La tiroestimulina, un heterodmero de dos nuevas subunidades de glucoprotenas humanas que activan al receptor de hormona estimulante de la tiroides.Koji Nakabayashi1, Hirotaka Matsumi1, Alka Bhalla1, Jeehyeon Bae1, Sietse Mosselman2, Sheau Yu Hsu1 and Aaron J.W. Hsueh1 1 Divisin de Biologa Reproductiva, Departmento de Ginecologa y Obstetricia, Escuela de Medicina Universidad de Stanford, Stanford, California, USA 2 Departmento de Farmacologa, Organon Inc., Oss, Holanda Direccin para correspondencia: Aaron J.W. Hsueh, Department of Gynecology and Obstetrics, Stanford University School of Medicine, Stanford, California 943055317, USA. Telfono: (650) 725-6802; Fax: (650) 725-7102; E-mail: aaronahsueh@stanford.edu

La tirotropina humana (TSH), la luteotropina (LH), la folitropina (FSH), y la gonadotropina corinica son miembros de la familia de hormonas glicoprotenas heterodimricas. Las subunidades alfa comunes forman heterodmeros no covalentes con diferentes subunidades . Recientemente se han identificado dos nuevos genes como hormonas de glicoprotena humana, alfa 2 (A2) y 5 (B5). Utilizando un ensayo de doble hbrido en levadura, se descubrieron las dos subunidades como socios de heterodimerizacin potencial. Anlisis Inmunolgicos confirmaron la heterodimerizacin de A2 y B5 en clulas transfectadas y su colocalizacin en la pituitaria anterior. Glicoprotenas heterodimricas recombinantes A2/B5 purificadas utilizando intercambio de catin cromatografa de fraccionamiento de tamao activaron receptores TSH humanos pero no receptores LH y FSH y mostraron una alta afinidad a los receptores TSH en un experimento de receptores radioligandos. El heterodmero tambin estimul la produccin de cAMP la incorporacin de timidina por clulas tiroidales cultivadas y aument los niveles de suero de tiroxina en ratas con TSH suprimido in vivo. Esta nueva hormona de glicoprotena heterodimrica se llam tiroestimulina basado en su actividad estimuladora de la tiroides. La expresin de tiroestimulina en la pituitaria anterior conocida para manifestar receptores TSH sugiri un mecanismo paracrino. El actual descubrimiento de un nuevo ligando basado en metodologa genmica puede facilitar la comprensin de los roles fisiolgicos de sistemas receptores TSH extratiroidales y la base estructural y funcional de la sealizacin del receptor por hormonas de glicoprotenas relacionadas.

Introduccin La tirotropina humana (TSH), la folitropina (FSH), la lutropina (LH), y la gonadotropina (CG) corinica son miembros de la familia de las hormonas de la glicoproteina derivadas de heterodimerizacin de una subunidad alfa comn con subunidades hormona especficas. Esas hormonas fueron originalmente purificadas de la pituitaria anterior (TSH, LH, y FSH) y de la placenta (CG humana) y se observa que activan receptores acoplados de protena G especficos en la tiroides (receptor TSH) y gnadas (receptores LH y FSH), respectivamente (1-4). Esas tres hormonas de glicoprotena derivadas de la pituitaria forman la base de los sistemas de retroalimentacin objetivo pituitario-perifricos clsicos y son esenciales para el desarrollo y la diferenciacin de los tejidos tiroidal y gonadal. Particularmente TSH es esencial para la produccin de yodotironinas por la glndula tiroides y los desrdenes en el eje pituitaria-glndula tiroideshormona tiroides llevan a disturbios de esencialmente todos los rganos y caminos metablicos (5-6). Basados en las investigaciones de GenBank, identificamos dos genes similares a subunidades de hormonas de glicoprotenas humanas adicionales y los denominamos alfa2 (A2) y 5 (B5), debido a sus similaridades estructurales a subunidades conocidas y a la cronologa del descubrimiento (7). (Los nmeros de acceso del GenBank para A2 y B5 son AF403384 y AF403430, respectivamente.) A2 y B5 han conservado residuos de cistena, similares a aquellos encontrados en subunidades alfa y bien caracterizadas(8,9) importantes para la formacin de las ligazones claves de los bisulfuros. Como todas las otras subunidades de hormonas de glicoprotenas, A2 y B5 poseen la estructura de nudos nica de la cistina que es caracterstica de las protenas relacionadas con TGF-, la PDGF, y las familias de protenas morfogenticas de los huesos (10,11). Ya que la subunidad putativa A2 es propensa a combinarse tanto con subunidades conocidas o nuevas para producir hormonas heterodimricas bioactivas, realizamos un screen de interaccin proteina-proteina de doble hbrido en levadura para identificar potenciales socios de dimerizacin para e interacciones encontradas entre A2 y B5. Generamos Abs contra A2 y B5 para confirmar las interacciones entre esas subunidades putativas y su colocalizacin en la pituitaria anterior. Siguiendo las pruebas para la activacin de receptores de hormonas de glicoprotenas, se encontr que el heterodmero A2/B5 estimulaba TSH pero no a los receptores de gonadotropina in vitro e in vivo. La presente metodologa proporciona un nuevo paradigma para el descubrimiento de ligandos polipeptidos heterodimricos en baja abundancia utilizando bioinformtica, doble hbrido en levadura, y receptor de ligandos en metodologa coincidente.

