Universidad de Antioquia

Escuela de Microbiologa

Microbiologa I

Laboratorio

Universidad de Antioquia

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Microbiologa I

Laboratorio

Transferencia Gnica: Transformacin

Astrid V. Cienfuegos, BS

INTRODUCCINMuchos factores han contribuido a la emergencia y diseminacin de agentes infecciosos ms virulentos, incluyendo el cambio climtico, la contaminacin ambiental, el movimiento masivo de personas desplazadas y la pobreza. Al mismo tiempo, los microorganismos se han adaptado y sobrevivido en nuevos hospederos y ambientes. La adaptabilidad de los microbios se demuestra en el aumento alarmante de cepas resistentes a antibiticos, una tendencia que ha sido potenciada por el mal uso de estos en dcadas recientes, y la creencia comn que las infecciones bacterianas son tratables y por tanto de menores consecuencias. De hecho, comnmente se encuentran bacterias que son resistentes a ms de un antibitico, las llamadas cepas MDR (multidrug resistant).

Una bacteria puede adquirir resistencia a antibiticos por mutaciones espontneas, al azar en su genoma, o tomando genes que codifican factores de resistencia a antibiticos. Adicionalmente, las bacterias pueden tomar DNA codificante para factores de resistencia y transferirlos a otras bacterias de tres formas: conjugacin, transduccin, y transformacin. ConjugacinLa conjugacin es la transferencia unidireccional de DNA de una clula donante (que lleva un plsmido conjugativo) a una clula recipiente. Este proceso ocurre durante el contacto clula-clula y es similar a la recombinacin sexual observada en otros organismos. La transferencia comienza en un punto definido de la molcula de DNA y procede de manera linear. El DNA transferido puede ser todo o una parte de un plsmido y generalmente tambin incluye una porcin del DNA del hospedero. Por analoga a otros procesos de transferencia bacteriana, la bacteria recombinante puede ser llamada transconjugante. La cantidad de DNA transferido por conjugacin vara de unos pocos kilobases (kb) hasta un cromosoma bacteriano completo.

TransduccinLa transduccin es la transferencia de genes de una bacteria a otra mediada por un virus capaz de infectar bacterias (bacterifago o fago). Las infecciones por fagos, inician con la unin de las partculas virales a receptores especficos presentes en la superficie celular de la bacteria. Luego, el acido nuclico que se encuentra dentro de cpside viral, se transfiere al citoplasma de la bacteria, donde se vuelve metablicamente activo, iniciando la replicacin y transcripcin, o se integra en el genoma bacteriano. Los virus pueden empacar genes bacterianos, junto con los genes virales, y transferirlos a otras clulas. La cantidad de DNA transferido de esta manera vara considerablemente siendo de aproximadamente 200kb de longitud.

TransformacinLa transformacin fue el primer sistema bacteriano de transferencia gnica en ser descubierto. En 1920 el bioqumico ingls Frederick Griffith descubri por azar la transformacin en Streptococcus pneumoniae, mientras trabajaba en el desarrollo de una vacuna para la neumona. Griffith encontr, que una cepa no virulenta de S. pneumoniae se converta en virulenta tomando material de streptococos virulentos muertos.Streptococcus pneumoniae puede presentarse como dos variantes: S (smooth, lisa) es de alta virulencia puesto que tiene una cpsula que resiste la fagocitosis, o R (rough, rugosa) no causa enfermedad puesto que no tiene cpsula y por tanto es fagocitada rpidamente por las clulas fagocticas. Cuando Griffith inocul los ratones con la cepa S, stos moran; mientras que aquellos inoculados con la cepa R, permanecan vivos (Ver figura 1a). Luego inocul los ratones con bacterias de la cepa S muertas por calor, y como se esperaba, las clulas muertas no tenan capacidad de establecer infeccin y los ratones permanecieron vivos y saludables (b). Posteriormente, Griffith mezcl bacterias lisas muertas, con las clulas R no patognicas vivas, e inesperadamente, los ratones murieron por la infeccin; adems se recuperaron cepas S viables, demostrando as que las cepas no virulentas R haban sido transformadas al tomar el material gentico liberado por las clulas S muertas. Veinte aos despus (1944) Avery, McCarty y McLeod, extendieron estos resultados y demostraron que este material gentico, o factor transformante es el DNA.

