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JC/BK CONSENSUS REF 67-130 REF 67-130BC

COMPOSICIÓN :

Kit de extracción, DNA EXTRACTION KIT Réf.: 67-000

Kit de amplificación Réf.: 67-130B REF 67-130 REF 67-130BC

Kit de revelado Réf.: 67-130C

1. Presentación del Kit................................................................................................................................................................................................1 2. Objetivo de la prueba .............................................................................................................................................................................................1 3. Principio del Kit .......................................................................................................................................................................................................2 4. Composición del Kit y condiciones de conservación ............................................................................................................................................2 5. Materiales y reactivos necesarios..........................................................................................................................................................................3 6. Reconstitución de los reactivos .............................................................................................................................................................................4 7. Consignas de seguridad y realización ...................................................................................................................................................................5 8. Extracción de las muestras y transporte ...............................................................................................................................................................6 9. Los controles ..........................................................................................................................................................................................................6 10. Protocolo de extracción de las muestras.............................................................................................................................................................7 11. Protocolo de amplificación ...................................................................................................................................................................................8 12. Protocolo de revelado.........................................................................................................................................................................................10 13. Cálculos e interpretación de los resultados.......................................................................................................................................................12 14. Prestaciones .......................................................................................................................................................................................................13 15. Problemas / Soluciones......................................................................................................................................................................................14 16. Referencias.........................................................................................................................................................................................................14

1. Presentación del Kit • El kit JC/BK CONSENSUS se ofrece en dos formatos cuyas referencias 67-130 y 67-130 BC corresponden respectivamente a un

formato que contiene los reactivos de extracción y un formato exento de los reactivos de extracción. • El kit JC/BK CONSENSUS permite la detección simultánea tras la extracción, amplificación, y posterior detección en placa de microtización

con ayuda de sondas biotinladas de dos agentes patógenos pertenecientes a la familia de los polyomavirus, los virus JC y BK. • El kit JC/BK CONSENSUS, siguiendo el mismo protocolo, permite detectar e identificar los virus JC y BK en la orina, suero, plasma y

líquidos cefalorraquídeos (LCRs).

2. Objetivo de la prueba • Los polyomavirus pertenecientes a la familia de los polyomaviridae y dos de estos virus infectan específicamente al hombre: el virus JC

(JCV) y el virus BK (BKV). Su genoma viral está constituido de un ADN bicatenario circularizado y superenrrollado, compuesto de aproximadamente 5. 000 pares de bases. Los ADN de estos virus tienen una muy fuerte homología de secuencia.

• Virus ubiquitarios, su elevada seroprevalencia, entre 75 y 100 %, prueba su amplia difusión en la población humana. La primo-infección, inaparente o de expresión clínica no específica sobreviene a partir de la infancia. Tras su penetración, los virus se difunden en el organismo para alcanzar sus órganos objetivo, en los que permanecen de forma latente. Las infecciones generadas por estos dos virus, son esencialmente el resultado de reactivaciones endógenas que son en la mayoría de los casos asintomáticas. Se observan entonces excreciones urinarias intermitentes de polyomavirus.

• Las reactivaciones sintomáticas sólo se describen en los pacientes inmnodeprimidos: la leucoencelopatía multifocal progresiva (LEMP) es una enfermedad demielinizante del SNC asociada a una reactivación del JCV. EL virus es detectado entonces en el cerebro y/o en el LCR. La reactivación sintomática del BKV va asociada a afecciones urinarias (cistitis hemorrágicas, estenosis uretrales, nefritis intersticiales y tubulo-intersticiales) en los transplantados renales y de médula ósea. El virus es entonces detectable en la orina y/o en la sangre.

• Es por lo tanto importante, poder detectar y sobretodo poder diferenciar estos dos virus en los diferentes compartimentos del organismo. La presencia de uno u otro virus no tiene el mismo significado según la localización y no implica los mismos tratamientos ni los mismos pronósticos.

• El diagnóstico virológico se basa esencialmente en la búsqueda directa del virus. El diagnóstico serológico es de aplicación limitada a causa de la elevada seroprevalencia de los anticuerpos anti-polyomavirus. Éstas son principalmente las técnicas de biología molecular actualmente realizadas, pero de manera frecuente no discriminante.

• El kit JC/BK CONSENSUS permite, con una gran sensibilidad, detectar y diferenciar el JCV y el BKV en una sola reacción de PCR en las muestras biológicas.

• El kit JC/BK CONSENSUS no permite la detección del virus SV40.

IVD

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3. Principio del Kit

3.1 Extracción del ADN viral a partir de muestras

• El ADN viral se extrae según una técnica que combina las propiedades selectivas de unión de los geles de sílice en membrana con la velocidad de microcentrifugado.

• La muestra es lisada previamente en presencia de proteasa en una solución tampón escogida especialmente por sus capacidades de unión con la membrana. La utilización de las columnas QIAamp® permite, una vez se ha fijado el ADN, lavar de forma eficaz la muestra para eliminar los contaminantes. La fase de elución permite la obtención de un ADN purificado para realizar la amplificación.

• Esta extracción se realiza, bien con el kit 67-000 incluido en el kit JC/BK CONSENSUS ref. : 67-130 o bien con el kit QIAamp® DNA Blood Mini Kit (QIAGEN ref. :51104 o ref. : 51106 ).

3.2 Amplificación

• Los cebadores utilizados permiten amplificar una secuencia situada en la región codificante para el antígeno T de los virus JC y BK. Después de la amplificación, el tamaño del fragmento amplificado es de 197/198 pares de bases.

• Se suministran dos controles positivos de amplificación en el kit de amplificación 67-130B. Estos controles son plasmados compuestos a los que se ha integrado secuencias reconocidas por los cebadores específicos de cada uno de los dos virus JC y BK respectivamente.

• La premezcla control de inhibición contiene asimismo este plasmido compuesto. Ensayado en presencia de cada muestra, permite verificar la ausencia de inhibidores tras la extracción.

3.3 Revelado

• Después de la amplificación, los productos amplificados son químicamente desnaturalizados. Posteriormente, se añaden a los pocillos de una placa microtiter con el fin de ser revelados. Para aumentar su especificidad, se lleva a cabo una hibridación utilizando una sonda biotinada específica de JC virus y BK virus. El revelado se realiza mediante un conjugado streptavidine-peroxydasa asociado al sustrato 3,3 , 5,5 -tetrametilbenzidina (TMB).Se lee la densidad óptica a 450 nm con la ayuda de un lector de microplacas.

