INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 

 

CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS 

 

Identificación de algunos  factores que afectan la  interacción jitomate‐ 

Ralstonia solanacearum‐ bacteriófago ITL‐1 

TESIS  

 

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE  

MAESTRÍA EN CIENCIAS  

EN  

 

MANEJO AGROECOLÓGICO DE PLAGAS Y ENFERMEDADES 

PRESENTA 

GUADALUPE MONSERRAT ALVARADO JASSO 

 

 

 

YAUTEPEC, MORELOS, DICIEMBRE DEL 2013  

   

  

AGRADECIMIENTOS 

 

Al Dr. Roberto Montes Belmont y al Dr. Jesús Hernández Romano por la oportunidad de 

trabajar con ustedes. Gracias por su conocimiento transmitido, por la disposición y por 

aguantarme estos dos años y medio. 

A  los integrantes de mi comité tutorial y comisión revisora que sin duda sus comentarios y 

observaciones enriquecieron la tesis. 

A  todos  mis  compañeros  y  trabajadores  del  CeProBi,  especialmente  a  Itzel  Ramos 

Figueroa, Maribel García Mahecha y Jaime Rivera Contreras por el apoyo  incondicional y 

por  haber hecho una estancia divertida e inolvidable. 

Al  Instituto  Politécnico  Nacional  (IPN),  Consejo  Nacional  de  Ciencia  y  Tecnología 

(CONACYT)  y  al  programa  de  formación  e  investigadores  (PIFI)  del  IPN  por  el  apoyo  y 

financiamiento para realizar mis estudios de maestría. 

 

 

 

 

 

 

 

 

  

ÍNDICE  

  Páginas

RESUMEN  I 

ABSTRACT  II 

I  INTRODUCCIÓN  1 

II  Antecedentes  3 

2.1  Importancia del cultivo de jitomate  3 

2.2  Marchitez bacteriana  4 

2.3  Síntomas y ciclo de la enfermedad en jitomate  8 

2.4  Manejo de la marchitez bacteriana en jitomate  10 

2.5  Bacteriófagos en el control biologico  12 

2.6  Clasificación y ciclos de vida de os bacteriófagos   14 

2.7  Receptores fágicos en la bacteria Ralstonia solanacearum  18 

2.8  Uso de bacteriófagos para el manejo de Ralstonia solanacearum  20 

2.9  Factores que intervienen en la aplicación de bacteriófagos como control biológico 

23

2.10  Objetivo general  24 

2.11  Objetivos específicos   24 

III  Materiales y Métodos  25 

3.1   Origen de la cepa bacteriana y del bacteriófago ITL‐1  25 

3.2  Estandarización de la técnica de producción in vitro del  

bacteriófago ITL‐1 

25 

3.2.1  Preparación del stock bacteriano  27 

3.2.2  Titulación de bacteriófagos mediante la técnica de doble capa de agar   27 

3.3  Evaluación de los efectos preventivo y curativo del bacteriófago ITL‐1  29 

3.3.1  Diseño experimental para evaluar el efecto preventivo y curativo del 

bacteriófago ITL‐1  

29 

3.3.2  Evaluación de la progresión de la enfermedad  30 

3.3.3  PCR de colonia para determinar la presencia de R. solanacearum en  31 

  

aislamientos microbianos  

3.4  Evaluación de la patogenicidad de la cepa bacteriana utilizada   32 

3.5  Evaluación de la estabilidad del bacteriófago ITL‐1 en diferentes 

sustratos utilizados para el cultivo de jitomate en Morelos  

32 

3.5.1  Evaluación de la utilidad de la técnica de PCR tiempo real para cuantificar al bacteriófago ITL‐1  

33 

3.6  Comportamiento de factores ambientales durante los experimentos de 

infección 

36 

3.7  Influencia del origen del agua de riego sobre la actividad del bacteriófago 

ITL‐1 

37 

IV  Resultados y discusión   39 

4.1  Producción in vitro del bacteriófago ITL‐1  39 

4.2  Efecto preventivo y curativo del bacteriófago ITL‐1 en plantas de 

jitomate 

41 

4.3  Comportamiento de los factores ambientales durante la infección con R. 

solanacearum en los ensayos en el bioespacio e invernadero 

46 

4.4  Evaluación de oligonucleótidos para la cuantificación viral por PCR‐RT  49 

4.5  Evaluación del efecto de diferentes sustratos sobre la actividad del 

bacteriófago ITL‐1 

45 

4.6  Evaluación del efecto de diferentes sustratos sobre la actividad del 

bacteriófago ITL‐1 

51 

4.7  Influencia del origen del agua de riego sobre la actividad del bacteriófago 

ITL‐1  

54 

VI  Conclusiones   58 

VII  Bibliografía  59

   

  

ÍNDICE DE CUADROS 

Cuadro 1.  Diferencia entre biovares de R. solanacearum de acuerdo a su 

metabolismo oxidativo de diversos azúcares 

6 

Cuadro 2.  Determinación  de  razas  en  R.  solanacearum  y    relación  con 

los biovares 

7 

Cuadro 3.  Descripción  de  algunas  ventajas  y  desventajas  de  los 

bacteriófagos  

13 

Cuadro 4.  Mezcla de reacción  utilizada para el PCR‐RT  35 

Cuadro 5.  Concentraciones fágicas utilizadas en la curva patrón para el 

fago ITL‐1, cuantificado por PCR‐RT 

36 

Cuadro 6.  Ciclo umbral (Ct) obtenido por cada uno de los tres pares de 

oligonucleótidos evaluados para cuantificar al bacteriófago ITL‐1 

por PCR‐RT 

50

Cuadro 7.  Valores de capacidad de retención, pH y conductividad eléctrica 

de los sustratos 

52

Cuadro 8.  Valores de pH y conductividad eléctrica obtenidos por cada 

fuente de agua 

55

 

 

 

  

INDICE DE FIGURAS  

Figura  1.  Síntomas de marchitez bacteriana en jitomate causada por  

R. solanaceraum 

9 

Figura 2.  Ciclo lítico y Ciclo lisogénico de bacteriófagos   15 

Figura 3.  Clasificación de Bacteriófagos considerando características 

genómicas, morfología y la presencia o ausencia de cola 

17 

Figura 4.  Fagos que infectan a R. solanacearum  22 

Figura 5.  Microfotografía electrónica del bacteriófago ITL‐1   25 

Figura 6.  Representación gráfica de la cuantificación viral  28 

Figura 7.  Ubicación en el genoma del bacteriófago ITL‐1 de los tres pares 

de oligonucleótidos 

34 

Figura 8.  Perfiles de crecimiento bacteriano después de inocular al 

bacteriófago ITL‐1 en diferentes momentos de la curva de 

crecimiento microbiano 

40 

Figura 9.  Corte transversal del tallo de la planta de jitomate  42 

Figura 10.  Plantas de jitomate expuestas a R. solanacearum   43 

Figura 11.  Identificación cultural y por PCR de R. solanacearum en 

exudados de los tallos de las plantas de jitomate 

44 

Figura 12.  Condiciones de temperatura y porcentaje de marchitez que se 

presentaron durante 19 días en el bioespacio y el invernadero 

47 

Figura 13.  Condiciones de humedad relativa y porcentaje de marchitez que 

se presentaron durante 19 días en el experimento de infección 

48 

Figura 14.  Perfiles de amplificación del fago ITL‐1, utilizando tres pares de 

oligonucleótidos diferentes 

49 

Figura 15.  Perfiles de amplificación del fago ITL‐1, utilizando el par de 

oligonucleótidos ITL1‐RT1 y seis diluciones en base 5 

50 

Figura 16.  Curva patrón para la cuantificación del fago ITL‐1 por PCR‐RT 

utilizando los oligonucleótidos ITL1‐RT1 

51 

Figura 17.  Influencia del sustrato en la actividad del bacteriófago ITL‐1. Las  53 

  

literales iguales indican que no hay diferencia estadísticamente 

significativa 

Figura 18.  Estabilidad del bacteriófago ITL‐1 en agua de diferente origen  56 

I  

RESUMEN  

La  marchitez  bacteriana  del  jitomate  (Solanum  lycopersicum)  causada  por  Ralstonia 

solanacearum,  es  uno  de  los  principales  factores  limitantes  de  la  producción  de  este 

cultivo. Una de las alternativas para el manejo integrado de esta enfermedad es el control 

biológico  a  base  de  bacteriófagos.  En  este  trabajo  se  evaluó  la  interacción  entre  el 

bacteriófago  ITL‐1,  el  fitopatógeno  bacteriano  Ralstonia  solanacearum  y  la  planta  de 

jitomate.  El  proceso  de  producción  del  bacteriófago  se  analizó  a  nivel  laboratorio  para 

reducir  el  tiempo  de  producción.  Se  evaluaron  los  efectos  protector  y  curativo  del 

bacteriófago  ITL‐1    bajo  un  diseño  completamente  al  azar  con  5  tratamientos  y  10 

repeticiones, utilizando plantas crecidas en un sustrato de tepojal/turba 0.5/0.5. Después 

de  un mes,  no  se  encontraron  plantas  con  síntomas  de  la  enfermedad  y  tampoco  se 

detectaron fagos en  lixiviados de macetas con plantas tratadas, por  lo que se procedió a 

analizar  las posibles causas de estos resultados. Se comprobó  la presencia de  la bacteria 

en  las plantas  inoculadas y  se  realizaron análisis de  la  influencia de  la  temperatura y  la 

humedad relativa, así como del efecto de diferentes sustratos y fuentes de agua de riego 

sobre  la  estabilidad  del  fago  utilizando  como  sustratos  turba,  turba‐tepojal  (0.5/0.5), 

tezontle, tepojal, fibra de coco, suelo de Coatlán del Río y suelo de Zacatepec. Se preparó 

una  solución  fágica  con  1x106  PFU/mL  para  aplicarse  a  cada  uno  de  los  sustratos  y  se 

cuantificó  la  concentración  viral  en  el  lixiviado,  registrando  sus  valores  de  pH  y 

conductividad. Los resultados mostraron que en los lixiviados derivados de la turba y de la 

mezcla  de  ésta  con  tepojal,  el  pH  disminuyó  a  cerca  de  3.0.  Se  realizó  un  análisis  de 

viabilidad  del  fago  en  agua  de  cinco  orígenes  y  usadas  para  el  riego  de  cultivos  de 

jitomate, procedentes de Coatlán del Río, Zacatepec, San Gaspar, y dos muestras de agua 

potable de  la UPEMOR. Para esto, a cada agua  se  le aplicó una concentración de 1x106 

PFU/mL y se titularon  los  lixiviados a  las 3 h   y posteriormente a los días 3, 6, 9, 12, 15 y 

18.    Los  resultados mostraron  que  hay  diferencias  sustanciales  a  la  viabilidad  del  fago 

cuando se cultiva en el agua de diferente origen. Finalmente, los datos de temperatura y 

humedad relativa sugieren que no se presentaron las condiciones adecuadas para que se 

desarrollara la enfermedad en las plantas expuestas al fitopatógeno.  

II  

ABSTRACT 

Tomato bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum is one of the main limiting factors 

of production. One of  the alternatives  for  the  integrated management of  this disease  is 

the use of biological control based on bacteriophages, these are ubiquitous  in the world 

and are the most abundant biological entities on earth, the estimates range of population 

is  1030‐1032.  Bacteriophages  have  been  used  in  pharmaceutical,  food  industry  and  as 

biological control method. For  this  reason,  in  this work  it was evaluated  the  interaction 

between  bacteriophage  ITL‐1,  Ralstonia  solanacearum  and  tomato  (Solanum 

lycopersicum).  Bacteriophage  production  process  was  optimized  at  laboratory  level  to 

reduce the production time. Later, it was done an in situ assay testing the protective and 

curative  effect  of  bacteriophage  ITL‐1  under  a  completely  randomized  design  with  5 

treatments  and  10  replicates,  after  a month  into  the  experiment,  there were  no wilt 

plants, so we proceeded to analyze the possible causes of this result. It was evaluated the 

effect of different substrates and water sources for  irrigation for bacteriophage stability, 

and  the  influence  of  temperature  and  relative  humidity  on  disease  development.. 

Evaluated  substrates were peatmoss, peatmos‐tepojal  50%  ‐50%,  tezontle,  tepojal,  and 

soil samples of Coatlán del Río and Zacatepec. Bacteriophage solution was prepared with 

1x106 PFU/mL to apply to each of the substrates and viral concentration  in the  leachate 

was  quantified  1  hour  after  application,  registering  values  of  pH  and  conductivity.  The 

results showed that the peatmoss and the mix of this with tepojal decreased the pH, so 

we assumed that this condition inactivated the bacteriophage. In the case of water supply, 

it was made  a  stability  analysis  of  phage  in  five water  sources  from  Coatlán  del  Río, 

Zacatepec, San Gaspar, and potable water  from UPEMOR,  to every source of water was 

applied a concentration of 1x106 PFU/mL and virus were quantified at 3 hours and 3, 6, 9, 

12,  15  and  18  days  later.  The  results  showed  that  there  are  substantial  differences 

between each water sources  in terms of phage viability. Finally, the data of temperature 

and  relative  humidity  showed  that  there  were  no  suitable  conditions  for  disease 

development in plants. 

1  

I  INTRODUCCIÓN 

 

Dentro del grupo de las hortalizas, el jitomate es un cultivo muy dinámico por la creciente 

demanda de  la población de todo el mundo. De acuerdo al censo agropecuario del 2007 

en México,    el  jitomate  fue  la  principal  hortaliza  cultivada  y  ocupó  el  7°  lugar  de  los 

principales  cultivos  producidos.  Según  el  servicio  de  Información  Agroalimentaria  y 

Pesquera  (SIAP)  de México,  del  2000  al  2009,  se  tuvo  una  reducción  del  30%    de  la 

superficie sembrada con jitomate, registrando la mayor superficie (76,687 ha) en el 2001 y 

la menor con 55,888 ha en el 2012. El estado de Morelos se encontraba en  la década de 

los 80 dentro de  los 3 principales estados que sembraban jitomate a nivel nacional, pero 

cayó hasta el lugar 8 en el 2011 (SIAP 2011). Algunos motivos por los que se presenta este 

problema en el estado de Morelos, son causados por problemas fitosanitarios, entre ellos 

las virosis transmitidas por mosca blanca, el tizón tardío (Phytophthora infestans), el tizón 

temprano  (Alternaria  solani),  la  cenicilla  (Leveillula  taurica),  el  cancro  bacteriano 

(Clavibacter michiganensis) y la marchitez bacteriana (Ralstonia solanacearum). 

