la alfamilasa bibliografia tc1
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RESUMEN
Para desarrollar la hidrólisis enzimática de almidón de yuca usando enzimascomerciales (alfa amilasa y glucoamilasa). Se inicio con el proceso de carac-terización de las materias primas, al almidón de yuca producido en el Depar-tamento del Cauca, obtenido de la Cooperativa de Rallanderos(COPRACAUCA) se le realizó el análisis bromatológico, se determino larelación amilosa/amilopectina y se encontraron las condiciones óptimas deoperación en el proceso de hidrólisis con las enzimas comerciales de NovoNordisk. También se caracterizaron las enzimas comerciales para observarsu comportamiento en temperatura como en acidez.
ABSTRACT
In order to develop the enzymatic hydrolysis of cassava starch usingcommercial enzymes (alpha amilasa and glucoamilasa). The process initialwas the charac-terization of the raw materials, the starch from mandiocawas obtained in the Departmento del Cauca, of the Cooperativa deRallanderos (COPRA-CAUCA) It's was carried out the analysis and lookthe relationship amilosa/amilopectina and they were the good conditionsof operation in the hydrolysis process with Novo Nordisk's commercialenzymes. The commercial enzymes were also characterized in order toobserve their behavior in temperature like in acidity
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Recibido para evaluación: Diciembre 2 de 2002. Aprobado para publicación: 28 de febrero de 2003.
1 Facultad de Ciencias Agropecuarias, Departamento de Ingeniería Agroindustrial, Proyecto Producción de glucosa farmacéutica a partir dealmidón de yuca, Grupo de Investigación Asubagroin, Universidad del Cauca. 2003.
Correspondencia: Jorge Eliécer Carrera, e_mail: [email protected]
PALABRAS CLAVE:
Almidón, amilosa, amilopectina,hidrólisis enzimática, alfa amilasa yglucoamilasa.
KEY WORDS:
Starch, amylese, amylopectim,hydrolisis, enzyme´s, alfa amilase,glucoamilase.
CARACTERIZACIÓN ENZIMÁTICA DE ALFA-AMILASAY GLUCOAMILASA EN LA HIDRÓLISIS DEALMIDÓN DE YUCA (manihot esculenta)
ENZYMATIC ALPHA-AMYLASE AND GLUCOAMILASACHARACTERIZATION IN CASSAVA STARCH HYDROLYSIS
INGRID MERA, JOSE LUIS HOYOS, JORGE CARRERA, CLARA LUZ FORERO, REINALDO VELASCO1
Facultad de Ciencias AgropecuariasVol 1 No.1 Marzo 200384
INTRODUCCIÓN
La yuca (Manihot esculenta) es una planta originaria dela América tropical. Los principales países productoresson Brasil, Zaire, Nigeria e Indonesia. La yuca, uno delos productos tradicionales de la agricultura nacional,se convirtió en fuente básica del desarrollo económicoy social en el norte del Cauca generando un perfil in-dustrial que beneficia directamente a casi 28 mil e indi-rectamente a miles de personas más. Es así como en elnorte del Cauca se encuentran 170 rallanderías con ca-pacidad de procesamiento de 1.000 - 2.500 Kg. de yucafresca/día. De 100 Kg. de yuca fresca, se producen 20Kg. de almidón, 6.5 Kg. de afrecho (subproducto demediana finura constituido por fibra y porciones de raí-ces) y 1.5 Kg. de mancha. Estos volúmenes de produc-ción de almidón benefician al sector agrícola al dar unvalor agregado a la yuca, pero al mismo se le puede darun mayor valor si se lo somete a un proceso de transfor-mación nivel 2, como el de la hidrólisis enzimática parala producción de glucosa (9). En los procesosenzimáticos, tales como producción del jarabe de la glu-cosa, el almidón es generalmente el componente prin-cipal de las mezclas de reacción.Hay tres etapas en la conversión del almidón:
� Gelatinización, implicando la disolución de losgránulos del almidón para formar una suspensiónviscosa.
� Licuefacción, implicando la hidrólisis parcial delalmidón.
� Sacarificación, implicando la producción de laglucosa y de la maltosa por hidrólisis adicional.
MATERIALES Y MÉTODOS
Caracterización del Almidón de Yuca (3)
El almidón se obtuvo de la cooperativa de rayanderosCOPRACAUCA.
