Bol. San. Veg. Plagas, 30: 519-532, 2004

La digestión de carbohidratos en las larvas del gorgojo rojo delas palmeras Rhynchophorus ferrugineus (Olivier, 1790)(Coleoptera: Curculionidae)

F.J. ALARCÓN, A. PEREGRINA, T.F. MARTÍNEZ, J.G. MAYORAL, P. BARRANCO

En este trabajo se estudia la evolución de la actividad amilolítica de Rhynchophorusferrugineus durante su desarrollo larvario por técnicas bioquímicas y electroforáticas.Los resultados confirmaron la presencia de amilasas en larvas neonatas antes de su pri-mera alimentación exógena. Durante todo su desarrollo, las larvas presentaron el mismopatrón de enzimas constituido por cuatro isoformas de bajo peso molecular (16 a 20kDa). Paralelamente, se estudió la respuesta de las larvas a la ingestión de diferentes die-tas. Se comprobó que las larvas alimentadas con dietas que sólo contenían carbohidra-tos purificados presentaron menores crecimientos y niveles de actividad amilasa diges-tiva. Este efecto fue revertido al añadir una fuente de proteína adicional a la dieta. Laestrecha relación encontrada entre el peso de la larva y su actividad amilasa digestiva(R^ = 0,769) indica que la secreción amilolítica está determinada por el tamaño de laslarvas y no tanto por la dieta ingerida. Los estudios electroforéticos mostraron que todaslas larvas, independientemente de la dieta consumida, presentaron el mismo patrón deisoenzimas. Los resultados obtenidos apuntan que las amilasas de Rhynchophorus ferru-gineus podrían ser enzimas diana en el desarrollo de futuras estrategias de control basa-das en inhibidores de amilasas.

F.J. ALARCÓN, A. PEREGRINA, T.F. MARTÍNEZ, J.G. MAYORAL, P. BARRANCO: Departa-mento de Biología Aplicada. CITE II-B. Universidad de Almería. La Cañada de SanUrbano, 04120 Almería, e-mail: falarcon@ual.es

Palabras clave: amilasa, carbohidratos, Coleoptera, Curculionidae, digestión, desa-rrollo larvario, electroforesis, Rhynchophorus ferrugineus

INTRODUCCIÓN

Ante la demanda creciente de productosagrícolas es necesario potenciar el desarrollode nuevas estrategias de producción basadasen programas de control integrado que com-binen diversas prácticas, entre las cuales seincluya el uso racional de plaguicidas, peroal mismo tiempo se exploren nuevas estrate-gias. De este modo, en una cuantía que porahora no supera el 5%, se usan también losdenominados bioinsecticidas, algunos de loscuales tienen un origen biológico (GATEHOU-

SE et al., 1992). Uno de los fines de este tipo

de prácticas es la obtención de plantas resis-tentes que contengan en sus tejidos bioinsec-ticidas y, por tanto, les confieran altos nive-les intrínsecos de resistencia a los insectos.

Las plantas, de manera natural, poseen ypueden desarrollar sus propias defensas quí-micas contra los insectos que atacan sus teji-dos. Entre las numerosas clases de fitoquí-micos naturales destacan las lectinas (CHRIS-

PEELS y RAIKHEL, 1991), compuestos fenóli-cos (SUMMERS y FELTON, 1994) e inhibidoresde enzimas digestivas (WOLFSON y MUR-

DOCK, 1995). Uno de los enfoques actualesen la búsqueda de nuevos bioinsecticidas se

ha orientado hacia la utilización de las pro-pias defensas químicas de las plantas. Lamayoría de estas sustancias tienen en comúnque ejercen su acción en el sistema digestivodel insecto. Es por ello que para el desarro-llo de estos métodos alternativos de controlresulta necesario conocer tanto la bioquími-ca y fisiología digestiva de los insectos queson plaga de cultivos agrícolas como losmecanismos y modos de acción de estosinsecticidas naturales.