4. Composición del Kit y condiciones de conservación

4.1 Kit de extracción de muestras, DNA EXTRACTION KIT Ref.: 67-000, o QIAamp® DNA Blood Mini Kit (QIAGEN ref.: 51104 o ref.: 51106)

• Número de extracciones por Kit : 50 o A Mini columna QIAamp® ............................................................. 5 x 10 o B Tubos colectores (2 mL) ............................................................ 2 x 50 o C Tampón AL Xn - NOCIF ............................................................. 12 mL o D Tampón AW1 (concentrado) Xn - NOCIF.................................. 19 mL o E Tampón AW2 (concentrado) ...................................................... 13 mL o F Tampón AE ................................................................................ 12 mL o G Proteasa QIAGEN ..................................................................... 24 mg o H Disolvente de la proteasa........................................................... 1,2 mL

• El Kit puede conservarse antes y después de la primera apertura a +2°C/+8°C hasta la fecha de caducidad que se indica en la caja a excepción de la proteasa QIAGEN que permanece estable 6 meses a temperatura ambiente en forma liofilizada. Posteriormente a su reconstitución debe conservarse a -18°C/-22°C, alicuotada, para no realizar sucesivas congelaciones y descongelaciones.

NOTA: Las denominaciones A, B, C, D, E, F, G, H de los reactivos de extracción sólo existen en el kit de extracción DNA EXTRACTION

KIT ref. : 67-000

4.2 Kit de amplificación 67-130B

• Número de amplificaciones : 60 o R9 Premezcla de amplificación ...................................................... 2 x 1 mL

contiene cebadores, tampón, MgCl2, dNTPs o R10 Premezcla control de inhibición ................................................. 2 x 0,75 mL

contiene cebadores, tampón, MgCl2, dNTPs, controlde inhibición o R11 Control positivo JCV ................................................................... 0,15 mL o R12 Control positivo BKV .................................................................. 0,15 mL

• Desde el momento de la recepción del Kit, los tubos R10, R11 y R12 del Kit con referencia 67-130B, deben conservarse entre -18°C/-22°C en el área reservada a la extracción de muestras.

• Conservar el Kit antes y después de la primera apertura congelado a -18°C/-22°C hasta la fecha de caducidad indicada en la caja.

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4.3 Kit de revelado 67-130C

• Número de revelados: 192 o R13 Control negativo de revelación ................................................................0,15 mL o R14 Solución de desnaturalización 1..............................................................1,5 mL o R15 Solución de desnaturalización 2 Xi - IRRITANTE................................... 1,5 mL o R16 Solución de fijado ....................................................................................35 mL o R17 Placa microtiter (12 x 8 pocillo) ...............................................................2 o R18 Sonda JCV lista para su uso (roja) T-TÓXICO....................................... 5 mL o R19 Sonda BKV lista para su uso (roja) T-TÓXICO ...................................... 5 mL o R20 Sonda de control lista para su uso (azul) T-TÓXICO .............................8 mL o R21 Solución de lavado (10x) ......................................................................... 2x60 mL o R22 Disolvente del conjugado T - TOXICO....................................................15 mL o R23 Conjugado streptavidina peroxidasa (50x) ............................................. 0,3 mL o R24 Sustrato - Tetrametilbenzidina (TMB) .....................................................15 mL o R25 Solución de parada C - CORROSIVO.....................................................20 mL o R26 Adhesivos................................................................................................. 4

• Conservar el Kit antes y después de la primera apertura a +2°C/+8°C hasta la fecha de caducidad indicada en la caja.

5. Materiales y reactivos necesarios

5.1 Kit de extracción de muestras DNA EXTRACTION KIT ref.: 67-000, o QIAamp® DNA Blood Mini Kit (QIAGEN ref.: 51104 o ref.: 51106)

• Etanol 96-100%. • Centrifugadora de microtubos • Vortex • Tubos en polipropileno (1,5 mL, 2 mL). • Baño María (o termociclador) a +56°C. • Micropipetas y puntas con filtro. • Guantes desechables. • PBS (por las muestras < 0,2 mL)


• Micropipetas y puntas con filtro. • Termociclador. • Guantes desechables. • Agua esterilizada. • Tubos 0,2 mL en polipropileno para amplificación. • HotStarTaq™ QIAGEN, ref. : 203203 (250 U) a 5 Unidades/ μL.


• Lector de placas microtiter (450 o 450/650 nm) e impresora. • Limpiador de placas microtiter (opcional). • Pipetas estériles. • Micropipetas (1-20 μL y 20-200 μL) y puntas con filtro ; pipeta multicanal • Recipientes desechables para los reactivos. • Tubos de 1,5 mL y 15 mL en polipropileno. • Incubadora a +37° C. • Vortex. • Agua destilada. • Guantes desechables.

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6. Reconstitución de los reactivos 6.1 Kit de extracción de muestras, DNA EXTRACTION KIT ref.: 67-000, o QIAamp® DNA Blood Mini Kit (QIAGEN ref.: 51104 o ref.: 51106)

6.1.1. Preparación de la solución stock de proteasa • Añadir 1,2 mL de disolvente de proteasa (H) a los 24 mg de proteasa liofilizada (G). • Conservar alicuotada a -18°C/-22°C (evitar cualquier congelación/ descongelación sucesivas).

6.1.2. Preparación del tampón AL (C) • Conservar a +2°C/+8°C. • Homogeneizar el tampón AL (C) antes de su utilización. • Nunca añadir la proteasa directamente al tampón AL (C). • Si hay un precipitado en el tampón AL, disolverlo calentándolo a +70°C.

6.1.3. Preparación del tampón AW1 (D)

• Conservar a +2°C/+8°C • El tampón AW1 (D) se suministra bajo forma concentrada. Antes de utilizarlo por primera vez, añadir 25 mL de etanol 96-100%, a los 19

mL de tampón concentrado. Después de la reconstitución, el tampón AW1 (D) permanece estable a temperatura ambiente.

