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49Laboratorio Actual • Año 25 • No. 41 • Octubre de 2009

LA INFLUENZA A(H1N1)*

Inés García Rodríguez**

I N M U N O L O G Í A

* El presente artículo se elaboró con base en la revisión de docu-mentos estadísticos de Salud Pública, Informes de la OMS, Datos tomados por Internet del Manual WHO Genova 2005, Manual Vigilancia MPS.** Bacterióloga Universidad Javeriana, MSc Microbiología Lon-don University, Gerencia y Administración de Salud CEAD e-mail: [email protected]

La cepa H1N1 o H1N1 humana es un subtipo de Influenzavirus tipo A del virus de la gripe per-teneciente a la familia de los Orthomyxoviridae.

El H1N1 ha mutado en diversos subtipos que inclu-yen la gripe española (extinta en la vida Silvestre), la gripe porcina, la gripe aviar y la gripe bovina. La cepa mantiene su circulación después de haber sido reintro-ducida en la población humana en los años 1970.

Cuando se comparó el virus de 1918 con el actual, el virólogo Jeffery taubenberger descubrió que únicamen-te hubo alteraciones en solo 25 a 30 aminoácidos de los 4.400 que componen el virus. Estos ligeros cambios pueden convertir al virus en una mortífera enfermedad que se puede transmitir persona a persona.

Actualmente, existen algunas mutaciones del virus H1N1 en la vida silvestre, causando al menos la mitad de infecciones de gripe ocurridas durante el año 2006.

Desde mediados de marzo del 2009, al menos 900 casos mortales han ocurrido en Europa y América por la pandemia de una nueva cepa de H1N1, otras 100 muertes en México aún no están oficialmente confirma-das como casos de influenza H1N1. Avanza la Influenza A (H1N1) en Colombia

Hasta el pasado 29 de Junio en Colombia se habían presentado 2.309 alertas de posibles sintomáticos con antecedentes de viaje a áreas afectadas o de contacto con casos de Influenza A(H1N1), 759 casos sospecho-

sos, 88 casos confirmados(incluyendo 2 fallecimientos), 9 casos probables y 1.440 casos descartados (1.283 por laboratorio y 157 que no cumplen definición de caso).

Los casos confirmados a 28 de Junio, eran: 4 en Cundinamarca, 29 en Bogotá (incluidos 2 fallecimien-tos),10 en Cali - Valle del Cauca, 1 en Sevilla - Valle del Cauca, 9 en Yopal - Casanare, 9 en Medellín - Antio-quia, 1 en Guatapé - Antioquia, 1 en Itaguí - Antioquia, 1 en Cartagena - Bolívar, 9 en Barranquilla - Atlántico, 3 en Santander, 1 en Risaralda y 2 en tunja - Boyacá.

Colombia fue el primer país de Suramérica en detec-tar presencia de la enfermedad, el pasado 3 de Mayo. La primera víctima del virus, una mujer de 24 años fa-lleció el 5 de Junio en el Hospital de Meissen en Bogotá donde fue internada por una fuerte neumonía.

El 19 de Junio falleció también en Bogotá un pacien-te de 28 años, que 2 días antes presentó un caso bas-tante agresivo, extenso y fulminante por complicaciones asociadas al virus A(H1N1). Según autoridades sanita-rias en ambos casos las víctimas no tuvieron contacto con nadie que hubiera viajado al exterior, por tanto se plantean como casos de “circulación autóctona del vi-rus”.

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PRIMERA PANDEMIA DEL SIGLO XXI

La Organización Mundial de la Salud (OMS) declaró el pasado 11 de Junio la fase 6 de alerta por el virus In-fluenza A (H1N1), esto declara la primera pandemia del siglo XXI ante pruebas incuestio nables de una propaga-ción comunitaria del nuevo virus en varios paises de las diferentes regiones de la OMS. El nivel 6 es caracterizado por la existencia de una transmisión elevada y sostenida en el mundo, en una situación de pandemia declarada, implicando diseminación y no mayor gravedad.

La directora de la OMS Margareth Chan, recono-ció “el virus no puede ser detenido”, explicó, el virus A (H1N1) se transmite entre humanos, pero la pandemia es moderada y se espera no llegar a un aumento dra-mático de infectados. Se mostró preocupada por el im-previsible comportamiento de un patógeno infectando sobre todo a jóvenes menores de 25 años.

Hasta el día 30 de junio se habían notificado ofi-cialmente 77.250 casos de influenza A (H1N1) en 120 países y el total de fallecidos era de 332 personas. Hasta agosto 25/09 se habían registrado en Colombia 507 ca-sos positivos y 29 fallecimientos.