La marchitez  bacteriana  es  una  enfermedad  que  afecta  a  cultivos  de  gran  importancia 

económica, es  causada por R.  solanacearum, una bacteria Gram negativa. Esta bacteria 

tiene una amplia gama de hospederos, afecta a más de 200 especies pertenecientes a más 

de 50 familias botánicas,  incluyendo cultivos de  importancia económica. En el campo, R. 

solanacearum se difunde fácilmente a través del suelo, agua contaminada de riego, agua 

de  superficie,  equipo  agrícola,  y  material  biológico  infectado.  Las  células  bacterianas 

pueden sobrevivir durante muchos años, en asociación con hospederos alternativos, y en 

2  

suelo  la  fumigación  con  bromuro  de metilo,  Vapam,  o  cloropicrina  tiene  una  eficacia 

limitada. Debido a que el bromuro de metilo afecta  la capa de ozono,  la producción y el 

uso de este gas fue eliminado en 2005 en virtud del Protocolo de Montreal. La marchitez 

bacteriana  sigue  siendo  un  problema  grave  para  los  cultivos  en  zonas  tropicales, 

subtropicales y cálidas del mundo (Jarvis 1991). 

En  los últimos años se han venido  investigando aplicación de bacteriófagos  líticos en  los 

cultivos como método de control  (Yamada 2007). Al  igual que otros métodos de control 

biológico, una ventaja de  la terapia fágica es  la reducción en el uso de agentes químicos 

contra  los  agentes  patógenos,  esto  evita  problemas  asociados  a  la  contaminación  del 

medio  ambiente  y  residuos de productos químicos  en  los  cultivos.  La  terapia  fágica  en 

ambientes  agrícolas,  se  exploró  extensivamente hace  40  a  50  años  como un medio de 

control para fitopatógenos. En las últimas décadas, el uso de la terapia de fágica  ha sido 

explorado con mayor entusiasmo (Yamada 2007). 

En este trabajo, se pretendió determinar el efecto protector y/o curativo del bacteriófago 

ITL‐1  sobre  la marchitez  bacteriana  causada  por  R.  solanacearum  bajo  condiciones  de 

invernadero.  Adicionalmente,  debido  a  la  carencia  de  información  sobre  el modelo  de 

infección Ralstonia  solanacearum  ‐Jitomate y  la  influencia de  las  condiciones de  cultivo 

sobre  los  fagos,  en  caso  de  no  obtener  los  efectos  deseados,  se  buscaría  evaluar  la 

influencia  de  algunos  de  los  factores  involucrados,  tales  como  evaluación  de  sustratos 

utilizados  en  el  estado  de Morelos  para  el  cultivo  de  jitomate,  evaluación  de  agua  de 

diferente origen y la relación de la temperatura y humedad con la marchitez bacteriana. 

3  

II  Antecedentes 

2.1   Importancia del cultivo de jitomate  

El  jitomate  (Solanum  lycopersicum  L.)  es  originario  de  América  de    Sur,  aunque    se 

considera a México como centro de su domesticación. Actualmente forma parte de la dieta 

alimenticia de varias culturas en el  mundo. Ya sea como hortaliza o como fruto, el jitomate 

ocupa en nuestros días el segundo lugar en importancia entre los productos agropecuarios, 

apenas aventajado por  los cereales. Se estima que  junto con  la papa, contribuyen con el 

50% de  la producción de hortalizas en el mundo;  lo anterior  indica el enorme valor que 

este  producto  posee,  no  sólo  en  el  ámbito  comercial  y  económico,  sino  también  en  el 

sistema alimentario mundial. El  consumo per  cápita anual en Norte y Centroamérica, es 

alrededor de 26.9 kg, mientras que a nivel mundial es de 12.6 kg (SAGARPA 2005; 2006). 

En México, el  jitomate es una de  las especies hortícolas de mayor  importancia debido al 

valor de su producción y a la demanda de mano de obra que genera el cultivo; tan sólo en 

el 2012,  se  cultivaron 55,888 Ha  con una producción de 2,800,000  toneladas  y    con un 

consumo  per  capita/año  de  18  kg.  Además,  es  el  principal  producto  hortícola  de 

exportación, ya que representa el 37% del valor total de las exportaciones de legumbres y 

hortalizas y el 16% del valor total de las exportaciones agropecuarias, sólo superada por el 

ganado vacuno (SAGARPA 2005; 2006). El estado de Morelos se encuentra dentro de  los 

10 principales estados que siembran  jitomate a nivel nacional, pero cae hasta el  lugar 8 

por la cosecha (SIAP 2011). 

4  

2.2  Marchitez bacteriana  

En  el  estado  de  Morelos,  el  jitomate  es  de  las  hortalizas  de  mayor  importancia 

económica  y  social,  esta especie vegetal actúa como  hospedero  de  diversas bacterias 

fitopatógenas, entre  las que  se encuentra R.  solanacearum,  causante  de  la  “marchitez 

bacteriana”. En  los últimos 3 años, esta enfermedad ha  llegado a  ser un problema en 

plantas  sólo en  invernadero,  sin presentar casos a cielo abierto  (Hernández 2011). En 

otros estados del país, R. solanacearum no solamente se encuentra en jitomate, sino que 

también  en  otros  hospederos  como  plátano,  chile,  papa  y  tabaco afectando  el 

rendimiento de manera notable (Hayward 1991). 

R.  solanacearum  es  una  bacteria  fitopatógena  de  tipo  Gram  negativa,  aerobia, 

clasificada  en  la  subdivisión  β  de  las  Proteobacterias.  Por más  de  50  años,  esta 

bacteria  se  nombró  como  Pseudomonas  solanacearum,  perteneciente  al  grupo  II  de 

homología de rARN, que  incluía otras Pseudomonas no fluorescentes como P. mallei, P. 

caryophylli, P.  cepacia, P. pickettii  y P. gladioli.  Sin  embargo,  basados  en  secuencias 

16S  del  rARN,  homologías  ADN‐ADN,  perfil  de  ácidos  grasos  y  otras  características 

fenotípicas,  el  grupo  II  de  Pseudomonas  se  colocó  en  el  género  Burkholderia.  Sin 

embargo, la información filogenética mostró que P. solanacearum, P. pickettii y Alcaligenes 

eutrophus se encuentran muy  relacionadas, por  lo que se agruparon en el nuevo género 

Ralstonia (Schell 2000). 

R.  solanacearum  es  causante  de  la  enfermedad  llamada  “marchitez  bacteriana”  en 

alrededor de 200 especies de plantas, destacando los cultivos de importancia  económica 

como  la  papa,  berenjena,  tabaco  y  jitomate  (Hayward  1991).  Esta  enfermedad  se 

5  

presenta en  zonas húmedas  tropicales,  subtropicales y algunas  regiones  templadas del 

mundo. La marchitez bacteriana se reportó  por  primera  vez  a  finales  del  siglo  XIX   en 

papa,  tabaco y  jitomate en Asia, el sur de EUA y América del sur (EPPO 2004). 

R.  solanacearum es un microorganismo  fitopatógeno que  se  encuentra principalmente 

habitando en el suelo y agua en ausencia de hospedero. Esta bacteria puede sobrevivir 

por días  y años en  agua  contaminada,  suelos húmedos  y en  la  rizosfera,  formando un 

reservorio  de  inóculo  el  cual  puede  dispersarse.  La  población  de  R.  solanacearum 

disminuye rápidamente a bajas temperaturas (menores a 4 ° C), pudiendo sobrevivir en 

un estado latente viable pero no cultivable (VBNC, por sus siglas en inglés).  En el estado 

VBNC,  la bacteria se encuentra en  un  estado  viable,  es  decir,  fisiológicamente  activa 

para  causar  infección, pero no es  posible detectarla en algún medio de cultivo artificial 

(McDougald  et  al.  1998).  Este  estado  puede  ser  inducido  por  varios  factores,  en  R. 

solanacearum  se ha  reportado que  los principales  factores pueden  ser  la  incubación o 

exposición  a  temperaturas  por  debajo  de  4  °  C  por  periodos  prolongados  o  a  la 

exposición  a  iones  cobre  (Grey et al. Steck 2001). 

El fitopatógeno está ampliamente distribuido alrededor del mundo y es considerado un 

“Complejo de especies” debido a  las variaciones que existen dentro del mismo grupo. R. 

solanacearum se  clasifica en 5 biovares, con base en la capacidad de las cepas de oxidar 

diversos azúcares y alcoholes (Cuadro 1) y en 5 razas basadas en su rango de hospederos 

(Cuadro 2) (Hayward 1964; EPPO 2004). La marchitez bacteriana del  jitomate puede ser 

causada  tanto por  la  raza  1,  la  raza 3 y ocasionalmente por  la  raza 2,  presentando en 

todos  los biovares los mismos  síntomas  (Sánchez  et  al. 2008;  Lin  et al. 2009).  

6  

 

Cuadro  1.  Diferencias  entre  biovares  de  R.  solanacearum  de  acuerdo  a  su 

metabolismo oxidativo de diversos azúcares.    

Utilización 

de: 

Biovar 

1  2 3  4  5 

Maltosa  ‐  + + ‐ + 

Lactosa  ‐  + + ‐ + Celobiosa  ‐  +  +  ‐  + 

Manitol  ‐  ‐ + + + 

Sorbitol  ‐  ‐  +  +  ‐ 

Dulcitol  ‐  ‐  +  +  ‐ 

Hayward 1964; EPPO 2004 

 

A  pesar  de  que  no  existe  una  correlación  establecida  entre  la  capacidad  de  oxidar 

azúcares  o  alcoholes  (biovares)  y  los  hospederos  (razas)  de  R.  solanacearum,  aquellas 

cepas que presentan el biovar 2 están siempre relacionadas  con  la  raza  3  y  cepas  de 

biovar 5 están usualmente  relacionadas con la raza 5 (Denny y Hayward 2001). 

En el complejo de R. solanacearum, la Raza 3 biovar 2 (Rs R3Bv2), ha tomado importancia 

a nivel mundial, esto a causa de lo devastadora que es en cultivos de jitomate y papa en 

varios países, por  lo que  en  el  2002, en  EUA  R.  solanacearum  R3bv2  fue enlistada 

como  un “Agente Patógeno Selecto” de plantas en el Acta de bioterrorismo en plantas y 

está  sujeta a estrictas  regulaciones de bioseguridad, esto con el  fin de erradicar a esta 

bacteria de EUA ya que R. solanacearum R3bv2 no es endémica en este país. En Europa 

7  

ha  ocasionado  grandes  pérdidas  en  la  producción  de  papa,  además  de  las  pérdidas 

debido a la cuarentena impuesta para este patógeno (Janse 1996). 

Cuadro    2.    Determinación  de  razas  en  R.  solanacearum  y  relación  con  los  

biovares.     Raza 

 Hospederos 

Distribucióngeográfica

Biovar DivisiónRFLP

 1 

jitomate, berenjena, tabaco yChile 

Asia, Australia yAmérica

3, 4 y 1  

I y II  

2  Plátanos y otras Mussa spp 

Caribe, Brasil yFilipinas

1  

II  

3  

Papa, jitomates y geranios Todo el mundo,excepto EUA 

2  

II 

4  Jengibre  Japón y China 3 y 4  I5  Mora  China 5  I

Hayward 1964, EPPO 2004 

Actualmente,  la  clasificación  en  razas  resulta  subjetiva  por  lo  que R.  solanacearum    se 

clasifica en cuatro  filotipos que corresponden a su origen geográfico, pero  también ésta 

clasificación  se  encuentra  en  discusión,  se  ha  propuesto  dividir  los  cuatro  filotipos  del 

complejo  de  especies  de  R.  solanacearum  por  tres  especies  distintas  (Remenant  et  al. 

2010). La clasificación actual de filotipos es: Filotipo I  incluye cepas de Asia, Filotipo IIA y 

IIB cepas de origen americano, Filotipo III cepas de los alrededores del Océano Índico y de 

África, y el Filotipo IV cepas de Indonesia (Fujiwara et al. 2011), de este último filotipo se 

propone su separación en una nueva especie junto con Ralstonia syzygii y “Blood Disease 

Bacterium” (Remenant et al. 2010).  

 

 

8  

2.3 Síntomas y ciclo de la marchitez bacteriana 

La  marchitez  bacteriana  en  solanáceas  se  presenta  de  manera  súbita  (Fig.  1‐A),  las 

plantas muestran un marchitamiento total sin cambios de color, deteniendo el desarrollo 

de  la  planta  y provocando  la muerte  de  ésta  (Figura  1  A‐B).  Los  tejidos  vasculares  de 

tallos  y  raíces  toman  una  coloración  café  chocolate  (Figura  1‐C),  cuando  se  realiza  un 

corte transversal a  los tejidos vasculares se presentan  exudados  blanquecinos  excepto 

en  casos  leves,  característicos  de  esta  bacteria  (Figura  1‐D),  lo  que  ayuda  a  su 

identificación  en  campo,  mediante  la  observación  de  un  fluido  filamentoso  de  color 

blanco lechoso que emana al sumergir un trozo de tallo infectado en agua limpia (Agrios 

2005). 

 

9  

 

Figura  1.  Síntomas  de  marchitez  bacteriana  en  jitomate  causada  por  R. solanaceraum. (A) Síntomas tempranos y (B) muerte de planta. (C) Decoloración del xilema en plantas  infectadas de  jitomate.  (D) Producción de exudados por  tejidos infectados con R. solanacearum  (Modificada de Agrios 2005). 

 

R.  solanacearum  infecta  a  las  plantas  hospederas  principalmente  a través de su raíz, 

penetrando  por  heridas  formadas  por  nuevas  raíces  o  por  el  daño  de  organismos  de 

suelo (por ejemplo: nematodos); de  igual manera,  la bacteria puede penetrar por medio 

de  insectos,  por  heridas  causadas manualmente  o  por  herramientas.  Una  vez  que  la 

bacteria infecta la raíz,  ésta  coloniza  los  haces  vasculares del  xilema.  La  infección  es 

más severa en plantas en condiciones de temperatura que oscila entre  los 24 y 38 ° C y 

10  

disminuye notablemente  cuando  la  temperatura excede 38 °C o  son menores a 16 ° C 

(Champoiseau et al. 2009). El patógeno puede ser  llevado de cultivos enfermos a sanos 

por la transferencia de suelos por la maquinaria y por el agua de riego o lluvias. Los ríos 

representan  un  factor  importante  de  diseminación  cuando  la  bacteria  se  encuentra 

contaminándolos,  logrando  diseminar  la  enfermedad  a  otras  regiones  con  cultivos 

sanos  (Caruso  et  al. 2005). 