6.1.4. Preparación del tampón AW2 (E)

• Conservar a +2°C/+8°C. • El tampón AW2 (E) se suministra bajo forma concentrada. Antes de utilizarlo por primera vez, añadir 30 mL de etanol 96-100%, a los 13

mL de tampón concentrado. Después de la reconstitución, el tampón AW2 (E) permanece estable a temperatura ambiente.


• Los reactivos de este Kit pueden utilizarse directamente según el protocolo descrito a continuación.


6.3.1 R21 Solución de lavado (10x)

• Se pueden formar cristales en la solución concentrada de lavado (R21). Si esto ocurriera, precalentar a +37°C hasta la disolución completa antes de la dilución.

• Mezclar un volumen de solución de lavado (10x) (R21) y 9 volúmenes de agua destilada. Preparar suficiente solución de lavado 1x para llenar todos los pocillos 10 veces a razón de 350 μL por pocillo cada vez.

• La solución obtenida puede conservarse 3 meses entre +2°C/+8°C.

6.3.2 R22 / R23 Conjugado (50x)

• Puede aparecer un precipitado blanco en el disolvente conjugado (R22). No afecta la funcionalidad del reactivo. Agitar con vortex y extraer la cantidad de reactivo necesario. NO CALENTAR.

• Diluir el conjugado (50x) (R24) a 1/50o en el disolvente del conjugado (R23) homogeneizado previamente con un vortex. • Mezclar 1 volumen de conjugado (50x) (R23) y 49 volúmenes de disolvente del conjugado (R22). Preparar suficiente cantidad del

conjugado, dejándolo listo para usar, para poder distribuir 100 μL en cada pocillo.

Ejemplo para 1 mL de conjugado diluido : Mezclar 20 μL de conjugado R23 en 980 μL de disolvente R22.

• El conjugado se prepara durante el proceso de hibridación. No debe conservarse diluido.

Precauciones en la utilización del Kit

ATENCIÓN : la presencia de detergente y/ o elevadas concentraciones de proteínas en la extracción puede interferir con la fijación del ADN sobre la placa. Por esta razón es importante respetar el protocolo y utilizar únicamente los reactivos recomendados o suministrados en los JC/BK CONSENSUS Kits

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7. Consignas de seguridad y realización

7.1 Consignas de manipulación en Biología Molecular

• El kit JC/BKCONSENSUS debe ser manipulado por personal cualificado, según las buenas prácticas de laboratorios y las instrucciones de manipulación para la biología molecular.

• Se recuerda que la utilización de técnicas de amplificación requiere tomar precauciones para evitar cualquier riesgo de contaminación de las muestras.

• Es obligatorio que las áreas que correspondan respectivamente a la preparación de reactivos, a la preparación de muestras y a las fases de amplificación y de revelado sean independientes. En ningún caso, los productos amplificados deben ser introducidos en áreas de preparación y alicuotado de los reactivos y de preparación de muestras.

• Las muestras utilizadas deben reservarse exclusivamente para este análisis. • Las muestras deben ser preparadas en un puesto de seguridad microbiológica. No debe nunca abrirse los tubos de muestras diferentes

simultáneamente. • Las pipetas utilizadas para manipular las muestras se reservan para este uso. Se trata de pipetas de desplazamiento positivo o de

pipetas más clásicas pero provistas de puntas con filtro .Los diferentes tipos de puntas utilizadas estarán esterilizadas. • Las pipetas utilizadas para la preparación y la distribución de los reactivos quedarán también reservados para este uso. Es conveniente

alicuotar los reactivos con el fin de evitar las fases de congelación/ descongelación.

7.2 Precauciones generales de manipulación

• Manipular y eliminar todas las muestras, el material, los reactivos y los efluentes como si fuesen susceptibles de transmitir agentes infecciosos.

• Leer todas las instrucciones antes de empezar la manipulación. • No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad que figura en las etiquetas. • Utilizar únicamente los reactivos del Kit. • No intercambiar los reactivos de Kits que lleven números de lotes diferentes o de Kits que provengan de otros fabricantes. • Nunca pipetear con la boca. • No se debe beber, fumar o comer en el área de trabajo.

7.3 Precauciones y riesgos específicos de algunos reactivos

• Los tampones de extracción AL (C) y AW1 (D) contienen cloruro de guanidinio (sales caotrópicas). o R22 : Nocivo en caso de ingestión o R36/38 : Irritante para la piel y los ojos. o S13 : Conservar lejos de los alimentos , incluyendo el de los animales. o S26 : En caso de contacto con los ojos lavar inmediata y abundantemente con agua y consultar un especialista. o S36 : Llevar un traje de protección adecuada. o S46 : En caso de ingestión consultar inmediatamente con un médico y mostrarle el embalaje o la etiqueta.. o Las sales caotrópicas no son compatibles con agentes desinfectantes que contengan lejía.

• Los tampones AW2 (E) y el disolvente proteasa (H) contienen 0,04 % de azida de sodio como conservante. • La solución de desnaturalización 2 (R15) contiene hidróxido de sodio :

o R36/38 : Irrita los ojos, la piel o S26 : En caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua y acúdase a un médico. o S37/39 : Úsense indumentaria adecuada y protección para los ojos/la cara. o S45 : En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible, muéstresele la etiqueta).

• Las sondas listas para usar (R18,R19 y R20) contienen formamida: o R61 : Riesgo durante el embarazo de efectos adversos para el feto.. o S53 : Evítese la exposición - recábense instrucciones especiales antes del uso. o S45 : En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible, muéstresele la etiqueta).

• Las soluciones de lavado (R21) contienen 0,01% de Timerosal como conservante. • El diluyente del conjugado (R22) contiene dicromato de potasio

o R46 : Puede causar alteraciones genéticas hereditarias. o R49 : Puede causar cáncer por inhalación. o S53 : Evitese la exposicion - recabense instrucciones especiales antes del uso. o S45 : En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible, muéstresele la etiqueta). o S60 : Elimínense el producto y su recipiente como residuos peligrosos. o S61 : Evítese su liberación al medio ambiente. Recábense instrucciones específicas de la ficha de datos de seguridad.

• Solución de parada (R25) contiene cloruro de hidrógeno o R20 : Nocivo por inhalación.. o R34 : Provoca quemaduras. o S26 : En caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua y acúdase a un médico. o S45 : En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible, muéstresele la etiqueta).

