Hidrólisis

Síntesis pordeshidratación

Disacárido

Agua

Monosacárido Monosacárido

Hidrólisis

Síntesis pordeshidratación

Hidrólisis

Síntesis pordeshidratación

Disacárido

Agua

Monosacárido Monosacárido

UNIVERSIDAD DE PUERTO RICO- HUMACAO

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA

BIOL 3013

Experiencia de Laboratorio: Macromoléculas: hidratos de carbono, lípidos y proteínas

Adaptado y traducido por la Dra. Melissa Colón Cesario, UPRH 2009 de:

“Exercise Six: Biologically Important Molecules”, Biology Laboratory Manual, Vodopich & Moore, McGraw Hill, 2008.

“Laboratory #3: Chemical Composition of Cells”, Laboratory Manual Biology, Mader, McGraw Hill, 2007.

Objetivos:

1. Reconocer la importancia de los carbohidratos y lípidos2. Utilizar pruebas bioquímicas para detectar la presencia de almidón y azúcares.3. Reconocer los componentes de un lípido.4. Utilizar la pruebas para detectar la presencia de lípidos.5. Utilizar pruebas bioquímicas para detectar la presencia de proteínas en una solución.

Introducción a macromoléculas:

Todos los organismos se componen de la unidad básica de la materia conocida como el átomo. Cuando los átomos se unen con otros átomos producen moléculas. Las moléculas orgánicas están directamente asociadas con los organismos vivos, debido a que son los bloques que componen la estructura celular. Las moléculas orgánicas grandes se forman mediante la síntesis por deshidratación y se destruyen mediante el proceso de hidrólisis. Lo que implica que para romper una macromolécula tenemos que romper una molécula de agua (hidrólisis), mientras que al formar una macromolécula se produce una molécula de agua (síntesis de deshidratación).

Entre las diferentes clases de moléculas orgánicas que existen nos vamos a enfocar en los hidratos de carbonos (monosacáridos, disacáridos, polisacáridos), los lípidos (grasas) y las proteínas. Para detectar estas moléculas en diferentes soluciones vamos a utilizar agentes bioquímicos que reaccionan solo cuando estas moléculas están presente.

Hidratos de Carbono: Los hidratos de carbono son macromoléculas que se componen de pequeñas moléculas conocidas como monómeros. Estos monómeros son azúcares simples conocidas como monosacárido (Ej. Glucosa). Otros carbohidratos tienen una organización más compleja, como los disacáridos y los polisacáridos. Los disacáridos se componen de dos unidades de azúcar como la maltosa. Los polisacáridos se componen de cadenas de glucosas como por ejemplo el glucógeno, el almidón y la celulosa.

La glucosa es utilizada como fuente de energía en los organismos vivos. La energía se libera cuando la glucosa se rompe formando dióxido de carbono (CO2) y agua (H2O). Esta energía liberada es la que utilizan los organismos para hacer trabajo. Nosotros los animales almacenamos el azúcar en forma de glucógeno, mientras las plantas las almacenan en forma de almidón.

Lípidos: Los lípidos son moléculas que son insolubles en agua y solubles en solventes como alcohol y eter. Por lo general, los aceites y las grasas se componen de tres moléculas de ácidos grasos unidos y una molécula de glicerol (triglicérido). Las grasas son la fuente de almacenaje a largo plazo de energía en el cuerpo humano. Los lípidos incluyen a las grasas, los aceites, los fosfolípidos, los esteroides y el colesterol.