Mtodos Pruebas de doble hbrido en levadura y anlisis RT-PCR. Se evaluaron interacciones entre A2 y diferentes subunidades de hormonas de glicoprotenas en el sistema de doble hbrido en levadura usando vectores pGBT9 GAL4-rea de aglutinacin (BD) y pGADGH GAL4-rea de activacin (AD) (12). Se evalu la ligazn especfica de diferentes pares de protenas pecific con base en la activacin de los genes reportados GAL1HIS3 y GAL4-lacZ (Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, California, USA). La regin madura del cADN A2 fue fusionada al GAL4-AD en un vector de plataforma en levadura, pGADGH. Similarmente los cADN codificando otras subunidades de hormonas de glicoprotenas sin los peptidos de sealizacin se fusionaron al vector GAL-4BD del pGBT9. Se evaluaron interacciones especficas de diferentes pares de protenas con base en la activacin del gen reportado GAL1-HIS3 medianamente deficiente en leucina, triptofan e histidina pero en la presencia de 5 mM 3-aminotriazola (13). Se testearon al menos10 diferentes colonias expresando cada par de protenas de fusin. Para el anlisis de RT-PCR de la expresin de ARNm deA2 y B5 mRNA, los tejidos se recolectaron de ratas macho Sprague-Dawley de 50 das (Simonsen Laboratories Inc., Gilroy, California, USA). El total de ARNm se extrajo utilizando el reagente mRNA TRIzol (Life Technologies Inc., Grand Island, New York, USA) antes de RT para obtener cADN. La amplificacin PCR del cADN se realiz bajo condiciones de alto rigor (desnaturalizacin: 94C, 30 segundos; atemperado y extension: 6872C, 3 minutos, 35 ciclos). Los cebadores especficos son: cebador flujo arriba A2, CATCCCAGGCTGCCACTTGCACCCCTTC; cebador flujo abajo A2, CTTTCTGAGGCTGCTGATGGTGCAGC; cebador flujo arriba B5, ATGGCCCTCCTCCTTCTGGCTGGCTAT; B5 cebador flujo abajo, CTCCGCAGTCACAGCGGATGGCCACGG. La omisin del paso RT lleva a una prdida de los productos PCR. Generacin de Ab s para A2 y B5 e inmunoanlisis. Para la produccin de Ab, cADN que corresponden a la regin madura del A2 o B5 humano fueron subclonados en el interior del vector pGEX-4T-1 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey, USA). Despus de la transformacin en Escherichia coli cepa BL21 (Invitrogen Corp., Carlsbad, California, USA), la espresin de las protenas de fusin que consistan de enzima glutationa S y A2 o B5 madura se introdujo siguiendo el tratamiento con isopropil-1-tio--D-galactosida. Las protenas de fusin en el lisato bacterial se purificaron usando una columna de afinidad de glutationaSefarosa 4B, emulsionada en un un ayudante de Freund, e inyectada en conejos (Strategic BioSolutions Inc., Newark, Delaware, USA) para generacin Ab.Se purific IgG usando la columna Proteina G Sefarosa 4 Flujo Rapido (Amersham Pharmacia Biotech).