Hasta la fecha, la eficacia de estas sustan-cias se determina mediante tres aproxima-ciones progresivamente más complejas. Enuna primera aproximación se realizan ensa-yos "in vitro" en los que se evalúa el efecto ymodo de acción de estas sustancias. En estesentido, generalmente lo primero que serequiere antes de iniciar una estrategia deeste tipo es conocer con detalle el tipo y lascaracterísticas de las enzimas que actúan enel sistema digestivo de la especie en cues-tión. Obviamente, en estos estudios de labo-ratorio no se puede evaluar la respuesta fisio-lógica del insecto a los tratamientos. En lasegunda aproximación, las sustancias a eva-luar, que previamente se han confirmadocomo posibles bioinsecticidas, se incorporanen un alimento artificial de composiciónconocida, analizándose "m vivo" el efecto deésta sobre la fisiología, crecimiento y desa-rrollo de los insectos. En una última etapa serealizan ensayos "m planta" en los que final-mente se evalúa el efecto real de esta sustan-cia sobre dicho insecto después de incorpo-rarla a la planta mediante técnicas molecula-res. Como puede deducirse el desarrollo decada etapa se sustenta en los resultados obte-nidos en la fase previa y se requieren pobla-ciones de insectos establecidas en laborato-rio que puedan emplearse como modelo bio-lógico experimental.

En el Laboratorio de Entomología Agrí-cola de la Universidad de Almería se cuentacon una población estable de gorgojo rojo delas palmeras (Rhynchophorus ferrugineus,Olivier, 1790) desde 1996. Este coleópterofue introducido en España a través de palme-ras ornamentales importadas y está causando

daños graves en palmeras del género Phoe-nix, especialmente en Phoenix canariensis(BARRANCO et al., 1996 a y b). Gracias almantenimiento de esta población de labora-torio se han podido conocer importantesdatos sobre su biología. Aunque se trata deuna plaga de plantas ornamentales y, ennuestro país, no tiene importancia comoplaga de cultivos agrícolas, es importantedestacar el hecho de que puede constituir unMODELO BIOLÓGICO potencial paraconocer los mecanismos y modos de acciónde futuros bioinsecticidas a los tres nivelesdescritos anteriormente y que los resultadosobtenidos para esta especie podrían serextrapolados a otros insectos plaga. A todolo anterior se une su facilidad de cría enlaboratorio con alimento artificial y el grantamaño de sus larvas que facilita cualquiertipo de estudio sobre su fisiología digestiva.Recientes estudios llevados por ALARCÓN etal. (2002) han dilucidado distintos aspectosde la fisiología digestiva del Rhynchophorusferrugineus en relación con los mecanismosde acción de las enzimas responsables de laactividad proteolítica de este insecto, asícomo los efectos de distintas dietas sobre elfuncionamiento de las mismas. Adicional-mente al estudio de la actividad proteolítica,se ha puesto de manifiesto que esta especieposee un equipamiento enzimático capaz dehidrolizar carbohidratos solubles (MARTÍNEZet al., 2000). De hecho, las plantas de las queestos animales se alimentan se caracterizanpor su alto contenido en carbohidratos, a lavez que su relativamente baja concentraciónde proteínas (ALARCÓN et al., 2002). A pesarde la preponderancia de los carbohidratos enla dieta de ésta y otras muchas especies deinsectos plaga (PUEYO et al., 1995), puedeafirmarse, hablando en términos generales,que el conocimiento de las enzimas amilasasy otras carbohidrasas digestivas de los insec-tos plaga es más limitado que el de las enzi-mas proteolíticas. Las plagas de cultivos y dealmacén adaptadas al consumo de carbohi-dratos (principalmente almidón) son nume-rosas, pero la investigación orientada a la uti-lización de posibles bioinsecticidas cuyo

blanco de acción sea la inhibición de la acti-vidad amilasa está en sus inicios (BIGGS yMCGREGOR, 1996; SILVA et al, 2001). Eneste sentido, se considera de gran interés lautilización del Rhynchophorus ferrugineuscomo MODELO de estudio de la fisiologíade la digestión de los carbohidratos, aprove-chando los aspectos favorables ya comenta-dos de la cría de esta especie.

Los objetivos del presente trabajo son porun lado la detección, cuantificación y carac-terización bioquímica de la actividad de lasenzimas amilolíticas digestivas durante eldesarrollo larvario de Rhynchophorus ferru-gineus, y finalmente de otro, la evaluacióndel efecto de distintas dietas sobre el creci-miento y la expresión de las enzimas respon-sables de la digestión del almidón. Este estu-dio representa una etapa inicial imprescindi-ble en el proceso de estudio de la posibilidadde la inhibición de las amilasas como nove-dosa medida de control en la lucha contrainsectos plaga.