• Evite cualquier contacto entre los diferentes reactivos y la piel. En caso de contacto, lavar abundantemente con agua. Llevar guantes durante la manipulación.

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8. Extracción de las muestras y transporte • Las muestras si no son procesadas a su recepción, se congelarán entre -18°C/ -22°C. • Las muestras que requieran un transporte, lo harán de acuerdo a la legislación del país correspondiente en lo que atañe el transporte de

muestras biológicas potencialmente infecciosas.

8.1 Orinas

• La recogida de orina es realizada en un recipiente esterilizado (ej. : recipiente ECBU). • Es suficiente un volumen de 3 mL (200 μL mínimo. • La orinas son enviadas al laboratorio preferentemente a temperatura ambiente (+18°C/25°C) o a +2 °C/+8 °C. Si las orinas no son

tratadas a la llegada al laboratorio, serán almacenadas a +2°C/+8 °C por un plazo máximo de una semana. Más allá de este plazo, almacenar las orinas a -18°C/-22°C.

• Las orinas enviadas al laboratorio congeladas en hielo seco, serán almacenadas preferentemente a -18°C/-22°C o a –78°C/-82°C .

8.2 Sueros o plasmas

• La sangre se obtiene en tubo seco o tubo con EDTA. ATENCIÓN: Las muestras de sangre recogidas en tubo heparinado son incompatibles con un análisis por amplificación génica. El citrato

contenido en los tubos de obtención de muestras sanguíneas puede provocar problemas de pérdida de señal en la detección de los productos amplificados.

• Los tubos son centrifugados a 1200xg durante 10 minutos a 20°C y los sueros o plasmas son decantados en el puesto de seguridad microbiológica (PSM) en los criotubos a razón de 2 mL máximo (200 μL mínimo).

• Los sueros o plasmas son enviados al laboratorio preferentemente a temperatura ambiente (+18°C/25°C) o a +2°C/+8°C. Si los sueros o plasmas no son tratados a la llegada al laboratorio, serán almacenados a +2°C/+8 °C por un plazo máximo de una semana. Más allá de este plazo, almacenar los sueros o plasmas a -18°C/-22°C.

• Los sueros o plasmas expedidos al laboratorio congelados en hilo seco, serán almacenados preferentemente a -18°C/-22°C o a –78°C/-82°C.

8.3 Líquidos cefalorraquídeos (LCR) • Los líquidos cefalorraquídeos son obtenidos en tubo seco en las condiciones clásicas de realización de punciones lumbares. El volumen

mínimo es de 200 μL. • Los líquidos cefalorraquídeos serán enviados al laboratorio preferentemente a temperatura ambiente (+18 °C/+25 °C). Si los LCR no son

tratados a la llegada al laboratorio, se almacenarán a +2°C/+8 °C durante un plazo máximo de una semana. Más allá de este plazo, almacenar los LCR preferentemente a -18°C/-22°C o a –78°C/-82°C.

• Los líquidos cefalorraquídeos expedidos al laboratorio en hielo seco serán almacenados preferentemente a -18°C/-22°C o a –78°C/-82°C.

9. Los controles • Los controles positivos de inhibición siguen el mismo principio.

La utilización de la sonda o testigo permite diferenciaruna muestra positiva de un control positivo

VECTOR DE CLONADO

FRAGMENTO AMPLIFICADO BK VIRUS

CONTROL POSITIVO DEL FRAGMENTOAMPLIFICADO BK VIRUS

BK VIRUSBKV BKV

BKVBKV PLASMIDA

% GC y tamaño identicos

• La utilización de controles es imprescindible para la validación de las manipulaciones.

9.1 Los controles positivos

• El Kit contiene controles positivos que permiten comprobar la capacidad de los cebadores JC/BK CONSENSUS para amplificar un fragmento a partir de las secuencias correspondientes a los virus JCV y BKV.

• En el Kit 67-130B se incluye dos tubos de controles positivos de amplificación: o R11, plasmida JCV; o R12, plasmida BKV.

• Una vez amplificados en dos tubos respectivamente, se los revelará con la sonda de control (R20) del Kit 67-130C.

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9.2 Los controles de inhibición

• Estos controles permiten detectar la presencia eventual de inhibidores de amplificación en la muestra analizada. • Se suministra una premezcla de control de inhibición (R10) lista para usarse. • Cada muestra será amplificada en paralelo junto a la premezcla de amplificación (R9) y la premezcla de control de inhibición (R10).

9.3 El control negativo de amplificación

• Este control permite controlar la ausencia de contaminación. • Está realizado con todos los reactivos exceptuando la muestra, desde la amplificación a la detección. La muestra se sustituye por agua.

9.4 El control negativo de revelado (R13)

• Este control permite calcular el valor umbral. • Este control negativo (R13) se suministra listo para usarse en el Kit de revelado, referencia 67-130C. • Debe preverse este control por partida doble durante el revelado sobre microplaca.

10. Protocolo de extracción de las muestras

10.1 Kit de extracción de las muestras, DNA EXTRACTION KIT ref.: 67-000, o QIAamp® DNA Blood Mini Kit (QIAGEN ref.: 51104 o ref.: 51106)

En el área reservada para la extracción de las muestras

• Equilibrar la temperatura de las muestras entre +18°C/ +25°C. • Equilibrar la temperatura del tampón de elución (F) entre +18°C/ +25°C. • Comprobar que los tampones AW1 (D) y AW2 (E) así como la solución de proteasa han sido reconstituidas según el protocolo descrito

en la sección 6 « reconstitución de los reactivos. ». • Si existe un precipitado en el tampón AL (F), disolverlo calentándolo a +70ºC. • Todas las fases de centrifugado se realizan a temperatura ambiente.

10.2 Fase de lisado

• Preparar tantos tubos de 1,5 mL como número de muestras disponibles, e identificarlos marcándolos sobre el tapón. • Precalentar el baño maría o el termociclador a +56ºC. • Pipetear 20 μL de proteasa y depositarlos en el fondo de un tubo de micro centrifugación de 1,5 mL. • Añadir 200 μL de muestra en el tubo.

Si el volumen de muestra inicial es inferior a 200 μL, ajustar a 200 μL con un tampón PBS. El volumen de muestra no puede ser inferior a 100 μL. • Añadir 200 μL de tampón AL (C) a la muestra. Mezclar con el vortex durante 15 s.