Para la produccin de dmeros de A2/B5, se transfectaron clulas de rion fetal humano 293T con subunidades A2 y B5 de cADN subclonado en un vector bipromotor pBudCE4.1 (Invitrogen Corp.) usando el mtodo de precipitacin de fosfato calcio. Se recolect un medio acondicionado libre de suero conteniendo protenas recombinantes y concentrado 200-fold usando membranas Ultrafree 10-kb. El medio se hirvi durante 5 minutos en un intermediario de muestras SDS y se someti a un 12% de Tricina-SDSPAGE. Para inmunoblotting, la membrana se bloqueo en un 5% de leche seca sin grasa en Tris-intermediario salino con 0.1% entre 20 a 1 hora, seguido de incubacin con policlonal Ab A2 o B5 anti-rabbit durante 1 hora a temperatura ambiental. La despus mancha se incub durante 30 minutos con 0.1 g/ml de rbano anti-rabbit IgG- conjugado con peroxidasa (Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA) como un Ab secundario antes de la visualizacin por quimicoluminiscencia mejorada (Amersham Pharmacia Biotech). Tambin se realizaron pruebas similares de inmunoblotting utilizando extractos de la pituitaria anterior obtenida de ratas macho adultas. Para inmunomanchado, la pituitaria anterior de ratas machos adultas se embebi en parafina despus de ser fijada en solucin de Bouin. Las secciones del tejidod se bloquearon con 5% de suero de cabra en PBS durante 30 minutos para saturar sitios de ligazones no especficas. El policlonal de conejo primario Ab a A2 o B5 se diluy en 1:200 en PBS conteniendo 5% de suero de cabra. Se incubaron secciones durante la noche a 4C y se lavaron tres veces durante 2 minutos cada vez en PBS. Las secciones entonces se incubaron en un conjugado de oro con goat anti-rabbit secundario Ab seguida de manchado con solucin SilvEnhance (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, California, USA) como descrito previamente (14). Se realizaron controles negativos sustituyendo el Ab primario con suero de conejo preinmune. Para el anlisis inmunohistoqumico usando una rotulacin doble fluorescente (15), se incubaron secciones fijas con el B5 Ab seguido por la fluorescina combinada AffiniPure Fab fragmentos de IgG de cabra anticonejo (Jackson InmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, Pennsylvania, USA). Posteriormente se incubaron las secciones con el A2 Ab seguido de tintura rojo Texas-combinado con AffiniPure goat anti-rabbit intacto IgG. Se observ la fluorescencia de la fluorescina en una longitud de onda de excitacin de 495 nm y una emisin de ms de 515 nm. Se observ la fluorescencia del rojo Texas a una excitacin de 510 nm y una emisin de 580 nm. En algunas pruebas, se reemplaz el B5 Ab con Ab contra hormonas pituitarias individuales conocidas proporcionadas por el Programa Nacional Pituitaria y Distribucin de Hormonas (NIH, Bethesda, Maryland, USA). Purificacin del heterodmero A2/B5 utilizando cromatografa rapida lquida de protena y estimulacin de receptores humanos TSHs. Se aplic un medio acondicionado de clulas 293T expresando tanto A2 como B5 a

concentradores Ultrafree con un corte de masa molecular entre 10 y 100 kDa (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA). Se aplic el sobrenadando a una columna de intercambio de cationes Mono S HR10/10 (Amersham Pharmacia Biotech) a 4C (20 mM 2-[N-morfolino] cido etanosulfnico, pH 6.6), Y se usaron fracciones del pico para inmunoblotting para detectar fracciones con antigenicidad con A2 y B5. Las fracciones positias se dializaron contra PBS y se concentraron antes de la aplicacin en una columna Superdex G75 para fraccionamiento de tamao y determinacin de bioactividad. Se confirm la pureza del heterodmero A2/B5 por tintura de plata siguindo SDS-PAGE, y la cuantificacin deA2/B5 purificado se baso en el ensayo Bradford (BioRad Laboratories Inc., Hercules, California, USA). Debido a la inestabilidad del dmero A2/B5 durante SDS-PAGE, se verific la formacin de dimer usando un anlisis de conexin cruzada . Los complejos purificados de B5 yA2 se conectaron cruzadamente usando 1 mM disuccinimidil suberato (DSS) (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA) durante 30 minutos y se termin la reaccin agregando 1 M Tris-HCl, pH 7.4. Los complexos conectados cruzadamente se monitorearon usando SDS-PAGE (10%) bajo conduiciones reducidas. Se confirm la naturaleza de glicoprotena de A2/B5 al tratar los heterodmeros con N-glicosidsis F (New England Biolabs Inc., Beverly, Massachusetts, USA) antes de SDS-PAGE. Evaluacin de la actividad estimuladora de la tiroides in vitro e in vivo. Las clulas 293T se transfectaron co plsmidos humanos codificados TSH, LH, o cADN receptores FSH (16.17) e incubados en DMEM/F12 medio suplementados con 1 mg/ml of BSA y 0.25 mM IBMX con o sin A2/B5, TSH bovino, TSH humano (Genzyme Transgenics Corp., Framingham, Massachusetts, USA), o gonadotropinas. 16 horas despus de la incubacin, se determin la produccin de cAMP utilizando un ensayo radioinmune especfico (18). Para demostrar la especificidad de los efectos simulatorios de A2/B5, se preincubaron muestras con antisuero o suero preinmune contra A2 o B5, durante 1 hora antes de agregarlo a las clulas cultivadas. Para los ensayos de receptores de radioligandos, se rotul TSH bovino usando was Iodogen (Pierce Chemical Co.). Las clulas 293T expresando establemente receptores humanos TSH tipo silvestre se incubaron con TSH I125-rotulado (10,000 cpm/tubo) con o sin TSH no rotulado o A2/B5 en 300 l intermediario aglutinado (HBSS; 280 mM sucrosa y 0.5% BSA). Despus de la incubacin durante 3 horas a 23C, las clulas se lavaron dos veces y se centrifugaron antes del conteo de radioactividad en el pellet usando un contador gama. La habilidad de A2/B5 para regular las funciones de la tiroides se teste usando ensayos in vitro (19) e in vivo (20). Se mantuvieron clulas de tiroide de ratas Clonal FRTL5 en Ham de Coon modificado F12 conteniendo un medio de 5% de suero de becerro antes del tratamiento con hormonas de testeo durante 16 horas para medir el contenido de cAMP usando un ensayo radioinmune especfico. Se realizaron ensayos para la incorporacin de 3H-timidina en capas unimoleculares subconfluentes de