Determinación de Humedad. La humedad de la muestrase extrae por evaporación a temperatura de 100-105° Chasta peso constante, considerándose que la pérdidade peso es agua .Determinación de Cenizas totales. El método se basaen la eliminación de la materia orgánica de un materialpor medio de incineración a 600° C. El residuo restantese considera que son las cenizas.
Determinación del Extracto Etéreo o Grasa bruta.Se determino utilizando en método de Soxlhet(gravimetricamente).Determinación de Nitrógeno (Proteína). Se determi-nó a través del de método de Kjeldhl.Determinación de la relación amilosa/amilopectina.
Caracterización de las Enzimas
Se utilizaron dos tipos de enzimas amilolíticas para eldesarrollo del proceso a nivel de pruebas de laboratoriodonadas por Novo Nordisk (1,6,2)
A. α - Amilasa. (BAN) (Tabla 1)B. Glucoamilasa. (AMG) (Tabla 1)
Caracterización de la Alfa-Amilasa (7,8)
Comportamiento de la Actividad de la Enzima conla Variación de pHSe prepararon 5 muestras cada una con 3 repeticionesde 10 ml al 30% en peso (base húmeda) de almidón enagua; se mantuvo la temperatura a 60ºC. Se agregóCaCl2 y Buffer fosfato o acetato de sodio, para hacervariar el pH en un rango de 5.0 - 7.0 Se agregó la enzi-ma a - amilasa en una concentración 0.1% de acuerdocon las recomendaciones del fabricante. Posteriormen-te, se tomaron muestras de la solución a los 90 min.Para obtener la concentración de almidón realmentedeseada. La cantidad de almidón hidrolizado se dividiósobre el máximo teórico hidrolizado (1.000 g de almi-dón/g enzima). Ésta relación se multiplico por 100 y sellamo % de actividad.
ENZIMA BAN AMGRango de
Temperatura (°C) 60 – 80 70 – 80
Rango de pH 5 – 7 4.5 – 5.5Unidad Kilo Novo
(KNu/g)480 300
Concentración deCalcio (ppm)
100-150
Dosis enzima(Kg/Ton)
1.0-1.5 1.1-1.3
Sustrato (% p/p) 30 30
Estabilizador de pHFosfato
monosodicoAcetato Na
Tabla 1. Protocolo de enzimas comerciales marzo de2003.
Fuente: Novo, (4)
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Caracterización del Almidón
La muestra tomada para la hidrólisis no presenta lascondiciones optimas para un proceso eficiente, se ob-serva un porcentaje alto de humedad, genera un por-centaje de Aw (actividad de agua) propicia para el ata-que de microorganismos, a nivel industrial esto produ-ce acumulaciones de pirógenos. El porcentaje de 7.15%en cenizas, corrobora que la extracción de almidón noes adecuada, es indicativo de contenido de impurezas.La relación amilosa/amilopectina para una hidrólisis encondiciones optimas de trabajo debe ser 12/88 (CIAT).El porcentaje de amilosa presentado en la muestra es de32%, alejado de los rangos ideales de trabajo, a menorrelación amilosa/amilopectina, mayor rompimiento deenlaces endo alfa- 1,4, Glucosidicos obteniéndose unmayor rendimiento en la producción de glucosa libre.(Ver tabla 2).
CARACTERIZACIÓN DE LAS ENZIMAS
El diseño experimental que se uso para el análisis de losdatos obtenidos fue completamente al azar, por tratarsede un experimento de laboratorio donde las unidadesexperimentales son homogéneas y la variación entre ellases muy pequeña. Después de analizar los datos en elpaquete estadístico (SAS), se observa que los datos seajustan al diseño. Al realizar el análisis de varianza y alcomparar el valor de F (Función de probabilidad) calcu-lado y F tabulado se observa que el F calculado esmayor que el F tabulado, lo cual indica que haysignificancia. Esto quiere decir que existe uno o variostratamientos mejores que los demás. Para saber cual esel mejor tratamiento se aplicaron las pruebas de signifi-cación, usando el método de análisis de promedios DMS(diferencia mínima significativa). (5)
Comportamiento de la Actividad de la Enzima conla Variación de TemperaturaSe prepararon 5 muestras cada una con 3 repeticionesde 10 ml al 30% en peso (base húmeda) de almidón enagua; se mantuvo el pH en el valor optimo encontradocontrolado con buffer fosfato y CaCl2 efectuaron reac-ciones de 90 min., se vario la temperatura a 55 - 75ºC.Se agregó la enzima a - amilasa en una concentración0.1% de acuerdo con las recomendaciones del fabri-cante. Posteriormente, se tomaron muestras para obte-ner la concentración del almidón remanente deseada enla solución. La cantidad hidrolizada de almidón se divi-dió sobre el máximo teórico hidrolizado (1.000 g dealmidón/g enzima). Ésta relación se multiplico por 100y se llamo % de actividad.
