxidados (%EO)

Porcentaje de explantes contaminados (%EC)

Porcentaje de explantes prósperos (%EP)

Tabla 5. Fórmula de los porcentajes de protocolos de desinfección (Braun & Zucari, 2014)

24

9.2.2 FASE II. Establecimiento del cultivo

En esta fase se determinó la formulación del medio a partir del medio basal MS (Murashige Skoog

1962). Para ello, se estableció cuatro (4) medios de cultivos. Tabla 6 los cuales variaron en la

concentración de soluciones como auxinas, citoquininas, vitaminas y hormonas de crecimiento

vegetal, cabe resaltar que estos medios son formulados en el laboratorio de Tejidos Vegetales. Ver

anexo (7). Para determinar cuál es la mejor formulación se realizará medición de las siguientes

variables: Número de brotes, largo de las hojas y tiempo de brotación.

9.2.3 Análisis Estadístico.

Para el análisis estadístico se realizó un diseño estadístico factorial 3x3 a partir de ANOVA

obteniendo así diferencias significativas para la comparación de los resultados se utilizó el método

de Turkey en un software Infostat.

25

10 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

10.1 FASE I. Desinfección de explantes de maracuyá amarilla (Passiflora edulis Sims

forma flavicarpa)

De acuerdo a la figura 1 se observan diferencias significativas entre los tratamientos (p

26

membrana, la reactivación de las enzimas productoras de energía y a la desnaturalización de las

proteínas esenciales de la célula (Negroni, 2009).

Según (Nel, Steinberg, Labuschagne, & & Viljoen, 2007) el timsen es considerado como un

desinfectante de acción rápida y es activo a concentraciones bajas, mediante investigaciones

realizadas se observó que posee una eficacia alta contra conidios de Fusarium oxysporum,

Fusarium cubense en un tiempo de 30 segundos de exposición en cultivo de banano. Otros estudios

realizados por (Hernández & González, 2010) demostraron que la aplicación de fungicidas logran

disminuir o eliminar de manera parcial la acción de microorganismos fungosos en las plantas

durante la fase cero o incluso en la fase preparativa de micropropagación de la planta. Se observó

con la aplicación del fungicida logró disminuir de manera rápida la presencia de hongos y bacterias

en un tiempo de exposición de 10 minutos, este tiempo en comparación con otros tiempos usados

en otras investigaciones es alto; pero con esto asegura que su efecto sea el adecuado en los cultivos

de maracuyá sin embargo se deben realizar estudios que optimicen el tiempo v.s las

concentraciones del desinfectante.

Otros autores como (Rebolledo, Aparicio, & Cruz, 2006)y (Guerrero, Basantez, Rafael, & Idalmis,

2016) utilizaron hipoclorito de sodio en el proceso de desinfección donde obtuvieron bajos

porcentajes de contaminación al respecto es importante tener en cuenta que al aumentar la

concentraciones y el tiempo de exposición del hipoclorito de sodio los explantes presentaron

necrosis. En este trabajo de investigación se observó que al disminuir la concentración del

hipoclorito de sodio y aumentar el tiempo de exposición, el porcentaje de contaminación aumenta.

27

En relación al tratamiento T4 en el que se aumenta la concentración del hipoclorito de sodio y se

baja el tiempo de exposición se disminuyó el porcentaje de contaminación de los explantes.

La mayor incidencia de contaminación que se presentó en el proceso fue dada por la presencia del

hongo Micelio esterilia, con un porcentaje del 100% como se observa en la figura 2 donde se

muestra el crecimiento de la contaminación presente en la desinfección de marcuya in vitro.

A B

28

Figura 2. A. Descripción macroscópica: de color blanco, aspecto algodonoso con consistencia blanda. B.

Descripción microscópica: no se observa ninguna estructura reproductiva siendo clasificado como Micelio

esterilia.

Figura 3. Porcentaje de oxidación de explantes de maracuyá

En cuento al porcentaje de oxidación en la figura 3, se observan diferencias significativas entre los

tratamientos (P

29

comportamiento de efectividad se vio por la combinación de procesos y condiciones de cultivos

óptimos (tiempo, compuestos inhibidores de crecimiento, y por último la aplicación de soluciones

antioxidantes), establecidos durante la estandarización del proceso de desinfección para el cultivo

de maracuyá. (Ancasi, Montero, Ferreira, & Muñoz, 2016) en su trabajo observaron que la

aplicación de ácido cítrico obtuvo menor grado de oxidación reduciendo el complejo de fenólico

logrando la supervivencia de los explantes de plátano de manera in vitro, evidenciando que la

aplicación del ácido cítrico figura 4, es uno de los antioxidantes más comunes en cultivos in vitro

para evitar la oxidación de tejidos como es en los segmentos nodales del cultivo de maracuyá.

