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Instituto Politécnico Nacional
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
Detección de cianobacterias toxigénicas pertenecientes al
género Microcystis mediante marcadores moleculares y
ensayos biológicos
Tesis
Que para obtener el grado de
Maestría en Ciencias Químicobiológicas
presenta
QBP Mario Alberto Arzate Cárdenas
Directores: Dr. Felipe Fernando Martínez Jerónimo
Dra. Roxana Olvera Ramírez.
1
Índice.
Introducción _____________________________________________________________ 4
Antecedentes ___________________________________________________________ 25
Justificación ____________________________________________________________ 27
Objetivos ______________________________________________________________ 28
Materiales y métodos ____________________________________________________ 29
Resultados _____________________________________________________________ 37
Discusión ______________________________________________________________ 48
Conclusiones ___________________________________________________________ 54
Anexo 1. Extracción de DNA por el Método de CTAB _______________________________ 55
Anexo 2. Cuadro comparativo de los componentes de los medios minerales empleados en el
aislamiento de Microcystis spp. _______________________________________________ 56
Anexo 3. Datos de la prueba de consumo de Microcystis aeruginosa LB2385 por Daphnia magna
______________________________________________________________________ 57
Referencias _____________________________________________________________ 63
2
Índice de Cuadros
Cuadro 1. Clasificación de las cianotoxinas de acuerdo a su efecto tóxico. __________________________ 11
Cuadro 2. Variación estructural de las microcistinas y su peso molecular. ___________________________ 13
Cuadro 3. Tamaño esperado de los RFLP de mcyA-Cd de tres cepas de cianobacterias digeridos con las
endonucleasas indicadas. _________________________________________________________________ 21
Cuadro 4. Casos humanos de exposición a cianotoxinas. ________________________________________ 24
Cuadro 5. Bioensayos de toxicidad aguda con D. magna _________________________________________ 33
Cuadro 6. Iniciadores empleados para PCR Múltiple. ___________________________________________ 35
Cuadro 7. Caracterización de los sitios de colecta durante el 2007. ________________________________ 37
Cuadro 8. Caracterización fisicoquímica del agua de los sitios de colecta. ___________________________ 38
Cuadro 9. Sitios de colecta de los cuales se han conseguido aislado clonales. ________________________ 39
Cuadro 10. Resultado del bioensayo de toxicidad con neonatos de Daphnia magna empleando muestras de
agua de las diferentes colectas. ____________________________________________________________ 39
Cuadro 11. Concentración letal media (CL50) para D. magna del extracto crudo de Microcystis sp. (biomasa
total de cianobacterias de los sitios de colecta). _______________________________________________ 40
Cuadro 12. Concentración letal media (CL50) para D. magna del extracto crudo de los aislados de Microcystis
sp. ____________________________________________________________________________________ 40
Cuadro 13. Reproducción de D magna alimentada con Ankistrodesmus falcatus o Microcystis aeruginosa. 41
Cuadro 14. Media de las dimensiones corporales medidas al final de la prueba de consumo. ___________ 42
Cuadro 15. Resultados de la PCR múltiple ____________________________________________________ 45
Cuadro 16. Curva de calibración ELISA _______________________________________________________ 45
Cuadro 17. Concentración de microcistinas en los extractos crudos de Microcystis sp. ________________ 46
Cuadro 18. Resumen de los resultados de las ensayos realizados a los diferentes aislados. _____________ 47
Índice de figuras Figura 1. Estructura de la microcistina LR. ....................................................................................................... 12
Figura 2. Modelo propuestos para la biosíntesis de microcistinas. .................................................................. 18
Figura 3. Conjuntos de genes mcy y nda de diferentes géneros. ..................................................................... 20
Figura 4. A Diseño de los iniciadore mcyA-Cd. ................................................................................................. 22
Figura 5. Concentración de microcistinas en la presa de Valle de Bravo en 1999. .......................................... 25
Figura 6. Concentración de microcistinas en la presa de Valle de Bravo en 2001. .......................................... 26
Figura 7. Sitios de colecta en la Ciudad de México.. ......................................................................................... 29
Figura 8. Almacenamiento del material de colecta en botellas de PET. .......................................................... 30
Figura 9. Biomasa colectada en el Lago de Chapultepec 1ª sección. ............................................................... 30
Figura 10. Aislamiento de Microcystis sp. y escalammiento del cultivo. .......................................................... 31
Figura 11. Cultivo de las cepas de referencia provenientes de la colección UTEX. .......................................... 31
Figura 12. Esquema para la obtención del extracto crudo celular. .................................................................. 32
Figura 13. Prueba de consumo con Daphnia magna. ...................................................................................... 34
Figura 14. Amplificación de la región mcyA-Cd ................................................................................................ 43
Figura 15.Resultado de la PCR múltiple de material de colecta. ...................................................................... 44
Figura 16. PCR Múltiple de aislados de Microcystis sp.. ................................................................................... 44
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Resumen.