Caracterización de la Glucomilasa (7,8)
Comportamiento de la Actividad de la Enzima conla Variación de pHSe prepararon 5 muestras de 250ml al 30% en peso(base húmeda) de almidón en agua. Se realizarondextrinizaciones con a - amilasa en las condicionesóptimas encontradas; se ajustó la temperatura a 60ºC +1ºC y se agrego Acetato de Sodio buffer 0.1 M, parahacer variar el pH en un rango de 4 a 6. Se añadió laenzima glucoamilasa en una concentración de 0.25%,de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.Luego, se tomaron muestras de la solución a las 4.5 hpara obtener la concentración de glucosa remanente enla solución. La cantidad glucosa se dividió sobre elmáximo teórico hidrolizado (1,125 Mm de maltosa/genzima). Ésta relación se multiplico por 100 y se llamo% de actividad.
Comportamiento de la Actividad de la Enzima conla Variación de TemperaturaSe prepararon 5 muestras de 250ml al 30% en peso (basehúmeda) de almidón en agua. Se realizarondextrinizaciones con a - amilasa en las condiciones ópti-mas encontradas; se ajustó el pH en el valor optimo en-contrado con Acetato de Sodio buffer 0.1 M y se vario latemperatura entre 55 y 75°C. Se añadió la enzimaglucoamilasa en una concentración de 0.25%, de acuer-do con las recomendaciones del fabricante. Luego, setomaron muestras de la solución a las 4.5 h para obtenerla concentración de glucosa remanente en la solución. Lacantidad glucosa se dividió sobre el máximo teóricohidrolizado (1,125 Mmol de maltosa/g enzima). Ésta rela-ción se multiplico por 100 y se llamo % de actividad.
Tabla 2. Análisis proximal almidón de yuca.
Fuente: Starch, (2)
Humedad 16.43%
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Caracterización de la Alfa-Amilasa
Comportamiento de la Actividad de la Enzima conla Variación de pH
La alfa amilasa (BAN) de Novo Nordisk presento unamayor actividad a pH 6.0, como se muestra en la Tabla3, de acuerdo al DMS (Diferencia mínima significativa)se observo que los tratamiento a pH5.0 y pH6.0 son losque presentan mayor diferencia en actividad amilolitica.(Ver gráfico 1).
Comportamiento de la Actividad de la Enzima conla Variación de Temperatura
La alfa amilasa fúngica (BAN) de Novo Nordisk logra sumayor actividad a una temperatura media de 70°C, comose muestra en la Tabla 4. El análisis de promedios DMSse observo que los tratamientos a temperatura 70°C y55°C son los que presentan mayor diferencia en activi-dad amilolitica, por encima de 70 °C la actividad dismi-nuye, tomando la grafica un comportamiento Gaussiano(Ver Gráfico 2).
Caracterización de la Glucomilasa
Comportamiento de la Actividad de la Enzima conla Variación de pH
La amiloglusidasa (AMG de Novo Nordisk) presentouna mayor actividad a pH 4.8 como se muestra en laTabla 5, Las actividades fueron muy bajas por el tiem-po de la hidrólisis indicando que sus comportamien-tos están por el orden de mas de 5 horas. de acuerdo aprueba de promedios en la Gráfica 3 se observa uncomportamiento ideal a pH 4.8 indicando que existendiferencias significativas con respecto a los otros tra-tamientos.
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Tabla 4. Alfa-amilasa. Actividad Vs Temperatura.