NOMENCLATURA

todos los Influenzavirus tipo A están categorizados de acuerdo a las 2 proteínas encontradas en la super-

ficie del virus Hemaglutinina (H) y Neuraminidasa (N). todos los virus de influenza contienen estas proteínas, pero la estructura de las proteínas difiere de cepa a cepa debido a una rápida mutación genética en el genoma viral.

Las cepas del virus Influenza A tienen asignada la nomenclatura H-Número y N-Número según las varian-tes de las 2 proteínas que contiene. Hay 16 subtipos H y 9 subtipos N, conocidos en aves. Solo 3 H y 2 N se encuentran en humanos.

(HA) Hemaglutinina

(NA) Neuraminidasa

enco-desUS1 and NEP

1918“Spanish influenza”

1957“Spanish influenza”

1968“Hong Kong influenza”

Nextpandemic influenza

Avian virusor

H3N2human virus

H3avian virus

H2N2human virus

H3N2 influenza virus

H3avian virus

Reassortment

H2N2 influenza virusH1N1 influenza virus

H1N1human virus

H2N2avian virus

Bird-to-humantransmission of H1N1 virus

Neuraminidase

ReassortmentHaemagglutinin

All eight genetic segmentsthought to have originatedfrom avian influenza virus

three new genetic segments fromavian influenza virus introduced

(H, N, PB1); contained fiveRNA segments from 1918

two new genetic segments fromavian influenza virus introduced

(H, PB1); contained fiveRNA segments from 1918

All eight genes new orfurther derivative of

1918 virus

Copyright © 2006 Nature Publishing GroupNature Reviews Y Drug Discovery


FISIOPATOLOGÍA

Los virus de Influenza se enlazan mediante hema-glutinina en residuos de azúcares de ácido siálico en las superficies de las células epiteliales; típicamente en la nariz, garganta y pulmones de mamíferos o en el intesti-no de las aves.

SINTOMATOLOGÍA

En la mayoría de los casos de infección por el subti-po H1N1 se manifiesta de forma similar y con síntomas clásicos a cualquier caso de infección por gripe común (influenza tipo A), Aumenta la secreción nasal, tos, dolor de garganta, fiebre alta (mayor a 38°C), malestar gene-ral, pérdida de apetito, dolor en articulaciones, vómito, diarrea, y en casos de mala evolución, desorientación y perdida de conciencia. Los individuos inmunosuprimi-dos sufren mayor agresión del virus, y pueden contraer neumonía fácilmente.

GRUPOS POBLACIONALES MÁSVULNERABLES

Las personas mayores de 65 años.Los niños entre 6 meses y 2 años.Embarazadas cursando el 2° y 3° trimestre de gestaciónNiños prematuros con peso menor a 1.500 gramos.Paciente con afecciones crónicas en sistema cardiovas-cular y pulmonar.Pacientes con insuficiencia renal y enfermedades meta-bólicas.Pacientes inmunosuprimidos. Niños y Adolescentes con terapia prolongada con ácido acetilsalicílico (Aspirina).

COMPORTAMIENTO Y TRANSMISIÓNDEL VIRUS

La transmisión del virus H1N1 se produce por vía respiratoria principalmente por gotas de saliva produci-

das por la tos o estornudos y por contacto con las super-ficies contaminadas. Esto ocurre desde un día previo al inicio de síntomas y hasta 7 días después del inicio.

Los síntomas son similares a los de la influenza esta-cional, fiebre, tos, mialgias, odinofagia, cefalea, letargia, en algunas personas se presenta secreción nasal, náu-seas, vómito y diarrea.

REMISIÓN Y TRATAMIENTO DEL VIRUS

Se hará de acuerdo a la GUÍA DE EStUDIO Y MA-NEJO DE CASOS Y SUS CONtACtOS PARA ENFER-MEDAD SIMILAR A INFLUENZA incluyendo diagnós-tico, manejo clínico y terapéutico con los lineamientos emitidos por Ministerio de Protección Social (MPS) y Secretaría Distrital de Salud (SDS).

Los antivirales utilizados pueden variar en la medida que se disponga de más información sobre su eficacia, el espectro clínico de la enfermedad, eventos adversos y susceptibilidad. La formulación es responsabilidad del médico tratante.

La presentación de OSELtAMIVIR en cápsulas, dis-ponible a la fecha está indicada para tratamiento en adultos. Es necesario tener en cuenta para el uso pediá-trico debe diluirse según las indicaciones del laboratorio fabricante, procedimiento cuya responsabilidad tiene el servicio farmacéutico en cada institución.

La Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos (FDA por su sigla en inglés), autorizó el uso de tAMIFLU y RELENZA en casos de emergencia y una prueba de diagnóstico para ayudar a controlar una nueva cepa de gripe porcina.

Al respecto, se tiene un ensayo Quick View para In-fluenza tipo A y B, que está compuesto por un hisopo largo, que es bañado en una solución sensible que de-tecta, por medio del color el virus. El hisopo se introdu-ce en la nariz, en la zona más profunda y con sólo unos segundos de estar en el área es suficiente para absorver parte del virus; luego se introduce en una solución que colorea (de acuerdo a diversas tonalidades ya preesta-blecidas) y si , tiene cierto tono, es virus de la Influenza, ya sea tipo A o B. Sólo se requieren diez minutos para que el hisopo se tiña de cierto color, lo cual es funda-mental para lograr un diagnóstico adecuado. también, se cuenta con la prueba diagnóstico rRt-PCR Swine Flu Panel que fue autorizado por la (FDA) para analizar muestras de pacientes de gripe a fin de determinar, si tienen la nueva cepa.

Laboratorios calificados pueden usar en caso de ur-gencia el Panel en tiempo Real - PCR para la detec-ción del Virus de la Influenza en presuntos casos para diagnosticar la nueva cepa H1N1. Este panel está au-torizado solamente para uso en individuos que hayan


sido diagnosticados con Influenza A y que no puedan ser diagnosticados por la metodología actual aprobada por la (FDA).

El análisis debe realizarse siguiendo adecuadamente las instrucciones para su uso, y con las limitaciones que presenta. Este panel para detección in vitro del virus, utiliza hisopos de muestras nasofaríngeas y/o nasales de pacientes con signos y síntomas de enfermedad infeccio-sa y cultivo viral para detección de Influenza A(H1N1), y se realiza en un equipo de Applied Byosistems 7500 Fast Dx Real time PCR. Los laboratorios calificados para realizar este proceso deben reportar sus resultados a las autoridades de salud de su país, y el Centro de Control de las Enfermedades (CDC por sus siglas en inglés) en Washington, D.C. será quien realice el seguimiento de los eventos.

OPERADORES DE SALUD Y BIOSEGURIDAD

Se debe aplicar las máximas medidas de bioseguri-dad durante la atención de los pacientes. Utilizar siem-pre elementos de protección personal y desecharlos de acuerdo a las normas de bioseguridad y el plan de ges-tión integral de residuos hospitalarios y similares.

Después de toda atención los profesionales de salud deben aplicar el protocolo universal de lavado de ma-nos.

TéCnICa Para El lavadO dE manOsdE ruTIna

Humedecer las manos con abun-dante agua.

Aplicar un promedio de 5 c.c. del jabón líquido antiséptico, prefe-riblemente con componente yo-dado.

Frotar palmas y dorsos 5 cm por encima de la muñeca.

Frotar dedo por dedo, espacios in-terdigitales y las uñas.

Enjuagar con abundante agua para que sea efectivo el lavado.

Finalizar secando con toalla dese-chable preferiblemente.

BIOSEGURIDAD PARA PREVENIR INFECCIÓN DEL VIRUS A(H1N1)

* Medidas de distancia social y aislamiento de perso-nas con infección respiratoria.

* Usar tapabocas las personas con gripa.

* No saludar de beso, ni de mano.

* Ventilar y permitir entrada del sol en casa, oficina y lugares cerrados.

* No compartir alimentos, vasos, cubiertos.

* Mantener limpias las cubiertas de cocina, baños, ma-nijas, barandas, juguetes, teléfonos y demás objetos de uso común.

* Estar abrigado y evitar cambios bruscos de tempera-tura.

* Comer frutas y verduras ricas en vitamina A y C (za-nahoria, papaya, guayaba, naranja, lima, limón y piña).

* Lavar las manos frecuentemente con agua y jabón.

* Evitar exposición a contaminantes ambientales.

* No fumar en lugares cerrados ni cerca de niños, an-cianos o enfermos.

* Acudir al médico inmediatamente presente signos de alarma como tos, fiebre de 38°C o más.

* No asistir a actividades masivas con síndrome gripal, usar tapaboca.