 2.4  Manejo de la marchitez bacteriana en jitomate 

 

Para  el  manejo  de  la  marchitez  bacteriana  se  han  utilizado  bactericidas  (cobre)  y 

antibióticos (estreptomicina, tetraciclina, gentamicina). Sin embargo, diversas cepas de R. 

solanacearum  son  reportados  como  resistentes  y/o  tolerantes  a  estos  productos 

químicos (Saddler 2005).  

Existen  reportes de sólo algunos cultivares que presentan resistencia a R. solanacearum, 

sin  embargo,  no  ha  sido  efectivo  para  el  control  de  la  enfermedad,  esto  debido  a  la 

variabilidad de las cepas bacterianas (Hanson et al. 1996). En regiones donde el patógeno 

ya está establecido, las prácticas culturales pueden ser efectivas bajo ciertas condiciones. 

Estas prácticas  incluyen rotación de cultivos con plantas no hospederas; no obstante,  la 

bacteria  puede  permanecer  en  estado  VBNC  por  largos  periodos  hasta  que  de  nuevo 

encuentre  a  su hospedero. Otras prácticas  como el  tratamiento en  semillas, el uso de 

antagonistas,  manejo adecuado del riego y el manejo de nematodos, han sido utilizadas, 

sin mucho éxito (Hanson et al. 1996).   

11  

Existen  otros  tipos  de  tratamientos  alternativos  para  la  erradicación  de  la  “marchitez 

bacteriana en  jitomate” utilizados en varios países,  como  la modificación   del   pH   del  

suelo,    inductores    de    resistencia    en    plantas    (ejem.  acibenzolar‐s‐metil),  aceites 

esenciales  (ejem.  timol) o ácido  fosfórico,  todos ellos han demostrado que  reducen  la 

población bacteriana y  la severidad de  la enfermedad (Anith et al. 2004, Norman et al. 

2006, Ji et al. 2007). 

 

12  

2.5   Bacteriófagos en el control biológico  

Los  bacteriófagos  son  las  entidades  biológicas  más  abundantes  en  el  planeta,  los 

podemos encontrar de manera natural en  la  tierra, agua, en el océano e  incluso en  los 

alimentos que consumimos, con más de 1030 partículas estimadas en la biosfera, jugando 

un  papel  importante  en  el  equilibrio microbiano.  A  partir  del  descubrimiento  de  los 

bacteriófagos  por  Frederick  Twort  y  Felix  D’Herelle,  considerados  pioneros  en  la 

investigación  fágica,  estos  virus  han  sido  manipulados  en  un  sinfín  de  estudios  y 

aplicaciones, ya sea en ámbitos clínicos, veterinarios y agrícolas (Ackermann 2011, Kutter 

y Sulakvelidze 2004). 

 

Un método de control biológico utilizado con éxito a nivel  laboratorio y comercial es el 

uso de bacteriófagos (Yamada 2007) el cual se está expandiendo rápidamente en el área 

de  protección  en  cultivos  innovando  y  remplazando  los métodos  de  control  químicos 

utilizados. Los  fagos pueden  ser utilizados efectivamente como parte de una estrategia 

de  manejo  integrado.  La  fácil  preparación  de  los  tratamientos  y  el  bajo  costo  de 

producción,  los  transforma  en  buenos  candidatos  no  sólo  para  el  control  de  R. 

solanacearum, sino también para su detección, diferenciación de razas y biovares (Jones 

et al. 2007). 

 

En el cuadro 3 se mencionan algunas ventajas y desventajas descritas por Greer (2005)  y 

Vidaver (1976), respectivamente. 

 

13  

 

Cuadro  3:  Descripción  de  algunas  ventajas  y  desventajas  del  uso  de  bacteriófagos 

descritas por Greer (2005) y Vidader (1976). 

Bacteriófagos 

Ventajas  Desventajas 

Se    autoreplican  y  autolimitan,  éstos  se 

replican  solamente  cuando  la  bacteria 

hospedera está presente en el ambiente y 

se  inactiva  cuando  ésta  disminuye  su 

población 

La alta especificidad de los fagos puede ser 

una desventaja 

Son  componentes    naturales    de    la  

biosfera, pueden ser aislados dondequiera 

que  la  bacteria  hospedera  se  encuentre, 

incluyendo suelo, agua, plantas, animales y 

cuerpo humano 

Los  requerimientos  del  límite  de

bacterias  (104

–106 UFC/mL)  puede  limitar 

el impacto de los fagos 

 

No son tóxicos para células eucariontes  El  surgimiento  de  bacterias  mutantes

resistentes  a  fagos  puede  hacer 

inefectivos a  los fagos (sólo en caso que el 

bacteriófago sea lisogénico)  

Específicos  o  altamente  discriminatorios, 

atacando solamente a la bacteria blanco sin 

causar daño a otras bacterias 

Factores  como  la  temperatura,  pH  y 

fisiología  de  la  bacteria  puede  obstruir  el 

control 

Los    formulados  a  base  de  fagos  son  

relativamente    de  fácil preparación  y  no 

tienen  altos  costos  de  producción, 

además  pueden  ser almacenados a 4  ° C 

en oscuridad sin  reducciones significativas 

en la concentración de partículas virales 

Bacteriófagos  (lisogénicos)  con  potencial

de transducción pueden dar características 

indeseables, como factores de virulencia. 

 

14  

2.6  Clasificación y ciclos de vida de los bacteriófagos  

 

Los  bacteriófagos  se  clasifican  en  familias  y  géneros,  las  familias  son  definidas  por  la 

naturaleza del ácido nucleico del fago y  la morfología, diferenciando si su genoma es de 

ADN o ARN, siendo la gran mayoría de ADN de cadena doble (dsADN) pero existen grupos 

cuyo  genoma puede  ser ADN o ARN de  cadena  sencilla  (ssADN,  ssARN),  e  incluso ARN 

bicatenario  (dsARN),  ya  sea  lineal  o  circular  (Carter  y  Saunder  2007, Moat  et  al.  2002, 

Ackermann 2011).  

Con  base  en  su  morfología,  los  bacteriófagos  pueden  ser  poliédricos,  filamentosos  o 

pleomórficos, y pueden o no poseer una estructura tipo cola que puede ser corta,  larga, 

contráctil  o  no  contráctil.  A  aquellos  virus  que  poseen  cola  también  se  les  llama 

caudovirus (Carter y Saunders 2007, Ackermann 2011).  

Con base en el ciclo de vida que desarrollan en su hospedero, los bacteriófagos se pueden 

clasificar  en  líticos  y  lisogénicos  (figura  2).  Los  líticos  provocan  la muerte  celular  por 

destrucción de su célula hospedera, en los fagos lisogénicos la actividad lítica se reprime y 

el  genoma  del  fago  con  frecuencia  se  incorpora  al  de  la  bacteria,  reproduciéndose 

simultáneamente  con  el  hospedero,  sin  ocasionar  la muerte  celular,  este método  de 

infección puede proteger al hospedero de  la  infección por otros fagos o cepas similares, 

llamando a esto inmunidad de sobreinfección (Carter y Saunders 2007, Ackermann 2011, 

Shigenobu et al. 2005). 

Dentro de los bacteriófagos con genoma de ADN se encuentran los miovirus (Myoviridae), 

que  son  fagos  líticos  con  cadena doble de ADN  (dsADN)  y  lineal, de  cabeza esferoide, 

icosahédrica, y con una cola larga contráctil. Los sifovirus (Siphoviridae) son bacteriófagos 

15  

con  genoma  de  ADN  bicatenario  lineal,  que  pueden  ser  líticos  y  lisogénicos  según  las 

condiciones ambientales, con cabeza isométrica icosahédrica, y con presencia de una cola 

larga no contráctil. Los podovirus (Podoviridae) son bacteriófagos líticos de cadena doble 

de  ADN  bicatenario  lineal,  de  cabeza  isométrica  icosahédrica,  con  una  cola  corta  no 

contráctil.  Estas  tres  familias  representan  alrededor  del  96%  de  los  fagos  (Ackermann 

2011).  

 

 

Figura 2: A) Ciclo  lítico y   B) Ciclo  lisogénico de bacteriófagos.  (1) Adsorción e  inyección de ADN;  (2)  replicación del genoma viral,  (3) producción de  cabeza y  tallos, síntesis de holinas y lisinas y empaquetamiento de ADN; (4) ensamblaje de fagos, destrucción de  la membrana  celular  y  liberación  de  progenie;  (5)  persistencia  del  genoma  viral  en  el citoplasma bacteriano como elemento episomal,  (6)  integración de ADN del fago en el genoma del hospedero. 

A 

B

1 

2 

3 

4 

5 

6 

16  

Dentro de  los bacteriófagos con genoma de ADN de cadena  sencilla, se encuentran  los 

microvirus  (Microviridae), bacteriófagos pequeños que poseen una cabeza  icosahédrica, 

sin  presencia  de  cola,  con  actividad  lítica.  Los  inovirus  (Inoviridae)  son  bacteriófagos 

filamentosos, con estructura  flexible que no presentan actividad  lítica, con  la capacidad 

de infectar la bacteria insertando su material genético al cromosoma de la bacteria.  

Los bacteriófagos que presentan material  genético  compuesto de ARN  se  clasifican de 

igual manera en cadena doble, entre  los que se encuentran  los cistovirus  (Cystoviridae) 

que son bacteriófagos esféricos envueltos, que presentan actividad lítica, y los de cadena 

sencilla entre los que se encuentran los levivirus (leviviridae) con morfología icosahédrica, 

con actividad lítica (figura 3) (Carter y Saunders 2007). 

  

17  

 

Figura  3:  Clasificación  de  los  bacteriófagos  considerando  características  genómicas, morfología y la presencia o ausencia de cola (modificada de Carter y Saunders 2007).  

 

 

18  

2.7  Receptores fágicos en la bacteria Ralstonia solanacearum 

 

La  infección  viral  es  el  proceso  en  el  cual  el  fago  reconoce  y  se  adhiere  a  la  célula 

huésped  e  inyecta  su  ácido  nucleico,  atravesando  la membrana  celular  hasta  llegar  al 

citoplasma.  En  el  medio  ambiente,  la  infección  es  siempre  un  evento  al  azar,  está  

altamente  influenciada  por  la  densidad  bacteriana.  Esto  quiere  decir  que,  a  mayor 

densidad de huésped, mayor oportunidad de infección (Skurnik y Strauch 2006).

El  primer  paso  para  la  infección  viral  es  el  reconocimiento  del  fago  con  la  bacteria 

hospedera.  La  susceptibilidad  de  la  bacteria  al  fago  depende  primeramente  si  el  fago 

puede  reconocer  sitios  específicos  conocidos  como  receptores  de  la  célula,  éstos  se 

encuentran  en  la  estructura  de  las  células,  así  que  el  reconocimiento  del  fago  al 

hospedero  estará  íntimamente  relacionado  con el  tipo de bacteria.  Los  receptores  se 

encuentran en las estructuras celulares en el siguiente orden: membrana exterior de  las 

bacterias Gram‐negativas, membrana celular de bacterias Gram‐positivas, capa capsular 

de bacterias Gram‐negativas, los flagelos y los pilis (Lindberg 1973).

Como ya se mencionó, R. solanacearum es una bacteria Gram‐negativa. En este tipo de 

bacterias  la  membrana  celular  externa  está  compuesta  por  un  complejo    de  

lipopolisacáridos  (LPS),  proteínas  y  fosfolípidos. Sólo los LPS están expuestos al exterior 

de la célula bacteriana por lo que éstos son accesibles a los fagos y por ello representan 

uno de los principales receptores para  el  reconocimiento  fago–hospedero  en  bacterias 

19  

Gram‐negativas. Hendrick y Sequeira (1984) reportan que  los LPS actúan como receptor 

de  reconocimiento  en  los  fagos  Psso  154 (perteneciente a la familia Mioviridae) y  Psso 

NCL  (perteneciente  a  la  familia  Podoviridae)  específicos  de  R.  solanacearum.  Sin 

embargo,  no  sólo  el  complejo  de  LPS  ha  sido  reportado  como  receptor  para  el 

reconocimiento  de  fagos  de  R.  solanacearum,  los  pilis  también  se  reportan  como 

potenciales  sitios  de  reconocimientos  para  la  adsorción  del  fago  ΦRSM  en  R. 

solanacearum (Askora et al. 2009). 

 

 

 

20  

2.8  Uso de bacteriófagos para el manejo de Ralstonia solanacearum 

 

En el año 1990, Takana et al. reportaron  fagos específicos para R. solanacearum los cuales 

lograron reducir la marchitez del tabaco causado por Pseudomonas solanacearum (ahora 

Ralstonia  solanacearum). Con el uso de  fagos específicos contra R.  solanacearum y una 

cepa avirulenta de R.  solanacearum  (M4S),   observaron que el uso combinado de  fagos 

más la cepa avirulenta, se disminuyó a 17.6% la marchitez, en comparación con el control 

con  un  95.8%  de  marchitez,  también  observaron  que  la  cepa  avirulenta  por  sí  sola 

disminuía a un 39.5% el grado de marchitez. Este  trabajo es uno de  los primeros en  los 

que se da a conocer un fago específico contra R. solanacearum. Como consecuencia de las 

pérdidas económicas que  causa R.  solanacearum en  cultivos de  interés agrícola,  se han 

buscado nuevos  fagos específicos  y de amplio espectro de acción entre el  complejo de 

especies en el que se encuentra clasificada R. solanacearum.  

 

En  el  2001, Ozawa  et  al.  reportaron  el  fago  P4282  específico  de  R.  solanacearum  que 

producía  una  proteína  bacteriolítica,  la  proteína  afecta  a  diversas  cepas  de  R. 

solanacearum,  por  lo  que  sugieren  el  uso  de  esta  proteína  bacteriolítica  para  generar 

plantas  de  tabaco  transgénicas  que  tengan  resistencia  a  la  marchitez  bacteriana. 