MATERIAL Y MÉTODOS

Insectos. Las larvas proceden de unapoblación de Rynchophorus ferrugineus esta-blecida en el laboratorio. La población deadultos se mantenía sobre caña de azúcar(Saccharum officinarum).A partir de los adul-tos se obtenían los huevos embrionados queposteriormente eran eclosionados. Las larvasfueron criadas en dieta artificial control (Cua-dro 1) según BARRANCO et al. (1997). Elnúmero de estadios post-embrionarios descri-tos en estas condiciones de cultivo son untotal de nueve. Todo el proceso de cría se rea-lizó en oscuridad dentro de una cámara decultivo a una temperatura de 25 ± 0,5 °C y conuna humedad relativa del 65 + 5 %.

Estudio del desarrollo ontogénico de laactividad amilasa. Para realizar este estudiose seleccionaron un total de 500 larvas neo-natas que fueron criadas en dieta artificialcontrol durante todo su desarrollo larvario.El muestreo de éstas se realizó 24 h despuésde la muda, salvo para el primero de ellos en

el que se incluyeron dos muestras; una delarvas recién eclosionadas (Llr) y otra conlarvas de 1 día de edad (Ll). El número delarvas utilizadas fue el siguiente: Llr y Ll:100 individuos; larvas de estadio 2 (L2): 50individuos y larvas de estadios 3 a 9 (L3 aL9): 10 individuos. En cada punto de mues-treo se procedió al pesado individual de laslarvas, salvo para Llr y Ll que se pesaron engrupos de 25 larvas. Una vez pesadas, laslarvas fueron sacrificadas y conservadas a-20 °C hasta su análisis.

Estudio de la influencia de la dietasexperimentales sobre el crecimiento y laexpresión de la actividad amilasa. Un totalde 200 larvas recién eclosionadas fueronmantenidas en dieta artificial control (Cua-dro 1) hasta un día después de su muda a L6.En ese momento se transfirieron a tubos decultivo que contenían 16 dietas experimenta-les diferentes elaboradas cada una de ellascon un tipo carbohidrato diferente (Cuadro2). Se prepararon dos tipos de dietas; las die-tas A sólo incluían las fuentes de carbohidra-tos (harinas vegetales, almidón, sacarosa ymaltosa) y las dietas B que además de éstoscarbohidratos, incluían caseína (CS) al 1%como fuente de proteína. Siete larvas por

Cuadro 1.- Composición de la dieta control para lacría de larvas de R. ferrugineus (para 1000 mi de

dieta)

1 Panreac S.A.2 Santiveri®3 Hidro Rex Vital Aminoácidos S.P. Veterinaria, S.A.

Tarragona

Ingrediente

Agar1

Levadura de cerveza2

Germen de trigo2

Harina de maíz2

Nipagina1

Acido ascórbico1

Acido benzoico1

Cloranfenicol'

Vitaminas y aminoácidos-^

Agua destilada

Cuadro 2.- Composición de las dietas experimentales utilizadas en el estudio de crecimiento y expresión deamilasas digestivas (para 100 mi de dieta)

Las fuentes de hidratos de carbono utilizadas en cada tipo de dieta fueron la siguientes:Harinas vegetales: maíz, trigo, avena, cebada y arroz. Las semillas fueron obtenidas en un mercado local, molidasy tamizadas a través de un paso de luz de 0,1 mm.

Disacáridos: sacarosa y maltosa. (Fuente: Panreac)

Polisacáridos: almidón. (Fuente: Panreac)Las dietas A sólo incluyen los carbohidratos mencionados.

Las dietas B incluyen, además de las distintas fuentes de carbohidratos arriba indicadas, como fuente de proteínaadicional un 1% de caseína (CS) (p/v).

dieta experimental se alimentaron durante 5días en cada una de ellas. Este tiempo sedeterminó como el periodo de alimentaciónde las larvas de sexto estadio antes de iniciarel proceso de muda al siguiente estadio(BARRANCO et al., 1996b). Después de cadaperiodo de alimentación, las larvas fueronpesadas, sacrificadas y conservadas a -20 °Chasta su procesado.

Preparación de los extractos crudosenzimáticos. Las larvas fueron disecadas yse les extrajo el sistema digestivo completo,procediendo rápidamente a congelarlo (Fig.1). Todas las operaciones se realizaron enbaño de hielo a 4 °C. En las larvas Llr, Ll ,L2 y L3, debido a su pequeño tamaño, seoptó por utilizar un pool de larvas completaspara la preparación de los extractos enzimá-

Ingredientes

Agar

Fibra de coco

Agua destilada

Nipagina

Ácido ascórbico

Ácido benzoico

Cloran fe n icol

Vitaminas

Fuente de carbohidratos*

Caseína

Figura 1. Disección y sistema digestivo de una larva de R.ferrugineus de estadio 7.