Figura 1. El principio transformante (tomado de Laboratory excercises in organismal and molecular microbiology)La transformacin slo ocurre naturalmente en ciertas especies bacterianas (al parecer es una propiedad determinada genticamente), pero bajo condiciones de laboratorio, es posible realizar transformacin en cualquier tipo de clula procaritica o eucaritica. El proceso ocurre cuando alguna bacteria, viva o muerta, libera DNA en el medio que la rodea. Este DNA es vulnerable a la degradacin, pero tambin puede encontrar otra clula bacteriana, antes que ocurra cualquier cambio significativo en la molcula. La segunda bacteria toma el DNA, lo transporta a travs de la pared y la membrana celular y permite que se recombine con la porcin homloga del cromosoma residente bacteriano. . Durante la transformacin las bacterias competentes unen primero DNA reversiblemente y en poco tiempo esa unin pasa a ser irreversible. La clula recombinante es llamada transformante. En teora cualquier fragmento de informacin gentica puede ser transferido de esta forma, aunque la cantidad de DNA transferida por clula es pequea, del orden de 10kb de longitud. En las bacterias que se pueden transformar naturalmente, la competencia esta regulada y existen protenas especiales, como lo son protenas de membrana, de unin a DNA, autolisinas de la pared celular y nucleasas, que juegan un papel importante en el transporte y procesamiento de DNA.

Figura 2. Procesos transferencia gentica (tomado de BrockBiologa de los microorganismos 13ed.)Transformacin en el laboratorioLa transformacin bacteriana se realiza artificialmente en laboratorios de investigacin, y biotecnologa para obtener un alto nmero de copias de un gen o un fragmento de DNA o bien, para expresar determinados genes y estudiar sus productos.

Escherichia coli no se transforma naturalmente, pero puede hacerse competente suspendiendo las clulas en una solucin de cloruro de calcio. La membrana es permeable a los iones cloro, pero no permeable a los iones de calcio. Cuando el cloro entra a la clula, el agua tambin lo hace, causando que sta se hinche ligeramente y se vuelva porosa. Cuando las clulas se someten a un choque de calor (42C, 2 minutos) las molculas libres de DNA, como los plsmidos, entran a la clula por los poros transientes. El plsmido que ingresa a la clula es preparado previamente para llevar el fragmento de DNA que se requiere estudiar (genes de insulina, toxinas u otros). Adicionalmente el plsmido contiene un marcador de resistencia, que al expresarse le da capacidad a la bacteria de degradar o neutralizar algn antibitico (ampicilina, tetraciclina u otro), permitindole sobrevivir en el medio suplementado con ste; de esta manera se seleccionan las clulas que han recibido el plsmido. Sin embargo, las bacterias transformadas, es decir, aquellas que han recibido el plsmido, pueden no contener el gen de inters debido a la religacin del plsmido. Para determinar qu bacterias contienen realmente el plsmido ligado al gen de inters, es necesario hacer un segundo tamizaje en el medio, que puede realizarse con IPTG-Xgal.

Finalmente, se estimula el crecimiento en grandes cantidades de las bacterias que contienen el inserto, estas pueden lisarse luego para aislar el plsmido con el fragmento de DNA de inters o para obtener una gran cantidad de protenas. Esta es una forma fcil de produccin de protenas, como por ejemplo la insulina o antibiticos.

En este laboratorio se analizarn los resultados de un experimento de transformacin de la cepa E. coli DH5 (eficiente para ser transformada (fcil introduccin del plsmido), se multiplica con facilidad y es resistente a condiciones de almacenamiento) con el plsmido pGemT Easy.