Las cianobacterias pueden seguir diversas estrategias que les permiten explotar los recursos de los
cuerpos de agua hasta convertirse en el grupo dominante del fitoplancton. En ambientes
eutróficos pueden generar florecimientos, los cuales se caracterizan por el incremento rápido en
la concentración de la biomasa. Este aumento excesivo de materia orgánica tiene diferentes
consecuencias para los cuerpos de agua, que van desde lo estético, cambios en las propiedades
organolépticas del agua, depleción de la concentración de oxígeno disuelto e incluso la liberación
de metabolitos tóxicos, comúnmente llamados cianotoxinas.
Entre las cianotoxinas más estudiadas a la fecha se encuentran la microcistinas, de las cuales se
tiene poca información para los lagos de México, y aún menos para los lagos urbanos de la Ciudad
de México. Es así que se seleccionaron algunos lagos donde se llevan a cabo actividades
deportivas, recreativas y de esparcimiento, además de que algunos sirven como refugio para aves
migratorias, como en la Alameda Oriente.
Con el material de colecta se realizaron ensayos de toxicidad aguda con el organismo de referencia
Daphnia magna, primero en el agua, con la cual no se encontró mortalidad de los organismos
expuestos, posteriormente con extractos crudos acuosos de la biomasa principalmente constituida
por Microcystis, con los cuales se observó mortalidad en los neonatos de D. magna,
permitiéndonos calcular la CL50.
A partir de la biomasa colectada se obtuvieron aislados clonales de Microcystis sp., con los cuales
se realizaron bioensayos de toxicidad aguda, para calcular la CL50. Con el extracto crudo de algunos
aislados se produjo mortalidad en los cladóceros y con otros no, con los que si produjeron se
estimó la CL50 entre 170-330 mg de biomasa seca/L.
Para determinar si la mortalidad observada era debida a microcistinas se hizo la caracterización de
los aislados mediante la amplificación de tres regiones génicas diferentes, un fragmento del
operón de la ficocianina, una región del gen 16 S rRNA, específica para el género Microcystis, y un
fragmento del gen mcyA. Los aislados en los que se encontraron los tres amplificados son
potencialmente productores de microcistinas, sin embargo, era necesario un método analítico que
permitiera saber sí estos genes se expresan en las condiciones de cultivo o no. Para ello se
analizaron los extractos crudos acuosos mediante una prueba de ELISA, determinando su
concentración en ppb. En general todos los aislados producen microcistinas, pero no en la misma
proporción, lo cual pudiera explicar en cierta medida las diferencias observadas en la mortalidad,
aunque no se descarta la interacción de otras moléculas que pueden afectar a los organismos de
prueba.
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Introducción.
En el presente trabajo se abordarán diversos aspectos con respecto a las cianobacterias, cuyos
florecimientos son consecuencia de la contaminación de los cuerpos de agua, lo cual trae consigo
diversos efectos que van desde lo estético hasta afectar a los ecosistemas acuáticos e incluso
convertirse en un problema de salud pública por la liberación al medio de diversos metabolitos.
Estos últimos se han estudiado en fechas recientes para conocer tanto su estructura química y sus
posibles interacciones con los organismos que coexisten con las cianobacterias. Dadas estas
circunstancias se hace una breve descripción de los microorganismos estudiados, la producción de
cianotoxinas y sus efectos en cladóceros.
Cianobacterias.
Inicialmente fueron nombradas algas verde-azules, debido a que tienen la capacidad de realizar
fotosíntesis oxigénica. Para ello cuentan en su fotosistema con el pigmento clorofila a, además de
pigmentos accesorios como las ficobiliproteínas, de las cuales deben su nombre inicial a la
ficocianina, de color azul (cyano-κυανο). Actualmente, son clasificadas dentro del Reino Monera,
pues comparten características comunes con las demás procariontes, como la ausencia de núcleo
y demás organelos membranosos, poseen pared celular de peptidoglicana parecida a la de las
bacterias gram negativas y contiene ribosomas 70 S en vez de 80 S, como los de los eucariontes
(Bryant, 1994). Sin embargo, comparte con los organismos del reino vegetal la capacidad
fotosintética (Whitton y Potts, 2000).
