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IV simposio Internacional de Regreso a la U….

Perspectivas diagnósticas y pronosticas del laboratorio en la práctica clínica

Taller pruebas diagnósticas en Taller pruebas diagnósticas en

Inmunodeficiencias primarias

Dra. María Claudia Ortega Dr. Carlos E Olmos O.

Dr. Jairo Muñoz . Ma. Consuelo Romero S

Citometría de flujo al alcance de las inmunodeficiencias primarias-IDP

Ma.Consuelo Romero S, PhD-Jairo Muñoz, MSc

Zulma Maldonado, Bcl-Clara M. Manosalva Bcl

Unidad de IDP-Instituto de Referencia Andino

Taller pruebas diagnósticas en

Inmunodeficiencias primarias

Inmunodefiencias

Ma. Consuelo Romero S, PhD

Citometría de Flujo

Inmunodeficiencias

• Grupo heterogéneo de patologías que como resultado de anormalidades en el sistema inmune


resultado de anormalidades en el sistema inmune producen un incremento en la susceptibilidad a infecciones, cáncer y autoinmunidad

Análisis básicos de tamizaje en IDP

Linfocitos B

Linfocitos T


PMN NK

Citometría de Flujo-definición:

• Medición simultánea de múltiples características físicas de una sola célula en


suspensión a una alta velocidad.

• Principio de las mediciones célula por célula

Citometría de flujo-características

• Una columna de líquidotransporta en su seno alas células a analizarhaciéndolas pasar


haciéndolas pasaralineadas por delantede una fuente deiluminaciónmonocromática(generalmente un láser)

• Una serie de detectoresregistran la luz dispersadapor las células y suemisión de fluorescencia(luz emitida con distinta


(luz emitida con distintalongitud de onda.

• Esa fluorescencia esrecolectada ytransformada en valoresdigitales almacenados enun computador.

Citometría de flujo-características

• Mediante el marcaje de las células con moléculas fluorescentes se pueden conocer


moléculas fluorescentes se pueden conocerpropiedades de las mismas: expresiónantigénica, fenotipificación, viabilidad, función, capacidad efectora etc.

PARÁMETROS CELULARES MEDIDOS

� El tamaño celular relativo ( Forward Scatter o

FSC)

�La complejidad interna o granularidad relativa


�La complejidad interna o granularidad relativa

(Side Scatter o SSC)

�Intensidades relativas de emisión de fluorescencia

� ( FL1, FL2, FL3 ,FL4…..etc..)


FORWARD SCATER – LUZ DIFRACTADA

- S relaciona con la superficie y área celular.- Se detecta en el eje de incidencia del laser:

SIDE SCATER – LUZ REFLEJADA Y REFRACTADA

-Se relaciona con la complejidad interna de la célula y su granularidad-Se detecta en un ángulo de 90 grados con el haz del laser.

Parámetros evaluados

Ma. Consuelo Romero S, PhDCitometría de Flujo

Fuente de Luz Incidente: Láser de Argón a 488 nm

Detector de dispersión de luz frontal α Tamaño celular-FSCFSC (Forward Scatter)

Detector de dispersión de luz en ángulo recto α Complejidad celular-SSCSSC (Side Scatter)

www.biol.unlp.edu.ar/inmunologia/citometria.ppt

Que podemos medir?

• Partículas o células en suspensión desde 0.2 hasta 50 µm

• Células a partir de tejidos sólidos: disgregación


• Células a partir de tejidos sólidos: disgregación y suspensión

Características de una célula medidas en el citómetro de flujo:

Tamaño y granularidad


Granulocitos

Monocitos

Linfocitos

Glóbulo rojo: 6 umLinfocito:8 umPolimorfonuclear neutrófilo= 12 um


http://www.google.com.co/imgres?q=tamaño+de+las+células+de+la+sangre&um=1&hl=es&lr=&sa=N&biw=1152&bih=753&tbm=isch&tbnid=4ioBwyZSCRvNoM:&imgrefurl=http://www.proyectosalonhogar.com/cuerpohumano/Cuerpo_humano_circulatorio2.htm&docid=KzJC7DOOkdhJM&w=374&h=241&ei=zBKRTun9OM2

Polimorfonuclear neutrófilo= 12 umMonocito =14 um

MARCACION DE CELULAS CON ANTICUERPOS

FLUORESCENTES

•Se utilizan, generalmente, inmunoglobulinas monoclonales contra antígenos de la superficie de las células, o proteínas intraceluaresmarcadas con colorantes fluorescentes.

•Control negativo: Anticuerpo del mismo isotipo marcado con el mismo fluorocromo pero que no reconoce ninguna de las moléculas de la


fluorocromo pero que no reconoce ninguna de las moléculas de la superficie.

•Control negativo: células que no fueron marcadas para determinar autofluorescencia.