Actualmente,  los  principales  trabajos  de  investigación  sobre  bacteriófagos  de  R. 

solanacearum  han  sido  realizados  por  el  grupo  de  investigación  del Dr.  Yamada,  de  la 

Universidad de Hiroshima. Sus trabajos incluyen estudios en planta con fagos filamentosos 

y fagos caudovirales (Ozawa et al. 2001). Yamada et al. (2007) reportaron cuatro tipos de 

21  

fagos que infectan a R. solanacearum: фRSL, фRSA, фRSM y фRSS (Figura 4). Los primeros 

dos son fagos de la familia Mioviridae, con dsADN de 240 y 39 kb, respectivamente, éstos 

poseen un   amplio  rango de hospederos. Mientras que  los bacteriófagos  фRSM  y  фRSS 

pertenecen a la familia Inoviridae, con ssADN de 9.0 kb en фRSM y 6.6 kb en фRSS. 

Otro  bacteriófago  filamentoso  que  infecta  a  la  cepa  de  R.  solanacearum  es  PE226, 

pertenece a  la  familia  Inoviridae, tiene cola  larga  flexible y posee un genoma circular de 

cadena  sencilla  y  sentido  positivo  de  5.47  kb  (Murugaiyan  et  al.  2010). Algunos  de  los 

fagos anteriormente mencionados son filamentosos y se han reportado que se comportan 

como fagos  lisogénico  y por esta razón no son los más recomendados para su uso como 

biocontrol. Sin embargo,  investigaciones recientes con фRSM3  indican que algunos fagos 

filamentosos con genes represores, pueden ser herramientas eficientes de biocontrol. Por 

ejemplo, фRSM3 reprime genes de virulencia en R. solanacearum, dando como resultado  

la  incapacidad  de  enfermar  a    plantas  de  jitomate  (Addy  et  al.  2012a).  Por  otra  parte, 

фRSL1  también  fue  evaluado  como  herramienta  de  biocontrol  para  R.  solanacearum, 

manteniendo  la concentración bacteriana  limitada por más de 140 h, permitiendo evadir 

la enfermedad de la marchitez bacteriana eficazmente (Figura 4) (Fujiwara et al. 2011).  

22  

Figura  4.  Fagos  que  infectan  a  R.  solanacearum.  Curva  de  crecimiento  con    3  fagos diferentes    y  una  mezcla  de  estos.  Las  condiciones  de  cultivo  fueron:  DO:  600  nm, momento  de  infección:  DO  entre  0.1  y  0.3,  MOI:  0.5,  tiempo  de  cultivo:  150  horas (tomado de Fujiwara  et al. 2011).  

En México, en el 2011 se reportó por primera vez R. solanacearum en jitomate en Sinaloa, 

Baja California y Jalisco (Perea et al. 2011); en el 2012 se detectó en el estado de Morelos 

(Hernández  et  al.  2012),  desde  entonces  se  diagnosticaron molecularmente múltiples 

casos de R.  solanacearum en  invernadero. Por  lo que en  la Universidad Politécnica del 

Estado de Morelos  se iniciaron trabajos para el biocontrol de R. solanacearum mediante 

el  uso  de  bacteriófagos  líticos,  y  la  identificación  de  factores  que  interfieren  en  la 

interacción del bacteriófago, la planta de jitomate y la bacteria.  

 

 

23  

2.9  Factores que intervienen en la aplicación de bacteriófagos como control biológico  

Una opción de control biológico para reducir la incidencia de R. solanacearum es el uso de 

bacteriófagos,  como  se  ha  mencionado  en  los  aparatados  anteriores,  el  uso  de  la 

aplicación de bacteriófagos se ha estudiado, pero se desconoce el efecto que tienen sobre 

ellos diferentes sustratos utilizados en el cultivo de jitomate. 

Se han avaluado diferentes bacteriófagos pero todos en sustratos artificiales y en cámaras 

de  crecimiento.  Por  ejemplo  el    fago  PE204  (perteneciente  la  familia  Podoviridae)    se 

evaluó en un microcosmos de suelo artificial (ASM) analizando la estabilidad del fago en el 

suelo, los resultados sugieren que la aplicación adecuada de los fagos líticos en el sistema 

de  la raíz en  la   planta con Silwet L‐77 (tensoactivo) puede ser utilizado para controlar  la 

marchitez bacteriana de los cultivos (Bae 2012). En los trabajos realizados por Fujiwara  et 

al. (2011) el sustrato utilizado es una mezcla de turba y vermiculita, pero no evalúan  las 

interacciones de estos sustratos con los fagos. 

En Morelos  se  tienen  cultivos  de  jitomate  que  utilizan  distintas  fuentes  de  agua,  por 

ejemplo  en  Jojutla  existen  invernaderos  que  utilizan  agua  de  pozo  con  un  claro  olor  a 

sulfuros, en Coatlán del Río utilizan agua de pozo  inodora, en Temixco utilizan agua de 

lluvia almacenada en ollas, mientras que en Jiutepec existen productores que utilizan agua 

potable  (Hernández  2012,  comunicación  personal).  Se  desconoce  el  efecto  que  estas 

distintas fuentes de agua pueden tener sobre la actividad de los bacteriófagos, efecto que 

pudiera  ser  de  crucial  importancia  si  se  busca  eventualmente  la  aplicación  de 

bacteriófagos en invernadero y campo. 

24  

Con todos estos antecedentes se planearon los objetivos que a continuación se exponen 

2.10  Objetivo general 

Identificar algunos  factores que afectan la  interacción jitomate‐ Ralstonia solanacearum‐ 

bacteriófago ITL‐1. 

 

2.11  Objetivos específicos 

 

1.‐ Estandarizar la técnica de producción in vitro  del ITL‐1. 

2.‐ Evaluar el efecto preventivo y/o curativo del ITL‐1 en plantas de jitomate. 

3.‐Evaluar el efecto de diferentes sustratos en la actividad lítica del  ITL‐1. 

4.‐ Evaluar el efecto de agua de diferente origen en la actividad lítica del ITL‐1. 

5.‐Relacionar  las condiciones de  temperatura y humedad relativa con el desarrollo de  la 

enfermedad. 

   

25  

III  Materiales y métodos 

3.1   Origen de la cepa bacteriana y del bacteriófago  ITL‐1 

La cepa bacteriana de R. solanacearum utilizada en este estudio fue aislada de un cultivo 

de  jitomate de  la  localidad de Coatlán,  se denominó R6 y  corresponde al  filotipo  II.    La 

bacteria se mantuvo en medio NBY.  El fago ITL‐1 (figura 5) fue aislado de composta en el 

municipio  de  Miacatlán.  Este  fago  pertenece  a  la  familia  Podoviridae  y  posee  como 

material genético ADN de doble cadena, una cabeza  icosaédrica   y cola corta. El fago   se 

mantuvo a 4 o C en una solución de sulfatos (K2SO4 0.16 g/L, MgSO4 0.45 g/L, K2HPO4 0.10 

g/L). 

 

Figura 5: Microfotografía electrónica del bacteriófago  ITL‐1,  se observa una morfología 

compatible con la familia Podoviridae, la cual incluye a fagos con material genético a base 

de dsADN, cápside icosaédrica y cola corta (Serrano 2013). 

 

3.2 Estandarización de la técnica de producción in vitro del bacteriófago ITL‐1 

Para  la   producción del bacteriófago  ITL‐1,  las  variables que  se  consideraron  fueron: 1) 

volumen  de  cultivo,  2)  tamaño  del  inóculo  bacteriano  inicial,  3)  tiempo  de  cultivo 

bacteriano hasta el momento de  la  inoculación viral, 4) multiplicidad de  infección  (MOI, 

por sus siglas en inglés), 5) tiempo de cosecha del virus.  

26  

El volumen de cultivo se mantuvo fijo, utilizando 3 matraces de 1000 mL conteniendo un 

volumen de 500 mL de medio NBY.  

El tamaño de inóculo bacteriano inicial  fue de  30 ml de un cultivo de entre 36 y 48 horas 

de R. solanacearum ajustado al 0.100 de absorbancia  a 600 nm.  

Para evaluar el tiempo para inocular el virus en el cultivo bacteriano se realizó una cinética 

bacteriana  en matraces.  El  crecimiento  bacteriano  se  obtuvo  leyendo  la  absorbancia  a 

600nm cada 2.5 horas.  En base a la curva de crecimiento se decidió inocular el fago a las 

5, 10 y 15 horas de crecimiento microbiano, tiempos que coincidían con el inicio y final de 

la fase exponencial, así como con el final de  la fase de crecimiento  lineal del crecimiento 

microbiano.  Al  momento  de  la  inoculación  viral  se  determinó  la  densidad  óptica  del 

crecimiento  bacteriano  a  600  nm  (DO600nm)  y  se  estimó  la  concentración  bacteriana 

utilizando la siguiente fórmula:  

UFC/ mL= [1840989* (DO600nm)2 +488150* DO600nm +81064]*1000 

la cual se obtuvo a partir del comportamiento del cultivo bacteriano en matraz leyendo la 

absorbancia  cada  hora,  cuantificando  la  bacteria  y  correlacionando  los  datos  de 

cuantificación  bacteriana  y  densidad  óptica  por  medio  de  un  análisis  de  regresión 

polinomial  (Serrano 2013).  La MOI que  se utilizó  fue de 0.1  (el número de virus  fue 10 

veces menor   al número de bacterias presentes en el cultivo). Para  la adición del virus al 

cultivo  bacteriano,  se  estimó  el  volumen  de  una  solución  stock  del  fago  ITL‐1 

(concentración de 1.42 x1010 PFU/mL), que contuviera diez veces menos fagos respecto a 

las bacterias que se tenían en el matraz, para de esta manera manejar una MOI=0.1. De 

acuerdo con  la  fórmula, el cultivo bacteriano con una densidad óptica de 0.1 a 600 nm, 

27  

tiene una concentración de 1.5x108 UFC/mL, por lo tanto el volumen de la solución fágica 

utilizada  fue  de  aproximadamente  500  µL  para  cada  matraz.  La  densidad  óptica  se 

continuó leyendo  2.5 horas. En cuanto se registraron  dos lecturas mínimas consecutivas y 

se observó una  tendencia al  incremento en  la densidad óptica, se detuvo el cultivo y se 

procedió a cosechar el virus,    tomándose una muestra por matraz y calculando el  título 

viral, por medio de la técnica de cuantificación viral.  

 

3.2.1  Preparación del stock bacteriano 

Para conservar el stock bacteriano se obtuvieron 2 mL de un cultivo de R. solanacearum 

crecido 36 y 48 horas, en medio NBY  liquido, a 30  ͦ C y 200 rpm. Los 2 mL de cultivo se 

centrifugaron a 5000 g por 3 min,  se   eliminó el  sobrenadante y el pellet bacteriano  se 

resuspendió en 1 mL de agua destilada estéril. Posteriormente se colocó en 20 microtubos 

de 1.5 mL, colocando 1 mL de agua destilada estéril y 50 µL de la bacteria resuspendida en 

agua. Los 20 microtubos se guardaron  a temperatura ambiente. 

 

3.2.2  Titulación de bacteriófagos mediante la técnica de doble capa de agar

Para  la técnica de cuantificación viral, se tomaron 10 µL de  la solución stock de fagos de 

concentración desconocida y se realizaron diluciones seriadas decimales con un volumen 

final de 100 μL en microtubos de 0.6 mL.  Un cultivo de R. solanacearum de entre 12 y 15 

horas de crecimiento,  se ajustó a 0.100 de absorbancia a 600 nm y de esta  solución  se 

28  

agregaron  50 µL  a  las diluciones de  los  fagos previamente preparadas,  agitando    en  el 

vortex  por  10  segundos.  Posteriormente  las  diluciones  se  incubaron  a  temperatura 

ambiente durante 5 minutos para después tomar  los 150 µL de  la mezcla y añadirlos a 3 

mL de medio NBY con agar suave mantenido a 40°C. La mezcla se agitó manualmente y se 

vertió  en una caja de Petri y transcurridas de 24 a 48 horas se procedió a hacer el conteo 

de  placas  de  lisis  por  duplicado,  cuidando  que  se  observara  el  efecto  de  dilución  y  la 

reproducibilidad entre  los duplicados. Para obtener  la concentración de  la solución viral, 

se tomó en cuenta el factor de dilución (considerando aquellas cajas que contengan entre 

50 y 100 placas de lisis) y se aplicó la siguiente fórmula (Figura 6).   

PFU/mL=FD*#placas/ volumen de diluciónPFU= Plaque‐forming unit por sus siglas en ingles  FD= Factor de dilución  #placas= número de placas  

 

 

Figura  6:  Representación  gráfica  de  la  cuantificación  viral.  La  cuantificación  se  realiza utilizando diluciones decimales   

 

 

29  

3.3  Evaluación de los efectos preventivo y curativo del bacteriófago ITL‐1 

Los  fagos  producidos  previamente  se  utilizaron  para  evaluar  su  efecto  preventivo  y 

curativo en las plantas de jitomate. Esta evaluación se realizó en el periodo del 1 de abril 

del 2013 hasta el 25 de abril del mismo año, realizándose cuantificaciones virales de  los 

lixiviados. Este experimento  se  llevó a  cabo en un bioespacio, el  cual  se define en este 

trabajo como un área de cultivo que presenta una malla antiáfidos que protege al cultivo 

del  ataque  de  los  insectos  pero  que  carece  de  control  de  temperatura  y  humedad;  El 

biospacio está   ubicado en  la Universidad Politécnica del Estado de Morelos. El ensayo 

utilizó  semillas  de  jitomate  de  la  marca  Harris  Moran  variedad  El  Cid  F1,  que  se 

germinaron y se mantuvieron en  la charola de germinación durante 20 días y después se 

trasplantaron  en macetas  que  contenían  como  sustrato  una mezcla  de  0.5:  0.5  turba‐

tepojal.  El  sustrato  se  esterilizó  previamente  por  autoclave  durante  20 min  a  15  psi,  y 

después con una solución de cloro al 0.5%. El exceso de cloro se lavó con agua corriente y 

se sometió a un proceso de solarización, por  lo cual, se colocó una cubierta de plástico 

negra sobre el sustrato durante  tres días. 

