ESTUDIO SOBRE UN NUEVO PROCESO RESPIRATORIO EN CONEJOS

Joan P l a n a i D u r a n . - D t o r . G e n e r a l T é c n i c o Josep B a s s o l s i M a 1 L a r a c h . - D. R e l a c i o n e s T é c n i c a s M. V a y r e d a i C a s a d e v a l l , T . P e y , M. B a s t o n s , M.A. B a - 1eri.- Dp. de Invest igación

LABORATORIOS SOBRINO, S. A. V a l 1 de B i a n y a ( G i r o n a )

1.- SUMARIO - La ponencia que presentamos, e s e l i n i c i o de una se- r i e de t r a b a j o s encaminados a ave r iguar , c u a l es e l agente c a u s a l de este nuevo proceso r e s p i r a t o r i o en conejos, e l c u a l t i e n e a expansionarse cada vez mas en n u e s t r a c u n i c u l t u r a i n d u s t r i a l .

Las conclus iones , a l a s que podemos l l e g a r con e s t a ponencia no son d e l todo s a t i s f a c t o r i a s p a r a noso- t r o s , ya que hub ie ras ido p r e c i s o d isponer de más t i em por p a r a acl*ar n u e s t r a s confusas ideas . No o b s t a n t e estamos t r aba jando en e l tema p a r a decantarnos h a c i a una de l a s dos preguntas que debemos formularnos.

¿Se t r a t a de una mutación d e l v i r u s de Mixomatosis, con un tropismo r e s p i r a t o r i o ? o b ien ¿Es en r e a l i d a d un nuevo v i r u s e l que a f e c t a a n u e s t r a c u n i c u l t u r a ? .

11. - INTRODUCCION

Desde e l año 1979 hemos t e n i d o ocas ión de i n t e r v e n i r en a lgunas exp lo tac iones c u n í c o l a s cuyos animales es- taban a fec tados de un f u e r t e c o r i z a contagioso , con l e s i o n e s en o j o s , n a r i z , c a r a , o r e j a s y g e n i t a l e s , s i endo i n t e r p r e t a d o s e s t o s s intomas como prop ios de una Mixomatosis, t a n t o por l o s p rop ios c u n i c u l t o r e s como por l o s e s p e c i a l i s t a s que habian v i s t o l o s a n i - males a fec tados .

A l no p r e s e n t a r c laramente l o s nódulos t í p i c o s de l a Mixomatosis, y a l f r a c a s a r l a vacunación f r e n t e a es t a enfermedad, empezamos a i n v e s t i g a r o t r a s p o s i b l e s causas de l a misma.

Sobre un t o t a l de 20 exp lo tac iones (Cataluña, Aragón y Valencia) con s h t o m a s de éste proceso r e s p i r a t o - r i o , noso t ros en un 90% de l o s c a s o s hemos a i s l a d o v i r u s a p a r t i r de macerados de pulmones y nódulos se cutaneos, a s í como i d e n t i f i c a d o d i f e r e n t e s gérmenes, s iendo l o s más impor tantes l a s P a s t e u r e l l a s Y Borde- t e l l a s ; y apareciendo en menor proporci6n, S taph i lo - cocos, S t reptococos , Pseudomonas, a s l como Pro teus

y gérmenes d e l t i p o Col i .

D e e s t a s g ran jas , 4 ( e l 20%) habían s i d o vacunadas de Mixomatosis con vacuna homóloga; 6 ( e l 30%) con vacuna he te ró loga , y l a s 10 r e s t a n t e s (e l 50%) no es- taban vacunadas de Mixomatosis.

111.- - MATERIAL Y METODOS

Experimento nol : Observación c l í n i c a - exámen macros- - tópico de l o s animales procedentes de d i f e r e n t e s gran j a s con d icho proceso r e s p i r a t o r i o .

Experimento no2: Aislamiento de l o s v i r u s . - Los a i s - lamientos de l o s v i r u s en c u e s t i ó n s e r e a l i z ó a par- - t i r de un macerado d e l t e j i d o pulmonar a fec tado , y de l o s nódulos subcutdneos de l a c a r a , o r e j a s , e t c . , a l c u a l s e l e añadió una asoc iac ión de a n t i b i ó t i c o s a base de P e n i c i l i n a , Kanamicina y Es t reptomicina , f i l - t rándose con f i l t r o s adecuados. Comprobada s u esteri- l i d a d , s e r e a l i z ó l a in fecc ión sobre l a s l l n e a s ce lu- l a r e s : SIRC (córnea d e l conejo) y RK13 ( r iñón de con$ j o ) , a s í como i n f e c c i o n e s exper imenta les en conejos .