Figura 3. Mapa circular del vector pGemTEasy y puntos de referencia (tomado del pGEM-TEasy Vector System Technical Manual TM042)

PRCTICAOBJETIVO GENERAL

Comprender el proceso de transformacin

OBJETIVOS ESPECFICOS

1. Revisar los protocolos de preparacin de clulas competentes y de transformacin.

2. Comprender la importancia del uso de controles en un experimento de transformacin

METODOLOGA

A cada grupo se le entregarn cuatro cultivos. Cada caja corresponde a uno de los siguientes controles: control de esterilidad (CE), control de viabilidad (CV), control de antibitico (CAB) y transformacin (T). Con base en los resultados observados desarrollarn la gua que se encuentra al final.

PROTOCOLOSPreparacin de clulas competentes con CaCl2 (Current protocols in Molecular Biology)

Hay varios mtodos para preparar clulas competentes pero el ms utilizado se realiza con cloruro de calcio ya que es eficiente, econmico y generalmente se obtienen clulas con altos niveles de transformacin. 1. Tomar una sola colonia bacteriana de E. coli DH5 (2-3 mm de dimetro) de un plato incubado por 16 a 24 horas a 37C. Transfiera la colonia a 100 ml de medio LB en un erlenmeyer de 1L. Incube el cultivo a 37C con agitacin vigorosa, monitoreando el crecimiento del cultivo, hasta obtener una densidad DO590nm de 0.375.2. Transfiera el cultivo a dos tubos Falcon de 50 ml estriles fros. Enfre el cultivo a 0C almacenando los tubos en hielo por 10 minutos.

3. Recupere las clulas por centrifugacin a 2700g (4100 rpm) por 10 minutos a 4C.

4. Decante el sobrenadante. Coloque los tubos en posicin invertida sobre una toalla de papel por un minuto para permitir que sean eliminadas las ltimas trazas de medio.

5. Resuspenda el sedimento de clulas haciendo vrtex suave en 10 ml de CaCl2 0.1M fro.

6. Repetir pasos 3 y 4

7. Resuspenda el sedimento de clulas haciendo vrtex suave en 2 ml de CaCl2 0.1M fro.

8. Realice alcuotas de las clulas y congele a -70C o utilcelas para transformacin (ver Protocolo de Transformacin).

Transformacin (adaptado del pGEM-TEasy Vector System Technical Manual TM042)

1. Prepare 2 cajas de petri con LB/AMP/IPTG/Xgal por cada reaccin de transformacin (mezcla de plsmido e inserto).

2. Centrifugue las reacciones de ligacin para colectar el contenido en el fondo del tubo. Adicione 2l de la reaccin de ligacin en 2 tubos ependorf 1.5ml.3. Remueva las clulas competentes de la nevera y deje descongelar en hielo (por 5 minutos). Mezcle las clulas suavemente inclinando el tubo.

4. Transfiera cuidadosamente 100 l de clulas competentes a cada tubo preparado en el paso 2.

5. Incline el tubo suavemente, y colquelo en hielo por 20 minutos.

6. Realice choque de calor por 45-50 seg en bao de agua a 42 C (no sacudir).7. Inmediatamente coloque las clulas en hielo por 2 minutos.

8. Adicione 900 l de medio LB a temperatura ambiente al tubo que contiene las clulas y luego transfiera el contenido a un tubo cnico de 15 ml.

9. Incube en bao mara 1.5 h a 37C con agitacin 150 rpm.

10. Siembre 100 l de las clulas en las cajas de LB/AMP/IPTG/Xgal.

11. Incube las cajas 16-24 h a 37C.Abreviaturas:

AMP: Ampicilina.IPTG: Isopropil-1-tio--D galactsido (anlogo de la lactosa).Xgal: 5-Bromo-4-cloro-3-indolil--D galactsido (anlogo de la lactosa).LB: Luria Bertani (medio de cultivo lquido nutritivo utilizado para el crecimiento de microorganismos modificados genticamente el cual contiene Triptona, extracto de levadura y NaCl).RESULTADOSNombres:

Fecha:

Experimento No.

