INTRODUCCCIÓNA partir de los ’50 comenzaron a desarrollar las técnicas de Fertilización in Vitro (IVF). En 1959 fue reportado el nacimiento del primer conejo producido por IVF. Y la primera IVF de bovino con semen capacitado en el oviducto o en útero de una vaca, pero el nacimiento del primer bovino por transferencia de un embrión de cuatro células en el oviducto de una vaca fue reportado por Brackett en 1981. En este experimento los ovocitos habian sido madurados in vivo y la fecundación se realizo in vitro con semen capacitado en una solución con alta concentración ionica. Finalmente los primeros terneros nacidos de ovocitos maduros, fertilizados y cultivados in vitro fue reportado en 1987.

Biotecnologías disponibles como la maduración y fertilización de ovocitos in vitro y el cultivo in vitro de los embriones nos ofrece nuevas posibilidades para mejorar los porcentajes de ganancia genetica anual. Nuevas tegnologias aun mas potentes para elmejoramiento genético estan siendo desarrolladas dia a dia. Actualmente se esta trabajando intensamente en la producción de animales transgenicos que a su ves puedan ser clonados y cultivados in vitro y transferidos a receptoras.

1. PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO.La fertilización in vitro, que literalmente dignifica “Fertilización en vidrio”, es es un frase genérica que abarca los procedimientos de Maduración in vitro (IVM), Fertilización in vitro (IVF) y cultivo in vitro (IVC), es decir los mecanismos de maduración del ovocito, la interacción de este con el espermatozoide en un ambiente creado en el laboratorio y el desarrollo de estos embriones hasta, generalmente, el estado de blastocito. Tambien se denominan estas tres etapas como Producción in vitro (IVP) de embriones.

La utilización comercial de embriones producidos por INP es aún limitada por la falta de eficiencia y repetibilidad de los resultados de los sistemas in vitro. Tales sistemas deben proporcionar el ambiente de cultivo necesario para que los embriones puedan desarrollar hasta estadios preimplantacionales avanzados para su eventual criopreservación y/o transferencia. En este punto describiremos las características de un laboratorio de IVF y las etapas principales de la tecnica.

1.1 Organización y manejo del laboratorio.Cuando se comienza a organizar un laboratorio para producir embriones de bovino utilizando Maduración, Fecundación y cultivo in vitro, una de las etapas más importantes es la instalación del laboratorio.

a. Lugar.Un laboratorio de IVF debe tener un lugar especial en el edificio en el que esta ubicado y debe estar dedicado exclusivamente a IVP. Generalmente consta de una habitación grande dividida con un parte dedicada al cultivo (Laboratorio de cultivo) y la otra porcion dedicada a la preparación de medios, preparación de semen, manutención de materiales de vidrio, etc.

El laboratorio debe tener temperatura constante de aproximadamente 26-28°C y su acceso debe estar restringido s{olo al personal que trabaja en IVP, extremando las medidas de asepsia. Esta pieza estará equipada con el incubador, lupas y microscopio invertido. Generalmente se le instalan tubos de luz ultravioleta que son encendidos en la noche, cuando el laboratorio no esta en funcionamiento.

La recuperación de ovocitos de ovarios de matadero debe realizarse en un lugar retirado de estos laboratorios para prevenir contaminación. En el caso de los laboratorios de IVP dedicados a la producción comercial de embriones, la obtención de ovocitos se hace generalmente por aspiración folicular en la manga. En este caso el laboratorio debe estar ubicado lo mas retirado posible de los corrales de dadoras y receptoras.

b. Equipos.A continuaciones describen los equipos esenciales para el funcionamiento de un laboratorio de IVP. Existen gran variedad de cada uno de ellos en el mercado por lo que señalaran solamente las caracteristicas principales y su función dentro del laboratorio.

Sistemas de purificación de agua: Uno de los factores que más influye en los resultados de un laboratorio de IVF es la calidad del agua que se utiliza en la preparación de los medios. Los pirogenos y bacterias son factores importantes que influyen en los resultados de los cultivos. Exite una clasificación del agua pura indicando el tipo: I, II y III. En IVF debe utilizarse agua tipo I que es aquella que tiene la menor cantidad de contaminantes.

Estufa de cultivo: Generalmente son el centro de atención de los laboratorios de IVP ya que en ella se fertilizan y desarrollan los embriones. Su principal característica es tener control automatico de gases. Algunos poseen control de CO2, O2 y N2 y otras solo de CO2. Generalmente una estufa mantiene diferentes cultivos (ovocitos en maduración, en fertilización, embriones endesarrollo), por lo que se abre constantemente. Es importante mantener temperatura y concentración de los gases constantes por los que existen estufas con una segunda puerta, generalmente de vidrio, y adamascada estante con puertas independientes.