Experimento no3: A p a r t i r de l o s v i r u s a i s l a d o s , a s í como con e l v i r u s de S a n a r e l l i campo, con cepa homó- loga vacuna1 y con v i r u s fibroma de Shope, obtuvimos un s tock de l o s mencionados v i r u s sobre l a l í n e a ce- l u l a r RK13 pa ra d isponer de m a t e r i a l a n t i g é n i c o ade- cuado. Las t i t u l a c i o n e s se r e a l i z a r o n en p l a c a s de M& c r o t i t e r con l a s t g c n i c a s clZisicas empleadas en v i ro - l o g í a .

Experimento no4: A l p r e s e n t a r e l proceso a e s t u d i a r , - una s in tomato log la pa rec ida a l a Mixomatosis y a l com p l e j o r e s p i r a t o r i o , rea l izamos una serie de experimeg t o s en conejos de raza Neozelandesa, y edad aproxima- da 2 meses, l o s c u a l e s e r a n s e n s i b l e s a i n f e c c i ó n ex- per imenta l con e l v i r u s S a n a r e l l i , P a s t e u r e l l a multo- c i d a y B o r d e t e l l a b ronch i sep t i ca .

LOTE A: 10 conejos , que nos s i r v e n como t e s t i g o s de i n f e c c i ó n de l o s v i r u s problema. Vía de i n - fecc ión: I n t r a p a r p e b r a l

LOTE B: 10 conejos vacunados de Mixomatosis con vac2 na he te ró loga (Fibroma de Shope) por v i a sub cutánea. La i n f e c c i ó n por v í a i n t r a p a r p e b r a l con e l v i r u s problema se r e a l i z ó a l o s 15 d í a s post-vacunación.

LOTE C: 1 0 conejos vacunados f r e n t e a l complejo res- p i r a t o r i o (Vacuna i n a c t i v a d a , con e x c i p i e n t e o leoso , a base de P a s t e u r e l l a multocida y Bor d e t e l l a b r o n c h i s e p t i c a ) . La i n f e c c i á n con e l v i r u s problema, se r e a l i z ó a l o s 15 d l a s p o s t vacunación por v i a i n t r a p a r p e b r a l .

Experimento nQ5: Sobre l o s d i f e r e n t e s v i r u s a i s l a d o s ae este proceso r e s p i r a t o r i o , t rabajamos con t r e s de e l l o s cuyas r e f e r e n c i a s son: G, C y D I comprobSndolos con una cepa de campo d e l v i r u s S a n a r e l l i ; con l a ce- pa Fibroma de Shope; y con cepa homóloga vacuna1 de Mixomatosis.

Los parametros e s tud iados fueron l o s s i g u i e n t e s :

a )Propagación d e l v i r u s sobre c u l t i v o s c e l u l a r e s . b )T inc iones r e a l i z a d o s sobre c u l t i v o s c e l u l a r e s . c)Determinación d e l tamaño. d) Efec to d e l c a l o r . e ) T e s t de s e n s i b i l i d a d a s o l v e n t e s orgSnicos. f) Reacciones de s e r o n e u t r a l i z a c i ó n . g)Capacidad hemoaglutinante d e l v i r u s .

I V . - RESULTADOS - Resultados experimento nQl : Los reproductores a f e c t a - - dos p resen tan un f u e r t e c o r i z a contagioso , con exuda- c i ó n puru len ta en f o s a s n a s a l e s y con jun t iva o c u l a r , as4 como nódulos m6s o menos edematosos en l a c a r a , o r e j a s y g e n i t a l e s . Todo e l l o acompañado de una insu- f i c i e n c i a r e s p i r a t o r i a .

En l o s animales de engorde que padecen este proceso predominan l a s c o n j u n t i v i t i s p u r u l e n t a s sobre l a s le- s i o n e s propiamente r e s p i r a t o r i a s .