REPORTE DE RESULTADOS1. De acuerdo a la explicacin recibida en el laboratorio, indique cmo se prepar cada control.

Control de Esterilidad:

Control de Viabilidad:

+

Control de Antibitico: + + Transformacin:

+ +2. Indique si hubo crecimiento (+) o no crecimiento (-) en cada caja.

SHAPE \* MERGEFORMAT

-El medio est contaminado?-Las clulas E. coli DH5 utilizadas

para la transformacin eran viables?

-El antibitico funciona bien?

-La transformacin es exitosa?

Si/NoControl que demuestra esta observacin

3. Discuta los resultados con respecto a la presencia o ausencia de crecimiento bacteriano en cada control. Son los resultados esperados? Cules pueden ser las posibles causas?4. Si las bacterias E. coli DH5 sin transformar crecen en agar LB + ampicilina, es posible demostrar que hubo transformacin? Explique.5. Si para la transformacin se hubiese utilizado un lisado de DNA que contiene clulas viables, habra sido posible determinar si ocurri transformacin? Explique.6. La eficiencia de transformacin es una medida del xito de la transformacin. Esta se expresa como el nmero de colonias resistentes a antibitico por g de DNA transformado. Una eficiencia de transformacin tpica es de 1 x 106 UFC/g. Usando el nmero de colonias obtenidas en la caja marcada T, determine la eficiencia de transformacin. Se debe tener en cuenta que se transform con 0.01ug DNA en 1 ml de medio, y se sembr 100ul en el plato (para los grupos que no obtuvieron crecimiento, o que en alguno de sus controles tuvieron resultados inadecuados, hacer el clculo con 200 UFC).

Investigue y responda brevemente las siguientes preguntas:1. Cul es el mecanismo de accin de la ampicilina sobre las bacterias sensibles? Cul es el mecanismo de resistencia?

2. Por qu tener el gen de resistencia a antibitico en un plsmido es ms beneficioso para la bacteria que tenerlo integrado en el cromosoma?

3. La transformacin ocurre en varios gneros bacterianos. Mencione dos ejemplos de bacterias gram positivas y dos de bacterias gram negativas que sean competentes naturalmente. En qu infecciones estn involucradas?

4. Escherichia coli debe hacerse competente con CaCl2 para poder realizar el procedimiento de transformacin. Adicionalmente, la cepa utilizada en la prctica, E. coli DH5, ha sido modificada genticamente para hacerla til en este procedimiento. Una de las modificaciones incluye alteraciones del sistema de metilacin-restriccin. Investigue en qu consiste esta alteracin, y cmo afectan la transformacin.

5. Investigue una aplicacin del uso de plsmidos en el rea mdica, industrial o agrcola.

ReferenciasFrederick M. Ausubel, Roger Brent, Robert E. Kingston, David D. Moore, J.G. Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl (eds.) Current Protocols in Molecular Biology. Unit 1.8: Introduction of Plasmid DNA into Cells. John Wiley & Sons, Inc., 2003

Steve K. Alexander, Dennis Strete, Mary Jane Niles. Laboratory excercises in organismal and molecular microbiology. Spieral Bound Comb, 2004

KleynBicknell. Microbiology Experiments: A Health Science Perspective. Chapter 16: Transformation: A Form of Genetic Recombination. McGrawHill Companies, 2003

Lecturas Recomendadas

Lansing M. Prescott, John P. Harley, Donald A. Klein. Microbiology, Fifth Edition. McGrawHill Companies, 2002.

Frederick M. Ausubel, Roger Brent, Robert E. Kingston, David D. Moore, J.G. Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl (eds.) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc., 2003

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