*OXFRDPLODVD�$FWLYLGDG�YV�7HPSHUDWXUD
44
45
46
47
48
49
50
51
50 55 60 65 70 75 80
T emperatura °C
Grafico 2. Alfa-amilasa. Actividad Vs Temperatura.
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5� 5� 5� 3URP��� �� �� �� �������� �� �� �� �������� �� �� �� �������� �� �� �� �������� �� �� �� �����
Tabla 5. Glucoamilasa. Actividad Vs pH.
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$FWLYLGDG�YV�S+�
65
70
75
80
85
4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5
pH
Grafico 1. Alfa-amilasa. Actividad Vs pH.
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5� 5� 5� 3URP��� �� �� �� �������� �� �� �� �������� �� �� �� �������� �� �� �� �������� �� �� �� �����
Tabla 3. Alfa-amilasa. Actividad Vs pH .
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Comportamiento de la Actividad de la Enzima conla Variación de Temperatura
La amiloglusidasa (AMG de Novo Nordisk) presentouna mayor actividad a Temperatura 65ºC como semuestra en la Tabla 6, Las actividades presentan %bajos de conversión a glucosa, debido al tiempo dehidrólisis. El análisis de promedios DMS corroboraeste comportamiento al no encontrar diferencias signi-ficativas entre los tratamientos a temperatura 60ºC y 70ºC, entre 60ºC y 75ºC, entre 70ºC y 75 ºC. (Vergrafico 4)
La tabla 7 resume las condiciones optimas de trabajode las enzimas usadas para la hidrólisis enzimática dealmidón de yuca.
CONCLUSIONES
El modelo experimental aplicado completamente al azarse ajusta a las unidades experimentales obtenidas. Estoindica que los tratamientos difieren en forma significati-va y señala cual es mejor comportamiento.
La relación amilosa/amilopectina determinada es alta,influyendo en la hidrólisis y el rompimiento de los enla-ces alfa-D, 1,4 y Alfa-D, 1,6 Glucosidicos en el almidónde yuca.
El tiempo de cinética empleado para la glucoamilasa(AMG) presento rendimientos bajos, indica que se debesometer una hidrólisis mas prolongada.
La enzima alfa amilasa (BAN) presento un buen com-portamiento en la cinética de reacción.
Se determino que el pH fue la variable más importanteen el procesos hidrolítico enzimático.
REFERENCIAS
(1) Carrera, Jorge, Módulos de Biotecnología.Enzimas industriales, Universidad del Cauca, Pri-mer edición 2002.
(2) Farmacopea USP 25, Páginas, año 2000.(3) Fennema, O. Química de los Alimentos. Acribia
S.A., España. 1993.(4) Novo Nordisk. Product Sheet Termamyl 120 L,
Fungamyl, AMG. Enzyme Business, Bagsvaerd,Denmark. 1997.
Grafico 3. Glucoamilasa. Actividad Vs pH.
$OID�$P LODV D�
$FWLYLGDG �YV �7HP SH UDWXUD
7 0
7 5
8 0
8 5
50 55 6 0 65 70 7 5 80
T e m p e r a t u r a °C
Tabla 6. Glucoamilasa. Actividad Vs Temperatura.
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Grafico 4. Glucoamilasa. Actividad Vs Temperatura.
D �DPLODVD JOXFRDPLODVDS+ ��� ���
7HPSHUDWXUD ���& ���&&RQFHQWUDFLyQ
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Tabla 7. Condiciones óptimas de la Alfa-amilasa yGlucoamilasa.
*OXFRDP LODV D
$FWLYLGDG �YV �S+�
42
43
44
45
46
47
48
49
3.9 4.2 4.5 4.8 5.1
p H
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(5) Pozueta, L. Métodos Estadísticos. Ediciones UPC,España. 1994.
(6) Procedimientos estandarizados de Enzyme'sBiotechnology, 1999.
(7) Rosendal, P. y Nielsen, B. Stability of Bacterial ?-Amylase in the Starch Liquefaction Process.Starch/
Stärke. Vol. 32, No. 11, Germany. 1979. 357-362.(8) Schenck, F. y Hebeda, R. Starch Hydrolysis
Products. VCH, USA. 1994.(9) Starch Conversion Technology. G.M.A.
Vanbeynum. Edit. Marcel Dekker Inc. New York,1985.