En l a nec rops ia observamos una f u e r t e conges t i6n de

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l a s v í a s r e s p i r a t o r i a s a l t a s y un p r o c e s o neumónico m a s o menos g r a v e según l o s c a s o s , ( t a n t o en r ep roduc t o r e s como an ima le s de e n g o r d e ) .

En un p o r c e n t a j e muy e l e v a d o de pulmones examinados observamos hemorrag ias pun t i fo rmes , m i e n t r a s que e n o t r o s hay i n t e n s a s zonas hemorrág icas .

En l o s demás órganos d e l an imal , no hay l e s i o n e s ma- c r o s c ó p i c a s e v i d e n t e s ( f o t o g r a f i a no1 y 2 ) .

Resu l t ados exper imento no2: E l p r i m e r v i r u s a i s l a d o -- Dar n o s o t r o s , f u e e l que denominamos como r e f e r e n c i a k , cuyo comp&tamient6 s o b r e c u l t i v o s c e l u l a r e s y a n i males de expe r imen tac ión f u e e l s i g u i e n t e :

A l o s 6 d í a s p o s t - i n f e c c i ó n de l a l í n e a c e l u l a r SIRC, observamos l a formación de p l a c a s v i s i b l e s macroscop& camente, l a s c u a l e s aumentaron e n número p o r un f ac - t o r d e m u l t i p l i c a c i ó n 10, a l o s 9 d í a s p o s t - i n f e c c i ó n de l o s t a p i c e s c e l u l a r e s . No se obse rvó e n l o s d í a s s i g u i e n t e s un incremento d e l número de p l a c a s , n i d e l e f e c t o c i t o p á t i c o en c u l t i v o c e l u l a r .

Con e l sob renadan te d e c u l t i v o s i n f e c t a d o s ( 9 d í a s p o s t - i n f e c c i ó n ) , se i n o c u l a n cone jos p o r v í a i n t r a n a - s a l , i n t r a p a r p e b r a l e i n t r a d é r m i c a ( e s p a l d a ) . A l o s 7 d í a s p o s t - i n f e c c i ó n , l o s an imales ( 1 0 p o r cada v í a ) muestran una i n a p e t e n c i a muy marcada, p r e s e n t a n i n d i ~ t i n t a m e n t e c o n j u n t i v i t i s , n a r i z con mucosidades, i n - s u f i c i e n c i a r e s p i r a t o r i a y t empera tu ra que van de 40oC a 42QC. En a lgunos cone jos no observamos mucosidades en l a n a r i z .

Todos l o s an imales i nocu lados exper imenta lmente mue- r e n e n t r e 9 y 12 d í a s p o s t - i n f e c c i ó n .

En l a s n e c r o p s i a s , observamos m a c r o s c o ~ i c a m e n t e unas hemorrag ias pun t i fo rmes en pulmón, en mayor o menor - i n t e n s i d a d , i n d e p e n d i e n t e de l a v í a de i n f e c c i ó n . En a lguno de e s t o s an ima le s apa recen hemorrag ias e n t r a - quea y p e r i c a r d i o ( D i a p o s i t i v a s d e an ima le s i n f e c t a - dos exper imenta lmente , a s í como de l a s n e c r o p s i a s re2 l i z a d a s ) .

~ e s u l t a d o s esperimento n s : Los t í t u l o s sobre c u l t i - vos de t e j i d o s de l o s d i f e r e n t e s v i r u s fueron l o s s i g u i e n t e s :

~ a ) Virus S a n a r e l l i campo 1 0 5 ~ 8 ~ 1 ~ ~ 5 0 / m l .

b ) Virus homólogo cepa vacuna1 1 0 6 . 6 ~ I C T ~ ~ / m l .

c ) Virus Shope l o 4 . 8 ~ 1 ~ ~ 5 0 / m l .

d ) Virus G l o 6 . ' D I C T , , / ~ ~ .

e ) Virus c 1 0 5 ~ 0 5 ~ 1 ~ ~ 5 0 / m l

f ) Virus D ~ O ~ ~ ~ D I C T ~ ~ / ~ ~ .

Resultados experimento no4: ---- LOTE A: A l o s 6 d i a s pos t - in fecc ión con l o s v i r u s p r o

blema l o s animales presentaban una f u e r t e ge- n e r a l i z a c i ó n d e l proceso r e s p i r a t o r i o con l a s in tomatologia ya d e s c r i t a anter iormente .