clulas FRTL5. Cuatro das antes del ensayo se cambi el medio a uno libre de suero conteniendo 0.1% BSA. Las clulas entonces se trataron con hormonas de prueba durante 20 horas antes de agregar 3H-timidina. Despus de 4 horas de incubacin las clulas se lavaron dos veces con intermediario y tres veces con cido tricloroactico helado. El sedimento entonces se solubiliz en 500 l de 0.2 M NaOH y se neutraliz con 50 l de cido actico glacial antes de medir la radioactividad. Para el bioensayo de TSH in vivo, se les administr triodotironina (3 g/ml) a ratas macho de 50 das en su agua bebestible durante 4 das (20), para suprimir la secrecin endgena de TSH. Se inyectaron intraperitonealmente dosis crecientes de recombinante A2/B5 o de TSH bovino, y se obtuvieron muestras de sangre 6 horas despus. Los niveles de suero tiroxina (T4) medidos por ensayos radioinmunes (Diagnostic Systems Laboratories Inc., Webster, Texas, USA) sirvieron como el punto final de los ensayos. Figura 1. Identificacin de A2 y B5 como socios potenciales de heterodimerizacin. (a) Comparacin de secuencias entre B5 humano y TSH- as como A2 y la subunidad comn (A). (b) Anlisis de doble hbrido de levadura de interacciones entre A2 y diferentes genes de subunidades en la familia de hormonas de glicoprotenas. Las clulas de levadura se transfectaron con plasmidos decofificando A2 y diferentes genes de subunidades fundidos al dominio de activacin de GAL4 y al dominio de aglutinacin respectivamente. El destacado crecimiento de las colonias expresando A2 y B5 indica una fuerte interaccin entre esas protenas. Tambin se observaron interacciones entre A2 y CG-, as como A2 y FSH-, Mientras que no se observ crecimiento de colonias de levaduras en clulas expresando slo A2, quitando de esta manera todas las posibilidades de activacin de esas construcciones. Figura 2. Expresin de ARNm de A2 y B5 en tejidos de ratas e inmunoanlisis de A2 y B5 en la pituitaria anterior. (a) anlisis de RT-PCR de transcritos A2 y B5 en tejidos de ratas. La amplificacin de los niveles de mensajes GAPDH reflej diferencias en la carga de cADN. (b) Especificidad hormonal de Ab s contra A2 y B5. El anlisis de inmunoblotting indic que Ab s contra A2 o las protenas reconocidas de B5 secretadas por las clulas 293T transfectadas con plasmidos de expresin codificando A2 o B5, o A2 y B5. Sin embargo no se pudieron encontrar seales en pistas cargadas con 500 ng de recombinante humano(h) CG, LH, FSH, o TSH. Se encontr una banda inferior en el inmunoblot A2 siendo no especfico. (c) Anlisis de inmunoblot de A2 y B5 en la pituitaria anterior de ratas. Se usaron extractos de la pituitaria para anlisis. Se trataron previamente algunas muestras con N-glicosidasis F. (d) Inmunomanchado de A2 y B5. La pituitaria anterior mostraba manchado positivo usando A2 o B5 Ab s (panel superior), mientras que el suero preinmune no fue efectivo. Se realiz inmunomanchado usando B5 Ab seguido por fluorescina-

combinada con fragmento IgG de cabra anti-conejo AffiniPure Fab (panel del medio). Posteriormente, se incub la misma seccin con el A2 Ab seguida por tintura rojo Texascombinada goat anti-rabbit intact IgG AffiniPure. Las imgenes para A2 (rojo) y B5 (verde) se combinaron (amarillo) para demostrar la coexpresin de esas dos subunidades. Como un control negativo, la omisin de A2 Ab no llev a seales derivadas de la tintura de rojo (no se mostraron datos). Usando el mtodo de doble inmunomanchado, se encontr una ausencia de coexpresin entre A2 (rojo) y ACTH, hormona del crecimiento (GH), prolactina (PRL), LH-, o TSH- (todo en verde; paneles del medio e inferior).