3.3.1  Diseño  experimental  para  evaluar  el  efecto  preventivo  y  curativo  del bacteriófago ITL‐1 

 

Para evaluar los efectos preventivo y curativo del bacteriófago ITL‐1 sobre el desarrollo de 

la  marchitez  bacteriana  causada  por  R.  solanacearum,  se  generaron  5  grupos  de  10 

plantas  cada  uno,  los  cuales  se  sometieron  a  los  siguientes  tratamientos:  1)  control, 

regado  solamente  con  solución nutritiva  (Ca(NO3)2∙4H2O 0.96 g/L, KNO3 0.64 g/L, K2SO4 

30  

0.16 g/L, MgSO4 0.45 g/  L), 2)  regado  con  la  solución de bacteriófagos  (50 mL  con una 

concentración de 1x 106 PFU/mL) los días lunes, jueves y sábado), 3) regadas con solución 

de  R.  solanacearum  (50 mL  con  una  concentración  de  1X103 UFC/mL)  los  días  lunes  y 

jueves , 4) aplicación de solución de bacteriófagos (50 mL con una concentración de 1x 106 

PFU/mL)  los  días  lunes,  jueves  y  sábado  por  las  primeras  dos  semanas,  seguido  de  la 

aplicación de una  solución de R.  solanacearum  (50 ml  con una  concentración de 1X103 

UFC/mL, los días lunes y jueves) en las semanas 3 y 4, ese grupo se incluyó para evaluar el 

efecto preventivo de los bacteriófagos; 5)  tratadas en la semana 1 y 2 con la solución de 

R. solanacearum (50 ml con una concentración de 1X103 UFC/mL, los días lunes y jueves) y 

las semana 3 y 4 con  la solución del bacteriófago. Este grupo se  incluyó para evaluar el 

efecto curativo de los bacteriófagos (50 mL con una concentración de 1x 106 PFU/mL, los 

días  lunes,  jueves  y  sábado).  Estos  distintos  grupos  fueron  distribuidos  en  un  diseño 

completamente al azar,  con 10 repeticiones por tratamiento, siendo una planta la unidad 

experimental. 

En cada uno de estos grupos se evaluó  la progresión de  la enfermedad para observar si 

había  un  efecto  del momento  de  la  aplicación  del  bacteriófago  sobre  el  porcentaje  de 

marchitez o la incidencia de la enfermedad (la cual se definió como el número de plantas 

con síntomas de marchitez en un periodo de tiempo). 

3.3.2  Evaluación de la progresión de la enfermedad  

Para evaluar  la progresión de  la marchitez bacteriana causada por R. solanacearum en el 

jitomate,  se  evaluó  el  porcentaje de marchitez  ([número  de  foliolos marchitos/número 

31  

total de foliolos]*100) para cada planta y el promedio de marchitez para cada grupo. Este 

análisis se realizó diariamente hasta que cada grupo presentara el 100% de marchitez o 

durante 30 días, esto equivaldría a la muerte de las plantas. 

Una vez manifestada la marchitez bacteriana, se realizó un análisis de datos considerando 

los parámetros evaluados para hacer análisis de varianza y   prueba de  comparación de 

medias de Tukey con un p=0.05,  evaluando el error experimental. 

 

3.3.3 PCR de colonia para determinar  la presencia de R. solanacearum en aislamientos microbianos 

 

Para  evaluar  en  plantas  de  jitomate  la  presencia  de  R.  solanacearum  en  aislamientos 

microbianos  obtenidos  de  plantas  de  jitomate  expuestas  al  fitopatógeno,  se  utilizó  la 

técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés). Para esto 

se tomó con un palillo estéril una cantidad mínima de la colonia a analizar, misma que se 

colocó en el fondo de un tubo de PCR. En cada experimento se agregaron dos controles, 

un control positivo (ADN genómico de R. solanacearum purificado) y un control negativo 

(muestra  sin  ADN molde).  Para  la  reacción  en  cadena  de  la  polimerasa  se  utilizó  los 

oligonucleótidos 759 (Fegan y Prior 2005), los cuales amplifican la región río arriba del gen 

IpxC. El amplicon de este fragmento de ADN tiene un tamaño de 282 pares de bases (pb). 

La  reacción de amplificación se  realizó por 40 ciclos. La mezcla de  reacción consistió en 

1µL  de  buffer  10X  (Thermo  Scientific  cat#EP0402), MgCl2  1.5 mM,  dNTP’s  200  µM,  los 

oligonucleótidos se utilizaron a una concentración de 0.5 µM cada uno y el volumen de 

32  

reacción  fue  de  10  µL,  en  cada  reacción  se  colocó  una  unidad  de  Taq  polimerasa.    La 

presencia o ausencia del amplicon de 282 pb. se analizó en un gel de agarosa al 2%. 

 

3.4 Evaluación de la patogenicidad de la cepa bacteriana 

Para  verificar  que  la  cepa  bacteriana  utilizada  era  capaz  de  causar  enfermedad  en  las 

plantas de  jitomate, se tomó una pequeña cantidad de cultivo  liquido de  la bacteria y se 

transfirió  hacia 10 plantas sanas previamente heridas, evaluando el desarrollo de lesiones 

a los 20 días de la inoculación. 

 

3.5 Evaluación de la estabilidad del bacteriófago ITL‐1  en diferentes sustratos utilizados para el cultivo de jitomate en Morelos  

Para  evaluar  el  efecto  de  los  diferentes  tipos  de  sustrato  en  la  actividad  fágica  (la 

capacidad del bacteriófago para  formar placas de  lisis),    se  eligieron  sustratos que  son 

comúnmente  usados  en  el  cultivo  de  jitomate  en  el  estado  de Morelos.  Los  sustratos 

fueron: turba, tepojal, turba‐tepojal 0.5:0.5, tezontle, fibra de coco, suelo proveniente de 

Zacatepec y de Coatlán del Río. Los sustratos se llevaron a peso seco en una estufa a 150  ͦ 

C por 24 horas. Posteriormente por duplicado cada sustrato fue pesado en tubos Falcon y 

llevado  a  85%  del  volumen  total  del  tubo.  Los  tubos  se  perforaron  en  la  base  para  

recuperar los lixiviados de cada sustrato.  Previamente se preparó una solución fágica con 

un título de 1x 106 PFU/mL, empleando  solución nutritiva como diluyente.  

Además  del  efecto  sobre  la  actividad  del  bacteriófago,  a  cada  sustrato  se  le midió  su 

capacidad de retención de líquidos,  así como el pH y la conductividad de los lixiviados que 

33  

se obtenían a partir de cada uno de ellos. La capacidad de retención de cada sustrato se 

midió vertiendo 40 mL de solución nutritiva a cada tubo y el porcentaje de retención se 

calculó con la siguiente fórmula: (volumen inicial ‐volumen final) / g de sustrato). 

El  pH  y  la  conductividad  se midieron  con  un  sensor multiparamétrico  (HANNA modelo 

HI98130). Una vez humedecido el sustrato, se dejó lixiviar durante 24 h, y posteriormente 

se adicionaron 30 mL de la solución nutritiva con fagos. Los fagos fueron titulados a partir 

de  los  lixiviados que se obtuvieron. La titulación de cada  lixiviado se hizo por duplicado. 

Los resultados se analizaron en el software Sigma plot 11.0 realizando   un ANOVA de un 

vía. 

 

3.5.1  Evaluación  de  la  utilidad  de  la  técnica  de  PCR  tiempo  real  para  cuantificar  al bacteriófago ITL‐1  

Con el objetivo de determinar si era factible aplicar la técnica de la reacción en cadena de 

la polimerasa en tiempo real (PCR‐RT por sus siglas en inglés)  para la cuantificación de los 

bacteriófagos  en  los  lixiviados,  se  implementó  esta  técnica,  estandarizando 

oligonucleótidos previamente diseñados en el laboratorio y evaluando el desempeño de la 

reacción al utilizar lixiviados.  

 Para realizar la cuantificación fágica por la técnica molecular de PCR en tiempo real (PCR‐ 

RT),  se evaluó  la  sensibilidad de  la amplificación por PCR‐RT con  tres distintos pares de 

oligonucleótidos, cada uno localizado en una región genómica distinta del genoma de fago 

ITL‐1  (figura 7). 

34  

 

 

Figura  7.  Ubicación  en  el  genoma  del  bacteriófago  ITL‐1  de  los  tres  pares  de 

oligonucleótidos evaluados por PCR‐RT. 

 

 Para preparar la curva patrón se utilizó un stock fágico con un título de 1x108 PFU/mL, el 

cual se preparó precipitando  los  fagos por centrifugación a alta velocidad  (40,000 g por 

una hora a 4  ͦ C) y solubilizando el pellet fágico en solución de sulfatos. Esta solución fágica 

se  tituló por duplicado. Se prepararon seis diluciones seriales base diez, cada una de 50 

µL,  para  esto  se  tomaron  5  µL  del  stock  viral, mezclando  con  45  µL  de  agua  libre  de 

nucleasas. 

 

Para estimar el intervalo de concentraciones fágicas que podían detectarse con cada uno 

de los tres pares de oligonucleótidos, inicialmente se realizó una serie de reacciones, que 

incluían una sola reacción por dilución para cada par de oligonucleótidos. El volumen de 

reacción  fue de 10 µL.  La mezcla de  reacción que  se utilizó  comprendía  los  reactivos  y 

concentraciones señalados en el cuadro 4. 

35  

 Cuadro 4. Mezcla de reacción  utilizada para el PCR‐RT  

Reactivo Concentración 

inicial Concentración 

final Cantidad para una reacción 

Master mix*   2x  1x  5 µL 

Mix de 

Oligonucleótidos 3 µM (c/u)  0.3 µM  1 µL 

H2O libre de 

nucleasas ‐‐‐  ‐‐  3 µL 

TOTAL      9 µL *Maxima SYBR‐ Green, Thermo Scientific, cat. #K0242 Promega, cat. #P1193   Los  oligonucleótidos  se  utilizaron  mezclando  cada  par  de  forma  de  que  cada  uno  quedara  a  una concentración de 3 µM. Cada mezcla de ligonucleótidos se denomino ITL1‐TR1, ITL1‐TR2 y ITL1‐TR3. 

  

En cada  tubo de  reacción  se colocó de  forma  independiente 1µL de  la dilución  fágica a 

evaluar para completar los 10µL de reacción. 

El termociclador (Qiagen Rotor‐Gene Q) se programó de la siguiente manera: se aplicó una 

etapa inicial de desnaturalización y activación de la enzima a 95°C por 10 min. Después se 

aplicó una segunda etapa que se repitió durante 50 ciclos, la cual consistía en una fase de 

desnaturalización  a  95°C  por  10  segundos,  una  fase  de  alineamiento  a  60°C  por  15 

segundos y una  fase de elongación a 72°C por 20 segundos, en esta etapa se registra  la 

fluorescencia de  la muestra. Finalmente se aplicó una etapa de obtención de  la curva de 

desnaturalización  (“melting”)  iniciando  a  60°C  y  terminando  en  95°C,  incrementando  1 

grado en cada paso, con 5 segundos de tiempo de espera entre cada incremento. 

36  

Para  determinar  el  par  de  oligonucleótidos  con  la mayor  sensibilidad,  se  consideró  en 

aquellos que presentaran los menores valores de ciclo umbral (Ct, por sus siglas en inglés) 

a una misma concentración fágica. 

Una vez seleccionado el par de oligonucleótidos con la mayor sensibilidad, se preparó una 

curva patrón incluyendo las concentraciones señaladas en el cuadro 5. El volumen que se 

tomó de cada dilución para una reacción de PCR‐RT fue de 1 µL, cada reacción realizó por 

triplicado. Los componentes de reacción son los mismos que se muestran en el cuadro 6. 

 

Cuadro  5.  Concentraciones  fágicas  utilizadas  en  la  curva  patrón  para  el  fago  ITL‐1, 

cuantificado por PCR‐RT 

 

 

 

 

 

 

3.6  Comportamiento de factores ambientales durante los experimentos de infección 

Se realizaron dos experimentos. El primero en un bioespacio y otro en un invernadero. En 

el primero  las aplicaciones de  la solución fágica se realizaron tres veces por semana y  la 

solución bacteriana dos veces por semana, en un periodo de 28 días. La solución  fágica 

(1x106 PFU/ml),   se preparó 10 minutos antes de  la aplicación en plantas regándolas con 

Factor de dilución Concentración fágica (PFU/µL) 

0  1x105 

5  2X104

25  4x103 

125  8x102 

625  160 

3,125  32 

15,625  6.4 

37  

una probeta directamente al pie del tallo de la planta, cada planta se regó con 500 mL de 

la solución fágica.  

Para el experimento del invernadero, realizado por la alumna Christian Rodríguez Salazar, 

se utilizó una  solución bacteriana  con una  concentración de 1.5 X108 UFC/ml  la  cual  se 

aplicó una sola vez a los 3 días después del trasplante, regando cada planta con 50 mL de 

la solución bacteriana. En este segundo experimento no se aplicaron bacteriófagos dado 

que el objetivo fue analizar las condiciones en las que se desarrollaba la marchitez. 

Durante el tiempo que duró cada experimento, se monitoreo  la temperatura y humedad 

relativa, tomando  lecturas cada 15 minutos con dispositivos electrónicos para el registro 

de estas variables (Dataloggers HOBO modelo U10‐003), además de registrar la incidencia 

de la enfermedad.  

 

3.7  Influencia del origen del agua de riego sobre la actividad del bacteriófago ITL‐1 

En la literatura no hay información en cuanto al efecto del agua de diferente origen en la 

actividad de los bacteriófagos, por lo tanto se evaluó el efecto que tiene el agua de riego  

de diferente origen  sobre  la  actividad del  fago  ITL‐1.  El  agua  se  colectó de  San Gaspar 

(agua potable), Coatlán del Río (agua de pozo) y Zacatepec (agua de pozo), que son sitios 

donde  se  siembra  jitomate,  incluyendo  dos muestras  de  la Universidad  Politécnica  del 

estado de Morelos nombradas  M3 y  M4 (agua potable). 

En  tubos  Falcon  con  capacidad  de  50 mL,  se  vertieron  40 mL  de  agua  por  duplicado 

teniendo al final 10 tubos. A cada tubo se le agregaron 23 µL de la solución stock de fagos 

38  

que contenía un título inicial de 1.3x108 PFU/mL, para llevar a un título de 1x106 PFU/ mL. 

