laboratorio de investigación de proteínas vegetales departamento de ciencias biológicas facultad...
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Laboratoriode Investigación de Proteínas Vegetales
Departamento de Ciencias Biológicas
Facultad de Ciencias ExactasUniversidad Nacional de La Plata
Calles 47 y 115, 1900 La PlataTel.: (0221) 423 0121 int. 57
Utilización de fitoproteasas sobre proteínas lácteas
Lazza, Cristian Martín; Pardo, Marcelo Fabián; Bruno, Mariela Anahí, Errasti, María Eugenia, Caffini, Néstor
Oscar
Direcciones electró[email protected] (Marcelo Pardo)[email protected] (Cristian M. Lazza)
Desde su constitución en 1992, el LIProVe ha adquirido gran experiencia en el estudio de fitoproteasas, convirtiéndose en el principal grupo de investigación del país dedicado al tema. Se han aislado y caracterizado ya treinta fitoproteasas, logrando establecer la secuencia de algunas de ellas mediante secuenciamiento directo (Edman) o a partir del cDNA.
Dado que en algunos casos la producción de proteasas es escasa, también se han desarrollado técnicas de cultivo in vitro para la producción de proteasas, así como de clonado y expresión de las mismas en levaduras.
Las aplicaciones biotecnológicas de las nuevas enzimas comenzaron a desarrollarse casi simultáneamente con el aislamiento de éstas, en campos tales como la tecnología de alimentos, la industria del cuero y la síntesis en medio orgánico.
El presente proyecto de investigación contempla el empleo de fitoproteasas aisladas en el LIPROVE en el tratamiento de proteínas lácteas bovinas
Aplicaciones de las proteasasTiernización de carnesElaboración de cerveza
Elaboración de quesos
Panificación
Proteínas modificadas para la industria alimentaria
Detergentes
Manufactura de cueros
Industria textil
Industria farmacéutica
Tratamiento de efluentes industriales
ACTIVIDADES DESARROLLADAS EN EL
LIPROVE Aislamiento, Purificación y
Caracterización de Fitoproteasas
Aplicación de Fitoproteasas en: Tecnología de Alimentos
Industria del CueroSíntesis de Péptidos en Medio
OrgánicoTratamiento de Efluentes Industriales
Vinculación con el Sector Productivo en: Desarrollo de Procesos de Purificación de Proteasas
1. Determinación del poder coagulante y seguimiento de los productos de hidrólisis en el proceso de formación de quesos
2. Hidrólisis de las proteínas del suero para aprovechar desechos industriales
3. Obtención de péptidos bioactivos a partir de las fracciones caseínicas y de proteínas del lactosuero
Separación Isoeléctrica a pH
4.5Leche en polvo descremada.
(redisolución en AD a 11% p/v) o leche fluída, pH
6,6
Suero, pH 6.6
PrecipitadoLavado y
redisol. en BP 0.1 M
Sobrenadan- te:
Procesamien-to del suero
Filtración y Centrifugación
Centrifugación. Pellet + 200 µl Buffer Muestra para ELF 5 min de ebullición
ESQUEMA GENERAL DE TRABAJO
Ensayos de coagulación
Ensayos de Hidrólisis con distintas proteasas
Hidrólisis: 450 µl muestra + 50 µl enzima, a diferentes Temperaturas y tiempos.
Reacción detenida por 500 µl of 5% TCA.
SDS-Tricine – Gel Electrophoresis. Densitogramas por gel scanning. Procesamiento de
datos.
Análisis de péptidos por HPLC
Manufactura de quesos
Caseína 1% P/V en BP 0.1 M
pH 6,6
Determinación del poder coagulante y seguimiento de los productos de hidrólisis en el proceso de formación de quesos
El cuajo bovino es por excelencia el más apto para coagular la leche, aunque se han ensayado varios tipos de proteasas vegetales, animales y fúngicas como sustituyentes parciales o totales del mismo.
