La ingeniería metabólica de Thermoanaerobacterium saccharolyticum para la producción de n-butanol Ashwini Bhandiwad , A. Joe Shaw , Adam Guss., Anna Guseva., Hubert Bahl.,Lee R.

Esfuerzos para obtener de forma sustentable combustibles a partir de biomasa.

Ha llamado la atención gracias a sus propiedades fisicoquímicas. Menos higroscópico Mayor contenido energético Mayor compatibilidad con la gasolina Menos corrosivo

Thermoanaerobacterium saccharolyticum

Producción de n-butanola concentraciones significativas.

Thermoanaerobacterium saccharolyticum JW/SL-YS485 Ha sido bien caracterizada y extensivamente manipulada.Gram positiva.Termófila.Anaerobia.Aislada del parque nacional de Yellowstone en Estados Unidos y crecen a unas temperaturas entre 45 - 65°C y en un pH entre 4 y 6.8

T. Saccharolyticum es capaz de utilizar gran variedad de azucares encontrados en la biomasa celulósica.

CelobiosaGlucosaXilosaManosaGalactosaArabinosa

Naturalmente competente para manipulaciones genéticas.

También ha sido modificada para la producción de etanol a altas concentraciones mediante la deleción de genes:o Ácidos Orgánicoso H2

Clostridium acetobutylicum

VÍA DEL N-BUTANOL

Flavoproteínas de transferencia de

electrones subunidad A y B y

la enzima bi-funcional aldehído

alcohol deshidrogenasa.

Ezimas: tiolasa, β-hidroxibutiril CoA deshidrogenasa,

crotonasas, butirilo CoA

deshidrogenasa

Genes implicados: thl, hbd, crt, bcd, etfA, etfAB, adhE2

and adhE1

Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum cepa DSM 571

Produce N-BUTANOL pero inconsistentemente

La via no ha sido caracterizada, pero se han encontrado genes responsables de la producción de N-BUTANOL en su genoma, recientemente secuenciado.

Los genes crt, bcd, etfB, etfA, hbd y thl son parte de un operón, responsable de la formación de butiril CoA.

Thermoanaerobacterium saccharolyticum cepa JW/SL-YS485

Termófilo(45 y 65 C) estrechamente relacionado con T. thermosaccharolyticum

Caracterizado y desarrollado ampliamente

Gram +

Anaerobio

pH 4.0 y 6.8

Variedad de azucares: celobiosa, glucosa, xilosa,

manosa, galactosa, arabinosa.

Hidroliza el xilano, manano, almidón y pectina.

Propio para manipulación genética.

Utilizado para la producción de etanol

Conveniente para la producción de N-BUTANOL

Cepas y condiciones de crecimiento bacteriano

Experimentos de transformación T. saccharolyticum

Medio TSC1 5 g de celobiosa fuente de C

El pH se ajustó a 6,7 para la selección en kanamicinaComparaciones de crecimiento

Medio TSD La fuente de carbono fue de 10 g de xilosa

pH se ajustó a 6,1.E.coli

medio LBpeptona de caseína y el extracto de levaduraSaccharomyces cerevisiae

YPDExtracto de peptona, glucosa y dextrosa

METODOLOGÍA

Construcción de plásmidos Tecnicas de clonación con levaduras estándar Construcción de plásmidos que expresan genes individuales de la vía de n-butano

Gen/Cluster de interés para la codificación de cada paso enzimático en T.

thermosaccharolyticum

Gen/cluster de interés para la codificación de cada paso enzimático en C.

acetobutylicum ATCC824

thl (Tthe_1656) DSM571

hbd (The_1657) adhE2 (CA_P0035)

crt (Tthe_1661)

bcd (Tthe_1660)

etfA (The_1658)

etfB (The_1659)

Son fusionados con el promotor pta-ack de T. saccharolyticum silvestre

Los genes fueron individualmente clonados en el plásmido pYC2 / CT para la inserción cromosómica de un casete genético para la resistencia a la kinamicina.

El plásmido pBu24 se construyó en E. coli utilizando el montaje Gibson para la expresión de la totalidad de la vía de n-butanol.

Construcción de cepas de T. saccharolyticum

El ADN para la transformación fue amplificado mediante PCR incluidas las regiones del locus pta -ACK y el gen de resistencia a la kanamicina.

La cepa M0355 homo – etanologénica de T. saccharolytcum se transformó con los productos de PCR para crear cepas Athl , Ahbd , ACRT , Abcd - etfAB y AadhE.