ticos. En este sentido, varios estudios conlarvas de coleópteros de otras especies handescrito que el patrón de enzimas digestivasen extractos crudos de larvas enteras es prác-ticamente similar al que muestran el de susdigestivos (OVERNAY et al., 1997; GIRARD etal., 1998). Las larvas y los digestivos indivi-duales fueron homogenizados en tampónTris-HCl 50 raM pH 7,5 por sonicación(MICROSON XL200, Misonix Inc., Far-mingdale, NY) en baño de hielo. Seguida-mente los homogenados se centrifugaron a12000 r.p.m. por 15 min a 4 °C. Los sobre-nadantes obtenidos se recuperaban y se con-servaban a -20 °C hasta su uso para los aná-lisis enzimáticos. La proteína soluble de losextractos se cuantificó según el procedimien-to descrito por BRADFORD (1976).

Determinación de la actividad amilasade los extractos larvarios. La actividadamilasa de los extractos larvarios se determi-nó utilizando como sustrato almidón al 2%(p/v) en agua destilada. Para ello, 20 \ú deextracto enzimático, se mezclaron con 0,125mi de tampón fosfato-citrato 0,1 M, 50 mMNaCl, pH 6,5. A continuación se añadieron0,125 mi de la solución de almidón. La mez-cla de reacción fue incubada a 37 °C durante20 minutos. Los azúcares reductores libera-dos se determinaron mediante espectrofotó-metro a 600 nm según el procedimiento des-crito en MARTÍNEZ et al. (2002). Todos losensayos se realizaron por triplicado. La acti-vidad enzimática se expresó en unidades(U)/mg proteína soluble y U/larva.

Zimogramas de los extractos larvariosde R.ferrugineus. Los zimogramas de acti-vidad amilasa se realizaron según la metodo-logía propuesta por MARTÍNEZ et al. (2000).Las electroforesis se realizaron en condicio-nes desnaturalizantes en geles copolimeriza-dos de almidón-poliacrilamida. Los extrac-tos larvarios fueron diluidos a partes igualesen tampón 0,125 M Tris, 20% (v/v) glicerol,0,04% (v/v) azul de bromofenol, 2% (p/v)SDS. En cada gel de electroforesis se inclu-yó un carril con 5 il de marcador de masas

moleculares (MWM) y en el resto de poci-lios se colocaron de 15 a 20 \xl de extractolarvario conteniendo 25 \xg de proteína. Des-pués de la separación electroforética, losgeles fueron incubados en tampón fosfato-citrato 0,1 M, pH 6,5 a 37 °C por 2h. Final-mente, los geles se lavaron en agua destiladay se sumergieron en una solución de lugol al2%. Tras esto, las bandas activas se revelaroncomo zonas de color claro sobre el fondooscuro teñido por el lugol que corresponde aalmidón no hidrolizado. Una vez teñidos, losgeles fueron fotografiados para su posteriorestudio.

Análisis estadístico. La comparación depesos y actividades enzimáticas de las larvasse llevó a cabo mediante ANOVA y se lesaplicó posteriormente el test de Tukey paracomparar diferencias entre medias a un nivelde significación del 95%, utilizando paraello una aplicación informática específica(Statgraphics Plus 4.0. Statistical GraphicsCorp,. Rockville, Maryland, USA). Los aná-lisis de correlación lineal para determinar elcoeficiente R2 (Pearson) se realizaron utili-zando la hoja de cálculo Excel de paqueteinformático Microsoft Office (MicrosoftCorp., USA).

RESULTADOS

Evolución de la actividad amilasadigestiva durante el desarrollo larvario.La evolución de la actividad amilasa expresa-da U/mg prot en las larvas de R.ferrugineusse detalla en la Figura 2. En general, se com-prueba que la actividad amilasa experimentaun incremento progresivo a medida que evo-luciona el desarrollo de las larvas, siendomucho más notable a partir de L4. Cuando seestimó la actividad amilasa total por individuo(U/larva), su evolución fue similar, observán-dose un incremento progresivo de la mismaconforme lo hacía la edad de la larva. A pesarde ello, si se compara con la actividad referi-da a U/mg prot, el aumento más marcado seprodujo más tardíamente, siendo éste a partirde L6. La Figura 3 representa la relación entre

Figura 2. Evolución comparada de la actividad amilasa digestiva de los extractos de larvas de R.ferrugineus,expresada en U/mg prot y U/larva.

el peso de las larvas y su actividad amilolíticadigestiva en U/mg prot y U/larva. En amboscasos se comprueba que existe una relaciónlineal entre ambos parámetros (R2> 0.9).