Proteínas: Las proteínas son moléculas con estructuras versátiles que se encuentran en las diferentes formas de vida. Los monómeros de las proteínas son conocidos como los amino ácidos, los cuales están compuestos por un grupo amino (-NH2), un grupo carboxilo (-COOH) y un grupo variable (R). El grupo R es quien da la propiedad distintiva de cada amino ácido. Al igual que los hidratos de carbono y los lípidos los enlaces entre los amino ácidos es mediante la síntesis por deshidratación. El enlace entre amino ácidos es conocido como un enlace peptídico. Un enlace peptídico se forma entre el grupo amino (-NH2) de un amino ácido y el

monosacáridos ácido graso

triglicéridoalmidón

mon

ómer

om

acro

mol

écul

a

Hidratos de Carbono Lípidos

monosacáridos ácido graso

triglicéridoalmidón

mon

ómer

om

acro

mol

écul

a

Hidratos de Carbono Lípidos

grupo carboxílico (-COOH) del amino ácido adyacente. Las proteínas se caracterizan por tener cuatro niveles de organización en su estructura: primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria. La estructura primaria está relacionada con la secuencia de amino ácidos, mientras que la secundaria está asociada con la formación de puente de hidrógeno entre amino ácidos que no están adyacentes. La estructura terciaria está envuelta con la tridimensionalidad de la proteína. Las proteínas son funcionales solo y cuando su estructura terciaria sea correcta. Algunas proteínas adquieren la estructura cuaternaria, es decir se asocian con otras cadenas de polipéptidos para ser funcionales (Ejemplo: la hemoglobina). Entre las funciones que tienen las

proteínas en la célula se encuentran: generar estructura, movimiento, defensa, almacenaje, señales y catálisis.

Detectar la presencia de hidratos de carbohidratos, lípidos y proteínas

Para detectar la presencia de lípidos e hidratos de carbonos en las soluciones se utilizan algunas sustancias químicas que reaccionan con el sustrato produciendo un cambio en color. Si el cambio en color es observado, entonces la reacción es positiva e indica que la molécula orgánica de interés está presente. Si no se observa cambio en color, entonces la reacción es negativa e implica que la molécula orgánica de interés no está presente, solo está presente el solvente. Para cada experimento recuerda incluir o identificar al grupo control adecuado. El grupo control te permite observar las diferencias entre los resultados positivos y negativos.

Prueba para detectar almidón:

Para detectar la presencia del almidón se utiliza una solución de iodo(I2KI). La solución de iodo distingue al almidón de los monosacáridos, disacáridos y otros polisacáridos. La solución de iodo (amarillo-marrón) reacciona químicamente con los espirales que se forman en la molécula de almidón cambiando a un color azul-negro. Si los hidratos de carbono no están en espiral, entonces la solución de iodo no reacciona (permanece amarillo-marrón).

EstructuraPrimaria

EstructuraSecundaria

EstructuraTerciaria

Lámina β

Amino ácidos

+H3NTerminal amino

αhélice

EstructuraCuaternaria

1 mL solución de glucosa

5

1 mL jugo de papa4

1 mL jugo de cebolla

3

1 mL solución de 1% almidón

2

1 mL agua1

ConclusiónColor de la Reacción

ContenidoTubo

Tabla 1: Prueba de almidón

1 mL solución de glucosa

5

1 mL jugo de papa4

1 mL jugo de cebolla

3

1 mL solución de 1% almidón

2

1 mL agua1

ConclusiónColor de la Reacción

ContenidoTubo

Tabla 1: Prueba de almidón

1 54321 5432

Procedimiento:

Identifique 5 tubos de ensayos limpios.

Tubo 1

1. Mezcla 1 mL de agua y 5 gotas de solución de iodo.2. Anota el color de la solución en la Tabla 1.

Tubo 2

1. Agita la solución de almidón que se encuentra en la mesa central antes de obtener tus muestras. Después de agitar la solución de almidón, mezcla 1 mL de la solución de 1% almidón y 5 gotas de solución de iodo. Agita.

2. Anota el color de la solución en la Tabla 1.

Tubo 3

1. Mezcla 1 mL de jugo de cebolla (tritura pequeños pedazos de cebolla en un mortero y añade agua) con 5 gotas de solución de iodo. Agita.

