lista de chequeo 6 nivel iii claudia calderón análisis
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Lista de chequeo 6
NIVEL IIIAnálisis molecular
Claudia CalderónBacterióloga, MSc MicrobiologíaResponsable Laboratorio Biología MolecularLaboratorio Nacional de Diagnóstico Veterinario ICA
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LISTA DE CHEQUEO 6. PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO
NIVEL III – ANÁLISIS MOLECULAR
Se llega al NIVEL III de diagnóstico (análisis
molecular) únicamente si el NIVEL I y II
son compatibles con enfermedad por TiLV
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LISTA DE CHEQUEO 6. PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO
NIVEL III – ANÁLISIS MOLECULAR
RT-PCR convencionalTranscripción reversa + Reacción en
cadena de la polimerasa
Reverse transcription
polymerase chain reaction (RT-PCR)
TiLV= negative sense RNA genome
Gel electrophoresis
Thermocycler
Training Course on EUS/TiLV Surveillance and Diagnostics10/14/2019-10/17/2019Traducción al español de la presentación original de Win Surachetpong y Kathy Tang-Nelson en el curso de entrenamiento EUS/TiLV Surveillance and diagnostics, Zambia, 2019
Reverse transcription
polymerase chain reaction (RT-PCR)
TiLV= negative sense RNA genome
Gel electrophoresis
Thermocycler
Training Course on EUS/TiLV Surveillance and Diagnostics10/14/2019-10/17/2019
Termociclador
Electroforesis en gel de agarosa
Reverse transcription
polymerase chain reaction (RT-PCR)
TiLV= negative sense RNA genome
Gel electrophoresis
Thermocycler
Training Course on EUS/TiLV Surveillance and Diagnostics10/14/2019-10/17/2019
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NIVEL III ANÁLISIS MOLECULAR
qRT-PCR Cuantitativo (tiempo real)
Transcripción reversa + Reacción en cadena de la polimerasa cuantitavo
Traducción al español de la presentación original de Win Surachetpong y Kathy Tang-Nelson en el curso de entrenamiento EUS/TiLV Surveillance and diagnostics, Zambia, 2019
Quantitative reverse transcription
polymerase chain reaction (RT-qPCR)
Training Course on EUS/TiLV Surveillance and Diagnostics10/14/2019-10/17/2019
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LISTA DE CHEQUEO 6. PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO
NIVEL III – ANÁLISIS MOLECULAR
LAMPAmplificación isotérmica mediada por
LOOP
▪ LAMP requiere de 4 a 6 primers▪ Uso de ADN polimerasa con actividad de
desplazamiento de cadena.▪ No requiere el paso de PCR para
denaturalizar (90°C)▪ La reacción ocurre a una misma
temperatura 60°C▪ Mayor tolerancia a inhibidores https://thebiologynotes.com/loop-mediated-isothermal-amplification-lamp/
✓ Mayor sensibilidad y especificidad que PCR
✓ Económico ✓ Simple ✓ Sin termociclador
Detección por Bioluminiscencia
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LISTA DE CHEQUEO 6. PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO
NIVEL III – ANÁLISIS MOLECULAR
▪ RT-PCR Convencional. Eyngor et al., 2014
▪ RT PCR Anidada. Tsofack et al., 2016.
▪ RT-PCR semi-anidada. Dong et., 2017.
▪ PCR en tiempo real. Tattiyapong et al. 2017.
Según la OIE, la RT-PCR se encuentra
dentro de los métodos de prueba
confirmatorios
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LISTA DE CHEQUEO 6. PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO
NIVEL III – ANÁLISIS MOLECULAR
iiPCRPCR Digital
DOI: 10.1016/j.rmclc.2017.06.002
▪ Generación de gotas en la que sedistribuirán las moléculas aleatoriamente.
▪ Pareja de sondas TaqMan (secuenciamutada).
