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LAB. N3: DETERMINACIN DE LA CALIDAD DEL AGUA POR SU CONTENIDO BACTERIAL

1. OBJETIVO(s)

a) GENERAL:

i) Determinar la cantidad de colonias de bacterias de una muestra de agua, utilizando como medio de cultivo agar nutritivo fundido estril. b) ESPECFICOS:

i) Determinar la cantidad de colonias de bacterias obtenidas de las muestras de: bao FIA, estanque de Arquitectura y lavadero del comedor del Teatro. Para cada muestra se analizar tres (03) cantidades distintas:

(1) Muestra de agua de 1ml(2) Muestra de agua (diluida en agua de disolucin estril) de 0.1 ml (10-1ml)(3) Muestra de agua (diluida en agua de disolucin estril) de 0.01 ml(10-2ml)

ii) Calcular las Unidades Formadoras de colonia por mililitro (UFC/1ml) de cada muestra.

2. FUNDAMENTO TERICO

2.1. CALIDAD DEL AGUA

Es un factor que incide directamente en la salud de los ecosistemas y el bienestar humano: de ella depende la biodiversidad, la calidad de los alimentos, las actividades econmicas, etc. Por tanto, la calidad del agua es tambin un factor influyente en la determinacin de la pobreza o riqueza de un pas.Se refiere a las caractersticas qumicas, fsicas, biolgicas y radiolgicas del agua. Es una medida de la condicin del agua en relacin con los requisitos de una o ms especies biticas o a cualquier necesidad humana o propsito. Se utiliza con mayor frecuencia por referencia a un conjunto de normas contra los cuales puede evaluarse el cumplimiento. Los estndares ms comunes utilizados para evaluar la calidad del agua se relacionan con la salud de los ecosistemas, seguridad de contacto humano y agua potable.

2.2.INDICADORES DE CONTAMINACIN DEL AGUA2.2.1. Indicadores fsico-qumicos:-Slidos totales (residuo de evaporacin): comprende la materia (orgnica e inorgnica) disuelta, coloidal y en suspensin; el residuo seco del agua potable debe ser igual o inferior a 1500 mg/litro.-Color: el agua potable debe ser incolora; las aguas residuales domsticas tienen un color entre gris y negro; las aguas residuales industriales pueden tener colores muy variados.-Olor: el agua potable debe ser inodora (la desinfeccin con derivados del cloro confiere cierto olor caracterstico); las aguas residuales domsticas tienen un olor desagradable; las aguas residuales industriales pueden tener olores desagradables; el sabor del agua est relacionado con su olor.-Temperatura: influye en el desarrollo de la vida acutica, el oxgeno disuelto y la velocidad de las reacciones qumicas y bioqumicas.-Turbidez: depende de la cantidad de slidos en suspensin; es mayor cuanto mayor es la contaminacin del agua.-pH: mide la concentracin de hidrogeniones; pH del agua potable entre 6,5-8,5; un pH elevado (superior a 7) indica baja-Conductividad: vara con la temperatura y depende de la concentracin de sustancias disueltas; las sales minerales aumentan la conductividad y la materia orgnica la disminuye; se mide en microsiemens por cm (400 para el agua potable).

2.2.2. Indicadores de la contaminacin orgnica:-Carbono orgnico total (COT): mide la cantidad de compuestos orgnicos, naturales o sintticos; expresa en mg/litro la cantidad de dixido de carbono producido en la combustin de una muestra a 950 C.-Demanda bioqumica de oxgeno (DBO): mide la cantidad de materia orgnica biodegradable; se determina midiendo la cantidad de oxgeno consumido por los microorganismos cuando utilizan la materia orgnica como fuente de energa para su metabolismo; los ensayos se realizan durante 5 das a una temperatura constante de 20 C y el resultado se expresa en mg/litro; la DBO del agua potable no debe exceder los 2 mg/litro; se trata de un mtodo biolgico cuyos resultados pueden alterarse por la presencia de sustancias reductoras (sulfuros, sulfitos, hierro ferroso, etc.) y de txicos para la flora microbiana.-Demanda qumica de oxgeno (DQO): indica la cantidad de contaminantes que pueden oxidarse mediante un oxidante qumico (dicromato potsico, etc.); estos contaminantes pueden ser materia orgnica e inorgnica; se expresa en mg de oxgeno por litro.-Nitrgeno total (NT): mide el nitrgeno de los compuestos orgnicos nitrogenados naturales (proteinas, pptidos, aminocidos) y sintticos (oxinas, hidracina, etc.) y el nitrgeno de nitratos y nitritos; se expresa en mg/litro.-Otros indicadores: nitrgeno amoniacal, nitratos y nitritos (en mg/litro.)