La  solución  se  incubó  durante  3  h  y  se  procedió  a  la  titulación  de  cada  solución, 

transcurridas 24 h se  realizó otra  titulación, y posteriormente cada  tercer día durante 2 

semanas, titulando por duplicado cada tubo obteniendo así 4 repeticiones por unidad. A 

cada muestra de agua se le midió el pH y la conductividad eléctrica. 

   

39  

IV  Resultados y discusión  

4.1  Producción in vitro  del bacteriófago ITL‐1   

La  inoculación  del  bacteriófago  ITL‐1  a  diferentes  tiempos  en  los  cultivos  de  R. 

solanacearum (figura 8), mostró que el mejor rendimiento fágico (1.85 x1011 PFU/ mL) se 

obtuvo  al  inocular  el  fago  a  las  5  h  después  de  iniciado  el  cultivo  bacteriano  y  que 

corresponde al inicio de la fase exponencial de crecimiento microbiano. En el momento en 

el que se detuvo el proceso el cultivo bacteriano presentó una densidad óptica de  0.097 a 

600 nm. 

 

Otro  título  fágico  (4.20  x1010  PFU/  mL),  se  obtuvo  al  inocular  el  fago  a  las  10  h  de 

crecimiento  microbiano,  al  momento  de  detener  la  cinética  el  cultivo  presentó  una 

densidad  óptica  de    0.948  a  600  nm.  El  título  fágico más  bajo  (2.14x109  PFU/ mL),  se 

obtuvo  al  inocular  el  fago  a  las  15  h  después  de  iniciar  el  crecimiento microbiano,  al 

momento de detener  la cinética el cultivo presentó una densidad óptica de   1.213 a 600 

nm.  En  todos  los  casos,  la  cinética  de  producción  viral  se  detuvo  5  h  después  de  la 

inoculación viral. 

Se observó que entre mayor es el tiempo de cultivo bacteriano, menor es el rendimiento 

fágico que se obtiene. Esto contradice a la idea de que a mayor concentración bacteriana, 

mayor rendimiento fágico. Esta contradicción podría explicarse de la siguiente manera: 

R.  solanacearum  es  una  bacteria  Gram‐negativa  la  cual  produce  un  polisacárido 

extracelular (Addy et al 2012a) el cual es liberado al medio por la bacteria.  

40  

 

Figura 8.   Perfiles de crecimiento bacteriano después de inocular al bacteriófago 

ITL‐1  en  diferentes  momentos  de  la  curva  de  crecimiento  microbiano.  La 

inoculación de virus se  realizó al inicio (………), final de la fase exponencial  ( ̶    ̶    ̶ ) 

y al final de la fase lineal (  ̶  ∙∙  ̶ ) de la curva de crecimiento microbiano. Los títulos 

virales  fueron  1.85  x10  11  PFU/  mL,  4.20  x1010  PFU/  mL,  2.14x109  PFU/  mL 

respectivamente. 

 

Este componente bacteriano es el que bloquea el xilema de  las plantas de  jitomate y, si 

además  funciona  como  receptor del  fago  ITL‐1,  al encontrarse de manera  soluble  y no 

asociado  a  bacterias, puede neutralizar  a  los  virus  impidiendo que  se  lleve  a  cabo una 

infección productiva. Existe evidencia de que ciertos bacteriófagos como el Φ 1 y el Φ11, 

utilizan a los polisacáridos bacterianos como receptores. Por lo tanto, si la producción de  

exopolisacáridos   solubles se  incrementa con el  tiempo de cultivo ello puede explicar el 

1.85 x10 11 PFU/ mL

4.20 x10 10PFU/ mL 

2.14 x109 PFU/ mL 

41  

menor rendimiento viral al inocular el virus en cultivos bacterianos con mayor tiempo de 

crecimiento (Brito 2013). 

Los  resultados  obtenidos  en  este  trabajo  respecto  a  la  amplificación  viral  (figura  8) 

coinciden  con  los  obtenidos  en  2011,  por  Terán  quien,  trabajando  con  el  fago  ITL‐1, 

obtuvo los mejores rendimientos virales cultivando el virus por un lapso corto de tiempo 

(entre  3  y  7  horas),  confirmando  que  es  recomendable  cosechar  al  virus  unas  horas 

después de haber inoculado el cultivo microbiano. 

4.2  Efecto preventivo y curativo del bacteriófago ITL‐1 en plantas de jitomate  

Durante  la  evaluación  de  los  efectos  preventivo  y  curativo  del  bacteriófago  ITL‐1,  se 

observó que:  1) no se desarrolló la enfermedad en las plantas, pre‐requisito indispensable 

para  evaluar  dichos  efectos,  y  2)  no  se  detectaron  bacteriófagos  en  los  lixiviados 

obtenidos. Se asumen varios factores que pudieron interferir en el proceso de infección de 

las plantas, así como también en la actividad del bacteriófago.  

La ausencia de marchitez en las planta, no se debió a la pérdida de viabilidad bacteriana, 

porque para  las aplicaciones, el cultivo de  la bacteria se preparó de 2 a 3 horas antes a 

partir de un  cultivo  fresco;  tampoco a  la pérdida de patogenicidad por el  fitopatógeno, 

porque  la cepa utilizada es capaz de causar  lesiones cuando se  inocula en el tallo de  las 

plantas de jitomate (figura 9). 

42  

 

Figura  9.  Corte  transversal  del  tallo  de  la  planta  de  jitomate.  Las  flechas  señalan  las  

lesiones que causó R. solanacearum. 

 

Después  de  25  días  de  exposición  a  la  bacteria  ninguno  de  los  grupos  de  plantas 

presentaron síntomas de marchitez  (figura 10). Para evaluar si  las plantas se  infectaron, 

estas se llevaron a laboratorio y el exudado de los tallos de cada planta se sembró en cajas 

de Petri con medio NBY. 

Después de  la siembra del exudado,  las colonias presentaron un fenotipo similar al de R. 

solanacearum,  caracterizado  por  colonias  mucoides,  de  color  blanquecino,  elevación 

umbonada,  con  bordes  ondulados  y  pleomórficas  (figura  11).  La  presencia  de  R. 

solanacearum se confirmó por PCR por la presencia del producto de 282 pb.  

Estos resultados indican que R. solanacearum infectó a las plantas de jitomate pero no se 

manifestó  la enfermedad. Probablemente  los  factores ambientales como  temperatura y 

humedad  relativa  no  fueron  los  adecuados  para  que  la  infección  progresara  a 

43  

enfermedad. Recientemente, Singh (2013) observó una relación entre el incremento de la 

temperatura de  los cultivos de  jitomate y el desarrollo de  la marchitez bacteriana por R. 

solanacearum, utilizando  las variedades de  jitomate Pusa Ruby y N‐5, determinando que 

la  incidencia de  la enfermedad se  incrementaba a pasar de  los 25 a 35 o C, mientras por 

debajo de los 25  o C, no se observo desarrolló de la enfermedad. Este reporte refuerza las 

observaciones  realizadas  en  este  trabajo  las  cuales  muestran  que  no  se  desarrolló 

enfermedad bajo las condiciones de cultivo que se utilizaron, en las cuales predominó una 

temperatura promedio de 22 o C. 

 

Figura  10.  Las  plantas  de  jitomate  expuestas  a R.  solanacearum  no  se  infectaron después de 25 días de exposición al fitopatógeno bacteriano. A) plantas de jitomate al  final  del  experimento,  B)  El  exudado  de  las  plantas  analizadas  fue  siempre transparente.  C)  Se  muestra  un  ejemplo  del  exudado  mucoide  que  se  obtiene cuando una planta está infectada.  

A B 

C

44  

En  la  figura  11  C  se  observa  que  el  producto  esperado  de  PCR  de  282  pb  de  R. 

solanacearum se encontró en el exudado de los tallos de las plantas  (carriles 1 y 2). 

Así mismo,  el peso molecular de  este producto  coincide  con  el  encontrado  en  la 

muestra en la que se uso como molde ADN genómico purificado de R. solanacearum  

(carril 3)  lo que  indica que  las colonias del exudado de  los  tallos de  las plantas de 

jitomate pertenecen a la especie R. solanacearum. 

   

  

 

Figura 11. Identificación cultural y por PCR de R. solanacearum en exudados de los tallos de  las  plantas  de  jitomate.  a)  y  b)  colonias  bacterianas  obtenidas  del  exudado,  c) Amplificación  por  PCR  del  fragmento  de  282  pb  de  R.  solanacearum.  Carriles  1  y  2, muestras  correspondientes  a  colonias  compatibles  con  la  morfología  de  R. solanacearum. Carril 3, control positivo en el que se usó como molde ADN genómico de R. solanacearum. Carril 4, marcador de peso molecular (Thermo Scientific SM1373 ladder 1).  

A B 

1  2 3 4800  

300  

200  

100  

C 

P.M (pb)  

282 pb  

45  

Para explicar  la ausencia de  la actividad  fágica en  los  lixiviados, en primera  instancia  se 

verificó que el pH de  la solución nutritiva estuviera en niveles aptos para el crecimiento 

adecuado de R. solanacearum  (pH 4‐8)   y para  la actividad del  fago  ITL‐1(pH 5‐7, Flores 

2012), ya que éste es un factor esencial y, como se describe más adelante, es crítico para 

la estabilidad del fago.  Los resultados mostraron que el pH de la solución nutritiva estuvo 

entre 5.5  y 6.0 por  lo que este no era un  factor que explicara  la ausencia de actividad 

fágica en los lixiviados. 

Otras posibles causas que pudieran explicar la ausencia de actividad fágica es que el fago 

se desestabilizara por el pH conferido a los lixiviados por la turba. Como se muestra en el 

cuadro 7, la turba confería a los lixiviados un pH ácido (pH=3.23 – 3.81), condición que no 

favorece  la estabilidad del bacteriófago (Iriarte 2007), el cual  inicialmente se encontraba 

en  la solución nutritiva con un pH=5‐6. Otra posibilidad es que  los  fagos podrían quedar 

atrapados en la turba, la cual pudiera funcionar como una columna de retención donde se 

quedan adsorbidos los virus.  Existen reportes que muestran que la radiación solar puede 

afectar a los bacteriófagos (Iriarte 2007). En este trabajo se descarta la posibilidad de que 

los  bacteriófagos  fueran  inactivados  por  los  rayos  solares  ya  que  la  solución  con 

bacteriófagos  se  transportó  al  bioespacio  protegida  de  la  luz  solar,  y  se  aplicó  por  las 

tardes en una hora en la que las plantas no se exponían a los rayos solares, sino hasta el 

día  siguiente.  Se  conoce  también  que  la  desecación  afecta  la  actividad  fágica  (Jończyk 

2011), pero este  factor se descarta porque  las plantas se  regaron diariamente cuidando 

que el sustrato permaneciera húmedo. En consecuencia todo indica que el pH de la turba 

impidió la actividad fágica. 

46  

4.3  Comportamiento  de  los  factores  ambientales  durante  la  infección  con  R. solanacearum en los ensayos en el bioespacio e invernadero 

 

Las condiciones ambientales  (humedad  relativa y  temperatura) no  fueron  las adecuadas 

para que se desarrollara  la enfermedad en el bioespacio; en  la figura 12 y 13 se muestra 

que las condiciones que se presentaron en ambos lugares. 

También  es posible que  la dosis  bacteriana utilizada  en  el  experimento  realizado  en  el 

biospacio fuera demasiado baja y tal vez no alcanzó la concentración umbral para que las 

plantas  se  infectaran  y  se desarrollara  la enfermedad,  sin embargo,  Singh  (2013),  logra 

incidencias hasta del 63% de la marchitez bacteriana usando tan solo 100 UFC/mL pero no 

indica a que temperatura ocurre este fenómeno.  

Entre el bioespacio y el  invernadero,  los perfiles de  temperaturas máximas difirieron de 

forma importante (figura 12). En el bioespacio el cultivo se inició con bajas temperaturas, 

presentando en la primera semana un máximo de 32 °C y un mínimo de 17.5 °C, mientras 

que en el  invernadero, en  la primera semana se presentó una temperatura muy estable, 

con un máximo de 37.8 °C  y un mínimo de 35.5 °C. Durante las semanas que siguieron, la 

temperatura en ambos lugares fue similar, a excepción de los días 10 y 11 post‐infección, 

en  los  cuales  se  presentó  un  descenso  en  el  invernadero.  La  última  semana  del 

experimento se presentaron temperaturas máximas de 40.4 °C y 38.4 °C en el bioespacio y 

el invernadero, respectivamente, y unas temperaturas mínimas de 35.7 °C y 31.3 °C. En el 

invernadero donde se manifestó la enfermedad, la caída en la temperatura, coincide con 

incremento en el porcentaje de marchitez. 

47  

 

Figura  12. Condiciones de  temperatura  y porcentaje de marchitez que  se presentaron 

durante 19 días en el bioespacio y el invernadero (dde: días después de la exposición a R. 

solanacearum). 

 

Con respecto a  la humedad relativa,  los perfiles entre el bioespacio y el  invernadero son 

muy  diferentes.  La  primera  semana  en  el  bioespacio  se  caracterizó  por  una  gran 

variabilidad en las máximas humedades registradas, con valores entre el 56.9% y el 99.5%, 

mientras que en el invernadero se presentó una humedad relativa estable, con un mínimo 

de 94.6% y un máximo de 100%. La aparición e incremento en la marchitez bacteriana en 

el invernadero, coincide con el incremento de la humedad relativa, este incremento en la 

humedad se debió, como ocurrió con  la temperatura, a  la anomalía climatológica de  los 

huracanes Ingrid y Manuel. Durante los días de posteriores a la exposición, el incremento 

de la  marchitez fue gradual hasta superar el 90% a los 7 días después de la exposición.  

