LABORATORIO N4

UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURAFACULTAD DE MEDICINA HUMANA

DOCENTE:

Dra. Violeta Morn Garrido.

TEMA: Funcin de la cadena respiratoria

ALUMNA:

FRIAS GUERRERO ILDA MERCEDES

MAYO- 2015

LABORATORIO N 5

CADENA RESPIRATORIA

I. OBJETIVOS

Demostrar el funcionamiento de la cadena respiratoria a travs del efecto de inhibidores sobre la cadena oxido-reduccin biolgica.

II. CONTENIDO:

Inhibir la cadena respiratoria, emulada en una reaccin in vitro, a diferentes niveles utilizando distintos compuestos.

III. FUNDAMENTO TEORICO

Mitocondria

Las mitocondrias se encuentran en todos los tipos celulares. Constituyen uno de los ejemplos morfofuncionales ms admirables, ya que preveen el andamiaje sobre el que se asientan las innumerables molculas que participan en las reacciones que transfieren las reacciones que transfieren la energa depositada en los alimentos a una molcula extraordinariamente verstil como lo es el ATP.

Las mitocondrias son orgnulos citoplasmticos limitados por dos membranas, externa e interna. En el interior de la membrana interna se halla la matriz mitocondrial. Entre las dos membranas existe un espacio intermembranar. La membrana externa es rica en lpidos y muy permeable. La membrana interna presenta unos pliegues llamados crestas mitocondriales; es rica en protenas y presenta una permeabilidad muy selectiva.

La principal funcin de las mitocondrias es la oxidacin de sustratos (procedentes de los combustibles celulares: azcares, lpidos, etc) y la conversin de la energa as liberada en energa qumica, en forma de ATP. Esta energa qumica puede luego ser utilizada por la clula en sus diferentes funciones: biosntesis, motilidad, transporte, etc. La sntesis de ATP tiene lugar en la denominada ATPasa dependiente de protones; las reacciones de oxidacin ocurren en la membrana interna, mediante la llamada cadena de transporte de electrones. Adems, en la matriz mitocondrial tienen lugar procesos bioqumicos muy importantes: oxidacin de cidos grasos, ciclo de Krebs y primera reaccin de la sntesis de urea. Finalmente como ya hemos visto, la mitocondria dispone de la maquinaria gentica (ADN, ARN, etc.) necesaria para la sntesis de sus propias protenas.

Fosforilacin Oxidativa.

La oxidacin del alimento durante la respiracin libera energa qumica potencial que es utilizada para sintetizar ATP. El proceso implica la fosforilacin oxidativa de molculas alimenticias como glucosa, cidos grasos o glicerina (las ms comunes). Las molculas son descompuestas durante una serie de reacciones, y la energa liberada en ciertos estadios del proceso es utilizada para producir ATP en reacciones de fosforilacin. NADH

Q

Cit. C

O2

Sustrato

Flujo de electrones (() entre los complejos (c.) de la cadena respiratoria.

Mitocondria,diminutaestructura celular de doble membrana responsable de la conversin de nutrientes en el compuesto rico en energa (ATP), que acta como combustible. Por esta funcin que desempean, se dice que las mitocondrias son el motor de la clula.

Estructura De Las Mitocondrias

Lamitocondria,quetiene una longitud comprendida entre 0,5 y 1 micrmetro, est envuelta en una membrana doble. La membrana exterior lisa est separada de la interior por una pelcula lquida. La membrana interior, replegada en unas estructuras llamadas crestas, rodea una matriz lquida que contiene gran cantidad de enzimas o catalizadores biolgicos. Dentro de esta matriz lquida hay cido desoxirribonucleico mitocondrial (ADNm), que contiene informacin sobre sntesis directa de protenas.

Funcin MitocondrialLaprincipalfuncinde las mitocondrias es generar energa para mantener la actividad celular mediante procesos de respiracin aerobia. Los nutrientes se escinden en el citoplasma celular para formar cido pirvico que penetra en la mitocondria. En una serie de reacciones, parte de las cuales siguen el llamado ciclo de Krebs o del cido ctrico, el cido pirvico reacciona con agua para producir dixido de carbono y diez tomos de hidrgeno. Estos tomos de hidrgeno se transportan hasta las crestas de la membrana interior a lo largo de una cadena de molculas especiales llamadas coenzimas.