Resultados Las secuencias de B5 y A2 humano se compararon con TSH- humano y la subunidad comn respectivamente (Figura 1a). Aunque la secuencia B5 carece de la regin de terminal-C "cinturn de seguridad", todos los residuos de cisteina que se necesitan para la formacin de nudos de cisteina se conservan. Puesto que la subunidad A2 identificada recientemente muy probablemente se combina con subunidades conocidas o nuevas para formar hormonas heterodimricas bioactivas, testeamos las interacciones poenciales entre diferentes pares de genes de subunidades utilizando un ensayo de doble hbrido de levadura. Como se muestra en la Figura 1b, se encontraron fuertes interacciones entre las subunidades A2 y B5, CG-, o FSH-. Sin embargo se encontraron mnimas interacciones entre A2 y LH- o TSH-. Con base en esos descubrimientos estructuramos plasmidos promotores dobles codificando diferentes pares de subunidades testeando su potencial activacin de gonadotropina humana y receptores TSH. Es de inters que el medio acondicionado de clulas 293T transfectadas con cADN codificando el par A2/B5 fue capaz de simular la produccin de cAMP por clulas expresando receptores TSH (ver Figura 3 y Figura 4, descritas a continuacin). Para detectar la expresin de A2 y B5 en diversos tejidos, se realiz un anlisis RT-PCR para identificar tejidos de ratas expresando tanto A2 como B5. Como se muestra en la Figura 2a, la transcripcin de A2 consistente con un tamao esperado de 208 bp se podra detectar en diversos tejidos, mientras que el mensaje de B5 con un tamao esperado de 346 bp se encontr slo en el cerebro, pituitaria anterior, tiroides, y corazn. Los cebadores usados fueron no intro extensivos, y la identificacin de los productos PCR se confirm por un secuenciamiento directo. La omisin de ARNm en la reaccin RT-PCR no rindi producto. Despus generamos Ab s especficos contra A2 y B5 para detectar la expresin de esas protenas. En inmunoblots bajo condiciones reducidas (Figura 2b), los Ab s especficos de A2 y B5 no reaccionaron de manera cruzada con las cuatro hormonas de glicoprotenas conocidas pero se detectaron bandas de aproximadamente 23 y 20 kDa en el medio acondicionado de clulas transfectdas que corresponden a subunidades A2 y B5 respectivamente. Una inspeccin inicial de tejidos que expresan ambos transcritos A2 y B5 indic que la pituitaria anterior tena altos niveles de inmunoreactividad mientras que el cerebro, tiroides y ovarios no exhiban ambos antgenos en el mismo tipo de clulas. Como se muestra en la Figura 2c, ambas inmunoreactividades A2 y B5 pueden ser detectadas en la pituitaria anterios de ratas usando un anlisis de inmunoblot. Se encontraron bandas grandes 23 y 20 kDa para A2 y B5, respectivamente. Sobre el tratamiento con N-glycosidasis F, se detectaron bandas de bajo mol wt consistentes con la naturaleza de glicoprotena de esas protenas de

subunidades. Por otro lado realizamos manchado inmunohistoqumico de A2 y B5. Como se muestra en la Figura 2d (panel superior), se encontraron ambas inmunoreactividades en A2 y B5 en la pituitaria anterior de la rata. Para verificar la coexpresin de las subunidades A2 y B5, se realiz inmunomanchado doble fluorescente. Como se muestra en la Figure 2d (panel del medio), mltiples clulas expresaron ambos antgenos A2 y B5 en la pituitaria anterior. Aunque el tipo de clula especfica coexpresando A2 y B5 no ha sido identificado, las clulas A2-positivas no mostraron contenido de ACTH, hormona del crecimiento, prolactina LH-, o TSH- (Figura 2d, paneles del medio e inferior). Para favorecer el anlisis de la naturaleza y bioactividad bioqumica de las protenas recombinantes A2/B5, un medio acondicionado de clulas 293T expresando el heterodmero A2/B5 se pas a travs de una columna de intercambio de cationes Mono-S. Como se muestra en la Figura 3a, un gran pico de protenas se extrajo entre 3035% 1 M NaCl. Esas fracciones conteniendo altos niveles de subunidades A2 y B5 en inmunoblots (panel superior) y el receptor TSH exhibido simulador de actividad (datos no mostrados). En contraste las fracciones 1 y 55 no contienen subunidades A2 o B5 detectables. Las fracciones mximas (fracciones 3038) fueron concentradas y se pasaron a travs de una columna de fraccionamiento de tamao Superdex G-75 antes de monitorear la bioactividad con base en la estimulacin de la produccin de cAMP por las clulas 293T expresando receptores humanos TSH (Figure 3b, lnea de puntos). Nuevamente el pico de la actividad estimuladora del receptor TSH coincidi con las fracciones que contenan ambas A2 y B5 bandas en inmunoblots (Figura 3b, panel superior izquierdo). El mol wt de las protenas bioactivas en esas fracciones fue estimado siendo 43 kDa con base en los marcadores mol wt. Manchado por plata de fracciones de pico combinadas siguiendo SDS-PAGE indic adems la purificacin de un complejo compuesto de subunidades A2 y B5 (Figura 3b, panel superior derecho). Basado en la propiedad estimulante de la tiroides, esta protena heterodimrica purificada se denomin tiroestimulina para distinguirla de la hormona estimuladora de la tiroides ya conocida, TSH. Figura 3. La purificacin del heterodmero A2/B5 heterodimer y la caracterizacin de su naturaleza de glicoprotena. (a) El aislamiento de A2/B5 utilizando la coluna de intercambio de cationes Mono-S. El medio acondicionado de clulas 293T expresando heterodmeros A2/B5 se concentraron antes del fraccionamiento utilizando la columna Mono-S. Se extrajeron muestras usando gradiente NaCl. A2 y B5 inmunoreactivos se monitorearon usando inmunoblots (panel superior) en fracciones seleccionadas (panel inferior, barras gruesas). (b) Posterior purificacin del dmero A2/B5 usando la columna Superdex G-75 y su estimulacin de receptores TSH. Adems se analizaron fracciones de pico de la columna Mono-S utilizando la columna de dimensionamientousing Superdex. Se