48  

Figura 13. Condiciones de humedad relativa y porcentaje de marchitez que se presentaron 

durante 19 días en el experimento de  infección  (dde: días después de  la exposición a R. 

solanacearum) 

 

A partir de la información de las figuras 12 y 13, se sugiere que temperaturas altas al inicio 

del  experimento  podrían  favorecer  el  incremento  de  la  población  bacteriana  en  el 

sustrato,  además  de  estresar  a  la  planta,  tanto  hídricamente  como  fisiológicamente, 

debilitando  sus  mecanismos  de  defensa.  Adicionalmente,  la  marchitez  se  presentó 

inmediatamente  después  de  tres  días  consecutivos  de  bajas  temperaturas  y  elevada 

humedad relativa, este estrés se presentó después de  la exposición a altas temperaturas 

(figura 12). Estas condiciones pudieron haber jugado un papel importante en el desarrollo 

de  la  enfermedad.  Los  dos  factores  que  sugieren  que  la  planta  se  torna  susceptible  e 

inducen  la aparición de marchitez bacteriana parecen  ser:  temperaturas elevadas  como 

encontró   Singh  (2013) quien determinó que a temperaturas por arriba de  los 35 o C   R. 

solanacearum  presentó incidencias del 63%, (por arriba de 35 o C) y humedad relativa del 

49  

100% exactamente antes de  la manifestación de  la enfermedad, ello podrá confirmarse 

con la repetición del experimento bajo condiciones controladas.  

4.4  Evaluación de oligonucleótidos para la cuantificación viral por PCR‐RT 

De  los  tres  pares  de  oligonucleótidos  analizados  en  las  reacciones  de  PCR‐RT,  los 

denominados  ITL1‐RT1  fueron  los que presentaron   una mayor  sensibilidad puesto que 

para una misma cantidad de ADN se obtuvo el menor Ct (cuadro 6, figura 14).   Con este 

par  de  oligonucleótidos  se  preparó  la  curva  patrón,  utilizando  diluciones  base  5  de  la 

solución stock fágica original.  

Figura  14.  Perfiles  de  amplificación  del  fago  ITL‐1,  utilizando  tres  pares  de oligonucleótidos  diferentes.  La  línea  roja  continua  corresponde  a  los  oligonucleótidos ITL1‐RT1,  la  línea  azul  discontinua  corresponde  a  los  oligonucleótidos  ITL1‐RT2  y  línea negra punteada corresponde a los oligonucleótidos ITL1‐RT3.  

Como  se  observa  en  la  figura  15,  el  desempeño  del  PCR‐RT,  incluyendo  1µL  de  cada  

solución fágica diluida en solución de sulfatos, corresponde a  lo esperado puesto que se 

50  

observan  separaciones  más  o  menos  constantes  entre  cada  triplete  de  curvas  de 

amplificación. También se observa una adecuada reproducibilidad para cada dilución. 

 

Cuadro 6. Ciclo umbral (Ct) obtenido por cada uno de  los tres pares de oligonucleótidos 

evaluados para cuantificar al bacteriófago ITL‐1 por PCR‐RT 

Concentración viral (PFU/mL) 

Ct 

  ITL1‐RT1  ITL1‐RT2  ITL1‐RT3 

1.00E+08  16.78  17.99  17.32 

1.00E+07  19.48  21.51  21.08 

1.00E+06  22.96  24.64  24.19  

Figura 15: Perfiles de amplificación del  fago  ITL‐1, utilizando el par de oligonucleótidos ITL1‐RT1 y seis diluciones en base 5.  

Al analizar la curva patrón se obtuvo un coeficiente de correlación de 0.99 (Figura 16), lo 

que  indica que existe un comportamiento  lineal entre  la concentración viral y el número 

Umbral 

51  

de  ciclos  del  sistema,  lo  que  permitió  proceder  a  evaluar  la  concentración  viral  en  los 

lixiviados. 

 

 

Figura 16.   Curva patrón para  la cuantificación del  fago  ITL‐1 por PCR‐RT utilizando  los 

oligonucleótidos ITL1‐RT1. 

 

Esta  técnica  puede  ser  usada  en    investigaciones  posteriores  para  estudiar  cómo  se 

modifica  la  concentración  viral  durante  la  amplificación  in  vitro,  así  como    para  su 

detección en planta y en el ambiente. 

 

 

 

 

 

Concentración

Ciclo umbral 

r= 0.99750 

r2=0.99501 

m=3.495 

b= 28.366 

52  

4.5  Evaluación del efecto de diferentes sustratos sobre  la actividad del bacteriófago 

ITL‐1 

 

A  los  lixiviados  obtenidos  a  partir  de  los  diferentes  sustratos,  se  les  midió  el  pH,  la 

conductividad y su capacidad de retención (cuadro 7). 

 

Cuadro  7.  Valores  de  capacidad  de  retención,  pH  y  conductividad  eléctrica  de  los

sustratos 

Sustrato  Capacidad de retención (mL/g) 

pH  Conductividad (µS/cm) 

Tepojal  0.46  6.02  2.735 

Turba/tepojal  0.75  3.81  3.34 

Suelo de Coatlán del Río 

0.23  6.37  6.94 

Fibra de coco  0.86  5.82  4.51 

Suelo de Zacatepec 

0.12  6.99  6.83 

Tezontle  0.10  6.96  2.04 

Turba  2.38  3.23  2.75  

 

En el cuadro 7 se observa que  la turba es el sustrato con mayor   capacidad de retención 

(2.38 mL/g), mientras que el tezontle presenta el menor valor para este parámetro (0.10 

mL/g).  Los  lixiviados  con  los  valores de pH más ácidos  fueron:  la  turba  (pH= 3.23),  y  la 

mezcla de ésta con tepojal (pH= 3.81). En relación a la conductividad el tezontle fue el que 

presentó la conductividad más baja (2.04 µS/cm) a comparación del suelo de  Coatlán del 

Río que tiene la conductividad más elevada (6.94 µS/cm). 

Al  titular  los  bacteriófagos  presentes  en  los  lixiviados,  se  observó  que  en  los 

correspondientes    a  la  turba  y    en  la  mezcla  de  ésta  con  tepojal,  no  se  detectó  la 

53  

formación  de  placas  de  lisis  en  ninguna  dilución  y  tampoco  en  los  lixiviados  sin  diluir 

(figura 17). En todos los lixiviados en los que se detectó al fago, el título viral fue siempre 

cercano  a  un  orden  de magnitud  de  105,  con  títulos  que  van  de  8.9  X104  a  6.0  X105  

PFU/mL. 

 

Figura  17.    Influencia  del  sustrato  en  la  actividad  del  bacteriófago  ITL‐1.  Las  literales iguales indican que no hay diferencia estadísticamente significativa.  

 

54  

Los  títulos  virales  que  se  obtuvieron  en  los  sustratos  tepojal,  fibra  de  coco,  suelo  de 

Zacatepec, suelo de Coatlán del Río y  tezontle se mantuvieron constantes a  lo  largo del 

experimento, a diferencia de  lo que ocurrió con  la turba y  la mezcla de ésta con tepojal, 

este resultado se atribuye a los bajos valores de pH (3.23, 3.81) que poseen.  Este factor es 

probablemente la causa por la cual no hubo actividad fágica. La capacidad que poseen los 

bacteriófagos para sobrevivir bajo condiciones desfavorables es muy variable (Ackermann 

2004),  intervienen  diferentes  factores  físicos  y químicos,  tales  como  la  temperatura,  la 

acidez,  y  la  concentración  de  iones  presentes  en  el  medio.  Todas  estas  condiciones 

influyen en la actividad del fago (Jończyk 2011). 

En  la  filosfera,  los bacteriófagos no pueden permanecer  tiempos prolongados ya que se 

encuentran limitados por diversos factores: irradiación de la  luz solar, la temperatura, la 

desecación y la exposición a bactericidas que en su composición contengan cobre (Iriarte 

2007).  En  todos  los  trabajos publicados  referentes  a  la estabilidad de  los bacteriófagos 

indican que existe una gran variación en los perfiles de estabilidad a diferentes valores de 

pH (Whitman et al. Marshal 1971, Thorne et al. Holt 1974, Feng et al en 2003, Jepson et al. 

March 2004, Vivek et al 2009, Yang et al 2010) y que no se puede determinar un patrón 

para  todos  los bacteriófagos,  lo que  señala nuevamente  la necesidad de determinar de 

forma individual este tipo de características en los nuevos bacteriófagos aislados.  

Los resultados obtenidos por Flores (2012) indican que el bacteriófago ITL‐1 es estable en 

un intervalo de pH que va de 5 a 7, empezando a caer la estabilidad a partir de un pH de 8 

y  perdiéndose  totalmente  el  título  a  pH’s menores  de  5.  Esto  podría  representar  una 

limitación  en  la  utilidad  del  bacteriófago  como  agente  de  control  por  lo  que  la 

55  

implementación de estrategias que incrementen la estabilidad del bacteriófago ITL‐1 en el 

campo ayudaría a utilizar este tipo de mecanismos de control biológico (Ma et al. 2008). 

4.7  Influencia del origen del agua de riego sobre la actividad del bacteriófago ITL‐1  

Las características de conductividad y pH que presentaba cada tipo de agua evaluado se 

muestran en el cuadro 8. 

Cuadro 8. Valores de pH y conductividad eléctrica obtenidos por cada fuente de agua

Origen del agua 

pH  Conductividad eléctrica (µS/cm) 

Pozo de Coatlán del Río 

6.60  0.46 

Agua potable de San Gaspar 

6.18  1.37 

Pozo de Zacatepec 

7.22  1.13 

Agua potable UPEMOR (M3) 

8.72  0.23 

Agua potable UPEMOR (M4) 

8.63  0.25 

 

 

Se observa que la fuente de agua que presenta un valor de pH ligeramente ácido es la de 

San Gaspar (pH= 6.18). Las muestras de Zacatepec (pH= 7.22) y  Coatlán del Río (pH= 6.60) 

presenta un pH cercano a la neutralidad, mientras que las muestras de agua potable de la 

UPEMOR  (M3  y  M4)  presentan  valores  ligeramente  alcalinos  (8.72  y  8.63, 

respectivamente).  En  relación  a  la  conductividad,  las  muestras  provenientes  de  la 

UPEMOR  (M3 y M4)  fueron  las que presentaron  la conductividad más baja  (0.23 y 0.25 

µS/cm), mientras que  la muestra   proveniente de San Gaspar tuvo  la conductividad más 

elevada (1.37 µS/cm). 

56  

Al poner en contacto el bacteriófago con el agua de estos orígenes,  se observó que en los 

correspondientes   a M3 y M4, no  se detectó  la  formación de placas de  lisis en ninguna 

dilución y tampoco en  la muestra sin diluir (figura 18). En todas  las muestras de agua en 

las que se detectó al fago, el título viral fue siempre cercano a un orden de magnitud de 

104, con títulos que  iban de 5.33 X 103 a 3.73 X 104 UFC/mL. Durante el transcurso de 12 

días, el título se mantuvo estable en las muestras de agua de San Gaspar, Coatlán del Río y 

Zacatepec, sin embargo no se detectó actividad en las muestras de agua provenientes de 

la UPEMOR. 

 

Figura  18.  Estabilidad  del  bacteriófago  ITL‐1  en  agua  de  diferente  origen,  (ddi:  días 

después de la inoculación con  R. solanacearum) 

 

57  

En el ensayo  llevado a cabo sobre el efecto preventivo y curativo del bacteriófago  ITL‐1, 

además de evaluar el efecto del sustrato sobre la actividad fágica, también se procedió a 

evaluar  el  agua  utilizada.  No  existen  reportes  que  muestren  la  influencia  de  las 

características del agua en la actividad fágica.  Como se mencionó anteriormente, uno de 

los  factores para que  la  actividad del bacteriófago  tenga éxito es el pH. Varios  autores 

mencionan  la  importancia de este y  las consecuencias de no estar en rangos aceptables 

para  la actividad  fágica. Es por este motivo que a cada bacteriófago aislado  se debe de  

evaluar estos factores, los valores obtenidos de pH del agua proveniente de las muestras 

de  la  UPEMOR  contenían  un  pH  de  8,  eliminando  por  completo  a  actividad  del 

bacteriófago. También se observa que  las muestras de  la UPEMOR (M3 y M4) fueron  las 

que presentaron  la menor conductividad  lo que  indica que estas muestras poseen pocas 

sales disueltas, Flores (2012) demostró que el bacteriófago ITL‐ 1 es sumamente inestable 

en agua destilada y en soluciones que contienen únicamente cloruro de sodio, por lo tanto 

es  posible  que  la  baja  concentración  de  sales  en  las muestras  de  la UPEMOR  también 

contribuyera a desestabilizar al bacteriófago ITL‐1. 

   

58  

VI  Conclusiones  

 

Los mayores títulos viales del bacteriófago ITL‐1 (1x109 PFU/mL) se encontraron a  las 5 h 

después de la  inoculación de un cultivo bacteriano con una densidad óptica de 0.1 a 600 

nm. 

Bajo  las  condiciones  en  las  que  se  realizó  el  experimento  de  infección  de  plantas  de 

jitomate  con  Ralstonia  solanacearum,  no  se  logró  el  desarrollo  de  la  enfermedad  y  en 

consecuencia    no  se  pudo  observar  la  interacción  jitomate‐  Ralstonia  solanacearum‐ 

bacteriófago ITL‐1. 

Aparentemente el pH que se genera a partir de  la turba en  los  lixiviados, desestabiliza al 

bacteriófago ITL‐1 lo que impide su detección en los mismos. 

Los resultados mostraron que hay diferencias sustanciales entre cada una de  las fuentes 

de agua y tipo de sustrato utilizados, en cuanto a la viabilidad del fago, confirmando que 

para cada fuente de agua la conductividad y el pH influyen en la actividad fágica. 

Finalmente, los datos de temperatura y humedad relativa sugieren que no se presentaron 

las  condiciones  adecuadas  para  que  se  desarrollara  la  enfermedad  en  las  plantas 

cultivadas en el bioespacio.  

   

59  

VII  Bibliografía    Ackermann H. 2004. Bacteriophages, Pp:135‐146, Schaechter M. The Desk Encyclopedia of 

Microbiology, Elsevier. China 1166p. 

 Ackermann H. 2011. Bacteriophage taxonomy.Microbiology.Aust. 4. 

 Addy H, Askora A,  Kawasaki  T,  Fujie M  and  Yamada  T.  2012a.  Loss  of  virulence  of  the 

phytopathogen  Ralstonia  solanacearum  through  infection  by  φRSM  filamentous 

phages. Phytopathology 102:469‐477. 

 Addy H, Askora A, Kawasaki T, Fujie M and Yamada T. 2012b.The filamentous phage фRSS1 

enhances  virulence  of  phytopathogenic  Ralstonia  solanacearum  on 

Tomato.Phytopathology 102: 244 – 251. 