2.2.3. Indicadores microbiolgicos:-Coliformes: bacterias aerbicas y anaerbicas facultativas gram-negativas, no esporuladas, con forma de bacilo, que fermentan la lactosa formando cido y gas a las 48 h de ser cultivadas en caldo lactosado a 35 C; en este grupo se encuentran bacterias no entricas y entricas (principalmente Escherichia coli); los coliformes sirven como indicadores de contaminacin fecal y del nivel de saneamiento de las aguas (un agua potable tendr 0 para el 95% de las muestras analizadas).-Estreptococos fecales: conjunto de estreptococos que poseen el antgeno D de Lancefield (Streptococcus faecalis, S. durans, S. bovis, etc.) conocidos tambin como enterococos al formar parte de la flora intestinal; son indicadores de la contaminacin fecal (0 por 100 en el agua potable).-Otras determinaciones: esporas de Clostridium sulfito-reductores, presencia de Clostridium perfringens, bacterifagos fecales, microorganismos patgenos (cuando se producen brotes de enfermedades de transmisin hdrica); la presencia de bacterias del gen. Leptospira (patgenas para el hombre y los animales) indica contaminacin por deyecciones animales.

2.2.4. Otros indicadores:-Elementos no deseables y/o txicos: Al, As, B, Cu, Fe, Mn, Ti, Zn, Sb, Ag, Ba, Cr, Sn, F, Hg, Ni, Pb, Se, etc.-Microcontaminantes orgnicos: hidrocarburos clorados, hidrocarburos aromticos policclicos, aceites y grasas (pueden ser mayoritarios), mercaptanos, pesticidas, detergentes, cianuros, fenoles, etc.

2.3. PRINCIPALES CONTAMINANTES MICROBIOLGICOSLas enfermedades infecciosas se transmiten principalmente a travs de las excretas de seres humanos y animales, en particular de las heces. As si el agua usada para beber y preparar los alimentos est contaminada, puede producir enfermedades infecciosas. Al respecto la OMS, en sus guas para la calidad de agua potable, seala que el riesgo ms comn y difundido que lleva consigo el agua potable son las enfermedades infecciosas causadas por bacterias, virus, protozoarios y helmintos.(a) LAS BACTERIAS:

(i) SALMONELLA: gnero de bacterias que pertenece a la familia Enterobacteriaceae, formado por bacilos gramnegativos, anaerobios facultativos, con flagelos pertricos y que no desarrollan cpsula (excepto la especie S. typhi ni esporas. Son bacterias mviles que producen cido sulfhdrico (H2S). Emplean glucosa por poseer una enzima especializada, pero no lactosa, y no producen ureasa ni tienen metabolismo fermentativo.Se presenta en al agua cruda, pero solo ocasionalmente se le haya en aguas tratadas, ya que la cloracin es altamente efectiva para controlar esta bacteria.Sntomas tpicos: Gastroenteritis aguda con diarrea, dolores abdominales, fiebres, nuseas vmitos y dolor de cabeza.

(ii) SHIGELLA: es un gnero de bacterias con forma de bacilo Gram negativas, inmviles, no formadoras de esporas e incapaces de fermentar la lactosa, que pueden ocasionar diarrea en los seres humanos. Tiene baja resistencia al cloro, por lo que la cloracin acaba con el peligro de ser afectado por esta bacteria.

(iii) ESCHERICHIA COLI: Se trata de una enterobacteria que se encuentra generalmente en los intestinos animales, y por ende en las aguas negras, pero se lo puede encontrar en todos lados, dado que es un organismo ubicuo. Causa gastroenteritis en seres humanos y animales. Diarreas, Nauseas y deshidratacin

(iv) VIBRIUM CHOLERAE: Es una bacteria Gram negativa con forma de bastn (un bacilo) curvo que provoca el clera en humanos.

(v) CAMPYLOBACTER: Las especies de este gnero son bacilos gram negativo con forma de coma y mviles por la presencia de uno o dos flagelos polares. Sntoma ms notorio es la diarrea.