En e l exámen macroscópico d e l pulmón, se obseg varon g a s hemorragias puntiformes circula- res d e s c r i t a s anter iormente (Fotograf f a no3) -

LOTE B: A l o s 6 d í a s pos t - infección, empieza a mani- f e s t a r s e l a s in tomato log ia c l í n i c a t í p i c a , con l e s i o n e s hemorrágicas en pulmón.

LOTE C: A l o s 9 d í a s pos t - in fecc ión l o s 10 conejos no p resen tan síntoma alguno, desencadenándose e l proceso a p a r t i r de l o s 13 a 16 d í a s pos t - iq fecc ión, con l a s in tomato log ía t í p i c a de l o s casos a n t e r i o r e s .

En l o s animales vacunados de Mixomatosis ( l o t e B) y l o s vacunados con complejo r e s p i r a t o r i o ( l o t e C) pero no i n f e c t a d o s , no s e observan 1s s i o n e s macroscópicas a n i v e l de pulmón.

Resultados experimento no5 : a ) Propagación d e l v i r u s - sobre c u l t i v o s c e l u l a r e s . - A p a r t i r d e l primer pase d e l v i r u s G, sobre l a l í n e a c e l u l a r SIRC, rea l izamos un segundo pase , sobre l a misma, y un primer pase so-

bre l a l í n e a RK13, a l o s 6 d í a s pos t - in fecc ión empe- zamos a obse rva r p l a c a s s iendo e l número de e l l a s m2 yor sobre l a l l n e a c e l u l a r RK13 que sobre l a l í n e a c e l u l a r SIRC. En l o s pases suces ivos l a capacidad de formación de p l a c a s desapareció espontaneamente, ob- servando un c a r a c t e r í s t i c o e f e c t o c i t o p á t i c o i d é n t i c o a l o s demás v i r u s a i s l a d o s , a s í como con e l v i r u s M i - xomatosis campo y cepa homóloga vacunal ( F o t o g r a f í a no4) (Diapos i t ivas de p l a c a s en c u l t i v o de t e j i d o s ) .

b)En l o s exámenes de l a s d i f e r e n t e s p reparac iones in - f ec tadas ( r e f . G , C , D) comparándolas con l a cepa Sa- n a r e l l i campo y l a cepa homóloga vacunal , observamos una completa i d e n t i d a d (Mixomatosis por L. J o u b e r t ) , r e spec to a l t i p o de a l t e r a c i o n e s producidas en l a s c é l u l a s ( e f e c t o c i t o p á t i c o ) a s í como l a s i n c l u s i o n e s t í p i c a s en e l c i toplasma.

c ) Determinación d e l tamaño de v i r u s . - En l a s pruebas r e a l i z a d a s , vemos que todos l o s v i r u s ensayados pasan a t r a v e s de l o s f i l t r o s de 0,45 micras de tamaño de poro, mien t ras que por e l tamaño de poro de 0,22 m i - tras quedan r e t e n i d o s l o s v i r u s S a n a r e l l i campo y ce- pa vacunal homóloga de Mixomatosis, pasando l o s v i r u s problema. Es tos ú l t imos quedan r e t e n i d o s en f i l t r o s de tamaño de poro 0,15 micras.

d ) Efecto d e l c a l o r . - E l ca lentamiento d e l v i r u s en baño maría a temperatura de 56oC, durante un pe r íodo de 1 hora l o i n a c t i v a completamente.

e ) Tes t de s e n s i b i l i d a d a l o s s o l v e n t e s orgánicos ( é t e r y c loroformo) . - Sens ib le a l é t e r e i n a c t i v a c i ó n t o t a l por e l cloroformo.

f ) Reacciones de seroneutra1izaciÓn.- Se han r e a l i z a - do pruebas de s e r o n e u t r a l i z a c i ó n cruzada no pudiéndo- se l l e g a r a ninguna conclus ión debido a l a f a l t a de uniformidad en l a obtención de sue ros .

g ) Capacidad hemoaglutinante d e l v i r u s . - Se comproba- ron l o s v i r u s r e f . : G , D, C S a n a r e l l i campo, cepa ho- móloga vacunal de Mixomatosis y v i r u s Fibroma de Sho- pe, no observándose hemoaglutinación p o s i t i v a f r e n t e

a g lóbulos r o j o s de p o l l i t o s de 3 semanas. Las técni- c a s de hemoaglutinación fueron l a s c l 5 s i c a s de hemog g l u t i n a c i ó n ráp ida en p l a c a y hemoaglutinación l e n t a en microplacas, a d i f e r e n t e s tempera turas de incuba- c ión ( 4 o C 16H, 22QC 2H y 37oC 2H).