•Control positivo: células normales, células de líneas celulares, comerciales

Citometría de Flujo www.biol.unlp.edu.ar/inmunologia/citometria.ppt

FLUOROCROMO

Sustancia que se emplea para marcar anticuerpos u otras moléculas, por su propiedad de emitir luz de una determinada longitud de onda, cuando se le estimula con un láser o con luz ultravioleta.

Ma. Consuelo Romero S, PhDhttp://www.medicoscubanos.com/diccionario_medico.aspx?q=fluorocromo

Los fluorocromos pueden usarse directamente, aprovechando la propiedad que tienen algunos de unirse a determinadas moléculas u orgánulos tales como los colorantes de ácidos nucleicos: ioduro de propidio, bisbencimidas, etc.Pero lo más habitual es que estos colorantes se empleen conjugados a otras moléculas, como anticuerpos, que son capaces de unirse de modo específico a estructuras concretas de la célula. http://fotonica.cnb.uam.es

Citometría multicolor

• COMO DISEÑAR UN PANEL DE FLUOROCROMOS:

– Selección de fluorocromos por brillo según la expresión antigénica y/o cantidad celular. (Valores Publicados)

– Minimizar el sobrelapamiento entre flourocromos.


– Minimizar el sobrelapamiento entre flourocromos.

– Usar los fluorocromos tandem ( varios fluoruocromos) considerando sus limitaciones.

– Conocer muy bien la configuración del equipo que se esta utilizando, y manejar un muy buen control de Calidad.

Luz Luz incidenteincidenteLuz Luz incidenteincidente Luz Luz transmitidatransmitidaLuz Luz transmitidatransmitida

Fluorocromos utilizados

FL1

FL2

Índice de coloración del fuorocromo y como se acopla a la molécula

Luz Fluorescente emitida


FL3FL4

emitidade menor energía y mayor longitud de onda

Citometría Análoga vs Digital

Análoga

• Se dificulta almacenar, comparar y calcular, recuperar información

• Menos canales de resolución

• No se puede modificar datos después de la adquisición


Digital

• Más rápida, mas exacta

• Más canales de resolución

• Datos originales

• Se puede compensar datos después de haber realizado la adquisición de estos

• El proceso de compensación permite corregir el sobrelapamiento

http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis355.pdf

Intensidad de fluorescencia y sitios de unión

Número

de

eventos

FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

FITC FITC


Intensidad de fluorescencia FITC

FITCFITC

FITC

FITC

Nivel de expresión antigénica en una célula.La expresión antigénica puede variar debido al nivel de activación celular y diferencias funcionales.

•En linfocitos CD4 activados disminuye la intensidad de expresión del

correceptor CD4.

•En linfocitos CD8 activados aumenta la expresión del correceptor CD8

•Activación TCR modulación de CD3

•La apoptosis reduce la expresión de determinados antígenos de linaje

CD19CD19,CD20CD2CD2

CD45

CD14 CD15

NeuNeuMonoMonoLBLBNKNKCD4CD4 CD8CD8

Estudio de la heterogeneidad celularEstudio de la heterogeneidad celular

CD19

CD3CD3

CD56CD56,CD16

CD4CD4 CD8CD8

CD45RACD45RA CD45RACD45RA CD45RACD45ROCD45RO CD45ROCD45RO

http://www.alfredoprieto.tk

IL-17anti-CD4-APC

anti-IL-17 RT

anti-CD45-PerCP

anti-CD3-FITCLinfocito T CD4

anti-CD3-FITC

anti-CD45-PerCP

anti-CD45-PerCP

anti-CD8-PE

Linfocito T CD8

anti-CD4-APC

anti-CD45-PerCP

anti-CD3-FITCLinfocito T CD3/CD8/CD4/CD45

anti-CD45-PerCP

anti-CD8-PE

Muestra con EDTA almacenada a temperatura 20-25 oC se puede procesar en las siguientes 48 horas

Cytometry, 1993;14:685-9

Cytometry, 1996;26:16-21

CDC.MMVR, 2003;52(No.RR-02):1-13.1

anti-CD19-PE

anti-CD45-PerCP

anti-CD20-FITCLinfocito B

anti-CD56-FITC

anti-CD45-PerCP

anti-CD45-PerCP

anti-CD16-PE

NK

LT/LB/NK

Población celular Tipo de antígeno Expresión de moléculas

por célula

Linfocito T TCR 100.000

CD3 124.000

CD4 100.000

CD8 90.000

CD45 > 200.000

Población celular Tipo de antígeno Expresión de moléculas

por célula

Linfocito B CD19 18.000

CD20 109.000

NK CD56 10.000

Monocito CD14 110.000

CD32 21.000

ANALISIS DE DATOS

Los datos colectados se pueden observar de 2 maneras:

1) Histograma

Eventos

medidos

FLUORESCENCIA

HISTOGRAMA


Los datos colectados se pueden observar de 2 maneras:

2) Dot-plot


Linfocitos

Monocitos

Análisis de datos

Granulocitos

CD3- CD4 en sangre total CD3 – CD4 en gate de linfocitos

Elijo un gate:

Ej. linfocitos

CD4 T cellsCD4 T cells

Cuantificación del número de linfocitos T CD4

CD 8 CD 8 T CellsT Cells

Representación de la información

J Immunol 1983;131:212

Expresión de Resultados

de células T maduras CD4/CD3 o CD8/CD3

• Datos porcentuales• Datos absolutos: Partículas de cuantificación con

fluorescencia conocida células/µµµµL• Datos estadísticos

Quadrant Statistics


File: Normal01.05 Log Data Units: Linear ValuesSample ID: Patient ID:

Tube: CD3/CD8 Panel: IMK-Lymphocyte

Acquisition Date: 15-Jun-95 Gate: G1Gated Events: 2383 Total Events: 6000

X Parameter: FL1-H CD3 (Log) Y Parameter: FL2-H CD8 (Log)

Quad Location: 17, 17

Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean

UL 126 5.29 2.10 4.51 4.12 324.82 171.35

UR 508 21.32 8.47 268.00 249.17 2472.09 1624.51LL 420 17.62 7.00 3.92 3.50 3.13 2.53

LR 1329 55.77 22.15 306.66 289.43 1.50 1.28


-Caracterización fenotípica: CD3, CD56, CD19

- Diferenciación celular: CD95, CD45RA, CD45RO

¿De que nos informan los estudios inmunfenotípicos?

- Diferenciación celular: CD95, CD45RA, CD45RO

- Co estimulación: CD28, ICOS, CTLA-4

- Recirculación: CD62L, CLA, α4β7

- Activación celular: CD57, CD25, HLA-DR, CD71

• Establecer rangos propios ?

• Parámetros que pueden afectar: género, edad del paciente, características clínicas del paciente, raza, estado de actividad física, hora del día.

Subclase n Media Rango al 95 %


Subclase n Media Rango al 95 %

LT CD 4 % 164 45 33-58

LT CD 8 % 164 24 13-39

LT totales CD3 % 164 72 56-86

LT CD4 células/µL 164 941 404-1612

LT CD 8 células/µL 164 511 220-1129

LT totalescélulas/µL

164 1513 723-2737

National Committee for clinical laborattory Stabdars, 1992.NCCLS

• Inmunofenotipificación de linfocitos apartir de

sangre periférica en niños:

• Maduración y expansión del sistema inmune en los primeros años, la cual puede variar


en los primeros años, la cual puede variar

• Objetivos: Establecer valores de referencia relativos y absolutos en diferentes etapas de la población pediátrica.

Marleke, W. et Al .J Pediatr 1997;130:388-93

Métodos: Sangre total con EDTA lisada, citometría a 2 colores

Total n= 429

Neonatos (sangre de cordón umbilical)

20

Niños sanos 358

Adultos 51

1 semana a 2 meses n=13


2 a 5 meses n=46

5 a 9 meses n=105

9 a 15 meses n=70

15 a 24 meses n=33

2 a 5 años n=33

5 a 10 años n=35

10 a 16 años n=23

Fenotipos

Linfocitos B CD19

Linfocitos T CD3

Linfocitos T CD4 CD3+/CD4+

Linfocitos T CD8 CD3+/CD8+

Linfocitos T activados CD3+/HLA DR+


Células NK CD3-/CD16+,CD56+

•Seleccionaron el gate de linfocitos por tamaño y granularidad y se confirmó su pureza con marcadores CD14 y CD45 = el gate contenía por lo menos 95% de linfocitos

•Valor relativo = expresado en porcentaje•Valor absoluto= tomando el valor de leucocitos •Estadística percentiles 5 y 95, mediana y distribución ??

Valor relativo de subpoblaciones de linfocitos en sangre

Ma. Consuelo Romero S, PhDMarleke, W. et Al .J Pediatr 1997;130:388-93

Valor absoluto de subpoblaciones de linfocitos en sangre


Mediana del valor absoluto de subpoblaciones de linfocitos en neonatos, niños y adultos


Valor absoluto de LT y subpoblaciones CD4 y CD8


Mediana del valor absoluto de células NK en neonatos, niños y adultos por edad


Conclusiones

• Los cambios en el valor absoluto de subpoblaciones de linfocitos no siempre son consistentes con los cambios en porcentaje.


• El porcentaje de LT CD3 permanece estable en un 64 al 72% desde los 2 años hasta el adulto lo cual no sucede con el valor absoluto, la mediana disminuye

• El incremento en el porcentaje de células NK hasta de dos veces durante la niñez no es causada por un aumento por si de estas células, sino por la disminución en el número

Conclusiones


células, sino por la disminución en el número de LT y LB.

• Valores confiables en cada grupo de edades: dirigidos a estudios de inmunodeficiencias.

• Infección y medicamentos: periodo estable

Conclusiones

• El informe de los resultados se debe categorizar por grupos de edades.

• Es suficiente la evaluación de un solo


• Es suficiente la evaluación de un solo marcador de linaje linfoide para LT,LB y NK??

• La muestra con EDTA es estable por 2 días a To

ambiente.

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