Para que el lisado sea eficaz, es necesario mezclar correctamente para disponer de una solución perfectamente homogénea. Si el volumen de la muestra es superior a 200 μL, aumentar el volumen de proteasa y de tampón proporcionalmente.

• Incubar a +56°C durante 10 m. • El lisado se ha completado transcurridos 10 min. de incubación. Tiempos de incubación más largos no tienen efecto alguno en el

rendimiento o la calidad del ADN extraído. Los agentes potencialmente infecciosos pueden resultar inactivados incubando la muestra a +95ºC durante 15 min. después del lisado. Sin embargo, incubaciones prolongadas a estas temperaturas pueden conducir a una degradación del ADN.

• Centrifugar brevemente los tubos para sacar las gotas presentes en los tapones.

10.3 Fase de carga de la columna

• Añadir 200 μL de etanol a 96-100 % por tubo y mezclar con vortex durante 15 s. Si el volumen de muestra inicial era superior a 200 μL, aumentar el volumen de etanol proporcionalmente.

• Centrifugue brevemente los tubos para sacar las gotas presentes en los tapones. • Aplicar con precaución cada muestra en una columna QIAamp® colocada sobre un tubo de 2 mL. Asegurarse de que no se moja la parte

superior de la columna (zona de contacto con el tapón). Cerrar el tapón y centrifugar a 6000 g durante 1 min. • Colocar las columnas sobre un tubo de 2 mL limpio y eliminar los tubos que contienen los elementos filtrados.

Cerrar cada columna durante la centrifugación con el fin de evitar contaminaciones cruzadas entre muestras. Si queda solución en la membrana de la columna, centrifugar de nuevo hasta que la solución pase a través de la membrana.

10.4 Fase de lavado

• Abrir las columnas con precaución y añadir 500 μL de tampón AW1 (D). Volver a cerrar las columnas y centrifugar a 6000 g durante 1 min. Colocar las columnas en un tubo de 2 mL limpio y eliminar los tubos que contienen los elementos filtrados.

• No es necesario aumentar el volumen tampón AW1 (D) si el volumen de la muestra inicial es superior a 200 μL. • Abrir las columnas con precaución y añadir 500 μL de tampón AW2 (E). Volver a cerrar las columnas y centrifugar a velocidad máxima

(20 000g) durante 3 min. Colocar las columnas sobre un tubo de 1,5 mL limpio identificado y eliminar los tubos que contienen los elementos filtrados.

• Añadir una fase intermedia colocando las columnas sobre un tubo de 1,5 mL limpio y centrifugando 1 min. a plena velocidad antes de realizar la elución sobre un nuevo tubo de 1,5 mL. Esta fase sirve para eliminar cualquier riesgo de subida del tampón AW2 (E) en la columna durante la deceleración de la centrifugadora. O durante la transferencia de las columnas fuera del rotor.

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10.5 Fase de elución

• Abrir las columnas con precaución y añadir 50 μL de tampón de elución AE (F) equilibrado a temperatura ambiente para los LCR, sueros y plasmas y un volumen de 200 μL de tampón de elución AE (F) para las orinas. Cerrar las columnas e incubar durante 1 min a temperatura ambiente. Centrifugar a 6000 g durante 1 minuto.

• Si el volumen de muestra inicial fuese inferior a 200 μL, variar proporcionalmente el volumen de elución hasta un limite de 50 μL para una muestra inicial de 100 μL.

• El tiempo de incubación antes de centrifugación puede alargarse a 5 min. Con el fin de mejorar el rendimiento en ADN. • La muestra extraída se conservará entre -18°C/-22°C.

11. Protocolo de amplificación

Kit de amplificación de las muestras 67-130B

NOTE: El protocolo de amplificación descrito a continuación se aplica exclusivamente:

- A los productos extraídos según el protocolo de extracción descrito en el capítulo 10 de esta ficha técnica y con el kit de extracción, DNA EXTRACTION KIT ref. : 67-000. o el kit QIAamp® DNA Blood Mini Kit (QIAGEN ref. :51104 o ref. : 51106 ). - Al agua estéril como testigo en el premix de amplificación.

ATENCIÓN : La premezcla control de inhibición (R10) y los controles positivos (R11 y R12) que contienen ADN requieren una correcta conservación a partir del momento de la recepción del Kit y deben ser manipulados en la sala de extracción.

• Poner en marcha el termociclador para que pueda aumentar la temperatura. • Para cada serie de amplificación, identificar el siguiente número de tubos en polipropileno de 0,2 mL para amplificación:

o 2 tubos para cada muestra que quiera probarse (premezcla de muestra y premezcla control de inhibición); o 1 tubo para los controles positivos JCV o 1 tubo para los controles positivos BKV o 1 tubo para el control negativo de amplificación (todos los reactivos de amplificación exceptuando la muestra, sustituida por agua estéril). o

Ejemplo para una serie de análisis de 5 muestras : n = 5 + 2 + 1 = 8 y n' = 5

En el área reservada para la preparación de los reactivos

11.1 Preparación de la HotStarTaq™ diluida

ATENCIÓN : Para garantizar las prestaciones del Kit, es obligatorio utilizar el polímero recomendado en el protocolo.

• A partir de la HotStarTaq™ QIAGEN, ref. : 203203 (250 U) a 5 Unidades/μL, preparar una dilución en agua estéril para (n+1) tubos de premezcla de amplificación y (n +1) tubos premezcla controles de inhibición, lo que equivale a :

o Pipetear (n + n' + 2) x 5 μL de agua estéril y depositarlas en un tubo. o Añadir (n + n' + 2) x 0,3 μL de HotStarTaq™ a 5 U/μL.

Ejemplo para 5 muestras : Pipetear 75 μL de agua estéril y añadir 4,5 μL de HotStarTaq™ concentrado.

11.2 Preparación de las premezclas de amplificación (R9)

o Pipetear (n+1) x 35 μL de premezcla de amplificación (R9) y depositarlas en un tubo de 1,5-2 mL. o Añadir (n+1) x 5 μL de HotStarTaq™ diluida.

• Repartir 40 μL en n tubos. Ejemplo para 5 muestras : Pipetear 315 μL de R9 y añadir 45 μL de HotStarTaq™ diluida; Repartir 40 μL en 9 tubos premezclas de amplificación.