DISCUSION

1.- Después de todos l o s exámenes c l í n i c o s a n i v e l de campo, a s i como l a s in fecc iones exper imenta les r e a l i z a d a s en e l l a b o r a t o r i o con l a s d i f e r e n t e s v i r u s a i s l a d o s , creemos que estamos a n t e un nuevo proceso r e s p i r a t o r i o en conejos de e t i o l o g í a v í r i c a , con com- p l i c a c i o n e s de agentes secundar ios (Borde te l l a , Pas- t e u r e l l a , Es taphi lococos , e t c ) .

2.- En todos l o s casos e l a i s l amien to d e l agente e t i g l ó g i c o sobre l a l í n e a c e l u l a r RK13, a s í como l a i n - f ecc ión exper imenta l en conejos ha s i d o s a t i s f a c t o - r i a . E l r e a i s l a m i e n t o de v i r u s en animales i n f e c t a d o s experimentalmente ha r e s u l t a d o s e r favorable .

3 . - En l a s i n f e c c i o n e s exper imenta les por d i f e r e n t e s v í a s de inocu lac ión (Intraparpebral-Intranasal e In- t radérmica) s e ha conseguido reproduc i r l a enfermedad Y en l a nec rops ia hemos observado l a a p a r i c i ó n de he- morragias p u n t i f o r ~ s y c i r c u l a 3 en pulmón. -

4 . - Tanto l o s animales no vacunados, como l o s vacuna- dos de Mixomatosis con vacuna he te ró loga (Fibroma de Shope), son s e n s i b l e s a l a in fecc ión exper imenta l con l o s v i r u s problema. En animales vacunados f r e n t e a l complejo r e s p i r a t o r i o (vacuna B o r d e t e l l a - P a s t e u r e l l a i n a c t i v a d a con adyu- vante o leoso) p a r e c a i s e r más r e s i s t e n t e a l a i n f e c - c ión espe r imen ta l , l o que se confirma en l a s pruebas de campo a n t e una i n f e c c i ó n n a t u r a l .

5.- E l e f e c t o c i t o p á t i c o de l o s v i r u s problema sobre l a l í n e a c e l u l a r RK13, ha s i d o i d é n t i c o a l observado con e l v i r u s S a n a r e l l i campo y l a cepa homóloga de Mixomatosis.

6.- En cuanto a l tamaño d e l v i r u s , según l a s pruebas

r e a l i z a d a s en e l l a b o r a t o r i o e s i n f e r i o r a l v i r u s S a n a r e l l i campo y a l a cepa homóloga vacuna1 de M i - xomatosis . Esto parece confirmarse por e s t u d i o s r e a l i z a d o s en microscopia e l e c t r ó n i c a .

7.- Todos l o s v i r u s se i n a c t i v a n a 56QC duran te 1 H .

8.- Con l a s pruebas r e a l i z a d a s con s o l v e n t e orgsni - cos, s e demuestra que es un v i r u s con envue l t a l i p i - d i c a .

9.- Virus no hemoaglutinante f r e n t e a g lóbulos r o j o s de p o l l o .

10.- Diagnóst ico c l í n i c o d i f e r e n c i a l : Es te proceso l o debemos d i s t i n g u i r de l a s s i g u i e n t e s enfermedades.

Mixomatosis:Los sintomas son pa rec idos , no o b s t a n t e podemos d i f e r e n c i a r l o , o b ien sospechar de uno u o t r o proceso, a l p a l p a r l o s nódulos de l a s o r e j a s , que en e l caso de l a Mixomatosis son e s f é r i c o s y b ien d e l i - mitados y en e s t e o t r o proceso son como i n t e n s a s zo- nas edematosas.