Estereoscopios y microscopios: Estos instrumentos son críticos durante todas las etapas del manejo de los gametos y embriones: busqueda y selección de ovocitos, evacuacion del semen y clivaje, control del desarrollo de los embriones durante el cultivo, etc. Por lo que debe se r de buena calidad y tener diferentes aumentos. Un microscopio invertido y uno compuesto con contraste de fase son necesarios para el trabajo con semen (determinar concentración y mobilidad) y ovocitos (determinar maduración o fecundación). Ademas se lo puede equiparar con equipos de fotografia y video, útiles especialmente en laboratorios de investigación.

Campana de flujo laminar: es necesaria para la preparación de medios y su manipulación en ambientes expuestos a contaminación.

Otros instrumentos: Existen numerosos equipos importantes en la preparación y almacenamiento de medios como: osmometro, peachimeto, freezer, tanque de N2

liquido, balanza analitica, centrifuga, platina térmica, hemocitómetro, micropipetas, filtros de diferentes tamaños, heladera, etc. 1.2. Procedimiento.EL procedimiento General se puede dividir en cuatro etapas principales que comprenden la colección de los complejos cúmulo-ovocitario, la maduración de estos cúmulos, la fertilización y finalmente el cultivo de los embriones. A continuación describiremos brevemente cada una de estas etapas.

a. Recuperación de los complejos cúmulos-ovocitarios (COCs) de los ovarios.Morfologiamente el complejo cúmulo-ovocitario comprende el ovocito, la zona pelúcida y las celulas que rodean la zona pelúcida denominadas cumulus ooforus. El conjunto cúmulo-ovocito es el denominado Complejo Cúmulo-Ovocitario (COCs).

Básicamente podemos, obtener los COCs de dos formas: De material De matadero o de hembras vivas. Los COCs provientes de ovarios de matadero se obtienen por aspiración del liquido folicular, ya sea con una bomba aspiradora o con una jeringa (folículos de 2 a 6 mm), o por desmenuzamiento de ovario (folículos >2mm). De hembras vivas se pueden obtener por aspiración folicular transvaginal con ayuda de la ultrasonografía, con aguja y endoscopio o por laparotomía.

Una vez obtenido el líquido folicular se realiza la busqueda de los COCs bajo la lupa, y se los lava en PBS. Luego se hace la selección y clasificación y se loscoloca en medio de maduración. La mayoria de los trabajos publicados describen y categorizar los COCs de acuerdo a la morfología de las celulas cúmulos oophorus y a las características de ovoplasma. En la siguiente tabla esta descrita la clasificación de los COCs de acuerdo a las características de la envoltura y del ovoplasma.

Tabla 1. Esquema de clasificación para evaluar las estructuras de los ovocitos bovinos. Estructura Descripción de la categoría Puntaje

EnvolturaCompleto, cumulus oophorus presente;más de tres capas; compacto.

1

Parcial, cumulus presente ya sea rodeando completamente al ovocito o parcial pero con más de 3 capas; compacto.

2

Expandido, cumulus presente; el componente celularMuestra expansión; cumulus celular aparece amontonado y en diferentes lugares.

3

Desnudo, sin cumulus; ovocito rodeado sólo por la zona pelúcida. 4

OvoplasmaGranulación homogenea que le da al ovocito una apariencia polvorienta; el ovoplasma llena el espacio rodeado por la zona pelúcida.

1

Granulación en racimos o con distribución heterogenea en el ovoplasma, puede estar localizada en el centro del ovocito dejando clara la periferia o puede estar condensada formando un solo monton de apariencia obscura en el ovoplasma; el ovoplasma llena la zona pelúcida.

2

Ovoplasma contraido lejos de la zona pelúcida llenándola irregularmente; ovoplasma degenerado, vacuolizado, fragmentado, o en pedazos; zona pelúcida vacia.

3

Fig. 1 Clasificación de los ovocitos

El éxito de la aspiración se mide por máximo porcentaje de COCs obtenidos respecto al número de folículos aspirados, con puntaje de 1 y 2 (Fig. 1) uno de los factores que más influye en la calida de los COCs, es la presión durante el proceso de aspiración, cualquiera sea el método utilizado. En la siguiente tabla vemos un ejemplo de la influencia de la presión sobre la calidad de ovocitos obtenidos con diferentes presiones de aspiración con una aguja de 17G y 57cm de longitud de ovarios de matadero.

Tabla 2. Efecto de la presión de aspiración sobre la calidad de ovocitos. Cada grupo son 30 varios.

Presión de la bombaCalidad de ovocitos 100 mmHg 75 mm Hg 50 mm Hg

Cúmulo completoDesnudo

Número de ovocitos36

17012832

14718