2. Anota el color de la solución en la Tabla 1.3.

Tubo 4

1. Mezcla 1 mL de jugo de papa (jugo de papa: tritura pequeños pedazos de papa en un mortero y añade agua) con 5 gotas de solución de iodo. Agita.

2. Anota el color de la solución en la Tabla 1.Tubo 5

1. Mezcla 1 mL de solución de glucosa y 5 gotas de solución de iodo. Agita la mezcla.2. Anota el color de la solución en la Tabla 1.

Preguntas:

De los resultados obtenidos, conteste las siguientes preguntas. Escriba su conclusión en la Tabla 1.

1. ¿Cuál de las soluciones es el control positivo? Explique su contestación.

2. ¿Cuál es el control negativo? Explique su contestación.

3. ¿Cuál tiene un color más intenso el jugo de papa o el jugo de cebolla? ¿Por qué?

Prueba para detectar azúcares:

*Precaución: El reactivo Benedict es un agente altamente corrosivo. Si la piel tiene contacto con el reactivo lava el área afectada con agua y jabón.

Azul (no reacciona)Polisacárido (carbohidrato)Almidón

Varía con las concentraciones – Ver “Glucosa”Disacáridos (carbohidrdatos)Maltosa

Varía con las concentraciones:Bien bajo (verde); Bajo (amarillo); Moderado (amarillo-anaranjado); Alto (anaranjado); Bien alto (anaranjado-rojo)

Monosacárido (carbohidratos)Glucosa

Azul (no cambia)InorgánicoAgua

Reacción Benedict después de CalentarCategoria del QuímicoQuímico

Tabla 2: Algunas reaciones típicas del Reactivo Benedict

*Precaución: El reactivo Benedict es un agente altamente corrosivo. Si la piel tiene contacto con el reactivo lava el área afectada con agua y jabón.

Azul (no reacciona)Polisacárido (carbohidrato)Almidón

Varía con las concentraciones – Ver “Glucosa”Disacáridos (carbohidrdatos)Maltosa

Varía con las concentraciones:Bien bajo (verde); Bajo (amarillo); Moderado (amarillo-anaranjado); Alto (anaranjado); Bien alto (anaranjado-rojo)

Monosacárido (carbohidratos)Glucosa

Azul (no cambia)InorgánicoAgua

Reacción Benedict después de CalentarCategoria del QuímicoQuímico

Tabla 2: Algunas reaciones típicas del Reactivo Benedict

1 mL solución de almidón

5

1 mL jugo de papa4

1 mL jugo de cebolla

3

1 mL solución de 1% glucosa

2

1 mL agua1

ConclusiónColor despuésde calentar

ContenidoTubo

Tabla 3: Prueba del Reactivo Benedict

1 mL solución de almidón

5

1 mL jugo de papa4

1 mL jugo de cebolla

3

1 mL solución de 1% glucosa

2

1 mL agua1

ConclusiónColor despuésde calentar

ContenidoTubo

Tabla 3: Prueba del Reactivo Benedict

1 54321 5432

Muchos de los monosacáridos (glucosa y fructosa) son agentes reductores, porque en su estructura molecular poseen grupos aldehídos (-CHO) o cetonas (-C=O) libres que reaccionan con agentes oxidantes débiles. Para detectar azúcares se utiliza el reactivo Benedict, el cual contiene un agente oxidante débil (cobre) que reacciona con las azúcares. Las azúcares reaccionan con el reactivo Benedict después de ser calentado en un baño de agua caliente, generando un cambio de la solución de color azul a verde, amarillo, anaranjado o rojo (ver Tabla 2).

Procedimiento Experimental:

Identifique 5 tubos de ensayos limpios.

Tubo 1

1. Mezcla 1 mL de agua y 7 gotas del Reactivo Benedict.2. Calienta en un baño de agua caliente de 5 a 10 minutos. Anota el color de la solución

en la Tabla 3.