 Agrios GN. 2005. Plant pathology. 5ª Edición. Harcourt/Academic Press. 635 p. 

 Anith KN, Momol M, T Kloepper,  JW, Marois  J, Olson M and  Jones   B. 2004. Efficacy of 

plant growth‐promoting rhizobacteria, acibenzolar‐S‐methyl, and soil amendment 

for integrated management of bacterial wilt on tomato. Plant Disease. 88:669‐673. 

 Askora  A,  Kawasaki  T,  Usami  S,  Fujie  M  and  Yamada  T.  2009.  Host  recognition  and 

integration  of  filamentous  phage  ΦRSM  in  the  phytopathogen,  Ralstonia 

solanacearum. Virology 384:69‐76. 

 Bae JY, Wu J, Lee H, Jo E, Murugaiyan S, Chung E and Lee S. 2012. Biocontrol potential of a 

lytic bacteriophage PE204 against bacterial wilt of tomato. Journal of microbiology 

and biotechnology, 22:1613‐1620. 

 Brito A. 2013 Mecanismo que utilizan  los bacteriófagos Φ1, Φ10  y Φ11 para  infectar a 

Rhizobium  etli  CFN42.  Encuentro  de  jóvenes  investigadores‐  CONACYT. 

60  

http://www.uagro.mx/usr/admin/investigacion/ponencias/biologicas/biol%20%28

67%29.pdf 

 Carter J and Saunders V. 2007. “Bacterial viruses”.Pp: 229‐255, In: Carter‐ J. Saunders, V. 

(eds.) Virology Principles and applications. John Wiley & Sons Ltd. England, 1116p. 

 Caruso  P,  Palomo  E,  Bertolini  B,    López  EG  and  Biosca.  2005.  Seasonal  variation  of 

Ralstonia  solanacearum  biovar  2  populations  in  a  Spanish  river:  recovery  of 

stressed  cells at  low  temperatures. Applied Environmental Microbiology 71:140–

148. 

 Champoiseau PG, Jones JB, Allen C. 2009. Ralstonia solanacearum race 3 biovar 2 causes 

tropical losses and temperate anxieties. Online. Plant Health Progress. 10:313‐01. 

 Cooksey DA. 1990. Genetics of bactericide resistance in plant pathogenic bacteria. Annual. 

Review of Phytopathology 28:201–19. 

 Denny TP and Hayward AC. 2001. Gram negative bacteria. Ralstonia. Laboratory guide for 

identification of plant pathogenic bacteria, Pp:151‐174. In: Schaad N, Jones B, and 

Chun W, (eds). APS Press, St. Paul, 798p.  

 EPPO, Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. 2004. Diagnostic protocols for regulated pests. 173 –

178. 

 Fegan  M,  Prior  P,  Allen  C,  and  Hayward  AC.  2005.  How  complex  is  the"  Ralstonia 

solanacearum  species  complex".  Bacterial  wilt  disease  and  the  Ralstonia 

solanacearum species complex, 449‐461p. 

 Feng YY, Ong SL, Hu JY, Tan XL and Ng WJ. 2003. Effects of pH and temperature on the 

survival of coliphages MS2 and Qbeta. J Ind Microbiology Biotechnology 30:549–552.  

 

61  

Fujiwara A, Fujisawa M, Hamasak R, Kawasaki T, Fujie M and Yamada T. 2011. Biocontrol 

of  Ralstonia  solanacearum  by  treatment  with  lytic  bacteriophages.  Applied 

Environmental Microbiology 77:4155‐4162.  

 Flores,  D.  2012    Determinación  de  las  condiciones  que  favorezcan  la  estabilidad  del 

bacteriófago  ITL‐1,  en  anaquel  y  durante  su  aplicación  en  campo.  Tesis  de 

Licenciatura.  Universidad Politécnica del Estado de Morelos. 

 Gaber B, and Wiebe W. 1997. Enfermedades del jitomate. Guía Práctica para Agricultores. 

Peto Seed Company. 61p. 

 Greer  G.  2005.  Bacteriophage  control  of  foodborne  bacteria.  Journal  Food  Protection 

68:1102‐1111. 

Grey B, Steck T. 2001. The viable but nonculturable state of Ralstonia solanacearum may 

be involved in long‐term survival and plant infection. 2001. Applied Environmental 

Microbiology 67:3866–3872. 

Hanson PM, Wang JF, Licardo O, Hanudin, Mah SY, Hartman GL, Lin YC and Chen JT. 1996. 

Variable reactions of tomato lines to bacterial wilt evaluated at several locations in 

Southeast Asia. HortScience 31:143‐146. 

Hayward  AC.  1964.  Characteristic  of  Pseudomonas  solanacearum.  Journal  of  Applied 

Bacteriology 27: 265 – 277. 

Hayward AC.  1991. Biology  and  epidemiology of bacterial wilt  caused by Pseudomonas  

solanacearum. Annual Review of Phytopathology 29:65–87. 

Hendrick  CA  and  Sequeira  L.  1984.  Lipopolysaccharide‐Defective  mutants  of  the  wild 

pathogen  Pseudomonas  solanacearum.  Applied  Environmental  Microbiology 

48:94‐101. 

Hernández  J,  Ramírez  Y.  2012.  First  report  of  Ralstonia  solanacearum  causing  tomato 

bacterial wilt in Mexico. New Diseases Report 26: 22. 

62  

Iriarte  FB,  Jackson  LE,  Balogh  B, Obradovic  A  and Momol MT.  2007.  Factors    affecting 

survival  of  bacteriophage  on  tomato  leaf  surfaces.  Applied  and  Enviromental 

Microbiology 73:1704–1711. 

Janse  JD.  1996.  Potato  brown  rot  in western  Europe:  History,  present  occurrence  and 

some remarks on possible origin, epidemiology and control strategies. EPPO Bull. 

26:679‐695. 

Jarvis W, and McKeen C. 1991. Tomato diseases.Agriculture Canada.70 p. 

Jepson CD, March JB. 2004. Bacteriophage lambda is a highly stable DNA vaccine delivery 

vehicle. Vaccine 22:3413–1419.  

 Ji P, Allen C, Sanchez A, Yao  J, Elphinstone  JG,  Jones  JB and Momol MT. 2007. New diversity of 

Ralstonia solanacearum strains associated with vegetable and ornamental crops in Florida. 

Plant Disease 91:195‐203.  

 

Ji P, Momol MT, Olson SM and Pradhanang PM. 2005. Evaluation of thymol as biofumigant 

for control of bacterial wilt of tomato under field conditions. Plant Disease 89:497‐

500. 

Jones  JB,  Jackson  LE,  Balogh  B,  Obradovic  A,  Iriarte  FB  and  Momol  MT.  2007. 

Bacteriophages for plant disease control. Annual. Review. Phytopathology 45:245–

62. 

Jończyk E, Kłak M, Międzybrodzki R and Górski A. 2011. The  influence of external factors 

on bacteriophages. Review. Folia microbiologica 56:191‐200. 

 

Kutter  E,  and  Sulakvelidze  A.  2004.  Bacteriophages:  Biology  and  Applications.  Estados 

Unidos de América.Ed. CRC Press. 528p. 

63  

Lin CH, Hsu ST and Tzeng KC. 2009. Detection of race 1 strains of Ralstonia solanacearum 

in  field  samples  in  Taiwan  using  a  BIO‐PCR method.  European  Journal  of  Plant 

Patholology 124:75–85. 

Lindberg A. 1973. Bacteriophage Receptors. Annual Review of Microbiology 27:205‐241.  

Ma  Y,  Pacan  JC,  Wang  Q,  Xu  Y,  Huang  X,  Korenevsky  A  and  Sabour  PM.  2008. 

Microencapsulation of bacteriophage Felix O1 into chitosan‐alginate microspheres 

for oral delivery. Applied and Environmental Microbiology. 74:4799‐4805. 

 

McDougald D, Rice S, Weichart D and Kjelleberg S. 1998. Nonculturability: adaptation or 

debilitation. FEMS Microbiology Ecology. 25:1–9. 

Messiha NAS, Van Bruggen AHC, Van Diepeningen AD, de Vos OJ, Termorshuizen AJ, Tjou‐

Tam‐Sin and  Janse NNA. 2007a. Potato brown rot incidence and severity under 

different management and amendment regimes in different soil types. European 

Journal of Plant Pathology 119:367–381. 

Moat GA,  Foster  J,  Spector M. 2002.  “Bacteriophage Genetics”  capítulo 6 en: Microbial 

Physiology. cuarta edición, Wiley‐Liss, USA, 1‐38p.  

Murugaiyan  S,  Bae  J, Wu  J,  Lee  S,  Um  H,  Choi  H,  Chung  E  and  Lee  J  y  Lee  S.  2010. 

Characterization  of  filamentous  bacteriophage  PE226  infecting  Ralstonia 

solanacearum strains.Journal of Applied Microbiology 110: 296:303. 

Norman DJ, Chen J, Yuen JM, Mangravita‐Novo A, Byrne D and Walsh L. 2006. Control of 

bacterial wilt of geranium with phosphorous acid. Plant Disease 90:798‐802. 

Ozawa H, Tanaka H,  Ichinose Y and Shiraishi T. 2001. Bacteriophage P4282, a parasite of 

Ralstonia solanacearum, encodes bacteriolytic protein important for lytic infection 

of its host. Molecular Geneticts Genomics 265:95‐101. 

 

64  

Perea SJM, García ERS, Allende MR, Carrillo FJA, León FJ, Valdez TB y López SFSM. 2011. 

Identificación de razas y biovares de Ralstonia solanacearum aisladas de plantas de 

jitomate. Revista Mexicana de Fitopatología 29:98‐108. 

Remenant B, Coupat‐Goutaland B, Guidot A, Cellier G, Wicker E, Allen C, y Prior P. 2010. 

Genomes of  three  tomato pathogens within  the Ralstonia  solanacearum  species 

complex  reveal  significant evolutionary divergence.BioMedCentral Genomics. 11: 

1:16. 

Saddler G.  2005. Management  of  bacterial wilt  disease.  Bacterial Wilt Disease  and  the 

Ralstonia solanacearum Species Complex. C. Allen, P. Prior, and A. C. Hayward, eds. 

American Phytopathological Society, St. Paul, MN USA. 121‐132p. 

Sanchez  PA,  Mejia  L  and  Allen  C.  2008.  Diversity  and  distribution  of  Ralstonia 

solanacearum strains  in Guatemala and rare occurrence of tomato fruit  infection. 

Plant Pathology. 57:320–331. 

Schell MA. 2000. Control of virulence and pathogenicity genes of Ralstonia solanacearum 

by an elaborate sensory network. Annual Review of Phytopathology 38:263:92. 

Singh D, Yadav DK, Sinha S and Choudhary G. 2013. Effect of temperature, cultivars, injury 

of  root and  inoculums  load of   Ralstonia solanacearum  to cause bacterial wilt of 

tomato. Archives of Phytopathology and Plant Protection. In press. 

Shigenobu M, Rashel M, Uchiyama  J, Sakurai S, Ujihara T, Kuroda M,  Ikeuchi M, Tani K, 

Fujiedam  M  and  Wakiguchi  H  and  Imai  S.  2005.  Bacteriophage  therapy:  a 

revitalized  therapy  against  bacterial  infectious  diseases.  Journal  of  Infectious 

Chemotherapy 11:211:219. 

Skurnik M and Strauch E. 2006. Phage therapy: Facts and fiction. International Journal of 

Medical Microbiology 296:5:14. 

 

65  

Sulakvelidze  A.  2005.  Phage  therapy:  an  attractive  option  for  dealing  with  antibiotic‐

resistant bacterial infections. Drug Discovery Today 10:807:809. 

Tanaka H, Negishi H, Maeda H.  1990.  Control  of  tobacco  bacterial wilt  by  an  avirulent 

strain  of  Pseuomonas  solanacearum  M4S  and  its  bacteriophage.  Annual 

Phytopathology. Society. of Japan 56:243:246. 

Terán  I.  2012.  Bioprospección  de  bacteriófagos  con  actividad  lítica  hacia  Ralstonia 

solanacearum. Tesis de Licenciatura Universidad Politécnica del Estado de Morelos. 

Thorne CB, Holt SC. 1974. Cold lability of Bacillus cereus bacteriophage CP‐51. Journal of 

virology. 14: 1008‐1012.  

Vidaver AK. 1976. Prospects  for  control of phytopathogenic bacteria by bacteriophages 

and bacteriocins. Annual Review of Phytopathology 14:451‐465. 

Vivek V, Kusum H and Sanjay C. 2009. Characterization of a T7‐Like Lytic Bacteriophage of 

Klebsiella  pneumoniae B5055: A  Potential  Therapeutic Agent. Current Microbiology 

59: 274‐281. 

SAGARPA  2010.  Monografía  de  Cultivos. 

http://www.sagarpa.gob.mx/agronegocios/Documents/pablo/Documentos/Mono

grafias/Jitomate.pdf  

Serrano  R.  2013.  Aislamiento,  caracterización  e  identificación  de  bacteriófagos  con 

actividad  lítica  hacia  los  fitopatógenos  del  JITOMATE  Ralstonia  solanacearumY 

Clavibacter michiganensis subsp. Michiganensis. Tesis de Licenciatura Universidad 

Politécnica del Estado de Morelos. 

SIAP  2013.  Resumen  nacional  de  la  producción  agrícola. 

http://www.siap.gob.mx/index.php?option=com_wrapper&view=wrapper&Itemid

=258 

Whitman  PA, Marshal RT.  1971.  Isolation  of  Psychrophilic Bacteriophage‐Host  Systems 

from Refrigerated Food Products. Applied Microbiology 22: 220‐223.  

 

66  

Yamada  T,  Kawasaki  T,  Nagata  S,  Fujiwara  A,  Usami  S  and  Fujie  M.  2007.New 

bacteriophages  that  infect  the  phytopathogen  Ralstonia 

solanacearum.Microbiology 153: 2630:2639. 

 Yang  H,  Liang  L,  Lin  S  and  Jia  S.  2010.  Isolation  and  Characterization  of  a  Virulent 

Bacteriophage AB1 of Acinetobacter baumannii. BioMedCentral Microbiology. 10: 1‐

10.