Los pigmentos fotosintéticos de las cianobacterias están localizados en la zona tilacoidal de la
membrana citoplásmica. Generalmente, el color verde de la clorofila-a es enmascarado por la
carotenoides y pigmentos accesorios como la ficocianina, aloficocianina y ficoeritrina, los cuales se
encuentran almacenados en los ficobilisomas, que se encuentran organizados en filas en la
superficie externa de la zona tilacoidal (Douglas, 1994).
Las cianobacterias cuentan con los fotosistemas I y II, además de tener la capacidad de sintetizar
pigmentos accesorios para captar la luz de manera más eficiente, pues pueden sintetizarlos de
acuerdo a la calidad de luz a la que estén expuestas (Mur et al., 1999).
Estos procariontes tienen una gran capacidad para almacenar nutrientes y metabolitos en
inclusiones del citoplasma. Además de estas inclusiones, algunas especies pueden poseer vesículas
de gas, que les proporcionan ventaja en un determinado cuerpo de agua, pues con ellas pueden
regular la profundidad o ubicación vertical a la cual es favorable su desarrollo dentro de la
columna de agua (Walsby, 1987).
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Diversidad morfológica.
Las cianobacterias pueden ser unicelulares, coloniales o filamentosas. Las formas unicelulares,
como el caso de los Chroococcales, poseen formas esféricas, ovoides o cilíndricas. Las células
pueden arreglarse en colonias irregulares, quedando unidas gracias a la matriz secretada durante
su crecimiento. La morfología filamentosa es el resultado de múltiples divisiones celulares en un
solo plano en ángulo recto al eje principal del filamento. La estructura celular consistente de una
cadena de células es llamada tricoma, cuyas células vegetativas pueden diferenciarse en
heterocistos y aquinetos.
La reproducción de las cianobacterias es de tipo asexual. Los organismos filamentosos pueden
reproducirse por fragmentación del tricoma o por la formación de hormogonios.
Taxonomía.
La taxonomía de este grupo es muy compleja e incluso resulta difícil para aquellos que no somos
especialistas en el tema. Por ello es de suma importancia contar con claves taxonómicas claras,
sencillas y completas que permitan la identificación de las especies de cianobacterias. Sin
embargo, aun no se cuenta con ellas, aunque en la actualidad se siguen las claves de Rippka
(1988b) y Komárek (1988), que son las más aceptadas, aunque los especialistas no han llegado a
un acuerdo sobre cuales son las más adecuadas. Hoy en día, muchos de los trabajos taxonómicos
refieren solo las características morfológicas de los organismos encontrados en un determinado
sitio de colecta, sin tomar en cuenta su fisiología, genética, los posibles estadios de desarrollo y el
efecto de los factores ambientales (Whitton y Potts, 2000).
Actualmente se cuenta con un sistema de clasificación que distingue 5 órdenes: los Chroococcales
y Pleurocapsales, que comprenden a los organimos no filamentosos, mientras que en los otros
tres, Oscillatoriales, Nostocales y Stigonematales, se incluyen a las especies filamentosas. Hasta
aquí no existe mucho problema para ubicar a las cianobacterias, pero se complica en gran medida
a manera que se va descendiendo en los taxa. Para la distinción de género y especie se
encuentran, entre los más citados, los trabajos de Komárek (1988) y Rippka (1979), quien incluye
características de cultivos axénicos.
Recurso Hídrico y eutrofización. La mayor cantidad de agua dulce disponible (excluyendo la de los polos, nieve y glaciares, se
encuentra en mantos freáticos. En algunos lugares del mundo puede obtenerse de una calidad tal
que puede ser consumida directamente por el ser humano, sin embargo, en algunas latitudes es
posible que este recurso no sea de la misma calidad o incluso resulte insuficiente para cubrir la
demanda. Es así que las aguas epicontinentales se convierten en un recurso muy importante para
la obtención de agua para consumo (Bartram et al., 1999)
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La composición de las aguas dulces depende de diversos factores ambientales, entre los cuales
puede citarse la geología, topografía, el clima y factores biológicos. Muchos de ellos pueden variar
en diferentes escalas de tiempo, en ciclos circadianos, estacionales o incluso de mayor duración.
