Ingeniera en Biotecnologa - Laboratorio de Cultivo de Tejidos

Prctica 4: PASAJE Y CONGELAMIENTO DE UNA LNEA CELULAR

Chantal Rodrguez Navarro A01064585 Mariana Bereber Castillo A01098097Miguel Ojeda Milln A01099203

Profesor: Dra. Hera Andrade Zaldvar

30 de septiembre del 2015

INTRODUCCINEn las prcticas de cultivo de tejidos se utilizan lneas celulares cuando se requiere trabajar con clulas animales. Una lnea celular se obtiene a partir de un cultivo primario, definiendo este como el cultivo empezado a partir de clulas tomadas directamente de rganos o tejidos de algn organismo. Sin embargo para conservar los cultivos celulares y mantener su viabilidad se recurre a diferentes tcnicas de laboratorio. Cuando un cultivo celular llega a un nivel de confluencia alto (85%-95%), es decir que est por llegar a su mxima capacidad de cubrimiento de superficie, es necesario realizar un pasaje celular debido a que el crecimiento celular se inhibe por contacto y las clulas empiezan a despegarse y morir. La tcnica del pasaje celular consiste en disgregar las clulas de las placas empleando algn mtodo mecnico, qumico y enzimtico, o combinacin de estos mtodos. En esta prctica se aborda el mtodo enzimtico el cual consiste en tratar el cultivo con una solucin de proteasas, como por ejemplo tripsina, elastasa, colagenasa, etc. para despegar las clulas de la placa de cultivo. Sin embargo es importante mencionar el fundamento de las otras tcnicas; el mtodo mecnico consiste en cribar los cultivos empleando algn instrumento para que de esta forma se despegan las clulas adheridas. Por ltimo se encuentra el mtodo qumico en el cual se aaden soluciones que reducen la concentracin de los iones que mantienen una estabilidad en las interacciones de las protenas de matriz celular con receptores celulares.Posteriormente se realizan diferentes lavados para eliminar la mayor cantidad de impurezas en el cultivo, ya sea metabolitos primarios, secundarios, clulas muertas y medio de cultivo restante. Y el ltimo paso consiste en realizar varios subcultivos en placas para que de esta manera las clulas pueden propagarse.Cuando se desea almacenar un cultivo por largos periodos de tiempo se recurre a la tcnica de crioconservacin, la cual se basa en la preservacin a temperaturas muy bajas, -80C en ultracongeladores y -180C en nitrgeno lquido, de esta forma las clulas se mantienen en animacin suspendida hasta que se requieran. Adems debe aadirse sustancias criopreservantes a las clulas, estas tienen la finalidad de reducir la cantidad de agua dentro de las clulas. Esto es importante ya que a temperaturas muy bajas el agua pasa a un estado slido cristalizado dentro de las membranas celulares, estos cristales pueden ocasionar el rompimiento de la membrana celular y en consecuencia se pierde la viabilidad. Los criopreservantes ms utilizados son el dimetilsulfxido (DMSO) y el glicerol.A continuacin se presenta informacin de diferentes lneas celulares y caractersticas especficas de cada una (Tabla 1):

Lnea celularM1WT3 (ATCC CRL-1985)

SW1116 [SW 1116, SW-1116] (ATCC CCL-233)

13762 MAT B III (ATCC CRL-1666)

ZEM2S (ATCC CRL-2147)

MDCK (ATCC CCL-34)

Imagen

OrganismoCricetulus griseus, hamster Chino Homo sapiens, humanRattus norvegicus, ratDanio rerio, pez cebra Canis familiaris

TejidoOvarioColon Glndula mamaria Embrionario epitelio de rin canino

Formato del productoCongeladoCongeladoCongeladoCongelado Congelado

Morfologa EpitelialEpitelialEpitelialFibroblasto Epitelial

Propiedades de cultivo AdherenteAdherenteSuspensin o leve adherencia AdherenteAdherente

Nivel de bioseguridad1 1111

EnfermedadNingunaCncer Adenocarcinoma No especificaNinguna

EdadNo especifica73 aosNo especifica Embrin, blstula Adulto

GneroHembraMacho No especificaNo especifica Hembra

Condiciones de almacenamientoNitrgeno lquido Nitrgeno lquido Nitrgeno lquido Nitrgeno lquido Nitrgeno lquido

Medio de cultivo Medio F12K adicionado con L-glutamina 2 mM, ajustado para obtener 1.5 g/L de bicarbonato de sodio, suplementado con 0.1 mg/ml de G418, 90%; suero fetal bovino, 10%Medio Leibovitz L-15 con suero fetal bovino a una concentracin final del 10%Medio McCoys 5a modificado adicionado con suero fetal bovino a una concentracin final de 10%50% medio L-15 de Leibovitz, 35% de medio de Eagle con alto contenido de glucosa, 15% de medio F12, complementado con 0,18 g / L de bicarbonato de sodio y SFB al 10% inactivado por calor

Medio esencial mnimo Eagle con 10% de SFB

Tabla 1. Caractersticas especficas de diversas lneas celulares

OBJETIVOAdquirir los conocimientos y destreza para realizar el pasaje y congelamiento de una lnea celular.