monitoreo la actividad estimuladora del receptor TSH con base en la produccin de cAMP por clulas expresando receptores TSH humanos recombinantes (lnea de puntos). Los niveles de A2 y B5 levels en las fracciones mximas se monitorearon por inmunoblots (panel superior izquierdo) y manchado de plata (panel superior derecho). (c) La heterodimerizacin del recombinante A2/B5 con base en anisis de conexin cruzada y la naturaleza de glicoprotena del heterodmero A2/B5. Las fracciones mximas de la columna Superdex conteniendo B5 y A2 purificado se conectaron de manera cruzada usando1 mM DSS (panel superior derecho) o tratadas con N-glycosidasis F (panel del fondo) antes de SDS-PAGE e inmunoblotting bajo condiciones de desnaturalizacin. El panel superior izquierdo presenta muestras sin el tratamiento previo con DSS. Figura 4. La actividad estimuladora dela tiroides del heterodmero A2/B5. (a) A2/B5 purificado, como TSH, estimul la produccin de cAMP por intermedio de receptores TSH humanos pero no por receptores LH y FSH. Efectos dependientes de dosis deA2/B5 y otras hormonas (panel izquierdo). b, bovino; hrec, recombinante humano; h, humano. Ausencia de estimulacin de receptores LH y FSH por A2/B5 (panel derecho). Se us CG o FSH humano (100 ng/ml) para servir como controles positivos (panel derecho). (b) Habilidad de Ab s especficos de A2 o B5 (dilucin 1:100) para neutralizar el efecto estimulatorio de A2/B5 (0.3 ng/ml) en la produccin de cAMP internediada por receptores TSH. La adicin de suero preinmune no alter los efectos estimulatorios de A2/B5. Adems de eso el pre tratamiento con el antisuero A2 y B5 no afect la produccin cAMP inducido por TSH humano (3 ng/ml). (c) El desplazamiento del TSH bovino rotulado desde receptores TSH humanos de recombinante por A2/B5. Se incluy CG humano como un control negativo. (d) A2/B5 purificado (100 ng/ml) promovi la produccin decAMP y la incorporacin de timidina por celulas de tiroides FRTL5 de ratas cultivadas in vitro. bTSH, TSH bovino (100 ng/ml). (e) Induccin de A2/B5 de produccin T4 por la glndula tiroides en ratones tratados previamente con triyodotironina (T3) para suprimir niveles endgenos de TSH. Cada punto de datos representa la media SE de tres a cuatro determinaciones con resultados similares obtenidos en al menos tres experimentos separados. Aunque las subunidades de tiroestimulina disociadas bajo SDS-PAGE sin reduccin (datos no mostrados), detectamos la presencia de complejos de alto peso mol correspondiente al tamao del heterodmero pronosticado despus de la conexin cruzada de la protena A2/B5 purificada (Figura 3c, panel superior derecho). La naturaleza de la glicoprotena de la tiroestimulina se testeo adicionalmente tratando el heterodmero purificado con N-glycosidasis F seguido por inmunoblotting. Como se muestra en la Figure 3c (panel inferior),la disminucin observada del tamao de