La eutrofización es el aumento de los procesos naturales de productividad primaria en ríos, lagos y
reservorios, generalmente ocasionados por el incremento de las concentraciones de nutrientes
minerales tales como el fósforo y el nitrógeno, que son aprovechados por organismos
fotosintéticos, desde cianobacterias hasta macrofitas. De estos dos nutrientes minerales, el más
importante es el fósforo, que en numerosas ocasiones es considerado como el nutriente limitante
para el incremento de la biomasa de productores primarios en ambientes dulceacuícolas. Esto
implica que la biomasa de los productores primarios puede aumentar en gran medida, un
fenómeno conocido como florecimiento (del inglés bloom). La excesiva cantidad de biomasa está
ligada a diversas consecuencias ambientales puesto que puede cambiar las propiedades
organolépticas del agua, modificar sus propiedades fisicoquímicas, reducir la concentración de
oxígeno disuelto al ser empleado durante la descomposición de la materia orgánica e incluso
puede estar asociado con la liberación de metabolitos tóxicos al agua.
En algunos casos la eutrofización se da de manera natural, pero en muchos de los sitios donde
esto ocurre en la actualidad se da por fenómenos antropogénicos, ya sea por aportes de aguas
residuales municipales o de los campos de cultivo donde los fertilizantes son lavados por
escorrentía.
El proceso de eutrofización es un problema de contaminación en muchos lagos y reservorios en
casi todas las latitudes, encontrándose informes de florecimientos de cianobacterias en diferentes
países del orbe.
Existen diferencias importantes en el crecimiento de algas y cianobacterias entre zonas templadas
y tropicales. En las primeras la variación estacional, tanto en temperatura como la duración del
fotoperiodo, es mucho más marcada que en las zonas tropicales, cuyos cambios a veces son casi
imperceptibles, propiciando que durante casi todo el año sea posible hallar cianobacterias, sin
poder ser desplazadas por otros miembros del fitoplancton. La presencia de cianobacterias
durante todo el año conduce a diversos problemas, pues al incrementarse su biomasa pueden
ocasionar problemas que van desde el punto de vista estético hasta el de salud pública, sin olvidar
que el ecosistema acuático puede verse afectado (Bartram et al., 1999).
Factores que afectan la formación de florecimientos.
Debido a que algunas cianobacterias muestran características ecológicas y ecofisiológicas
similares, pueden ser agrupadas por su comportamiento en ecosistemas planctónicos como
ecoestrategias, cuyo entendimiento puede ser de gran ayuda cuando se pretende llevar a cabo
acciones preventivas en cuerpos de agua (Mur et al., 1999).
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Intensidad de la luz.
Al igual que las algas, las cianobacterias requieren de la energía luminosa para realizar la
fotosíntesis. Sin embargo, las cianobacterias tienen la capacidad de sintetizar diversos pigmentos
accesorios que les permiten capturar la luz de manera muy eficiente, captando longitudes de onda
de 500 hasta 600 nm, que difícilmente son empleadas por otros organismos del fitoplancton,
incluso pueden vivir en ambientes con solo luz verde. Es de esta manera que las cianobacterias
pueden crecer a la “sombra” de otro fitoplancton (Mur et al., 1978).
Vesículas de gas.
Estas estructuras están presentes en muchas cianobacterias planctónicas, las cuales les permiten
migrar y posicionarse verticalmente en la columna de agua. La formación de las vesículas de ha
visto asociado con el proceso cíclico en algunos géneros de cianobacterias, en las cuales mediante
la fotosíntesis generan carbohidratos, que al ser almacenados dentro de las células funcionan
como lastre para descender en la columna de agua. En cuanto el proceso de fermentación de
vuelve más importante que la fotosíntesis, las cianobacterias utilizan dichos carbohidratos
generando así gases (producto de la fermentación) que quedan en estas vesículas, las cuales
tienen un densidad aproximadamente diez veces menor que la del agua, y cuando existen muchas
de ellas en el citoplasma, las células de las cianobacterias pueden una densidad igual o menor a la
del agua (Walsby, 1987).
Tasa de crecimiento.
De acuerdo con Reynolds (1987), la tasa de crecimiento de las cianobacterias es mucho menor que
la de microalgas. A 20° C y saturación luminosa, la mayoría de las cianobacterias alcanzan tasas de
crecimiento de 0.3-1.4 duplicaciones por día, mientras que las diatomeas pueden estar entre 0.8-
1.9 y las microalgas de 1.3-2.3 duplicaciones por día. Debido a la baja tasa de crecimiento que
presentan las cianobacterias, requieren de tiempos de retención del agua prolongados para
permitir así los florecimientos.