30

Figura 4. A. Oxidación total de los explantes de maracuyá sin la aplicación de ácido cítrico en el proceso

de desinfección. B. Explantes de maracuyá con aplicación de ácido cítrico en el proceso de desinfección.

Figura 5. Porcentaje de explantes vivos de maracuyá

B A

31

Respecto al porcentaje de explantes vivos en la figura 5, se observa una diferencia significativa

para cada uno de los tratamientos (P

32

En la figura 6, se observa el promedio de formación de brotes a partir de los segmentos nodales de

maracuyá, donde se evidencia diferencias significativas entre cada tratamiento (p

33

Figura 7. Promedio de número de brotes de maracuyá

En la figura 7, evidencia el promedio de numero de brotes, presentando diferencias significativas

entre cada tratamiento (p

34

Figura 8. Promedio largo de hojas de botes de maracuyá

De acuerdo a la figura 8, se observan diferencias significativas entre los tratamientos (p

35

Así mismo, (Rodríguez, Capote, & Zamora, 1999) en su investigación de aguacatero (Persea

americana Mill.) demuestra que al trabajar con una concentración de 40 mg/l de arginina en el

medio, se favorece el crecimiento y desarrollo de la lámina foliar. Esto corrobora con los resultados

obtenidos en el presente estudio, en donde el T4 y T3 se le adicionó arginina al medio establecido

para maracuyá, presentándose un crecimiento notorio de las hojas en cada uno de los explantes con

respecto a los otros tratamientos. Siendo el T4 el de mayor crecimiento foliar figura 9, ya que se

adicionó mayor proporción de arginina (30 mg/L).

Figura 9. Explante de hoja de maracuyá del T4

36

11 CONCLUSIONES

El método de desinfección más eficiente para los segmentos nodales de maracuyá, fue el

tratamiento T4, donde los componentes y sus tiempos fueron agua + solución jabonosa por 5

minutos, timsen por 10 minutos, yodopovidona 10 minutos e hipoclorito de sodio al 5% + tween

20 por 10 minutos y enjuagues con ácido cítrico por 3 minutos obteniendo explantes libre de

patógenos.

En la fase de establecimiento de cultivo se observó, que tratamiento T4 con la concentración de

0.2 mg/L de 6-BAP, generó una mayor respuesta en el porcentaje de formación de brotes con un

97%, un promedio en número de brotes de 1,80 por segmento nodal y un tamaño de hoja de 2,9 cm

con concentraciones de 30 mg/l de arginina.

37

12 RECOMENDACIONES

Se sugiere aumentar los tiempos de exposición y variar los componentes para el protocolo de

desinfección de los tratamientos T1 y T2 logrando así una disminución de contaminación fúngica

presente en los cultivos de maracuyá.

Evaluar el efecto de otros reguladores de crecimiento a diferentes concentraciones para estimular

proliferación de los explantes a partir de los segmentos nodales.

38

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bencilaminopurina sobre la multiplicación in vitro de ocumo criollo (Xanthosoma

sagittifolium L. Schott). Revista de la Facultad de Agronomía, 212-222.

42

14 ANEXOS

Anexo 1

43

Anexo 2

44

Anexo 3

45

Anexo 4

46

Anexo 5

47

Anexo 6

48

Anexo 7

Tabla 6. Formulación del medio de cultivo a partir del medio basal MS (Murashige Skoog 1962). Para

los explantes del maracuyá in vitro.

Formulación de medios para 200 ml

Composición T1 T2 T3 T4

Solucione A 5000 µl 5000 µl 5000 µl 5000 µl

Solucione B 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl

Solucione C 560 µl 560 µl 560 µl 560 µl

Solucione D 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl

Solucione E 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl

Ácido ascórbico 0,004 g 0,004 g 0,004 g

Mionositol 0,02 g 0,02 g 0,015 g 0,02 g

Ácido cítrico - - 0,015 g -

Glicina - - 15 µl -

Piridoxina - - 105 µl -

Arginina - 40 µl 30 µl

Riboflavina 0,02 g 0,02 g - 0,02 g

Sacarosa 6 g 6 g 4,5 g 6 g

pH 5,8 5,8 5,8 5,8

Agar 1,4 g 1,4 g 1.8 g 1,4 g

6-BAP 50 µl 40 µl 10 µl 20 µl

Tiamina 100 µl 100 µl 120 µl 100 µl

AIA - - 75 µl -

Ácido nicotínico 36 µl 36 µl - 36 µl

Antibiótico 0,016 g 0,016 g 0,012 g 0,016 g

Orthocide 0,016 g 0,016 g 0,012 g 0,016 g

lizeth paola ortiz rodriguez...el cultivo in vitro logra brindar posibilidades para la propagación...

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