TOMA DE MUESTRA EN PACIENTEAMBULATORIO Condiciones generales del paciente para la toma de muestra Antes de realizar cualquier procedimiento, explique al paciente el procedimiento a realizar y las molestias que


éste le puede causar. Sin embargo, aclare la necesidad de realizarlo con su colaboración para tener éxito en el procedimiento y obtener una muestra adecuada para la identificación viral. El paciente debe ubicarse en una silla cómoda, con la cabeza ligeramente inclinada hacia atrás para proceder a realizar según elección la siguiente toma de muestra.

Tracto respiratorio superior

Procedimiento para la toma de muestra de Hisopado/Frotis faríngeo.

1. Pida al paciente que abra la boca y saque la lengua, repitiendo rei-teradamente la letra “a” con el fin de mantener la faringe cerra-da.

2. Con la ayuda de un bajalenguas, presione la lengua. La manipu-lación en este momento de la toma de muestra es de gran im-portancia para evitar la lengua y la contaminación que de ella se derive.

3. tome el hisopo, colóquelo en la parte posterior y superior de la faringe, lo más cercano a la nasofaringe.

4. Luego rote el hisopo por la parte posterior de las tonsilas, median-te movimiento enérgico rotatorio y a la vez de arriba hacia aba-jo, con el fin de lograr obtener el mayor número de celulas.

5. Coloque el hisopo con la mues-tra en el vial medio de transpor-te viral o virocult® y marque el recipiente (nombre, apellidos, edad, fecha y hora).

El medio VIRAL contiene BHI + Albúmina + Fungizone + Gentamicina.Los hisopos utilizados deben ser en dacron, ra-yón o fibra poliéster, no de algodón.

1. Insertar un escobillón en la ventana nasal, paralelo al paladar, y deslizar por el piso de la mucosa permaneciendo en el lugar por unos se-gundos.

2. Rotar el escobillón lentamente.

3. Colocar el escobillón en el vial que contiene el medio de transporte viral, cortar el resto del escobillón y tapar el vial.

4. Marcar el recipientede la muestra.

Procedimiento para la toma de Hisopado/Frotis nasal

1. Insertar el escobillón en la ventana nasal paralela al paladar. Deslizar por la mucosa del piso de la fosa nasal hasta tocar la pared posterior de la faringe, ase-gurándose que se encuentra en el área de la nasofa-ringe.

2. Frotar la zona de la nasofaringe haciendo girar el es-cobillón para obtener una buena cantidad de células epiteliales.

3. Retirar lentamente el escobillón con movimiento gi-ratorio para absorber las secreciones.

4. Repetir el procedimiento en la otra ventana nasal uti-lizando otro hisopo.

5. Colocar los escobillones en el vial que contiene el medio de transporte viral, corte el resto del escobi-llón y tape el vial.

6. Marcar el recipiente de la muestra.

Procedimiento para la toma de Hisopado/Frotis nasofaríngeo


Si la muestra es depositada en:

Medio de transporte viral INS Virocult©

CONSERVACIÓN DE LAS MUEStRAS SEGÚN MEDIO

Medio de transporte viral INS Virocult©

tiempo temperatura tiempo temperatura

1 semana 4ºC a 8ªC 2 días 4ºC a 8ºC

2 meses (-) 20ºC No debe ser congelada 6 - 8 meses (-) 70ºC

Si la muestra es de aspirado nasofaríngeo, aspirado bronquialo lavado broncoalveolar los cuales se obtienen con solución

salina estéril en ausencia del medio de transporte viral bajo losparámetros del INS, deben refrigerarse inmediatamente y

transportarse al LSP a la mayor brevedad (antes de 24 horas).

CONSERVACIÓN DE MUESTRAS

Siempre habrá que adoptar las precauciones convencio-nales y aplicar métodos de protección de barrera cada vez que se obtengan muestras de pacientes, conservan-do la cadena de frío.

aislamiento del virus

TRANSPORTE DE MUESTRAS

Desde el consultorio al laboratorio, al interior de la institución. El recipiente que contiene la muestra o re-

cipiente primario debe ser a prueba de fugas (debe ser tapa rosca) y colocado de tal forma que conserve la po-sición vertical (en gradilla u otro soporte).

El recipiente secundario o de transporte que con-tiene las muestras debe ser de plástico, hermético y a prueba de fugas de líquido. Además debe contar con la respectiva identificación que incluye: nombre del pa-ciente, número de historia clínica, tipo de análisis y/o breve descripción del cuadro clínico. No se debe envol-ver alrededor del tubo o del recipiente primario, sino que se debe colocar por separado preferentemente en bolsas plásticas.

El transporte de material infeccioso está sometido a reglamentaciones nacionales e internacionales según las especificaciones de Naciones Unidas de la División en que están incluidas sustancias infecciosas.