(b) BACTERIAS COLIFORMES:

La denominacin genrica coliformes designa a un grupo de especies bacterianas que tienen ciertas caractersticas bioqumicas en comn e importancia relevante como indicadores de contaminacin del agua y los alimentos.Coliforme significa con forma de coli, refirindose a la bacteria principal del grupo, la Escherichia coli, descubierta por el bacterilogo alemn Theodor von Escherich en 1860. Von Escherich la bautiz como bacterium coli ("bacteria del intestino", "intestino"). Con posterioridad, la microbiologa sistemtica nombrara el gnero Escherichia en honor a su descubridor.COMO INDICADORES:Tradicionalmente se los ha considerado como indicadores de contaminacin fecal en el control de calidad del agua destinada al consumo humano en razn de que, en los medios acuticos, los coliformes son ms resistentes que las bacterias patgenas intestinales y porque su origen es principalmente fecal. Por tanto, su ausencia indica que el agua es bacteriolgicamente segura.Asimismo, su nmero en el agua es directamente e inversamente proporcional al grado de contaminacin fecal; mientras ms coliformes se aislan del agua, mayor es la gravedad de la descarga de heces.Caracteres bioqumicos: El grupo contempla a todas las bacterias entricas que se caracterizan por tener las siguientes propiedades bioqumicas: ser aerobias o anaerobias facultativas; ser bacilos Gram negativos; no ser esporgenas;

El grupo de los coliformes incluye bacterias en forma de bacilo, gram negativos, con las siguientes propiedades bioqumicas: oxidasa negativo y capacidad de fermentar lactosa, con produccin de gas en 48 horas a una temperatura de 37 C.

El grupo coliforme est formado por los siguientes gneros:

Escherichia Klebsiella Enterobacter Citrobacter

1 E. Coli2 Vibrio Cholerae

3 Salmonella

4 Shiguella

2.4. CONTEO BACTERIANOa. Conteo en placa PETRI: Mtodo ms usado para contar bacterias. Un caldo de cultivo con microorganismos es diluido y posteriormente muestras del mismo son distribuidas en la caja de Petri contenedora de agar. Es de suponerse que cada clula se dividir en sus mltiples alrededores para producir colonias separadas en el agar. Cada clula es llamada unidad formadora de colonias (UFC). Despus de la incubacin, el nmero de colonias se reflejar en el nmero de clulas UFC originalmente presentes. Es importante considerar un nmero limitado de colonias pues de no ser as, stas pueden sobrepoblarse y dificultar el conteo de las mismas (rango sugerido de 25-250 colonias). El conteo se facilita utilizando un contador de colonias. Este mtodo es deseable porque arroja el total de clulas viables (slo clulas vivas); en contraste con el conteo microscpico y el conteo de peso seco. Una desventaja radica en el tiempo que requiere para producir las colonias, ya que se necesitan como mnimo veinticuatro horas o ms. Por otra parte, no es cien por ciento fiable porque generalmente las colonias crecen unidas en cadenas o en grupos.OJO: Nosotros usaremos como rango sugerido 30-300 UFCa.1 Unidades Formadoras de Colonias: Unidades Formadoras de Colonias es un valor que indica el grado de contaminacin microbiolgica de un ambiente. Expresa el nmero relativo de microorganismos de un taxn determinado en un volumen de un metro cbico de agua.UFC es el nmero mnimo de clulas separables sobre la superficie, o dentro, de un medio de agar semi-slido que da lugar al desarrollo de una colonia visible del orden de decenas de millones de clulas descendientes. Las UFC pueden ser pares (diplococos), cadena (estreptococos) o racimos (estafilococos), as como clulas individuales Unidad formadora de colonias.Una dilucin hecha con bacteria y agua peptonada se coloca en el plato de agar (Cuenta de plato agar para muestras alimenticias o Agar trypticase de soja para muestras clnicas) y expandida en el plato siguiendo este patrn.SE MIDE : UFC/ml

3. MATERIALESTres frascos de dilucin y dos esptulas Tres frascos estriles y Pipetas (06) de 1 ml

|REJILLASTres mecheros Bunsen

OTROS MATERIALES:-AGUA DESTILADA -PERA-AUTOCLAVE -VASO DE PRECIPITADO: 200 ml y 400 ml-HORNO -PLACAS PETRI (06) ESTRILES-GUANTES DE ASBESTO -TERMMETRO-FSFOROS PEPTONAAGAR NUTRITIVO (en polvo)CANASTACANASTILLAS

COCINILLA ELCTRICATUBOS DE PRUEBA (09)

4. PROCEDIMIENTO

1) PREPARACIN DEL MEDIO DE CULTIVO1.1) Se desea preparar una muestra de 135 ml de agar nutritivo, para luego ser distribuidos en nueve (09) tubos de prueba. Tres (03) tubos de agar nutritivo para cada grupo.

Se sabe que: Concentracin del agar: 23g/L

Por regla de tres simple: 23g --------- 1 LX---------- 135 mlX=3.105 g es la masa de agar que se debe pesar para preparar 135 ml.