MATERIALES Y MTODOSTubos cnicos de 15 ml estriles Cmara de Neubauer Puntas de 1000l para micropipeta estriles -Micropipeta de 1000l Campana de flujo laminarIncubadora Centrfuga para tubos cnicosCamisas de centrfuga para tubos cnicos de 15ml Crioviales Caja rack contenedora para crioviales Pipetas estriles1 gradilla para tubos eppendorf Sustancias: Medio DMEM, Suero fetal bovino, DMSO, Antibiticos, PBS 1X libre de calcio y magnesio, Tripsina-EDTA 1X y Alcohol al 70 % + benzal al 05%Material biolgico: Frascos T75 con clulas MDCK con 70 95% de confluencia

PROTOCOLO EXPERIMENTALA. Pasaje Se revis que las clulas tuvieran la confluencia adecuada en el microscopio adecuado. En condiciones de esterilidad, dentro de la campana se comenz desechando el medio de cultivo de las cajas con ayuda de una pipeta. Una vez desechado se lav la monocapa con 2 ml de PBS y posteriormente se aadieron 2 ml de Tripsina-EDTA y se dej incubar durante 10 minutos a 37C 5% CO2, 95% humedad, con el fin de despegar las clulas. Una vez despegada la monocapa se agreg 2 ml de medio DMEM completo para inactivar la tripsina. Se resuspendieron las clulas para dividirlas 1:2 y fueron colocadas en 2 T-75 rotulados. Finalmente se complet cada T-75 con 10 ml de medio DMEM completo (10% FBS, 1X Antibiticos) y se metieron a la incubadora. A las 24 horas se revis su confluencia y se sometieron al proceso de congelamiento.

B. Congelamiento Se realiz el mismo procedimiento que para el pasaje, hasta el paso de dejar incubando durante 10 min con tripsina-EDTA para despegar las clulas. Posteriormente se resuspendieron las clulas en 5ml de medio DMEM completo y se pasaron a un tubo cnico estril de 15 ml para centrifugar a 2000 rpm/1.5min/25C. Dentro de la campana, se elimin el sobrenadante y se aadi 1 ml de medio DMEM en el tubo cnico con clulas, se homogeneizaron con ayuda de una pipeta y se tom una muestra de 10 ul. A la cual se le aadi 90 ul de PBS y 100 ul de azul de tripano, ya que se hizo un conteo de clulas viables utilizando la cmara de Neubauer. El tubo con el resto de las clulas, se dividi y se almacen en 2 crioviales previamente rotulados, a los cuales se les aadi suero para una concentracin final de 20% (200 ul), medio para un volumen de 950 ul, se resuspendi cuidadosamente y finalmente se agreg 50 ul de DMSO para una concentracin final de 5%. Finalmente, dentro de la campana se envolvieron los crioviales en toallitas absorbentes y se guardaron en una caja de unicel en el ultracongelador a -80C.

RESULTADOSe obtuvo un total de dos viales para conservar en el ultracongelador a -80C, cada vial tiene un volumen total aproximado de 1 mL. El contenido del primer vial proviene del cultivo de clulas MDCK ya existente. El contenido del segundo vial proviene del pasaje celular de dicho cultivo de clulas MDCK, se realiz el pasaje con xito y se dej cultivar por un dia en la incubadora a 5% CO2, 37C y 90% de humedad relativa. Una vez hecho esto se procedi a conservar este cultivo con el procedimiento ya descrito. Antes de crioconservar el primer cultivo se realiz un conteo celular de este para corroborar la viabilidad de clulas vivas que se encontraba en el cultivo, para esto se utiliz el colorante azul de tripano y se observ en el microscopio las clulas a las cuales no penetraba el colorante en su interior, ya que esto es una caracterstica de las clulas vivas. Contando las clulas vivas se realizaron los clculos siguientes para obtener el porcentaje de viabilidad:1. Conteo CelularNo. de clulasPromedioNmero de clulas/mLTotal de clulas clulas/mLTotal de clulas viablesclulas/mL

A: 65B: 5962155000310000310000

La prctica acab aqu, sin embargo para poder tener una certeza de que la conservacin se realiz adecuadamente es menester realizar el descongelamiento de estas y cultivarlas para corroborar que sobrevivieron. Acompaado de esta tcnica se puede hacer un conteo de viabilidad celular para obtener el porcentaje de clulas vivas.