La Figura 4 muestra un zimograma de laevolución de la actividad amilasa duranteel desarrollo larvario de R. ferrugineusdesde LI a L7. Pudo verse que desde la

Figura 3. Evolución de la actividad amilasa en larvas de R.ferrugineus en función de su peso. Los valores de actividadse han expresado en % sobre el valor máximo determinado en cada caso.

Figura 4. Zimograma obtenido a partir de extractos larvarios de R.ferrugineus de diferente edad. Carril 1= Ll, carril 2= L2, carril 3 = L3, carril 4 = L4, carril 5 = L5, carril 6 = L6 y carril 7 = L7.

eclosión (Ll) ya se aprecian cuatro fraccio-nes activas, aunque la intensidad de algu-nas de ellas, sobre todo las de menor masamolecular, es muy débil. No obstante, es apartir de L3 cuando se diferencian clara-mente estas cuatro isoenzimas. Desde unpunto de vista cualitativo (n° de bandas) nose observan diferencias apreciables entrelos estadios analizados, aunque desde unaperspectiva cuantitativa (intensidad de lasbandas), si se apreciaron variaciones encuanto a las bandas más activas en cada

extracto. Las masas moleculares de las dis-tintas isoformas estuvieron comprendidasentre 20 y 16 kDa.

Efecto del tipo de carbohidrato incor-porado en la dieta sobre el crecimiento yla expresión de la actividad amilasa.

Los pesos finales y actividades enzimáti-cas de las larvas alimentadas con las distin-tas dietas experimentales se analizan separa-damente, considerando como criterio deestudio la fuente de carbohidratos incorpora-

Figura 5. Actividad amilasa (U/mg prot) de las larvas alimentadas con dietas que incluyen diferentes harinas. La líneapunteada muestra el peso medio de las larvas criadas con el alimento artificial control (Cuadro 1). Las letras distintas

en cada barra indican diferencias estadísticamente significativas (p <0.05).

Figura 6. Actividad amilasa (U/mg prot) de Ias larvas de R,ferrugineus alimentadas con dietas que incluyen diferentesdisacáridos. Las letras distintas en cada barra indican diferencias estadísticamente significativas (p <0,05).

Figura 7. Actividad amilasa (U/mg prot) de Ias larvas de R.ferrugineus alimentadas con dietas que incluyen almidón.Las letras distintas en cada barra indican diferencias estadísticamente significativas (p <0,05).

Figura 8. Zimograma obtenido a partir de extractos del digestivo de larvas de R.ferrugineus criadas sobre distintasdietas artificiales. Carril 1= sacarosa, carril 2 = almidón, carril 3 = sacarosa + caseína, carril 4 = maltosa,

carril 5 = almidón + caseína, carril 6 = trigo, carril 7 • trigo + caseína y carril 8 = control.

da a las mismas (harinas vegetales, disacári-dos y polisacárido).

Dietas que incluyen harinas vegetales:Las larvas criadas con dietas que incluíanharinas vegetales mostraron pesos ligera-mente mayores a las del alimento control,aunque estas diferencias no fueron significa-tivas (datos no mostrados). En la Figura 5 semuestra la comparación de la actividad ami-lasa en U/mg prot de las larvas anteriores.Las larvas alimentadas con harinas sin case-ína mostraron mayor actividad específicaque las larvas del control, aunque sin dife-rencias estadísticamente significativas. Noobstante, las larvas alimentadas con harinade trigo si muestran valores más altos que lasdel control (p < 0,05). La actividad de larvasalimentadas con las harinas y caseína mues-tran valores contradictorios. Así pues, en tresde ellas (trigo + caseína, arroz + caseína ymaíz + caseína), los valores medios de acti-vidad amilasa son algo menores que en elcontrol, sin ser estadísticamente diferentes.En tanto que las alimentadas con avena +caseína y cebada + caseína mostraron valo-res medios de actividad amilasa mayores alas del control.

Dietas que incluyen disacáridos: Las lar-vas criadas en dietas que incluían sólo disacá-

ridos (maltosa y sacarosa) mostraron pesosinferiores a las larvas del control (p < 0,05)(datos no mostrados). Por otra parte, la inclu-sión en las dietas de disacáridos de caseínadeterminó un crecimiento de las larvas de R.ferrugineus similar al observado en el control.Los resultados de actividad amilasa obtenidospara las mismas larvas se muestra en la Figu-ra 6. En este caso, las larvas alimentadas sólocon disacáridos mostraron menor actividadamilasa digestiva que las larvas del control,fenómeno que sólo pudo ser compensadocuando a las dietas se le añadió caseína.