Complejo r e s p i r a t o r i o : En l a s a fecc iones r e s p i r a t o - r i a s no s e observan nódulos en o r e j a s , s ó l o exuda- c iones muco-purulentas en o j o s y f o s a s n a s a l e s , y en caso de p r e s e n t a r s e a lgún abceso, a l p r e s i o n a r s a l d r á pus.

Estreptococias-Estaphilococias: Procesos i n f e c c i o s o s b a c t e r i a n o s producidos por Es t reptococos o E s t a p h i l g cocos. Suelen p roduc i r abcesos puru len tos en e l o j o , en gazapos i n c l u s o a n t e s d e l d e s t e t e ; o b ien abcesos en d i f e r e n t e s p a r t e s d e l organismo. No obs tan te , aunque é s t o s s íntomas nos puedan s e r v i r de o r i e n t a c i ó n , ha rá f a l t a un d iagnós t i co de Labora- t o r i o p a r a p r e c i s a r e l agente c a u s a l .

11.- Tratamiento y P r o f i l a x i s : S i b i e n no podemos ha- b l a r todav la de un t r a t a m i e n t o o de una P r o f i l a x i s concre ta , s i que podemos, basados e n . l a e x p e r i e n c i a de l o s casos en l o s c u a l e s hemos i n t e r v e n i d o , d i c t a r unas normas genera les de ac tuac ión a l p r e s e n t a r s e

este proceso. Aparte de r e a l i z a r un c o r r e c t o d iagnós t i co , debemos i n c l i n a r n u e s t r a a t enc ión en l o s s i g u i e n t e s puntos:

- Eliminacien de l o s animales afec tados: Dada l a con t a g i o s i d a d d e l agente en cues t ión que, según pa rece , se t r a n s m i t e por con tac to de animal enfermo a animal sano, deberemos e j e r c e r una f u e r t e v i g i l a n c i a de to - do e l e f e c t i v o a f i n de poder e l i m i n a r todos l o s a n i males que aparezcan con síntomas.

- Desinfecciones: Una vez e l iminados l o s animales en fermos debemos l i m p i a r y d e s i n f e c t a r convenientemen- t e l a s j a u l a s y demás u t e n s i l i o s que hayan e s t a d o en c o n t a c t o con e l l o s . A s u vez, procuraremos l i m p i a r y d e s i n f e c t a r b ien n u e s t r a s manos p a r a que no sean vehfculo de i n f e c c i ó n p a r a l o s conejos sanos.

- Vacunación: Dada l a mayor r e s i s t e n c i a a l a en fe r - medad, demostrada en e l Labora to r io y en e l campo, de l o s animales vacunados a base de P a s t e u r e l l a mul- t o c i d a y B o r d e t e l l a b r o c h i s e p t i c a , con e x c i p i e n t e o leoso , s e procederá a vacunar todo e l e f e c t i v o , t a n t o reproductores como gazapos de engorde, y l o s que se vayan des te tando se vacunarán en e l mismo momento d e l d e s t e t e . Para e v i t a r e l p o s i b l e p e l i g r o de contagio por l a agu j a de inocu lac ión , y en g r a n j a s a f e c t a d a s s e r á reco- mendable u t i l i z a r una aguja d i f e r e n t e pa ra cada ani - mal y, a l o sumo, en e l engorde, una p a r a cada jaula, camada o grupo poco numeroso.

- Otros t r a t amien tos : Con e l f i n de coadyuvar en l a lucha c o n t r a l o s agentes b a c t e r i a n o s secundar ios pug den a d m i n i s t r a r s e a n t i b i 6 t i c o s como l a Er i t romic ina , Kitasamicina, T e t r a c i c l i n a , e t c . , a s í como choques v i t amín icos . A l s e g u i r con r i g o r e s t a s pau tas genera- les de ac tuación, hemos conseguido buenos r e s u l t a d o s en l o r e f e r e n t e a l a e r r a d i c a c i ó n de éste proceso v í - r i c o en l a s exp lo tac iones a f e c t a d a s .

Fot. no2.- Lesiones macroscópicas observadas en pulmones procedentes de animales repro- duc to res con s in tomato log ía r e s p i r a t o r i a

Fot . no3.- Hemorragias puntiformes y c i r c u l a r e s tí- p i c a s , en pulmón.

Fot . no4.- E f e c t o c i t o p a t i c o que producen l o s v i r u s a i s l a d o s s o b r e l a l i n e a c e l u l a r RK13