En esta parte del trabajo se intenta establecer cuáles son las proteasas vegetales con la mejor relación coagulación-proteólisis. El tiempo de coagulación se determina por observación directa en tubo, los resultados obtenidos se comparan con los del cuajo bovino comercial (quimosina) y posteriormente se realiza el análisis electroforético (TRICINA-SDS-PAGE) de muestras de miniquesos durante el proceso de maduración.
Queso tipo Holanda utilizando Onopordosina como coagulante
A B
Las muestras de miniquesos se dejan madurar por 21 dias y luego se analizan.
Miniquesos= A: utilizando quimosina como coagulante
B: utilizando hieronimaina como coagulante.
C: Densitograma correspondientes a la coagulación de leche de vaca por onopordaina D: Degradación parcial de las fracciones alfa y beta durante la coagulación de leche de cabra utilizando quimosina (-Q y -Q ) u onopordaina (-O y -O) como enzimas coagulantes. 0
10
20
30
60
90
Distancia relativa
Inte
nsi
dad
de
ban
da
0 510 20
3060
90
70
75
80
85
90
95
100
Tiempo, min
-Q
-Q
-O
-OA
rea
rela
tiva
d
e p
ico
C
D
Hidrólisis de las proteínas del suero para aprovechar desechos industriales
En la elaboración del queso se produce suero como subproducto, que es rico en proteínas de elevado valor nutritivo. Respecto a la actividad proteolítica de las fitoproteasas sobre suero del queso, se realizaron ensayos con las distintas enzimas a fin de evaluar su capacidad de proteólisis sobre los sueros de los quesos obtenidos y mediante análisis electroforético se determinaron los perfiles proteicos correspondientes.
Comparación por SDS-tricine-PAGE de las distintas fracciones obtenidas por procesamiento de la leche: 1 = patrón de PM, 2 = leche, 3 = suero, 4 = ß-lactoglobulina, 5 = caseínas, 6 = ß-caseína.
1 2 3 4 5 6
Densitogramas de las fracciones obtenidas por coagulación de la leche con balanseína: 1 = Lactoferrina, 2 = Seroalbúmina bovina, 3 = Inmunoglobulinas, 4 = s2 -caseína, 5 = s1 -caseína, 6 = ß-caseína, 7 = ß-lactoglobulina, 8 = - Lactalbúmina
Densitogramas correspondientes a la hidrólisis de ß-lactoglobulina
Obtención de péptidos bioactivos a partir de las fracciones caseínicas y de proteínas del lactosuero
Las proteínas lácteas son conocidas por tener importantes propiedades nutricionales, funcionales y biológicas. Son ingredientes importantes en alimentos funcionales promotores de la salud. Estas propiedades son parcialmente atribuidas a los péptidos bioactivos presentes en la estructura de las proteínas.
Estos péptidos son inactivos dentro de la secuencia de la proteína intacta, y pueden ser liberados por la acción de diferentes enzimas proteolíticas.
La importancia fisiológica de los péptidos bioactivos deriva de las siguientes propiedades hasta ahora descriptas: actividad opiode, acción antihipertensiva (inhibidores de la ECA), antitrombóticos, agentes inmunomodulatorios, transportadores de calcio (caseinofosfopeptidos) y actividad antimicrobiana.
El protocolo a emplear para la obtención de péptidos bioactivos consiste en:
Preparación de extractos acuosos a partir de los hidrolizados de ambas fracciones. Fraccionamiento por exclusión molecular.HPLC en fase reversa o electroforesis capilar.
Para la posterior identificación de los peptidos obtenidos se requerira de las siguientes metodologias:
Degradación de Edman o EM en tandem para el secuenciamiento.Actividad potencial: se determina por comparación de secuencia con otros péptidos conocidos en bases de datos.Confirmación de actividad in vivo o in vitro requiere de cromatografía semi-preparativa para obtener material suficiente para los ensayos biológicos.