Dietas que incluyen almidón: Las larvasalimentadas con dietas de almidón mostra-ron pesos medios algo menores que las delcontrol (datos no mostrados) .También eneste caso la inclusión de caseína determinóun peso final de la larva similar al control. Lacomparación de la actividad amilasa de lar-vas alimentadas con dieta de almidón semuestra en la Figura 7. En comparación conel control, los extractos de larvas alimenta-das únicamente con este polisacárido presen-taron valores de actividad inferiores a las pri-meras (p < 0,05). En la misma gráfica seobserva que la adición de caseína, incremen-tó de manera significativa la actividad amila-sa de las larvas.

Figura 9. Relación lineal entre la actividad amilasa (U/larva) y el peso de la larva. La figura incluye en conjunto losdatos individuales de las larvas de cada uno de los tratamientos (n = 147).

Zimogramas: Una vez comprobada laexistencia de variaciones cuantitativas en laactividad amilasa de larvas que consumieronlas diferentes dietas, se realizó un zimogra-ma de los mismos extractos larvarios paradeterminan la existencia de variaciones cua-litativas entre ellas (Fig. 8). Los resultadosobtenidos indican que todas las larvas, inde-pendientemente de la dieta que hubieraningerido, presentaban un patrón de amilasasdigestivas similar, si bien se apreciaron lige-ras variaciones cuantitativas en cuanto a laintensidad de algunas de las bandas activas(carriles 1 y 8: banda 1).

Finalmente, se consideró interesante ana-lizar si el peso de la larva (y por extensión elde su digestivo, ya que este representa un30% del peso corporal en todas las larvas)puede influir en los niveles de actividad ami-lolítica presente en ésta. Para ello, se repre-sentaron todos los datos de actividad (expre-sados en U/larva) frente a los pesos larvarios(Fig. 9). De este modo se comprobó unarelación lineal entre ambos parámetros (R2 =0.769). Los resultados indican que, indepen-dientemente de su alimentación, las larvastienen unos niveles de amilasas proporciona-

les a su peso corporal, y por correspondenciaal tamaño de sus digestivos.

DISCUSIÓN

Los resultados bioquímicos obtenidos en elpresente trabajo confirman la existencia deactividad a-amilasa en R.ferrugineus desdeel momento de la eclosión de las larvas hastael final de su desarrollo. Resulta interesantedestacar que incluso antes de que las larvasneonatas ingirieran su primera comida, éstasya poseen niveles de actividad similares a laslarvas de 2o ó 3er estadio (L2-L3). Este hechoparece sugerir que en esta especie existe unaexpresión constitutiva de la actividad a-ami-lasa no inducida por la ingesta de alimento.Esta aparición programada de las enzimasdigestivas ha sido descrita en numerosas espe-cies de invertebrados y vertebrados, lo quemanifiesta que es un mecanismo de expresióncontrolado a nivel genético (LEMOS et al.,1999). La presencia de actividad a-amilasatambién ha sido descrita en larvas de otrasespecies de coleópteros que ingieren altasproporciones de almidón en sus dietas, talescomo Diabrotica virgifera (Coleóptera: Chry-

somelida) (TTTARENKO y CHRISPEELS, 2000),

Sophorhinus insperatus (Coleóptera: Curcu-lionidae) (ADEDIRE, 1994), Callosobruchusmaculatus, Zabrotes subfasciatus (Coleópte-ra: Bruchidae) (SILVA et al, 1999) y Hypothe-nemus hampei (Coleóptera: Scolytidae)(VALENCIA et al, 2000), entre otras.

Al analizar la evolución de la actividad a-amilasa durante el desarrollo de la larva, losresultados de actividad mostraron que elaumento cuantitativo más importante de lamisma tiene lugar desde los estadios L4-L5hasta L9. En este sentido, ALARCÓN et al.(2002) describieron un patrón similar en eldesarrollo de la actividad proteasa digestivaen esta misma especie. Los mismos resulta-dos indican que, independientemente decomo se exprese la actividad a-amilasa, elpatrón de su evolución es el mismo para laactividad específica expresada en U/mg pro-teína soluble o en U/larva, aunque comopudo comprobarse el incremento hasta elestadio L9 fue de 8 y 60.000 veces más quela actividad detectada en larvas neonatas,respectivamente.