Tubo 2

1. Mezcla 1 mL de solución de glucosa con 7 gotas de Reactivo Benedict.2. Calienta en un baño de agua caliente de 5 a 10 minutos. Anota el color de la solución

en la Tabla 3.

Tubo 3

1. Mezcla 1 mL de jugo de cebolla y 7 gotas del Reactivo Benedict.2. Calienta en un baño de agua caliente de 5 a 10 minutos. Anota el color de la solución

en la Tabla 3.

Tubo 4

1. Mezcla 1 mL de jugo de papa con 7 gotas del Reactivo Benedict.2. Calienta en un baño de agua caliente de 5 a 10 minutos. Anota el color de la solución

en la Tabla 3.3.

Tubo 5

1. Mezcla 1 mL de solución de almidón y 7 gotas del Reactivo Benedict.2. Calienta en un baño de agua caliente de 5 a 10 minutos. Anota el color de la solución

en la Tabla 3.

Preguntas:

De tus resultados, determina cuál de estas soluciones está compuesta por azúcares. ¿Cómo llegas a esta conlusión? Escribe tu conclusión en la Tabla 3.

1. ¿Cuál de las soluciones es el control positivo? Explique su contestación.

2. ¿Cuál es el control negativo? Explique su contestación.

3. ¿Cuál tiene más azúcares, el jugo de papa o el jugo de cebolla? ¿Cómo llegas a esta conclusión?

Compare los resultados de la Tabla 1 y la Tabla 3. En las células de las plantas la glucosa frecuentemente se almacena en forma de almidón

i) ¿La glucosa se almacena en forma de almidón en la papa?

ii) ¿La glucosa se almacena en forma de almidón en la cebolla?

iii) ¿Cómo estos hallazgos explican los resultados de la Tabla 3?

1 mL de agua + 270 µL de Nile Blue A

4

1 mL de solución B + 270 µL de Nile Blue A

3

1 mL de solución A + 270 µL de Nile Blue A

2

1 mL de solución lípida + 270 µL de Nile Blue A

1

Descripción de la reacciónSoluciónTubos

Tabla 4: Prueba para lípidos

1 mL de agua + 270 µL de Nile Blue A

4

1 mL de solución B + 270 µL de Nile Blue A

3

1 mL de solución A + 270 µL de Nile Blue A

2

1 mL de solución lípida + 270 µL de Nile Blue A

1

Descripción de la reacciónSoluciónTubos

Tabla 4: Prueba para lípidos

1 4321 432

Prueba detectar los Lípidos

Las pruebas para los lípidos están basadas en la habilidad de absorber pigmentos en forma selectiva. El Nile Blue A es un colorante soluble en grasas que genera un cambio de color en la solución de lípidos (de azul a violeta claro).

Procedimiento:

1. Identifique 4 tubos de ensayos limpios

2. Añade los materiales listados en la Tabla 4.3. Añade 250 µL de la solución Nile Blue A a los tubos 4. Mezcla el contenido de cada tubo. Anota el color en la Tabla 4.

Preguntas:

1. ¿Cuál de los tubos es el control positivo para la prueba de lípidos?

* Precaución: El reactivo de Biuret es un corrosivo. Tenga cuidado al utilizar estereactivo durante el experimento. Si tiene algún contacto en su piel, lave el área con jabón y agua. Siga las instrucciones del instructor para descartar la solución.

Violeta-RosaVioletaReactivo de Biuret (azul)

PéptidosProteínas

Tabla 5: Pruebas para detectar proteínas

* Precaución: El reactivo de Biuret es un corrosivo. Tenga cuidado al utilizar estereactivo durante el experimento. Si tiene algún contacto en su piel, lave el área con jabón y agua. Siga las instrucciones del instructor para descartar la solución.

Violeta-RosaVioletaReactivo de Biuret (azul)

PéptidosProteínas

Tabla 5: Pruebas para detectar proteínas

2. ¿Qué tipo de moléculas orgánicas están presentes en la solución l desconocida A y B? Explique su contestación.