Características del embalaje

El embalaje debe ser de buena calidad lo suficiente-mente fuerte, para soportar golpes y cargas que normal-mente se presentan durante el transporte.

Deben estar cerrados para prevenir pérdida del con-tenido causado bajo las condiciones normales del trans-porte, vibración, o por cambios de temperatura, hume-dad o la presión.

El embalaje debe tener 3 componentes:

recipiente Principal o Primario hermético éste contiene la muestra debidamente rotulada y envuelta en material absorbente, para contener los líquidos en caso de rotura.

Embalaje secundario hermético resistente e im-permeable, éste contiene y protege el envase primario, debe resistir presión de 95kpa(0,95bar) a temperaturas de -40°C a 55°C debe ser asegurado con respecto al embalaje terciario con material acolchado, cartón aca-nalado o cavidad peltrada.

El embalaje Exterior o Terciario debe ser rígido y proteger el empaque secundario y su contenido, debe llevar etiquetas que indiquen posición del paquete.

PROCEDIMIENTO DEINMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

De acuerdo a la “Prueba de inmunofluorescencia indirec-ta para virus respiratorios”, Código: MEN-R02003-5006, 4.7 Descripción de la técnica.


Identificación diagnóstica del virus

Prueba de inmunofluorescencia indirecta para virus respiratorios, MEN R02003-5006. Descripción de 4.7 la técnica.

Muestras: Hisopado faringeo, aspiradosnasales o laxados broncoalveolares.

Definiciones de caso según protocolo deEnfermedad Similar a la Influenza.

Paciente

Retirar el escobillón

Vortex

Centrifugar el vial a 1700 rpm durante10 minutos a 4ºC.

Separar el sobrenadante yconservarlo en un vial plástico

a -70ºC

Lavar el pellet de célulascon PBS pH 7.2

Vortex

Centrifugar el vial a 1700 rpmdurante 10 minutos a 4ºC

Decantar elsobrenadante

Adicionar al vial decantado,alrededor de 1,5 ml de PBS

Vortex

Centrifugar el vial a 1700 rpmdurante 10 minutos a 4ºC


Adicionar al vial decantado,alrededor de 1,5 ml de PBS

IFI

4.7.1.14

4.7.1.15

4.7.1.16

4.7.1.5

4.7.1.11

4.7.1.12

4.7.1.13


Prueba de inmunofluorescencia indirecta para virus respiratorios, MEN-R02003-5006, 4.7 Descripción de la técnica, parte 1.

Resuspender el pellet celular conmínimo 50 ml de PBS pH 7.2.

Homogenizar hasta obteneruna suspensión opalescente


Mezclar muy bien y agregar10 ml a cada pozo

Agregar Acetona helada,dejar secar durante 10 minutos

Dejar secar

1. InfluenzaA2. InfluenzaB3. Virus Sincitial Respiratorio4. Adenovirus5. Parainfluenza16. Parainfluenza27. Parainfluenza38. Control Negativo9. Pool

1 2 6543 7 8 9

4.7.1.16

4.7.1.17

4.7.1.18

4.7.1.19



1 98765432

1 98765432

1 98765432

Dejar secar al aire dentro de lacámara de seguridad biológica

Incubar a 37ºC durante 30 minutosen una cámara húmeda

4.7.2

4.7.2.2

4.7.2.3

4.7.2.4

4.7.2.4

Agregar 1 gota de anticuerpo monoclonalespecífico para la identificación de cada virus.

Escurrir fuertemente y de manera horizontal.

Colocar el portaobjetos en un recipiente de Co-plin y cubrir con PBS Tween 20/azida de sodio y otro con agua destilada de 3 a 5 minutos cada uno.

Agregar suficiente FIT C-labeled Anti-Mouse IgG Conjugate, para cubrir las células.

PBS



1 98765432

Incubar a 37ºC durante 30 minutosen una cámara húmeda

Dejar secar al aire dentro de lacámara de seguridad biológica

1 98765432

4.7.2.3

4.7.2.7

4.7.2.8

4.7.2.9

4.7.2.10

Escurrir fuertemente y de manera horizontal

Colocar el portaobjetos en un recipiente de Coplin y realizar 2 lavados con PBS Tween 20/azida de sodio uno de 2 minutos y el otro de 3-5 minutos.

Colocar el portaobjetos en un recipiente de Coplin y realizar 2 lavados con agua destilada uno de dos minutos y el otro de 3-5 minutos.

Colocar una gota de líquido demontaje a cada pozo con laminilla

H20

PBS

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