• Colocar los tubos premezcla de amplificación (R9) preparados y el resto de HotStarTaq™ diluido en hielo. • Cerrar todos los tubos antes de desplazarse. • Coger el tubo de HotStarTaq™ diluido (volumen restante para lo tubos controles de inhibición), los n tubos preparados y los n tubos

vírgenes y desplazarse a al área reservada para la extracción de las muestras.

n = número de muestras + 2 tubos control positivos + 1 tubo control negativo de amplificación (n= número de tubos amplificados en la premezcla de amplificación) n = número de muestras (n = número de tubos amplificados en la premezcla de inhibición).

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Im Raum für Proben Extraktion.

11.3 Preparación de las premezclas de control de inhibición (R10)

o Pipetear (n +1) x 35 μL de premezcla control de inhibición (R10) y depositarlas en un tubo de 1,5-2 mL. o Añadir (n +1) x 5 μL de HotStarTaq™ diluida.

• Repartir 40 μL en los n tubos. Ejemplo para 5 muestras : Pipetear 210 μL de R10 y añadir 30 μL de HotStarTaq™ diluida ;

Repartir 40 μL en 5 tubos premezcla controles de inhibición.

11.4 Añadir la muestras y los controles en las soluciones de premezcla

• Llevar las muestras a temperatura ambiente y homogeneizarlas, respetando un tiempo de vortex de 15 segundos. Centrifugar en caso necesario: dispersión del extracto en el tapón o bajo volumen de extracto

• Para cada serie d amplificación, añadir el volumen de muestra y de los controles para cada una de las premezclas siguientes : o 10 μL de muestra extraído en 1 tubo premezcla control de inhibición preparado, correctamente identificado. o 10 μL de muestra extraído en 1 tubo premezcla de amplificación preparado, correctamente identificado. o 10 μL de control positivo JCV (R11) en 1 tubo premezcla de amplificación preparado, correctamente identificado. o 10 μL de control positivo BKV (R12) en 1 tubo premezcla de amplificación preparado, correctamente identificado. o 10 μL de agua estéril (para el control negativo de amplificación) en 1 tubo premezcla de amplificación preparado,

correctamente identificado.

En el área reservada para la amplificación

• Colocar los tubos en termociclador ; iniciar el programa de amplificación descrito en la tabla mostrada más abajo. Nota : La fase de desnaturalización durante 15 min. a 95ºC es imprescindible. Permite la activación del ADN polimerasa, HotStarTaq™ de QIAGEN. Nota : El volumen de la reacción es de 50 μL

11.5 Programa de amplificación

Termociclador PE 2400/9700 1 ciclo 95°C 15 min. 40 ciclos 94°C 30 seg 55°C 30 seg 72°C 30 seg 1 ciclo 72°C 7min. 4°C

• Los productos de amplificación serán analizados inmediatamente, o congelados a –18ºC/22ºC si el análisis queda diferido a días posteriores.

• Para una conservación prolongada (>1 mes), añadir 1 μL de EDTA 1M en cada producto amplificado y conservarlo a -18°C/-22°C.

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12. Protocolo de revelado

Detektionskit 67-130C

• Durante cada serie de pruebas, preparar un pocillo para cada uno de los productos amplificados y sus controles, según el modelo siguiente:

o Pocillo muestra : 1 pocillo por muestra amplificada para hibridar con la sonda JCV (R18) 1 pocillo por muestra amplificada para hibridar con la sonda BKV (R19) 1 pocillo por control de inhibición correspondiente para hibridar con la sonda control (R20).

o Pocillo control para cada serie : 1 pocillo control positivo JCV amplificado para hibridar con la sonda control (R20) 1 pocillo control positivo BKV amplificado para hibridar con la sonda control (R20) 1 pocillo control negativo de amplificado para hibridar con la sonda JCV (R18). 1 pocillo control negativo de amplificado para hibridar con la sonda BKV (R19). 1 pocillo control negativo de amplificado para hibridar con la sonda control (R20) 1 pocillo control negativo de revelado (R13) de amplificado para hibridar con la sonda JCV (R18). 1 pocillo control negativo de revelado (R13) de amplificado para hibridar con la sonda BKV (R19). 1 pocillo control negativo de revelado (R13) de amplificado para hibridar con la sonda control (R20).

Ejemplo para 5 muestras : 23 pocillos en la microplaca 10 pocillos para muestras amplificadas 5 pocillos para control de inhibición 8 pocillos para control

NB : Las dos sondas JCV (R18) y BKV (R19) deben ser utilizadas simultáneamente en cada muestra con el fin de no poner inútilmente en cuestión la calidad de la extracción o de la muestra encontrada inhibida y ensayada negativa en un sólo parámetro. En efecto, una carga viral elevada del segundo parámetro no ensayado, puede estar en el origen de la inhibición observada. (cf. : último párrafo sección 13.2)

• Realizar un plano de la placa. • R13 es el control negativo de placa listo para ser usado, suministrado con el Kit para calcular el valor umbral. • Los diferentes controles deben ser tratados como los otros productos amplificados.

En el área reservada para la post-amplificación

12.1 Desnaturalización y fijación • Preparar 1 tubo en polipropileno de 1,5 mL nuevo e identificado para :

o cada muestra clínica; o cada control de inhibición; o el control positivo JC virus amplificado; o el control positivo BK virus amplificado.

• Prever 2 tubos en polipropileno de 1,5 mL nuevos e identificados para: o el control negativo de revelación (R13) ; o el control negativo de amplificación (H2O).

Ejemplo para 5 muestras : Preparar 16 tubos de desnaturalización

• Para cada muestra o control, distribuir 5 μL de producto amplificado en los nuevos tubos de polipropileno de 1,5 mL identificados. • Añadir 10 μL de solución de desnaturalización 1 (R14), y agitarlo con vortex. • Añadir 10 μL de solución de desnaturalización 2 (R15), agitarlo con vortex e incubar 5 minutos a temperatura ambiente. • Añadir en cada tubo 200 μL de solución de fijación (R16), agitar con vortex.

ATENCION : referenciar correctamente los pocillos de la placa de microtiter (R17) para facilitar la interpretación de los resultados.