Una vez all, las coenzimas donan los hidrgenos a una serie de protenas enlazadas a la membrana que forman lo que se llama una cadena de transporte de electrones.

Lacadenadetransporte de electrones separa los electrones y los protones de cada uno de los diez tomos de hidrgeno. Los diez electrones se envan a lo largo de la cadena y acaban por combinarse con oxgeno y los protones para formar agua.

Laenergaseliberaa medida que los electrones pasan desde las coenzimas a los tomos de oxgeno y se almacena en compuestos de la cadena de transporte de electrones. A medida que stos pasan de uno a otro, los componentes de la cadena bombean aleatoriamente protones desde la matriz hacia el espacio comprendido entre las membranas interna y externa. Los protones slo pueden volver a la matriz por una va compleja de protenas integradas en la membrana interior. Este complejo de protenas de membrana permite a los protones volver a la matriz slo si se aade un grupo fosfato al compuesto difosfato de adenosina (ADP) para formar ATP en un proceso llamado fosforilacin.

ElATPseliberaenel citoplasma de la clula, que lo utiliza prcticamente en todas las reacciones que necesitan energa. Se convierte en ADP, que la clula devuelve a la mitocondria para volver a fosforilarlo.

Ciclo De La Respiracin Celular: Ciclo de Krebs

Es una sucesin de reacciones qumicas que ocurren dentro de la clula, mediante las cuales se realiza la descomposicin final de las molculas de los alimentos y en las que se producen dixido de carbono, agua y energa. Este proceso, que se lleva a cabo por la accin de siete enzimas, es conocido tambin por ciclo de los cidos tricarboxlicos. El ciclo de Krebs ocurre en todos los animales, plantas superiores y en la mayora de las bacterias. En los organismos que tienen clulas con ncleo, el ciclo tiene lugar dentro de un orgnulo membranoso que se llama mitocondria, una estructura que se compara a menudo con la central de produccin de energa de la clula. El descubrimiento del ciclo es obra de Hans Adolf Krebs, un bioqumico britnico que present este importante avance cientfico en 1937.

Los alimentos, antes de poder entrar en el ciclo del cido ctrico, deben descomponerse en pequeas unidades llamadas grupos acetilo. Cada grupo acetilo (CH3CO) contiene slo dos tomos de carbono, junto con hidrgeno y oxgeno.

Al comienzo del ciclo, un grupo acetilo se combina con una molcula con cuatro tomos de carbono llamada oxalacetato, para producir un compuesto con seis tomos de carbono: el cido ctrico. En los restantes pasos del ciclo, la molcula de cido ctrico se transforma, y pierde dos de sus tomos de carbono, que salen en forma de dixido de carbono. As mismo, se liberan tambin cuatro electrones.

El ciclo de Krebs es una va eficaz para convertir, dentro de la clula, los componentes de los alimentos en energa utilizable. En el ciclo, slo se destruyen los grupos acetilo; tanto las siete enzimas que llevan a cabo las diferentes reacciones, como los compuestos intermedios sobre los que actan, pueden volver a utilizarse una y otra vez. Muchos de los compuestos intermedios que se producen en el ciclo se usan tambin como materiales de construccin para la sntesis de aminocidos, hidratos de carbono y otros productos celulares.

IV. Material - Mortero - Gasa

- Tubos 16 x 16

- Pipetas 1 ml

- Placa Petri

- Bistur

Otros:- Agua helada

Muestra:- Tejido Cardiaco de Cerdo

Reactivos:- Cianuro de Sodio 0.1 M

- Malonato 0.1 M

- Solucin p - Fenilendiamina

- Buffer Fosfato 0.1 M (pH 7.4)

Esquipos:- Licuadora

Procedimiento:- Obtener 100 g de Tejido cardiaco fresco, de cerdo.

- Eliminar completamente la grasa y el tejido conectivo

- Colocarlo en un mortero de porcelana y triturarlo.

- Agregar 10 ml de agua helada.

- Agitar continuamente durante 15 min utilizando el moledor del mortero.

- Tamizar a travs de una gasa fina para eliminar el lquido.

- Repetir el lavado x 2 veces, para eliminar al mximo los sustratos naturales y el DPN.

- Transferir el tejido lavado a una licuadora.

- Agregar el volumen igual de Buffer Fosfato y mezclar lo mejor posible.