subunidades A2 y B5 es consistente con la presencia de conectada con sitios de glicosilacin N en esos peptidos (Asn 14 y 58 en A2; Asn 63 en B5). En clulas que expresan receptores TSH humanos recombinantes, se encontr que la tiroestimulina purificada era tan potente como TSH bovino y ms potente que TSH humano en produccin de cAMP estimulante (Figure 4a, panel izquierdo). Los valores de ED50 para A2/B5 y TSH bovino fueron 0.72 y 0.44 ng/ml, respectivamente. En contraste, los valores de ED50 para el recombinante humano y preparaciones pituitarias de TSH fueron 4.05 y 6.26 ng/ml, respectivamente. Sin embargo la tiroestimulina no fue efectiva para activar los receptores LH o FSH (Figura 4a, paneles de la derecha). Adems los efectos estimulatorios de la tiroestimulina fueron bloqueados por cotratamiento tanto con antisuero A2 o B5 o ambos (Figura 4b). En un ensayo de receptores de radioligandos en TSH bovino rotulado y receptores TSH humano recombinante (FigurA 4c), La tiroestimulina compiti de manera eficiente para aglutinar el receptor con un valor de ED50 (32.5 ng/tubo) comparable al del TSH bovino (28.5 ng/tubo). Adems de eso el tratamiento de una lnea de clulas FRTL5 de tiroide de rata con tiroestimulina, similar al TSH bovino estimil produccin cAMP e incorporacin de timidina (Figure 4d), Confirmando de esa manera la activacin d ereceptores TSH por la tiroestimulina. Para testear la actividad estimuladora dela tiroestimulina in vivo, se trataron ratas macho adultas con triyodotironina para suprimir la secrecin de TSH endgeno seguido de un tratamiento subcutneo con tiroestimulina. Como s emuestra en la Figura 4e, el trtamiento con tiroestimulina es ms potente que con TSH bovino al incrementar los niveles de T4 demostrando as su bioactividad in vivo. Debate Basado en la dimerizacin de dos nuevas subunidades de horonas de glicoproteinas, hemos identificado una nueva hormona de glicoprotena heterodimrica capaz de activar los receptores in vitro e in vivo. Debido a su habilidad de estimular los receptores de tirotropina esta hormona se denomin tiroestimulina. La expresin de esta hormona de glicoprotena y de los receptores TSH en la pituitaria anterior sugiere un mecanismo de sealizacin paracrino. El uso actual de las bsquedas en el GenBank , testeo por doble hbrido de levadura, anlisis de espressin de tejidos y la produccin y testeo de heterodmeros recombinantes representa un paradigma postgenmico en el descubrimiento de una hormona polipeptida. La clsica tirotropina heterodimrica y gonadotropinas fueron purificadas originalmente basadas en su bioactividad pero la metodologa presente toma ventaja de la relcin filogentica entre genes paralogos de subunidades conocidas y nuevas, la naturaleza heterodimrica que caracteriza a las hormonas de glicoprotenas y los mecanismos de sealizacin conocidos de los receptores de tirotropina y gonadotropina. Aunque se descubri que la tiroestimulina es un potente estimulador de las funciones de las clulas tiroides in vitro and in vivo, su funcin exacta en la

fisiologa de la tiroides es an desconocida. Se han encontrado mutaciones de prdida de funcin TSH- en pacientes con hipotiroidismo central congnito (21.24). Ya que eso pacientes mostraron funciones de tiroides defectuosas es poco probable que la tiroestimulina haya participado en el lazo de retroalimentacin TRH-TSH-T4 para sustituir la accin d ela tiroides de TSH en la vida adulta. Ciertamente, anlisis promoter indicaron que el gen humano B5 carece de un elemento de respuesta a la tiroides y no puede ser regulado por hormonas de la tiroides. Con mayor probabilidad, la tiroestimulina puede jugar un rol paracrino en la pituitaria anterior y en otros tejidos que expresan receptores TSH. Adems de las clulas de la tiroides, se ha demostrado la expresin del receptor TSH en las clulas foliculoestrelladas y tirotrofas de la pituitaria humana anterior basado en estudios de hibridacin in situ e inmunohistoqumica (25,26). Las clulas foliculoestrelladas forman una red para la comunicacin a larga distancia en la pituitaria anterior (27) pero su rol exacto no est claro. Basados en la presente identificacin de expresin de A2 y B5 en la pituitaria anterior, la tiroestimulina puede ser parte de un lazo ultra corto en la sintona fina de la secrecin TSH. Son importantes estudios futuros de los mecanismos reguladores que fundamentan la expresin de los genes A2 y B5 de la pituitaria. Puesto que la expresin extra-tiroidal del receptor TSH ha sido tambin demostrada en el cerebro (28), fibroblastos orbitales (29), corazn(29), timo (30), y tejidos adiposos (31,32), son de inters estudios sobre la produccin de tiroestimulina por esos tejidos extratiroidales. El rol fisiolgico exacto de la tiroestimulina puede ser revelado estudiando animales con una mutacin apuntada a los genes A2 o B5, as como la identificaccin de pacientes con defectos en esos genes. El TSH recombinante humano ha sido utilizado para facilitar el monitoreo del carcinoma de tiroides (33). Puesto que el heterodmero A2/B5 mostr una potente bioactividad parecida al TSH in vivo, la disponibilidad de tiroestimulina recombinante proporciona una herramienta de diagnstico adicional para los tumores de tiroides. La demostracin de la actividad estimuladora del receptor TSH del heterodmero de tiroestimulina proporciona una comprensin de la relacin funcional-estructural de diferentes subunidades alfa y en la familia de hormonas de las glicoproteinas. Se cree que los heterodmeros conocidos dela hormona de glicoprotena se estabilizan por un segmento de la subunidad , que se envuelve alrededor de la subunidad alfa como un cinturn de seguridad (8). Sin embargo, la subunidad B5 es nica en el sentido que carece del lazo de bisulfuro, importante para la formacin de este cinturn de seguridad. Ciertamente, el presente anlisis indic que el heterodmero A2/B5 es menos estable que las hormonas de glicoprotenas conocidad durante un anlisis SDS-PAGE. Aunque la menor afinidad entre las subunidades A2 y B5 imposibilita su purificacin usando procedimientos similares a aquellos usados para las hormonas de glicoprotenas clsicas, el heterodmero recombinanet puede ser detectado utilizando las metodologas