• Distribuir 100 μL de esta mezcla por pocillo según el esquema descrito más abajo: o para cada muestra, 2 pocillos; o para cada muestra amplificada con el control de inhibición, 1 pocillo ; o para el control positivo de amplificación JCV, 1 pocillo; o para el control positivo de amplificación BKV, 1 pocillo; o para el control negativo de amplificación, 3 pocillos ; o para el control negativo de revelado (R13), 3 pocillos.

• Cubrir la placa con un adhesivo (R26) e incubar 15 minutos a +37°C (la fijación puede prolongarse hasta una hora a +37ºC) o, según se prefiera, una noche a temperatura ambiente +18°C/+25°C.

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12.2 Hibridación • Precalentar el volumen necesario de la sonda JCV (R18) (roja), la sonda BKV (R19) (roja) y la sonda control (R20) (azul), listas para

usarse, 15 min. a + 37ºC antes de utilización. • Vaciar los pocillos dándoles la vuelta. • Añadir (por pocillo) 100 μL de sonda JCV (R18) (roja):

o en el primero del dos pocillos muestras; o en el primero del tres pocillos control negativo de amplificación; o en el primero del tres pocillos control negativos de revelado.

• Añadir (por pocillo) 100 μL de sonda BKV (R19) (roja): o en el segundo del dos pocillos muestras ; o en el segundo del tres pocillos control negativo de amplificación; o en el segundo del tres pocillos control negativos de revelado.

• Añadir (por pocillo) 100 μL de sonda control (R20) (azul) :: o en los pocillos control de inhibición; o en el pocillo control positivo JCV; o en el pocillo control positivo BKV; o en el tercero del tres pocillos control negativo de amplificación. o en el tercero del tres pocillos control negativo de revelado.

• Cubrir con un adhesivo (R26) e incubar durante 30 minutos a +37ºC.

12.3 Lavados post-hibridación • Reconstituir la solución de lavado 10x (R21), tal y como se describe en la sección 6 “Reconstitución de los reactivos". • Lavar la placa, según convenga, con un lavador de microplacas, o manualmente:

o Para un lavado automatizado : a. Programar una purga previa de 500 μL ; b. Aspirar el contenido de los pocillos; c. Reemplazar con 350 μL de solución de lavado 1x. Incubar 30 segundos y aspirar completamente los pocillos; d. Repetir la fase c, 4 veces ; e. Golpee la placa sobre papel absorbente para eliminar la solución de lavado residual.

o Para un lavado manual : o Vaciar los pocillos dándoles la vuelta y golpee la placa sobre papel absorbente ; o Distribuir alrededor de 350 μL de solución de lavado 1x con una piseta o un distribuidor automático. Incubar 30

segundos. Vaciar los pocillos dándoles la vuelta y golpear la placa ; o Repetir la fase b, 4 veces.

12.4 Detección y lavados post detección • Antes del final de la fase de hibridación, llevar el diluyente del conjugado (R22) a temperatura ambiente +18°C/+25°C. Diluir el conjugado

50x (R23) a 1/50o en el diluyente, tal y como se describe en la sección 6 “Reconstitución de los reactivos" ; • Vaciar los pocillos. Añadir 100 μL de conjugado, preparado previamente, en cada pocillo mediante un distribuidor automático o otra pipeta. • Incubar 15 min. a temperatura ambiente +18°C/+25°C ; • Realizar los lavados tal y como se describe en "12.3".

12.5 Revelado • Sustraer en un tubo tintado o cubierto de aluminio el volumen total del sustrato TMB (R24) necesario para la manipulación en curso (es

decir 100 μL por pocillo). Dejar equilibrar el sustrato a temperatura ambiente. Comprobar que los tubos están bien cerrados ; • Vaciar los pocillos. Añadir 100 μL de sustrato en cada pocillo ; • Incubar 30 min. a temperatura ambiente y a oscuras; • Detener la reacción añadiendo 100 μL por pocillo de solución de parada (R25) ; • Establecer el cero del lector de placa en vacío y leer la densidad óptica (DO) a 450 nm. Puede realizarse también una doble lectura

(450/650 nm).

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13. Cálculos e interpretación de los resultados

13.1 Validación de la prueba y establecimiento de los valores umbrales

• La interpretación de los resultados de la serie es únicamente posible si la DO obtenida tras hibridación de los controles negativos del Kit (R13) es < a 0,4 DO para cada pocillo correspondiente.

• El cálculo se realiza según las ecuaciones: • Determinación de los valores umbrales: Un valor umbral (S) se calcula a partir del promedio de los tres valores obtenidos, con cada una

de las tres sondas, y con los controles negativos de revelado del Kit tras hibridación o Lectura de DO a 450 nm: S = DO promedio + 0,15 o Lectura de DO a 450/650 nm: S = DO promedio + 0,075

• Comprobar que la amplificación no está contaminada: los valores de DO obtenidas con los controles negativos de amplificación (H2O) deben ser inferiores al valor umbral.

• Compruebe que la DO obtenida con el control positivo es superior al valor umbral.

ATENCIÓN : Si una de estas condiciones no se cumple, debe cuestionarse la validez de la manipulación y empezar de nuevo la serie de pruebas.

• Se procederá al análisis de los resultados obtenidos para cada muestra.

13.2 Interpretación

• Si la prueba ha sido validada, compare las DO de las muestras obtenidas tras hibridación, con la sonda JCV (R18) y la sonda BKV (R19) en el valor S calculado.

• La interpretación puede realizarse como sigue: o Si DO muestra > S + 10% ; La amplificación es positiva para JCV o BKV. o Si DO muestra < S - 10% ; La amplificación es negativa para JCV y BKV. o Si DO muestra = S ± 10% ; Debe repetirse de nuevo la prueba del producto amplificado.

• Tras la realización de la segunda prueba: o Si DO muestra > S + 10% ; La amplificación es positiva para los JCV o BKV. o Si DO muestra < S - 10% ; La amplificación es negativa para los JCV y BKV. o Si DO muestra = S ± 10% ; Debe realizarse de nuevo la amplificación a partir de otra muestra.

