Producción, caracterización y evaluación de inmunogenicidad de partículas pseudovirales para hepatitis B (HB-VLPs) expresadas en líneas celulares de mamiferos recombinantes.

IMÁGENES: En caso de incluir imágenes o gráficos, estos deberán presentarse en una resolución de 200dpi con tamaño

mínimo de 200mm x 250mm (proporcional)

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en formato PDF sin excepción

No se deben incluir animaciones o hipervínculos

El tamaño del eposter será PANORÁMICO 16:9 Orientación VERTICAL

Juan Battagliotti, Diego Fontana, Marina Etcheverrigaray, Claudio Prieto UNL, CONICET, FBCB (Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas), CBL (Centro Biotecnológico del Litoral),

Laboratorio de Desarrollo Biotecnológico, Ciudad Universitaria, Ruta Nacional 168 - Km 472,4 - C.C. 242 - (S3000ZAA) Santa Fe, Argentina.

LaHepatitisBesunainfecciónhepáticapotencialmentemortalcausadaporelvirusdelahepatitisB(HBV).Aúnhoyendía,constituyeun importanteproblemadesaludanivelmundial,afectandoamásde350millonesdepersonas. LavacunaparaHepatitisBquesecomercializa en Latinoamérica es producida en levaduras, expresando solo la proteína S de la envoltura del HBV en su forma noglicosilada.Sibienestavacunahademostradosereficazysegura,alrededordeun10%de lapoblaciónsana inmunocompetentenologradesarrollarunarespuesta inmune.Unaestrategiaparamejorar la respuestade lavacunacióncontraelHBVeseldesarrollodevacunasmásinmunogénicasmediantelainclusióndelas3proteínasdelaenvolturadeestevirus(S,MyL)ensusformasglicosiladas.Estas proteínas tienen la capacidad de autoensamblarse formando estructuras llamadas partículas pseudovirales (VLPs, Virus-LikeParticles), las cuales imitan la conformación del virus nativo, pero carecen del genoma viral, lo que las convierten en excelentescandidatosvacunales.

INTRODUCCIÓN

EnestetrabajosepresentaeldesarrolloycaracterizacióndeVLPsparaelvirusdelaHepatitisB(HB-VLPs),expresandolastresglicoproteínasdeenvolturadelHBVencélulasCHO-K1yHEK293,comoestrategiaparaeldesarrollodeuncandidatovacunalde

nuevageneración.Asuvez,lainmunogenicidaddeestasHB-VLPsfueevaluadaenanimalesdeexperimentación.

OBJETIVO

96 %

92%

A B

D

CONSTRUCCIÓNDELVECTORDEEXPRESIÓN,GENERACIÓNDELÍNEASRECOMBINANTESYANÁLISISDELAEXPRESIÓNDELAGLICOPROTEÍNAS

LasecuenciacodificantedelHBsAgfueclonadaenvectoresdetransferencialentivirales.EstosvectoresseutilizaronparatransducircélulasCHO-K1yHEK293,ygenerarlíneascelulares

recombinantesestables.

ElniveldeexpresiónenlaslíneascelularesrecombinantesCHO-HByHEK-

HBfueanalizadamediantemicroscopíadefluorescencia(MF)ycitometríadeflujo

(CF).

CARACTERIZACIÓNDEHB-VLPsElbrotedeHB-VLPsalsobrenadantedecultivosedeterminómedianteunensayodeELISAsándwichespecífico

paralaglicoproteínaS.

SedeterminóquelasHB-VLPsestabancompuestasdelastresglicoproteínasdesuperficiedelHBVmedianteunensayodeELISAsándwichencualseemplearonanticuerposmonoclonalesespecíficosparalacapturadecadaglicoproteína.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

LCHO-HB LCHO-K1wt

Absorban

cia49

2nm

mAbS

mAbM

mAbL

LasHB-VLPsfueronconcentradasmedianteprecipitaciónconpolietilenglicolyanalizadasmediantemicroscopíaelectrónicadetransmisión(TEM)ywesternblot

Seutilizóunsueropoliclonalanti-proteínaS.Elpeso

molecularresultóelesperadoparalaproteínaSglicosilada(27kDa)presenteenlasHB-VLPsy24kDaparaelcontrol(proteínaSnoglicosiladaproducidaenlevadura).

Seobservaronpartículasdentrodelrangoesperado(22-30nm).

ANÁLISIS DE LA INMUNOGENICIDAD DE HB-VLPs

Eltítulodeanticuerposanti-antígenoSobtenidoenlossuerosderatonesinmunizadosconHB-

VLPsresultósignificativamentemayoralobtenidoenlossuerosinmunizadosconel

antígenoSprovenientedeunavacunacomercial(*=ValorP<0,05).

Se determinó la presencia de anticuerpos específicos anti-L en sueros de ratones

inmunizados con HB-VLPs de la línea HEK-HB. Para esto, las placas de ELISA fueron

sensibilizadas con un péptido sintético correspondiente con una región presente

en la proteína L involucrada en la unión del HBV con el hepatocito.

A.LCHO-HBMF.B.LCHO-HBCF.C.LHEK-HBMF.D.LHEK-HBCF

A B

DC

92%

96%

A.HB-VLPsproducidaenLCHO-HB(campoampliado).B.HB-VLPsproducidasenLHEK-HB

A B

26,3nm

1 2 3

1-Vacunacomercial2-HB-VLPsLCHO-HB3-HB-VLPsLHEK-HB

Cut-off

** **

Títulodeanticuerpos:diluciónmayoralvalordecutoff, calculadocomo laabsorbanciadelcontrolnegativomásdosdesviacionesestándar.Segraficaelpromedioobtenidoparacadagrupoconsurespectivadesviaciónestándar.

PLANDEINMUNIZACIÓN:RATONESBALB/Cn=53dosisvíaintramuscularAdyuvante:Liposap®(producidoporLipomizeS.R.L.)

GRUPOI:HB-VLPsequivalentea0,4ugdeproteínaSprovenientedelalíneaLCHO-HB

GRUPOII:HB-VLPsequivalentea0,4ugdeproteínaSprovenientedelalíneaLHEK-HB

GRUPOIII:0,4ugdeantígenoS,provenientedeunavacunacomercialproducidaenlevadura

24kDa27kDa

Sedesarrollaronlíneascelularesrecombinantescapacesde

expresarysecretaralsobrenadantecultivosHB-VLPscompuestasporlas3proteínasdelaenvolturadelHBV.Estas

partículaspresentaronlamorfologíaytamañoesperados.

Asuvez,fueroncapacesdeinducirunarespuestainmune

humoralenanimalesdeexperimentación,ysedetectaronanticuerpos

específicosparalaregióndeunióndelHBVconelhepatocito.

Porlotanto,estasHB-VLPssuponenuncandidatovacunal

promisorio.