La realización de zimogramas permitió lavisualización del desarrollo de las distintasisoformas de a-amilasas en los extractos lar-varios de R.ferrugineus. Aunque se aprecia-ron variaciones con respecto a la importanciarelativa de cada una de las isoformas en eltotal de las fracciones amilolíticas, desde elprimer estadio, Ll , se observaron cuatro iso-formas de peso molecular comprendido entre20 y 16 kDa (Fig. 4). Resultados similares hansido descritos en otras especies de coleópterosque incluyen cantidades importantes de almi-dón en sus dietas. Así, en larvas de Zabrotessubfasciatus y Callosobruchus maculatus,ambas plagas de almacén, se han descritodesde tres hasta cinco isoformas de las a-ami-lasas con pesos moleculares comprendidosentre 94 y 35 kDa (SILVA et al, 1999).

Recientemente se ha podido comprobarque en algunos insectos plaga se induce laexpresión de nuevas enzimas digestivascomo respuesta a la ingesta de dietas quecontienen altas concentraciones de proteínaspotencialmente tóxicas (JONGSMA et al,

1995; BROADWAY, 1996; JONGSMA y BOLTER,

1997). La inducción de a-amilasas tambiénha sido descrita en larvas de insectos plagade almacén en los que ésta se produce comorespuesta a la ingesta de diferentes dietas(SILVA et al, 1999).

Con el propósito de evaluar la capacidadque tienen las larvas de R. ferrugineus devariar el patrón de sus a-amilasas digestivasal ser alimentadas con distintas dietas, se rea-lizó un ensayo en el que se transfirieron larvasalimentadas en dieta control a dietas experi-mentales que incluían un único ingredientenutritivo, harina de distintas semillas, almidónó un disacárido, sólo o en combinación conuna fuente de proteína (véase Cuadro 2).

La sustitución de la dieta control por die-tas basadas en distintas harinas vegetales noinfluyó negativamente en el desarrollo de laslarvas, ya que como pudo verse, el peso delas larvas fue igual o ligeramente superior alde las larvas alimentadas con la dieta con-trol. Además, la adición de proteína a lasharinas tuvo un efecto positivo sobre el cre-cimiento de las larvas. Las harinas de semi-llas, ricas en almidón, también poseen entreotros, un contenido importante de proteínaque aportaría a las larvas una fuente de nitró-geno suficiente para completar su desarrollocon éxito. Este fenómeno parece ser másnotable cuando las harinas se complementancon caseína. Por lo que respecta a la activi-dad amilolítica de los extractos obtenidos apartir de estas larvas, se pudo comprobarque, en general, los valores medios variarondependiendo de la harina ingerida, aunquesin presentar diferencias significativas conrespecto al control. Además, la adición decaseína a las harinas determinó un cambio enel patrón antes mencionado (Fig. 5).

Por otra parte, las larvas de R.ferrugineusalimentadas exclusivamente con disacáridosfueron incapaces de aumentar su peso corpo-ral, fenómeno que sólo pudo ser revertidocuando a la dieta se le adicionó una proteína.Con respecto a la actividad a-amilasa de laslarvas alimentadas exclusivamente con disa-cáridos, como era de esperar, mostraronniveles muy bajos en comparación con las

larvas alimentadas con la dieta control (Fig.6). No obstante, resulta sorprendente quecuando a la dieta de disacáridos se le adicio-nó caseína, se produjo una inducción de la a-amilasas digestivas, mostrando los extractoslarvarios actividades enzimáticas similares alas medidas en las larvas del control. Así, enninguno de los trabajos revisados se mencio-na una inducción de carbohidrasas inducidapor un sustrato nitrogenado. Otra explica-ción a este fenómeno, podría derivarse de ladisponibilidad de caseína que tiene la larvaque determinaría la existencia de elementosnitrogenados que son necesarios para la sín-tesis de proteínas enzimáticas, con lo que laslarvas podrían mantener un nivel basal deactividad a-amilasa superior al de las larvasque consumen exclusivamente disacáridos.

Por su parte, los datos obtenidos para elalmidón sólo indican que la presencia de esteúltimo en el alimento limita considerable-mente el desarrollo corporal de la larva,sobre todo al compararlo con la dieta con-trol. Este fenómeno es igualmente revertidocuando la dieta es suplementada con unaproteína. La actividad a-amilasa digestiva delos extractos de larvas alimentadas con almi-dón ofreció resultados contradictorios (Fig.7). La llamativa disminución aparente deamilasas digestivas en larvas que consumensólo almidón, sustrato de las a-amilasas,puede explicarse por la carencia de proteínade la dieta que limitaría la síntesis de novo dea-amilasas en presencia incluso de su propiosustrato. Este argumento parece soportarsepor el aumento considerable de la actividada-amilasa de las larvas cuando consumenalmidón y caseína.