La transformación del plásmido no replicativo, pBu24 se intento en cuatro cepas de T. saccharolyticum para la integración cromosómica del tipo salvaje:

M0210

M0350

M0355

• Cámara anaeróbica

• Inoculacion 10 mL de medio TSC1

1 μL de la cepa parental congelada1ml del cultivo se añadió a tubos que contenían 500ng de ADN lineal o plasmido.

• Incubacion: 15-18 Hrs 55ºC

• Las diluciones se suspendieron en TSC1 fundido pH 6,7 y se deja solidificar antes de la incubación

Cinco colonias de T. saccharolyticum

resistentes a la kanamicina por experimento de

transformación, fueron evaluadas por la

integración cromosomal por PCR, usando primers

externos al sitio de integración, siguiendo la

secuencia de verificación.

Ensayos enzimáticos

Preparación de extractos libres de células

Se obtuvo por centrifugación a 14.000 g durante 25 min y la eliminación de los restos celulares.

Concentración de proteínas reactivo de Bradford

Absorbancia Espectrofotómetro

Tiolasa escisión del Acetil CoA

La actividad de la β-Hydroxybutyryl CoA dehidrogenasa Consumo de NADPH

Crotonasa hidratación del crotonil CoA

Actividad de la Butiril CoA dehidrogenasa:

1. Disminución en la absorbancia y consumo de ferroceno

2. Monitoreo del consumo de NADH

 

Butiraldehído deshidrogenasa Consumo de NADPH (cofactor)

Butanol deshidrogenasa

Metodos de análisis

Productos de fermentación cromatografía líquida

Detección de la metabolitos Índice De refracción

El hidrógeno cromatografía de gases.

Carbono y electrones de equilibrio

Balances de carbono calculo de moles de carbono en los productos y los sustratos consumidos el CO2 era representado por la producción estequiometria del acido acético, etanol y butanol.

Carbono en el peso celular seco fórmula general para la composición de células.

Balances de electrones electrones disponibles por mol del sustrato y de los productos

Resultados SE DIVIDEN EN 2 PARTES Se evaluó la expresión heteróloga de las enzimas de la vía de producción de n-butanol (una a la vez) en T. saccharolyticum. Los organismos fuente fueron T. thermosaccharolyticum y C. acetobutylicum.

Después de la evaluación de las enzimas individuales, se expresó la vía completa en 2 cepas de T. saccharolyticum para demostrar la producción heteróloga n-butanol.

T.t, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum; T.s., Thermoanaerobacterium saccharolyticum; C.a., Clostridium acetobutylicum; C.k., Clostridium kluyveri.

Cepas parentales El T. saccharolyticum - WT, M0355 y M0210 - no mostraron actividad

detectable

Las actividades de las dos primeraas en T.

saccharolyticum fueron de aproximadamente 1,5-3

veces menor que las actividades medidas para

C. acetobutylicum

T.t, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum; T.s., Thermoanaerobacterium saccharolyticum; C.a., Clostridium acetobutylicum; C.k., Clostridium kluyveri.

Actividad global de las tres cepas de ingeniería - Aadhe, I2B y M0210-V - se

han mejorado en comparación con el cepas

parentales - M0355, M0210 y WT.

Fig. 3. Vía metabólica para la producción de n-butanol en T. saccharolyticum.

fig. 4. curvas de crecimiento que representan las fermentaciones de productos finales de cepas de T. saccharolyticum hasta 60 h

(A) WT, (B) I2B, (C) M0210, y (D) M0210-V

La producción de etanol se reduce en

aproximadamente 50% en respuesta a la producción

de butanol

La producción de ácido acético aumenta en 46% y 67% en las

cepas I2B y M0210-V, respectivamente

Discusión y conclusiones En este estudio se demostró la producción heteróloga de n-butanol en un huésped termofílico T. saccharolyticum.

La producción de n-butanol a través de una vía metabólica sintética fue lograda en WT (wild type) y la cepa Del-ldh de T. saccharolyticum; esto no fue demostrable en cepas donde la producción de acetato era deficiente.

Hay una aparente letalidad en la producción de n-butanol SI NO SE PRODUCE TAMBIÉN ácido acético.

Se observó que la producción de acetato incrementó en las cepas productoras de butanol 12B y M0210-V

Discusión y conclusiones La vía que produce n-butanol en C.acetobutylicum a partir de glucosa requiere 2 acetil-coA, dos NADH y dos NADPH por cada molécula de n-butanol que se produce.

Sin embargo, un investigador determinó que se necesitan tres NADH no 2. Algo similar se encontró en los experimentos que se llevaron a cabo en este estudio.