presentes basadas en purificacin de dmeros y anlisis de conexin cruzada, subrayando el valor de este paradigma en identificar los restantes miembros de la familia de hormonas de glicoprotenas. La sustitucin de la regin del cinturn de seguridad de TSH- con las regiones correspondientes de CG- o FSH- confiere actividad LH pero no FSH al quimrico TSH (34), mientras que una mutacin pequea de la cistena clave 105 en TSH- cerca de la regin del cinturn de seguridad conduce a la formacin de TSH circulante inactivo (22). Ya que la conformacin del cinturn de seguridad parece no jugar un rol prominente en la bioactividad de FSH (35), Estudios funcionales-estructurales usando B5 seran interesantes y pudieran revelar los dominios exactos involucrados en la especificidad de las interacciones del receptor para ligandos de esta familia. Entre las diferentes hormonas de glicoprotena, ha sido elucidada la estructura de cristal para hCG y FSH (8,36). El heterodmero de la tiroestimulina proporciona un modelo nico para promover la elucidacin de la relacin estructural-funcional de esta familia de cistinas que contienen nudos deligandos de glicoprotenas. Se ha propuesto que las subunidades de gonadotropinas y TSH proporcionan la especificidad para las interacciones del receptor, mientras que las subunidades comunes interactan con la regin transmembranal del receptor para activar protenas G (37). El presente descubrimiento de la activacin del receptor TSH por A2/B5 sugiere que B5 puede ser el responsable por la interaccin con el ectodominio del receptor TSH, mientras que A2 activa la regin transmembranal del receptor ocupado. Sin embargo, nuestras pruebas preliminares indicaron que un heterodmero consistente de las subunidades B5 conocidad y nuevas no activaron el receptor TSH, y que el heterodmero A2/CG- no activ al receptor LH. De esa manera, diferentes heterodmeros, incluyendoA2/B5, probablemente asumen una distinta conformacin en el estado heterodimrico que es ptima para la interaccin con receptores especficos. Se ha aplicado la fusin de genes y el intercambio de dominios entre diferentes genes de subunidades de hormonas de glicoprotenas para generar diversos recombinantes gonadotropina y tirotropina anlogos (9,38,39). Metodologas similares utilizando subunidades A2 y B5 pueden facilitar la comprensin de los mecanismos de sealizzacin de ligandos para hormonas de esta familia. En conclusin, el presente estudio entrega una nueva metodologa para el descubrimiento de hormonas de protenas heterodimricas basada en las interrelaciones pilogenticas entre genes paralogos y el uso del anlisis de doble hibrido por levadura para identificar candidatos a ligandos heterodimricos. Aunque el ensayo de levadura ha sido utilizado extensamente para testear interacciones potenciales entre pares de protenas intracelulares (12), su utilidad para protenas extracelulares ha sido limitada (40). El descubrimiento de una nueva hormona heterodimrica funcional en la familia de las hormonas de glicoprotenas pavimenta el camino para la identificacin de los restantes miembros de esta familia de ligandos y la

elucidacin futura de la interrelacin evolucionaria entre esta familia de ligandos heterodimricos, los receptores de hormonas de glicoprotenas conocidos, y los receptores acoplados relacionados con protena G ricos en leucina, de contenido repetido, (41,42). Reconocimientos Este trabajo fue apoyado por NIH concesin HD-23273. Le agradecemos a Danette Daniels y T. Sugawara de la Universidad de Stanford por la ayuda en la purificacin de la tiroestimulina e inmunomanchado, C. Spencer por la asistencia editorial, G. Vassart (Free University, Belgium) por el cDNA receptor de TSH, y al National Hormone & Peptide Program por diversas hormonas pituitarias. N del T. Trminos marcados con rojo Esta es la traduccin literal de los siguientes trminos, pero pueden ser nombres propios de test o de ensayos, etc anti-rabbit = anti-conejo goat anti-rabbit = Es un IgG de cabra conjugada con peroxidasa y dirigidacontra antgenos de conejo

Coons modified Hams = pernil (jamn) modificado de mapache??? O ser clulas de muslo de mapache modificadas genticamente???