1.2) Se mezcla los 3.105 gramos de agar con 135 ml de agua destilada en un vaso de precipitado de 200 ml, remover hasta que la solucin sea homognea. 1.3) Se calienta la solucin de agar nutritivo en la cocinilla elctrica hasta alcanzar los 80 C (medido con termmetro)

5 PASO 1.36 PASO 1.2

1.4) Se procede a vaciar el contenido la solucin de agar nutritivo preparado en los nueve tubos de prueba, distribuyndose as 15 ml a cada tubo. Recordar que despus de vaciar el agar en los tubos se debe colocar algodn en la boquilla de cada tubo con el objeto de evitar su exposicin al medio. 1.5) Luego los tubos son colocados en una canastilla para ser llevados al autoclave aproximadamente 1 h.

7 PASO 1.5

8 PASO 1.4

2) PREPARACIN DEL AGUA DE DISOLUCIN ESTRIL(agua destilada + peptona)

2.1) Se desea preparar 297 ml de agua de disolucin (99 ml para cada grupo). El agua de disolucin ser utilizada para lograr obtener muestras de agua de 10-1 ml y 10-2 ml. 2.2) Se sabe que : Concentracin de Peptona es 1 g/L1g------ 1LX ------- 297 ml -> X= 0.297 gramos deben ser pesados en la balanza electrnica.

2.3) Hecho esto procedemos a disolver los 0.297 gramos de peptona en 297 ml de agua destilada, agitamos la solucin hasta notar que sea homognea.

2.4) Luego vaciamos el agua de disolucin en tres (03) frascos 99 ml cada uno.

9 Agua de disolucin (99 ml). GRUPO 1

3) TOMA DE MUESTRAS DE AGUA3.1) LUGARES:Para la extraccin de la muestra:(a) Utilizamos un frasco estril (vaco) para la extraccin de la muestra de agua.(b) Abrir el grifo o cao del cual se va realizar la toma, medimos la temperatura del agua, esperamos unos cinco minutos y anotamos la marca del termmetro(c) Luego abrimos el frasco y rpidamente lo colocamos en el grifo hasta que la cantidad de la muestra de agua llegue a la mitad aproximadamente, cerramos hermticamente. Anotamos la fecha y hora de la toma.

10 Muestra de agua BAO FIA (grupo 1)

4) CULTIVO DE LA MUESTRA DE AGUA

i. Primero retiramos los tubos de prueba que contienen el agar nutritivo, esperamos unos minutos a que se enfren (sin dejar que se solidifique).ii. Vaciamos el contenido de cada tubo (nueve tubos) a las respectivas placas petri estriles (nueve placas).

11 Paso i. y ii.

iii. Teniendo listo las placas petri con el agar nutritivo. Realizamos lo que muestra el siguiente esquema: (Para cada grupo)Vaciamos 1 ml extrado en el agua de disolucin

Extraemos 1 ml y 0.1 ml de muestra con una pipeta

12 Muestra de agua

13 Agua de disolucin (99ml)

PLACAS PETRI con agar nutritivo FUNDIDO ESTRIL

10-2 ml10-1 ml1 ml

iv. Cuando se tienen listas las placas, moverlas circularmente para que exista una distribucin uniforme de la mezclav. Una vez lista las nueve placas con muestra de agua (3 por cada grupo), las colocamos en forma invertida en la incubadora durante 48 horas aprox. Y esperamos los resultados.

5. RESULTADOS

Tabla 1 Cuadro resumen de la extraccin de la muestra de agua.GRUPOMUESTRAFECHAHORAT (C)

1BAO FIA16/09/201411:00 a.m.19

3ESTANQUE DE ARQUITECTURA16/09/201411:22 a.m.21

5LAVADERO DE PLATOS DEL TEATRO16/09/201412:00 a.m.18.5

PLACAS GRUPO 1

PLACAS GRUPO 3

PLACAS GRUPO 5

Tabla 2 Cuadro de los resultados de UFC /ml y observacionesGRUPO MUESTRADILUCINUFC/mlOBSERVACIN

1 ml10-1ml10-2ml

1BAO FIA287118(*)287-Tamao: 0.1mm46 UFC/mlESTANQUE DE ARQUITECTURA-> 420 UFC/ml A medida que la concentracin disminuya las colonias de bacterias disminuyen en cantidad y estn distribuidas con mayores espacios entre ellas. Esto no se evidencia en los resultados del grupo 5 ya que en la placa de 10-1ml hay ms colonias de bacteria (42) que la placa de 1 ml (8). VER TABLA.2 Este mtodo de determinacin de la cantidad de colonias de bacterias en una muestra de agua resulta ser estadstico, por lo que es necesario realizarlo repetidas veces para as encontrar un resultado ms fiable, en nuestro caso con los resultados obtenidos no podemos afirmar con exactitud la calidad del agua, pero si fuese as compararamos con los LMPs del ANEXO I. Haciendo esto las tres muestras se encuentran dentro del rango