- Refrigerar o colocar en un recipiente con hielo para evitar el deterioro de las enzimas.V. PREPARACION DE SISTEMAS

a) Sistema de succinato

Mesclar, dejar reposar

Observar los cambios de color

Comentarlas observaciones

COMPONENTES123456

Buffer fosfato de sodio 0.1 M, pH 7.41.51.21.00.50.50.5

2.6 diclorofenolindofenol 0.02%1.01.01.01.01.01.0

Succionato 0.1 M0.2-0.20.20.20.2

Malonato 0.1 M---0.5--

Cianuro de sodio 0.1M----0.5-

Barbiturato de sodio 0.1M-----0.5

Homogenizadoheptico-0.50.50.50.50.5

}

b) Sistema usando fenilendiamina

COMPONENTES12345

- Buffer fosfato de sodio 0.1 M, pH 7.40.21.51.01.01.0

- Cianuro de sodio 0.1M--0.5--

- Malonato 0.1 M---0.5-

- Barbiturato de sodio 0.1M----0.5

- P-fenilendiamina0.50.50.50.50.5

- Homogeneizado heptico-0.50.50.50.5

Mesclar y dejar reposar a temperatura ambiente

Observar los cambios de color

Interpretar los resultados

CUESTIONARIO1. Qu INTERPRETACON LE DAN LOS TUBOS 1, 2, 3, 4, 5, 6 EN EL PRIMER EXPERIMENTO? TUBO 1

No hay coloracin pues como no hay homogeneizado heptico (no hay mitocondrias) no habr reaccin de la cadena respiratoria.

TUBO 2

Tampoco hay coloracin pues aunque hay mitocondrias no hay succinato que es la que inicia la reaccin de la cadena respiratoria.

TUBO 3

Si hay coloracin azul debido a que en el tubo estn todos los componentes para que se efecte la reaccin, por lo tanto sta llega a su final y el 2.6 diclorofenolindofenol puede actuar aceptando electrones de oxigeno colorendose de color azul.

TUBO 4

No hay coloracin pues se ha agregado malonato el cual inhibe la accin del succinato por lo cual no se produce la reaccin.

TUBO 5

Tampoco hay coloracin pues el cianuro que se agreg bloqueo la accin del citocromo C, impidiendo el paso de los electrones al citocromo O.

TUBO 6

S hubo coloracin pues el inhibidor que se agreg fue el barbiturato y ste no interrumpe la cadena a nivel del sistema del succinato como se ve en el esquema anterior, por eso la reaccin llego a su final y se colore azul.

2. Qu INTERPRETACION LE DA A LOS TUBO 1, 2, 3, 4, 5 EN EL SEGUNDO EXPERIMENTO?

TUBO 1: NO FUNCIONO EL SISTEMAEst presente la p fenilendiamina, que es un dador de hidrgenos, pero no hay homogenizado heptico, lo cual no se presenta reaccin. TUBO 2: SI FUNCIONO EL SISTEMAEn este caso el sistema funciono correctamente porque tena todos los materiales (La p fenilendiamina, y el homogenizado heptico) por lo cual se lleva a cabo la reaccin y se colorea de color rojo. TUBO 3: NO FUNCIONO EL SISTEMAEn este caso no funciono porque se aadio un inhibidor: Cianuro de sodio, el cual inhibe la ltima parte de la cadena respiratoria, en la trama en la que el P-fenilendiaminarecibe recibe los H+. TUBO 4: SI FUNCIONO EL SISTEMATambin funciono bien, y aunque se aadi Malonato (que es un inhibidor) solo afect la Ruta Corta, mas no la Ruta Larga, y por eso funciono sin ningn problema. Est presente la p fenilendiamina y el homogenizado. TUBO 5: NO FUNCIONO EL SISTEMAEn este caso tambin no funciono porque se aadio otro inhibidor: Barbiturato, el cual inhibe la primera parte de la cadena respiratoria, en la trama en la que el Sustrato dona sus H+ al NAD y se convierte en FADH (Est presente la p fenilendiamina y el homogenizado).