3. Los lípidos proveen más del doble de calorías por gramo que los carbohidratos. Basado en sus resultados, ¿cuál solución tiene más calorias, el desconocido A o B? Explique su contestación.

Pruebas para detectar proteínas

El reactivo de Biuret es utilizado para detectar proteínas o péptidos debido a que es una solución que detecta los enlaces peptídicos. El reactivo de Biuret (azul) contiene una solución fuerte de hidróxido de sodio o potasio (NaOH o KOH) y pequeñas cantidades de solución de sulfato de cobre (CuSO4). Es el cobre (Cu+2) del reactivo de Biuret quien identifica los enlaces peptídicos de las proteínas produciendo un color violeta en la solución.

Procedimiento:

1. Identifica cuatro tubos de ensayo con los nombres listado en la Tabla 6. Añade a cada tubo el volumen determinado.

2. Añade a cada tubo 5 gotas del reactivo de Biuret. Mezcla la solución.3. Anota los colores en la Tabla 6.

2 mL de almidón4

2 mL de pepsina3

2 mL de albúmina2

2 mL de agua1

ColorSoluciónTubo

Tabla 6: Resultados de la prueba de Biuret

2 mL de almidón4

2 mL de pepsina3

2 mL de albúmina2

2 mL de agua1

ColorSoluciónTubo

Tabla 6: Resultados de la prueba de Biuret

1 4321 432

Preguntas:

1. ¿Cuál de las soluciones es el control positivo? Explique su contestación.

2. ¿Cuál es el control negativo? Explique su contestación.

3. ¿Cuál solución contiene más proteínas la albúmina o el almidón? Explique su contestación.

1 mL de solución lípida + agua4

1 mL de agua destilada + Sudan IV3

1 mL de miel + Sudan IV2

1 mL de solución lípida + Sudan IV1

Descripción de la reacciónSoluciónTubos

Tabla 4: Prueba para lípidos

1 mL de solución lípida + agua4

1 mL de agua destilada + Sudan IV3

1 mL de miel + Sudan IV2

1 mL de solución lípida + Sudan IV1

Descripción de la reacciónSoluciónTubos

Tabla 4: Prueba para lípidos

1 4321 432

4. Los amino ácidos libres tienen enlaces peptídicos?

Prueba detectar los Lípidos

Las pruebas para los lípidos están basadas en la habilidad de absorber pigmentos en forma selectiva. El Sudan IV es un colorante soluble en grasas que genera un cambio de color en la solución de lípidos (de azul a rojo-anaranjado).

Procedimiento:

1. Identifique 4 tubos de ensayos limpios

2. Añade los materiales listados en la Tabla 4.3. Añade 5 gotas de la solución Sudan IV a los tubos 4. Mezcla el contenido de cada tubo. Anota el color en la Tabla 4.

Preguntas:

1. ¿Cuál observación indica una prueba positiva para los lípidos?

2. ¿La solución lípida es soluble en agua?

3. ¿La miel contiene muchos lípidos?

4. Los lípidos proveen más del doble de calorías por gramo que los carbohidratos. Basado en sus resultados, ¿cuál solución tiene más calorias, la solución de aceite o la miel?

Referencias:

Audesirk T, Audesirk, G & Byers B.E. Capítulo 4: Moléculas biológicas. Biología: La vida en la Tierra. (8va ed.). Pearson Prentice Hall.

Campbell, Reece, Urry, Cain, Wasserman, Minorsky & Jackson. (2008) Chapter 4: Carbon and Molecular Diversity. Biology. 8va Ed. Pearson Benjamin Cummings, USA.

Raven, Johnson, Losos, Mason & Singer. (2008) Biology. 8va Ed. McGraw Hill, USA

Primera Clase Graduada de Microbiología en el 1990: