La Investigación al servicio de la Salud

Margarita SalasC t d Bi l í M l l S O hCentro de Biología Molecular Severo Ochoa

(CSIC–UAM)

La Propiedad Industrial en la Sociedad:Salud, Deportes y Medioambiente

UIMP, Santander, 13 de Julio de 2010

1944 - Avery, McLeod y McCarthy demostraron que el DNA es el “principio transformante” en pne mocco (el material genético)“principio transformante” en pneumocco (el material genético)

El DNA es una doble hEl DNA es una doble héélicelice

Propuesto porPropuesto por James WatsonJames Watson yyPropuesto por Propuesto por James WatsonJames Watson yyFrancis CrickFrancis Crick en 1953en 1953Basado en datos de difracciBasado en datos de difraccióón de rayos X n de rayos X y estudios de la composiciy estudios de la composicióón qun quíímica del mica del y py p qqDNADNA

Rosalind Elsie Franklin

• Londres,1920-1957

Una fotografía importanteg p

• Cristalograíia de rayos X del DNA B obtenida por Rosalind FranklinRosalind Franklin

• De esta foto se obtuvieron datos cruciales para datos c uc a es pa a proponer la estructura en doble hélice del DNA

Reglas de ChargafReglas de ChargafReglas de ChargafReglas de Chargaf

[A] = [T] y [C] = [G][A] = [T] y [C] = [G]

Apareamiento de bases complementariasApareamiento de bases complementarias

Estructura del DNAEstructura del DNA

•• Vuelta completa de hVuelta completa de héélicelice(360(360°°) es) es 3 4 nm3 4 nm(360(360 ) es ) es 3.4 nm3.4 nm

•• bases espaciadas bases espaciadas .34nm.34nmpp•• 10 bases/vuelta10 bases/vuelta

Modelo de WatsonModelo de Watson--Crick de replicación Crick de replicación

1955: Arthur Kornberg

Descubrió la primera DNA polimerasa en Escherichia colicon la que sintetizó por primera vez ácido desoxiribonu-cleico en el tubo de ensayo

1959: Arthur Kornberg (Stanford University) & Severo Ochoa (NYU)

Central Dogma of BiologyCentral Dogma of Biology

SEVERO OCHOA (1905-1993)

Premio Nobel 1959 N 959

Descubrió la Polinucleótido Polinucleótido fosforilasa: sintetizópor primera vez ácido ribonucleico en el tubo de ensayo

Código genéticoCódigo genético

Algunas contribuciones de la Biotecnología

– Sector farmacéutico: Insulina, hormona de crecimiento,interferones, vacunas, etc

S di bi l B i difi d – Sector medioambiental: Bacterias modificadas parabiodegradar compuestos tóxicos

– Sector agrícola: Plantas transgénicas resistentesa insectos, virus, suelos salinos, etc.

ALGUNOS GENOMAS SECUENCIADOS

Eucariotas Procariotas

Saccharomyces cerevisiaeArabidopsis thalianaO

Escherichia coliBacillus subtilis

Oryza sativaPlasmodium falciparumAnopheles gambiaeT b i

Bacillus anthracisBorrelia burgdorferiChlamydia trachomatisCl t idi f iTrypanosoma brucei

Trypanosoma cruziLeishmania majorDrosophila melanogaster

Clostridium perfringensHaemophilus influenzaeHelicobacter pyloriMycobacterium lepraeDrosophila melanogaster

Caenorhabditis elegansFugu rubripesGallus gallus

Mycobacterium lepraeMycobacterium tuberculosisNeisseria meningitidisSalmonella entericaGallus gallus

Mus musculusRattus norvegicusPan troglodytes

Salmonella entericaSalmonella typhiStaphylococcus aureusStreptpcoccus pneumoniaePan troglodytes

Homo sapiensStreptpcoccus pneumoniaeVibrio choleraeYersinia pestis

30-4000026000

19000

26000Genes

14000

60004000

Genome 4 6 12 1 125 97 180 3200Genome(Mb)

4,6 12,1 125 97 180 3200

E t t tá d dEstructura estándar de un gen

Procesamiento del mRNA

A. RNA editing

B. Alternative splicingp g

• Are we ‘just’ E. coli, except more so?

"Tout ce qui est qvrai pour le C lib ill t Colibacille est vrai pour l'éléphant" vrai pour l éléphant

Jacque Monod (1972) (1972) 1965 Nobel laureate

Humanos y ChimpancésHumanos y Chimpancés

Homo sapiens 99.9% idénticosomo sapiens 99.9% dé cosHomo sapiens y Pan troglodytes 99.0% idénticos

Q é di l ?Qué nos dice el genoma?

Todavía no mucho…

• el mismo tamaño (3 200 millones de nucleotidos)• ~ el mismo tamaño (3.200 millones de nucleotidos)

• ~el mismo número de genes (~25.000)

• los mismos genes• ~los mismos genes

Expresión de genes

Hipótesis: No son las diferencias estructurales de las proteinas, sino las diferencias en su expresión entre los phumanos y los chimpancés lo que da cuenta de nuestra “humanidad ”cuenta de nuestra humanidad.

Telómeros y Telomerasa

1 Los extremos de los cromosomas eucarióticos tienen miles de 1. Los extremos de los cromosomas eucarióticos tienen miles de copias de una secuencia de DNA de 6 nucleótidos (telómeros).

2. Telomerasa, enzima que cataliza la adición de nuevas secuencias repetidas.

3. La ausencia o la mutación de la telomerasa produce acortamiento del cromosoma y división celular limitadaacortamiento del cromosoma y división celular limitada.

SNPs

• Los polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) representan el tipo de variación más frecuente en el DNA de los humanos.

• Ocurren con una frecuencia de 1 por cada 1000 nucleótidos

y tienen una gran importancia en el fenotipo.

Cambio sinónimo: TTA (Leu) a TTG (Leu)Cambio no sinónimo: TTA (Leu) a TTT (Phe)Cambio no sinónimo: TTA (Leu) a TTT (Phe)

AsthmaAutoimmune polyglandular syndrome

Breast and ovarian cancer

Crohn's diseaseDiGeorge syndromeFamilial Mediterranean feverI d fi i ith H I MBurkitt lymphoma

Chronic myeloid leukemiaColon cancer

Immunodeficiency with Hyper-IgMSevere combined immunodeficiency

Alzheimer diseaseLung cancerMalignant melanomaMultiple endocrine neoplasiaN fib t i

Alzheimer diseaseAmyotrophic lateral sclerosisAngelman syndromeCharcot-Marie-Tooth diseaseNeurofibromatosis

p53 tumor suppressorPancreatic cancerProstate cancer

Charcot Marie Tooth diseaseEpilepsyEssential tremorFragile X syndromeProstate cancer

Ras oncogeneRB: retinoblastomavon Hippel-Lindau syndrome

g yFriedreich's ataxiaHuntington diseaseNiemann-Pick diseasevon Hippel-Lindau syndromeParkinson diseasePrader-Willi syndromeRett syndromeSpinocerebellar atrophyWilliams syndrome

BIOMEDICINA

- La mayoría de enfermedades tienen alguna base genética

- Algunas son monogénicas: unas 1500 asociadas a genes de secuencia conocida

- Otras, las más comunes (cáncer, obesidad, cardiopatías)dependen de más de un gen y el medio ambiente desempeña un importante papel

- Hasta ahora se han caracterizado unos 3 millones de SNPs distribuidos a lol d t d l hlargo de todo el genoma humano

El conocimiento de los genes implicados en la enfermedad, de sus mecanismosde control y del efecto de los SNPs y mutaciones permitirá:

1. DIAGNOSTICO: tests genéticos para detectar predisposición a enfermedades

2 PREVENCION: Evitar la exposición a factores ambientales que favorezcan2. PREVENCION: Evitar la exposición a factores ambientales que favorezcanla aparición de enfermedades. Evaluación de riesgos por exposición a contaminantes, agentes químicos o radiaciones.

3. TERAPEUTICA:

- Terapia génicae ap a gé ca- Farmacogenómica: drogas personalizadas. Diseño de medicamentosespecíficos para un patrón genético determinado. Reducción de losefectos secundarios al conocer la capacidad genética del pacientep g ppara asimilarlos.

Genómica ComparadaH R dHumanos vs. Roedores

La mutación c-kit de humanos y ratones tiene fenotipos similaresLa mutación c-kit de humanos y ratones tiene fenotipos similares Puede observarse el mismo tipo de hipopigmentación en ambos organismos

Por tanto los ratones son buenos modelos para estudiarPor tanto los ratones son buenos modelos para estudiarenfermedades humanas

Phage ø29 and Biotechnology

BACTERIOPHAGE φ29 DNA

Enzymatic activities of bacteriophage φ29 DNA polymerasey p g φ p y

M13 DNA REPLICATION BY THE φ29 DNA POLYMERASE

Exonucleasedomain

TPR2

Thumb

Fingers

Palm

TPR1

Exonucleasedomain

TPR2

Thumb

Fingers

Palm

TPR1

BA

.. FRYYD-LRNATAITTFGQMAL...NV---------------------.QINRKLLINSLYGALG

CRB69 /558/

. G EEETKDPVYTPMGVFITAWARYTT..... DVTGKVPYLKEN ALGFRLGSNPKQLAKLMLNSLYGKFACRFFD-PRLASSITMRGHQIM..... T---------------------T.Q-ALKIIMNAFYGVLG

..

..RWYC-KECAESVTAWGRQYI...AYA---------------------RWYC-KECAESVTAWGRHYI..AYAK--------------------

.QRAIKILANSFYGYYG

.QRAIKILANSFYGYYGRWYC-LECAESVTAWGREYI..A... YA--------------------- .QRAIKILANSYYGYYGRWYC ..A... AR-------------------- .-KECAESVTAWGREYIQRAIKILANSYYGYYGY

420398ø29 /379/

.T. gorgonarius /481/Thermococcus sp.9ºN-7P. kodakaraensis

/483//483/

E. coli Pol IITOK DNA pol

/490//483/

Region TPR-2 confers processivity to ø29 DNA polymerase15 33

240 72 15 3.7 1 0.2 0.05

Wild-type ∆TPR2

[DNA pol], nM240 72 15 3.7 1 0.2 0.05

15 33*

33 mer

15 mer

Region TPR-2 is required for strand-displacement activityof ø29 DNA polymerase

15 20 33*

Wild-type1 10 50∆TPR2c

1 10

33 mer

20 mer

15 mer

TP-primed & strand-displacement DNA amplification(Isothermal PCR)(Isothermal PCR)

IN VITRO AMPLIFICATION OF φ29 DNA (19285 bp)

Infectivity of the in vitro-amplified φ29 DNA

D l I ti ió Bá i A li iDe la Investigación Básica a sus Aplicaciones

1989. Patente DNA polimerasa de ø29(Inventores: Luis Blanco, Antonio Bernad, Jose M. Lázaro, Margarita Salas)

2001 Comercialización de la DNA polimerasa de ø292001. Comercialización de la DNA polimerasa de ø29Amersham Biosciences ––> GE Healthcare

Kit Templiphi: amplificación DNA circular

2003 Kit G i hi lifi ió DNA ó i li l2003. Kit Genomiphi: amplificación DNA genómico lineal

A B

C

DD

control pUC18(ng)

pUC18(pg of DNA

added to reaction)

pUC18/DH5α(amount of colonyadded to reaction)

A B DC

Patki, AAmersham Biosciences

Li, W. et alAmersham Biosciences

Li, W. et alAmersham Biosciences

GenomiPhi

-Amplificación de DNA genómico linealp g

- Estudios de genotipadoC ió d - Construcción de genotecas

- Archivos de DNA- Medicina forenseMedicina forense

Improvement of φ29 DNA polymerase amplification performance by fusion ofamplification performance by fusion of DNA binding motifs

Chimera:Chimera:

1. Greek Mythology: a fire-breathing monster with the head of a lion, body of a goat and tail of a snake.

2. Biology: A substance, such as an antibody created from the proteins or genes of two different species.

3. Psicology: A fanciful mental illusion or fabrication.

Collins English Dictionary

φ29 DNA polymerase (HhH)

Modelling of the chimerical DNA polymerase

φ29 DNA polymerase (HhH)2

N terminus

downstream 5´

N‐terminus

TPR2

template tunnel

primerstrand

thumb3´

5´

3´

5

dsDNAmelting

displacedstrand

templatestrand5´

C‐terminus

linkermelting

product double-stranded

tunnel

strand

GTGSGA Stop codon

Scheme of the construction of chimerical DNA polymerases

Stop codon

pJLw2

HindIII29 DNA pol

H I695-751 696-802

BamHI

p

pJLw2derivative

pUC57-(HhH)2

PCR of 29 DNA polymerase gene with primer 3containing the HindIII site, and primer 4 thatadds the sequence coding for the linkerGTGSGA, removes the stop codon and containsa KasI site

PCR of the HhH domains H and I of TopoV withprimer 1 that adds the sequence coding forGTGSGA, and primer 2 which adds the stopcodon and a BamHI site

Primer 4

KasI

29 DNA polymerase

HindIII

GTGSGA

Primer 3

Fragment II

GTGSGA

KasI

Primer 2

BamHI

TopoV-(HhH)2 domains H-I

Primer 1

Fragment I

Digestion with KasI y further ligation with T4 DNA ligase

BamHI

Primer 4Fragment II Primer 2Fragment I

HindIIIPrimer 3

Cloning into the pJLw2 derivative (HindIII-BamHI)chimera 29-HI

29 DNA polymerase GTGSGA

Primer 2

TopoV-(HhH)2 domains H-I

Site-directed mutagenesis to insert a stop codon at the end of (HhH)2 domain H to obtain chimera 29-H

g p ( )

Chimerical DNA polymerases have an improved DNA binding

φ29 DNAP φ29-H φ29-HI

stable DNA pol/DNA complexes

- 1 1 2 2 4 5 9 1 1 2 2 4 5 9 1 1 2 2 4 5 9 [DNA pol] nM

free DNA

1.1 2.2 4.5 9 1.1 2.2 4.5 9 1.1 2.2 4.5 9 [DNA pol], nM

φ29 DNAP φ29 H φ29 HI

Chimerical DNA polymerases show an enhanced Rolling Circle Replication efficiency

A φ29 DNAP φ29-H φ29-HI B

φ29-H

A (n

g)

ssDNA M13unit-length φ29-HI

ynth

esiz

ed D

NA

5 10 5 10 5 10 time min

φ29DNAPSy

C φ29 DNAP φ29-H φ29-HI

5 10 5 10 5 10 time, min time (min)

ssDNA M13ssDNA M13unit-length

60 30 15 7.5 60 30 15 7.5 60 30 15 7.5 [DNA pol], nM

Multiply-primed Rolling Circle Amplification of plasmidic DNA by ø29 DNA polymerase and chimerical DNA polymerases

φ29 DNAP φ29-H φ29-HIDNA polymeraseA

4370-2899-

1933-

1331-

759-

Reaction time, h. 1 2 4 6 1 2 4 6 1 2 4 6

DNA polymeraseB

φ29 DNAP φ29-H φ29-HI

4370-2899-

DNA polymerase φ29 DNAP φ29 H φ29 HI

1933-

1331-

Reaction time, h. 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

759-

Multiply-primed Whole Genome Amplification of genomic DNA with φ29 DNA polymerase and chimerical DNA polymerases

φ29 DNAP φ29-H φ29-HI

6x105

4370-2899 ca

tion

fold 5x105

4x105

3x1052899-1933-1331-

759

Am

plifi

3x10

2x105

1x105

time, h. 2 4 8 16 2 4 8 16 2 4 8 16

759-

Reaction time, h.

CENTRO DE BIOLOGźA MOLECULAR ŅSEVERO OCHOAÓC S I C ŠU A MC.S.I.C.ŠU.A.M.

Grupo ø29 2006–2009

Protein p56 inhibits B. subtilis UDG activity

0 0

UDG 15 nMT G A T G C G C U G T A C C G A T C C C5´*p56 (nM)

S

30 90 270

810

T G A T G C G C ___ G T A C C G A T C C C5´*

+ UDG

5

+ NaOH, Heat

AP site

PT G A T G C G C G T A C C G A T C C C5´*

Therapeutic potential of protein p56

As antiviral agent against herpesvirus, poxvirus and HIV

In Chemotherapy (combined with anti-tumor agents)

“protein p56 inhibits DNA-binding ability of uracil-DNA glycosylase”of uracil DNA glycosylase

Role of p56 as antiviral agent

Herpesvirus(HSV 1 VZV CMV )

Poxvirus(Vaccinia smallpox ) (HSV-1; VZV; CMV…) (Vaccinia, smallpox…)

Viral uracil-DNA glycosylase

“ Important role for replication and infection cycle in non-dividing cells”

Role of p56 as antiviral agent

HIV cellular UDG is incorporated into particles

“Essential for viral life cycle” y

Particleassembly

Release virus core

Vpr-UDGcomplex

Polyprotein withVpr-UDG complex

Reverse transcriptionin presence of Vpr-UDG

nucleus nucleus

complex

provirusprovirus

Role of p56 in chemotherapyRole of p56 in chemotherapy

dUMP dTMPThymidylate

Fluoropyrimidines “Thymineless death”

- depletion of dTTP pool

Methylene tetrahydrofolate

synthase

- Misincorporation of uracil into DNA

DihydrofolateMethylene tetrahydrofolate

DNA synthesis arrests and DNA degradation(block in S-phase)

Tetrahydrofolate

Dihydrofolatereductase

NADP+ NADPH + H+

Antifolates

Role of p56 in chemotherapyRole of p56 in chemotherapy

“Thymineless death”

- depletion of dTTP pool

Antitumor agents treatment in UDG mutants

- depletion of dTTP pool

- Misincorporation of uracil into DNA - Misincorporation of uracil into DNA

DNA synthesis arrest and DNA degradation(block in S-phase)

Dramatic effect (Lethality)

-Arrest in G2-M boundary

-Toxicicity and cell death

Tinkelenberg et al. (2002)

Modelling processivity and strand-displacement in ø29 DNA polymerase

VIRUS DE INTERES SANITARIO QUE INICIAN LA REPLICACION CON PROTEINA TERMINAL

VIRUS DNA ADENOVIRUSVIRUS DNA ADENOVIRUS

VIRUS RNA POLIOVIRUSRINOVIRUSENCEFALOMIOCARDITISHEPATITIS C HEPATITIS C