3. Cmo SEPARARIA MITOCONDRIS PURAS?

Para estudiar la funcin de cualquier organelo, es necesario primero aislarlo en forma relativamente pura, sin contaminacin importante de otros organelos. Por lo tanto, separara mediante centrifugacin del tejido, por ejemplo heptico, colocara la muestra en una centrifugadora a 800 x g durante 10 min. A 4C. El sobrenadante de esta homogenizacin se centrifuga de nuevo, esta vez a 8500 x g durante 10 min. Y a 4C.

El proceso habitual para conseguirlo se llama fraccionamiento subcelular y, por lo general comprende tres procedimientos: extraccin, homogeneizacin y centrifugacin.

.Extraccin.- consiste en aislamiento de un organelo especfico extrayndolo de las clulas en que se localiza. Se realiza en condiciones poco agresivas, usando solucionas acuosas adecuadas.

.Homogeneizado.- consiste en girar dentro de un tubo de vidrio de dimensiones adecuadas que contiene los fragmentos desmenuzados del rgano en estudio (en este caso de hgado), con un medio homogeneizante apropiado como el STKM (del ingls Sucrosa, Tris, Kalium y Magnesium). La fuerza mecnica ejercida, rompe las clulas liberando sus constituyentes en la sacarosa.

.Centrifugacin.- utiliza una serie de pasos de centrifugacin diferencial, con velocidades sucesivamente mayores y cada uno produce un sedimento y un sobrenadante, que es centrifugado seguidamente.

La importancia de los estudios de fraccionamiento subcelular en el desarrollo de la bioqumica y la biologa celular, no se exagera por su enfoque experimental y amplio uso, constituye una parte fundamental en el estudio de las funciones de los organelos celulares. 4. CUL ES LA FINALIDAD DEL HOMOGENIZADO HEPTICO?

Se llama homogenizacin a la tcnica que consiste en disgregar los tejidos y romper las membranas plasmticas de las clulas, con lo que se liberan los orgnulos subcelulares y el citosol. Los homogenados se utilizan, sobre todo como punto de partida para obtener por centrifugacin diferencial las distintas fracciones subcelulares: ncleo, mitocondrias, fraccin microsomal

La finalidad del homogeneizado heptico es la de obtener MITOCONDRIAS PURAS que puedan realizar la Cadena Respiratoria y que brinden el sistema enzimtico necesario para ello (NAD, FAD, CITOCROMOS), es decir, se rompe la membrana celular mediante choques hiposmticos para as, poder aadir las diferentes sustancias que nos permiten experimentar en qu momento se produce o no la Cadena Respiratoria.

CONCLUSIONES El proceso de centrifugacin es importante realizarlo a la revolucin apropiada pues si se hace a menos velocidad, el homogeneizado no ser transparente como se espera sino ms bien que tendr un color amarillo parduzco, lo que indica que no todo el material de residuo se ha asentado.

Los inhibidores de la cadena respiratoria no actan solo a un nivel de sta, sino que cada uno tiene su lugar preferido donde actuar.

Los inhibidores de la cadena respiratoria son de diferentes naturalezas qumicas. Si nos exponemos a cualquiera de estos inhibidores puede llegar a significarnos la muerte.

Existen diversos inhibidores que actan en diferentes puntos de la cadena respiratoria haciendo que no cumpla con sus funciones (transporte de electrones, sntesis de ATP y produccin de agua)

El efecto de los inhibidores pueden ser contrarrestados con ciertos sustratos especficos que reactivan el transporte de electrones en puntos especficos de acuerdo al inhibidor que est actuando.

Se ha logrado demostrar el funcionamiento de la Cadena Respiratoria mediante la inhibicin de sitios especficos, expresndose esto mediante el cambio de color de la solucin: mediante un color azul en el primer sistema (succinato) y un color rojo en el sistema II.

La cadena respiratoria es de suma importancia dentro del metabolismo celular por lo que es necesario conocer con exactitud porque elementos est afectada, por cuales no y cuales le favorecen con el nico objetivo de mantenerla en su normal funcionamiento.

Bibliografa

MURRAY Robert y otros; 1994; Bioqumica de Harper;

Decimotercera edicin; Editorial El Manual Moderno S.A. Mxico.

LEHNINGER, Albert; 1991; Bioqumica.

Segunda edicin; Ediciones Omega S.A. Barcelona Espaa.

C. I

(Fe, S)

C. IV

Cit. a

Cit. a3

Cu

C. III

Cit. B

(Fe, S)

Cit. C1

C. II

(Fe, S)

FAD

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