DISCUSIN Antes de realizar la crio preservacin, es necesario identificar que las clulas deben cumplir con ciertos requerimientos como lo son: encontrarse en un estado sano, encontrarse en la fase de crecimiento exponencial y se debe asegurar que el cultivo no se encuentre contaminado. Teniendo las condiciones ptimas, se procede a realizar un lavado con PBS libre de Mg2+, con el fin de mantener las clulas en suspensin y se despegan por medio de la tripsina, su funcin bsica es la digestin de las protenas de adherencia. Se utiliza sola o combinada con otras enzimas o con agentes quelantes de calcio para potenciar su actividad. Esta enzima puede neutralizarse por competicin con las protenas del SFB. El mtodo de criopreservacin es delicado, ya que durante el proceso se pueden lesionar las clulas por lo que es importante seguir las medidas adecuadas para cada lnea celular. Un punto crtico para el adecuado congelamiento, es la velocidad con la que se enfran, si este proceso es ms lento que el flujo de salida de agua, las clulas tienden a deshidratarse y por el contrario si se realiza muy rpido, y las clulas no estn suficientemente deshidratadas resulta en la formacin de hielo intracelular. Las lneas celulares pueden congelarse de manera controlada o no controlada, la primera se logra programando los congeladores y su tasa de enfriamiento. Aunque es ms comn el mtodo no controlado, en el cual primero se enfran las clulas a 4 C, despus a -80 C y finalmente se almacenan en nitrgeno lquido, tal como lo hicimos en nuestra prctica. La diferencia de almacenarlos a -80 C o en N2, radica en el tiempo de conservacin debido a la baja temperatura que alcanza, en el congelador se conservan de 6 meses hasta 2 aos, mientras que en N2 lquido dura por ms aos.Otro factor muy importante es el uso de crioprotectores, para prevenir la formacin de hielo, eliminar elevadas concentraciones de sales, reducir el encogimiento celular y reducir la fraccin de la solucin congelada a determinada temperatura, adems deben ser removidos fcilmente posterior al descongelamiento. En general el ms utilizado es DMSO al 10% en suero, sin embargo para el uso de estudios clnicos, se ha demostrado que es considerablemente txico, por los que se ha experimentado con otros agentes crioprotectores como el glicerol, ya que no es txico an en altas concentraciones, adems de disminuir la desnaturalizacin de las protenas a bajas temperaturas o la trehalosa, la cual tiene interaccin con los lpidos y protenas de la membrana, previniendo la deshidratacin. Sin embargo, el ms utilizado es el DMSO porque es el que penetra las clulas rpidamente, para reducir su toxicidad y potenciar la recuperacin de las clulas, se ha determinado que la mejor opcin es una solucin 4% DMSO + 6% trehalosa + 90% SFB para clulas madre de tejido adiposo por ejemplo, la concentracin vara de acuerdo a la lnea celular, en nuestro caso se utiliz nicamente DMSO al 5%. Por otra parte, se utiliza una elevada concentracin de SFB para el congelamiento de clulas para nutrir las clulas y proporcionarles un medio adecuado, adems de que los carbohidratos juegan un rol de proteccin durante el congelamiento, disminuyen los efectos secundarios del DMSO y preservar la funcin biolgica de las clulas. Para nuestra lnea celular se utiliz una concentracin de 20% SFB.

CONCLUSINLas prcticas de laboratorio realizadas son ejercicios que se llevan a cabo a menudo en los laboratorios de cultivos celulares, estas prcticas tienen su complejidad ya que se estn manipulando organismos vivos por lo cual se tiene que mantener parmetros de esterilidad para que no se contamine por ningn tipo de microorganismo el cultivo, ya que de ser as todo este se perderia; tambin se debe realizar la prctica lo ms rpido posible ya que las clulas al estar fuera de su ambiente idneo pueden morir causando as una disminucin de la viabilidad del cultivo. Para corroborar que se han realizado con xito las prcticas, en el caso del pasaje celular solo basta con esperar a que el cultivo crezca de forma normal, con las caractersticas especficas de la lnea que se trabaja y en el caso de la crioconservacin se realiz un conteo previo de clulas, de esta forma cuando se descongele el vial con las clulas ya se tendrn parmetros establecidos para el nuevo cultivo, aunque el proceso de descongelamiento puede ser un factor que afecte la calidad del cultivo.Estas prcticas presentan cierta complejidad y reto en un principio, ya que se manejan varios reactivos, la esterilidad es fundamental y todo proceso debe hacerse con sumo cuidado, sin embargo al realizar varias veces pasajes y congelamientos celulares estos se van tornando en procesos sencillos

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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