Detección por Citometría de flujo
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2015 2016 2017 2018 2019 2020 2021
TÉCNICAS MOLECULARES PARA LA DETECCÓN DE TiLV EN EL LNDV
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DIFERENCIAS ENTRE LAS TÉCNICAS DESARROLLADAS DE RT-PCR
Bull. Eur. Ass. Fish Pathol., 40(6) 2020, 237
▪ Alta sensibilidad y especificidad
para la detección de TiLV.
▪ RT-qPCR mayor sensibilidad.
▪ Todos los métodos tienen 100%
de especificidad
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¿Por qué?
▪ Probar peces individuales para TiLV requiere muestras de gran
tamaño cuando la prevalencia dentro de la explotación es baja.
Es costoso, requiere mucho tiempo y requiere mucha mano de
obra.
Ventajas
▪ Permite estimación de la prevalencia dentro de la granja.
▪ Estrategia dentro de la vigilancia posterior a brote de TilV.
POOL DE MUESTRAS PARA LA DETECCIÓN DE TiLV
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▪ Un modelo bayesiano mostró que la prevalencia dentro de la granja se puede
estimar a partir del porcentaje de pooles positivos de 5.
POOL DE MUESTRAS PARA LA DETECCIÓN DE TiLV
▪ Un pool de tejidos de 5 o 10 peces
individuales. que contenía al menos una
muestra TiLV positiva fue suficiente para
producir un resultado positivo.
▪ Excepto cuando los valores del umbral del
ciclo (Ct) estaban entre 31 y el valor de corte
de 34.
Doi: 10.1111/TBED.13957
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▪ Tipo de muestra
▪ Alevinos < a 2gramos
▪ Pool de órganos: hígado, riñón, encéfalo
ENVÍO DE MUESTRAS AL LABORATORIO NACIONAL DE DIAGNÓSTICO VETERINARIO (LNDV)
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ENVÍO DE MUESTRAS AL LABORATORIO NACIONAL DE DIAGNÓSTICO VETERINARIO (LNDV)
▪ Tipo de muestra
▪ Alevinos < a 2gramos
▪ Con abdomen abierto completo
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▪ Condiciones para la toma de la muestra y su conservación
▪ Uso de RNAlater® :▪ Solución para estabilización y protección del ARN
▪ No altera la estructura tisular.
▪ Almacenaje de las muestras inmersas en RNAlater a temperatura ambiente por una semana, sin comprometer calidad ARN.
ENVÍO DE MUESTRAS AL LABORATORIO NACIONAL DE DIAGNÓSTICO VETERINARIO (LNDV)
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Comparación de métodos de
conservación de RNA para detección de TiLV
RNA Later
Etanol 95%
Etanol 70%
Congelación -20ºC
Refrigeración 4ºC
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Extracción de ARN
EXTRACCIÓN DE ÁCIDO NUCLÉICO
*Siguiendo las recomendaciones y protocolo de los fabricantes.