• Antes de validar definitivamente los resultados negativos, es necesario analizar los resultados de estas muestras en relación a los controles de inhibición:

o Si la DO del control de inhibición es superior a 0,8 unidades de DO la muestra es amplificable, el resultado obtenido con la sonda JCV o BKV puede validarse.

o Si la DO del control de inhibición es negativa o inferior a 0,8 unidad de DO y el resultado con la sonda JCV y BKV. ha sido negativo, la muestra contiene probablemente inhibidores de la reacción de amplificación génica. El resultado no puede ser validado; es ininterpretable. La muestra debe ser obtenida y amplificada de nuevo (o repetir la prueba sobre una nueva muestra).

o Si la DO del control de inhibición es negativa y el resultado con la sonda JCV o BKV positivo, la muestra es positiva a la detección del genoma de los JCV o BKV. En efecto, una muestra de carga viral elevada puede entrar en competencia durante la amplificación con el plásmido y conllevar un resultado más bajo o negativo con la sonda de control de inhibición.

Los métodos de amplificación que utilizan la Polymerase Chain Reaction (PCR) están cubiertos por las patentes n° 4683195 y 4683202 poseídos por Hoffman-La Roche. Ni estas instrucciones ni la compra de reactivos comercializados por Argene constituyen una autorización o licencia implícita para la utilización de dichos métodos. QIAamp®, es una marca registrada de QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania, con licencia para ARGENE. Los productos QIAGEN contenidos en este kit están desarrollados y fabricados por QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania.

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14. Prestaciones NOTE: Los resultados del kit JC/BK CONSENSUS están garantizados con la utilización del kit de extracción DNA EXTRACTION KIT 67-000

o con el kit QIAamp® DNA Blood Mini kit (QIAGEN ref. :51104 o ref. : 51106 )

14.1 Resultados de un estudio retrospectivo en 231 muestras

• Estudio realizado en el laboratorio de virología de CHU Robert Debré en Reims. • 231 muestras clínicas (orina, sangre, LCR) recogidas durante el año 2001 y almacenadas a –80°C fueron ensayadas con el kit JC/BK

CONSENSUS. Estas 231 muestras habían sido caracterizadas con la técnica propia del laboratorio (1) : extracción Qiagen DNA Mini Blood, PCR polyomavirus, detección de los productos amplificados en microplaca HYBRIDOWELL™ (Argene ref. : 67-012). Entre esas 231 muestras el 47% (109) eran positivas para JCV y/o BKV.

• Los resultados están presentes en los cuadros siguientes:

128 Orina PCR propio + -

+ 88 9 JC/BK CONSENSUS

- 3 31

En orina, Sensibilidad : 96,7% Especificidad ; 75,6%

51 Sangre PCR propio + -

+ 10 2 JC/BK CONSENSUS

- 0 39

Sur sangre, Sensibilidad : 100% Especificidad ; 95%

52 LCR PCR propio + -

+ 7 3 JC/BK CONSENSUS - 1 41

Sur LCR, Sensibilidad : 87,5% Especificidad ; 93,2%

Es decir en las 231 muestras : PCR propio

+ - + 105 14

JC/BK CONSENSUS - 4 108

Sensibilidad : 96% Especificidad ; 88,5%

• Los resultados del PCR JC/BK CONSENSUS concuerdan al 91% con los las técnicas de referencia, los resultados obtenidos con los diferentes tipos de muestras parecen indicar una mayor sensibilidad de la PCR JC/BK CONSENSUS.

14.2 Resultados del estudio de especificidad realizado en el mismo laboratorio:

• Las muestras ensayadas son extractos de cultivo celular infectadas por HSV-1, HSV-2, CMV, VZV, EBV (células NAMALWA), Adénovirus Entérovirus Coxsackie A9, y HIV1.

• Para todos los agentes patógenos ensayados se ha obtenido un resultado negativo, probando la buena especificidad del kit.

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15. Problemas / Soluciones

15.1 Señales débiles o ausencia de señal

POSIBLES CAUSAS: SOLUCIONES:

Problema de extracción. • Comprobar que las extracciones de sangre hayan sido realizadas en tubo EDTA.

• Comprobar que el protocolo de extracción seguido sea el descrito en esta ficha técnica.

• Comprobar que la técnica de extracción corresponda a la validada con el kit 67-080BC

• Comprobar el resultado obtenido con el control de inhibición y rehacer la extracción aumentando a 100 μL el volumen de elución para los sueros y plasmas si el control de inhibición es negativo. Practicar la etapa suplementaria de centrifugado aconsejada durante la etapa de lavado.

• Comprobar los resultados en los dos parámetros virales JCV y BKV.

Problema de amplificación • Compruebe el resultado obtenido con los controles positivos de amplificación. Si son débiles o negativos, compruebe le programa entrado en el termociclador.

• Comprobar las prestaciones térmicas del aparato según el procedimiento recomendada por el proveedor.

Problema de desnaturalización • Respete la secuencia:

• Desnaturalización 1 vortex,

• Desnaturalización 2 vortex,

• Incubar 5 min.

Temperatura de hibridación inadecuada • Comprobar la temperatura de hibridación inadecuada.

Concentración en conjugado insuficiente • Comprobar la dilución del conjugado.

15.2 Ruido de fondo fuerte

16. Referencias 1) Moret H., Guichard M., Matheron S., Katlama C., Sazdovitch V., Huraux JM. et Ingrand D.

Virological diagnosis of progressive multifocal leukoencephalopathy : detection of JC virus DNA incerebrospinal fluid and brain tissue of AIDS patients. J.Clin.Microbiol. 1993 Dec ;31 (12) : 3310-3.

2) Lescieux A., Andreoletti L., Dewilde A., Hober D. and Wattre P.

Rapid detection of JCV-DNA in peripheral blood leucocytes and PBMCs from HIV-infected patients without PML. Inaugural Meeting of the European Society for Clinical Virology, Progress in Clinical Virology September 10, 1997 – Bologna, Italy.

POSIBLES CAUSAS: SOLUCIONES:

Problema de lavado • Respetar el protocolo, especialmente el tiempo y número de lavados post hibridación y postdetección.

Concentración demasiado elevada. • Comprobar la dilución del conjugado

Problema de depósito del conjugado • El conjugado debe depositarse al fondo del pocillo y no en la parte superior y sobre el borde del pocillo.

Temperatura de incubación del conjugado demasiado elevada

• Comprobar la temperatura de la sala (+18°C/+25°C).

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