La realización de zimogramas permitió lavisualización del patrón de a-amilasas de losdiferentes extractos larvarios. Los resultadosobtenidos para R. ferrugineus indican que,independientemente de la dieta ingerida, laslarvas de esta especie muestran siempre unmismo patrón de isoenzimas digestivas (Fig.8). Así, en todos los casos se comprobó lapresencia de las cuatro isoformas, aunque sedetectaron variaciones de intensidad entreellas. Estos datos son contrarios a los descri-

tos en larvas de otras especies de coleópterosen los que la fuente de almidón induce cam-bios en el patrón de isoformas de las a-ami-lasas digestivas (SILVA et al, 1999, 2001;TITARENKO y CHRISPEELS, 2000).

Según los datos biométricos obtenidos,los buches de las larvas tienen una capacidadde llenado que viene condicionada por eltamaño de la larva y, en todos los casos, esindependiente de la dieta que ingieren ya quese presentan normalmente llenos (datos nomostrados). Habida cuenta de este mecanis-mo de ingesta un tanto simple, se pensó quela secreción de a-amilasas digestivas en laslarvas podría estar condicionada, al igual quela ingesta, por el tamaño de la larva. En efec-to, cuando se representaron los valores deactividad amilasa total de todas las larvasmuestreadas con respecto al peso de las lar-vas se encontró una correlación lineal entreambos parámetros (R2 = 0,769) (Fig. 9), que-dando de manifiesto que el tamaño de lalarva condiciona de manera importante (enun 76%) la cantidad de a-amilasas en sudigestivo. Así, los extractos de las larvas máspequeñas, como las que fueron alimentadascon disacáridos, presentaban menor activi-dad a-amilasa que las de larvas mayores. Encualquier caso, la ingesta de carbohidratossin una fuente nitrogenada parece limitar elcrecimiento de la larva y por lo tanto, lasecreción de a-amilasas digestivas.

Concluyendo, la secreción de a-amilasasdigestivas en las larvas R. ferrugineus pareceestar condicionada en gran medida por eltamaño de la larva, por lo que se podríahablar de un mecanismo de síntesis de enzi-mas programado genéticamente y con pocacapacidad de acomodación al tipo de ali-mento ingerido (24% de la variabilidad debi-da a otros factores distintos del peso). Debi-do a estas características, las amilasas de estaespecie podrían ser enzimas clave para idearestrategias de lucha contra esta plaga basa-das en el uso de inhibidores de amilasas.Para confirmarlo será necesario llevar a cabonuevos estudios en los que se evalúe la res-puesta de las amilasas digestivas de R. ferru-gineus a diferentes inhibidores de amilasas.

ABSTRACT

ALARCÓN F. J., A. PEREGRINA, T.F. MARTÍNEZ, J.G. MAYORAL, P. BARRANCO. 2004.Carbohydrate digestion of larvae of red palm weevil Rhynchophorus ferrugineus (Oli-vier, 1790), (Coleóptera: Curculionidae) Bol. San. Veg. Plagas, 30: 519-532.

The evolution of digestive amylase activity during the larval development of Rhyn-chophorus ferrugineus larvae was studied. Results showed the presence of amylases in lar-val extracts before first exogenous feeding. Along their ontogenetic development, amyloly-tic equipment of larvae was characterized by four a-amylases of low molecular mass (16 to20 kDa). It was also studied the effect of several diets on growth and digestive physiology.Larvae fed with diets including only carbohydrates showed both low corporal growth anddigestive amylase activities. Nevertheless, this fact was reverted when larvae were fed withdiet supplemented with casein. Larval weight and amylase activities showed a linear corre-lation (R2 = 0,75). Results showed that variations of amylolytic secretion in larvae rearedwith different diets was mainly influenced by larval size. Zymograms showed the same pat-terns of a-amylases in larvae reared with different diets. Results obtained appointed to con-firm a-amylases of Rhynchophorus ferrugineus larvae as enzymes key in the development ofnew strategies against insect pest control based in the use of enzyme inhibitors.

Key words: amylase, carbohydrate, Coleóptera, Curculionidae, digestive process,larval development, electrophoresis, Rhynchophorus ferrugineus.

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(Recepción: 19 enero 2004)(Aceptación: 22 marzo 2004)