▪ Rneasy minikit (cat # 74104; Qiagen, UK)
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Perfil químico
▪ SuperScript™ II Reverse Transcriptase
▪ GE Healthcare illustra™ PuReTaq Ready-To-Go™ PCR Beads
RT-PCR CONVENCIONAL TiLV
Nombre del primer SecuenciaNM-CLU7-SF 5' AGT TGC TTC TCA YAA GCC TGC TA 3'
NM-CLU7-SR1 5' GAC CTA CAA CTA AGT GGT GAG TGG 3'
▪ Tilapia lake virus diagnostic PCR assay. Columbia University
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Controles positivos
Co
ntr
ol n
egat
ivo
RT-PCR CONVENCIONAL TiLV
240pb
GSA-MA-LNDV-M-053. Detección del virus de tilapias (Gen de la Proteina Hipotética) por RT PCR Convencional. V1
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Perfil químico
▪ SuperScript™ III One-Step RT-PCR Invitrogen (RT-PCR)
▪ GoTaq Flexi Promega (PCR Interna)
RT-PCR SEMI-ANIDADA TiLV
▪ Dong HT and et al. A Warning and an improved PCR detection method for Tilapia lake virus (TiLV) diseasein Thai tilapia Farms. 2017 NACA
Nombre del Primer Secuencia 5’-3’Nested ext-1 TATGCAGTACTTTCCCTGCC
ME1 GTTGGGCACAAGGCATCCTAME1 GTTGGGCACAAGGCATCCTA
7450/150R/ME2 TATCACGTGCGTACTCGTTCAGT
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Controles positivos
Co
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egat
ivo
RT-PCR SEMI-ANIDADA TiLV
250pb
Mu
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aP
CR
-1
Mu
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aP
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-2
C+T
ILV
1P
CR
-1
C+T
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CR
-2
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2P
CR
-1
C+T
ILV
2P
CR
-2
CM
MP
CR
-1
CM
MP
CR
2
MP
M
415pb
GSA-MA-LNDV-M-094. Detección del virus de la tilapia del lago (TiLV) (gen proteinahipotética) por RT PCR Semianidada. V1
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Perfil químico
▪ QuantiTect Sybr Green RT-PCR Kit (Qiagen)
RT-PCR TIEMPO REAL SYBR TiLV
▪ Tattiyapong P, and et al. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerasechain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journalof Fish Diseases 2018 41, 255–261.
▪ Nicholson, P. and et al.Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR. J.Vis. Exp. (141), e58596, doi:10.3791/58596 (2018).
Nombre Secuencia 5’-3’TiLV-112F CTGAGCTAAAGAGGCAATATGGATTTiLV-112R CGTGCGTACTCGTTCAGTATAAGTTCT
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Controles positivos
Co
ntr
ol n
egat
ivo
RT-PCR TIEMPO REAL SYBR TiLV
Mu
estr
aP
CR
-1
Mu
estr
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CR
-2
C+T
ILV
1P
CR
-1
C+T
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1P
CR
-2
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2P
CR
-1
C+T
ILV
2P
CR
-2
CM
MP
CR
-1
CM
MP
CR
2
MP
M
Ct
Temperatura melting
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Perfil químico
▪ Quantitect RT-PCR Probe kit (Qiagen)
RT-PCR TIEMPO REAL TAQMAN TiLV
▪ Pitchaporn Waiyamitra, and et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture 497 (2018) 184-188.
Nombre Secuencia 5’-3’TiLV-93F 5’-AGCCTGCCACACAGAAG-3’TiLV-93R 5’-CTGCTTGAGTTGTGCTTCT-3’
TiLV-93Probe 5’-FAM-CTCTACCAGCTAGTGCCCCA-Iowa Black o BHQ1-3’
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RT-PCR TIEMPO REAL TAQMAN TiLV
GSA-MA-LNDV-M-095. Detección del virus de la Tilapia del Lago (TiLV) (Gen Proteína Hipotética) por RT PCR en Tiempo Real . V2
![Page 25: Lista de chequeo 6 NIVEL III Claudia Calderón Análisis](https://reader031.vdocuments.co/reader031/viewer/2022012501/617b0ea286d63055bf2fb78c/html5/thumbnails/25.jpg)
Área de Mezclas Maestras
Laboratorio Nacional de Diagnóstico Veterinario
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Área de Extracción
Laboratorio Nacional de Diagnóstico Veterinario
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Área de Amplificación Convencional
Laboratorio Nacional de Diagnóstico Veterinario
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Área de Electroforesis
Laboratorio Nacional de Diagnóstico Veterinario
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Área de Tiempo Real
Laboratorio Nacional de Diagnóstico Veterinario
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Muchas gracias por la atención prestada
Claudia CalderónBacterióloga, MSc Microbiología
Responsable Laboratorio Biología MolecularLaboratorio Nacional de Diagnóstico Veterinario ICA