Fósforo y nitrógeno.
Originalmente se creyó que las cianobacterias dependían del nitrógeno y fósforo en altas
concentraciones, sin embargo, se ha visto que pueden crecer incluso cuando estos dos elementos
están en condiciones limitantes. Además, las cianobacterias tienen la capacidad de almacenar
fósforo, lo cual les permite hasta 4 divisiones celulares, lo cual corresponde a un incremento
sustancial en biomasa (32 veces). En algunos casos, si se considera al fósforo total en vez del
soluble, altas concentraciones de éste pueden favorecer de manera indirecta a la cianobacterias,
pues con el crecimiento de otros organismos fitoplanctónicos puede generarse un efecto de
sombreado por aumento de lo turbidez del agua, lo cual favorece el desarrollo de cianobacterias al
ser los organismos que requieren menos luz (Mur et al., 1999; Downing et. al., 2005).
Estabilidad poblacional.
Las cianobacterias son organismos no fácilmente consumidos por el zooplancton, y el impacto de
algunos ciliados y protozoarios rizópodos no es sustancial. También pueden ser atacadas por
cianófagos, bacterias y actinomicetos, pero la importancia de estos enemigos naturales para abatir
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la población no ha sido esclarecida. Al tener pocos enemigos naturales, además de que su
capacidad para flotar, se reduce la pérdida por sedimentación, por lo que la tasa de pérdida de las
poblaciones de cianobacterias es generalmente baja. Por ello, la baja tasa de crecimiento de las
cianobacterias se ve compensada con la alta prevalencia de sus poblaciones una vez que se han
establecido (Chorus y Bartram, 1999).
Temperatura.
Las tasas máximas de crecimiento de cianobacterias se registran alrededor de los 25° C. La
temperatura óptima para el crecimiento de las cianobacterias es mayor que la necesaria para el
desarrollo de algas verdes y diatomeas, lo cual explicaría porque en cuerpos de agua templados y
boreales se dan los florecimientos de cianobacterias principalmente durante el verano (Robarts y
Zohary, 1987).
Ecoestrategias de las cianobacterias.
Estas hacen referencia a la fisiología de las cianobacterias que ocasionan los florecimientos, pues
cada una tiene respuestas diferentes a los estímulos del medio, lo que las lleva a seguir un
comportamiento diferente, pero igualmente efectivo para la colonización de un ambiente
acuático. Entre ellas, podemos destacar a las siguientes estrategias:
Formación de scums.
Un número de cianobacterias desarrollan agregados (colonias) de células cocoides o filamentos
que no son distribuidos homogéneamente en la columna de agua. Entre los géneros importantes
que siguen esta estrategia se encuentran Microcystis, Anabaena y Aphanizomenon. En la
superficie del agua, donde la fotosíntesis de las células vegetativas permite el almacenamiento de
carbohidratos, las células van cambiando su densidad conforme aumenta la cantidad de material
acumulado, lo que les lleva a descender en la columna de agua, incluso llegando hasta el fondo.
Una vez que no reciben luz pueden hacer uso del material de reserva almacenado, ya sea por
respiración o fermentación. Es en el fondo donde ocurre el proceso inverso, ahora las células han
perdido los nutrientes almacenados y nuevamente tienen la capacidad de formar vesículas de gas
que les permitirán flotar hacia la zona fótica. El término scum hace referencia a esta capacidad que
tienen algunos géneros de cianobacterias para flotar y posicionarse en la parte más alta de la
columna de agua, formando una especie de “nata”, una capa densa de biomasa, la cual impide el
paso de luz hacia zonas más profundas (Utkilen et al., 1985).
En zonas templadas, dado que la temperatura baja durante el otoño, la fotosíntesis llega a ser más
rápida que la respiración, y el “lastre” de carbohidratos no es consumido. Entonces las colonias de
cianobacterias se hunden hacia el fondo donde pueden sobrevivir a las bajas temperaturas del
invierno. Las células que vuelven a emerger en la primavera lo hacen como colonias muy
pequeñas. Durante este periodo no es sencillo identificar a Microcystis spp., y solo llega a ser
evidente cuando las colonias aumentan de tamaño a los inicios del verano.
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Muchas cianobacterias no pueden sobrevivir a intensidades luminosas elevadas durante largos
periodos. Esto limita su distribución a ecosistemas más turbios y eutróficos. Sin embargo, las
especies de Microcystis son menos sensibles a dichas intensidades luminosas debido a la
capacidad de flotación que tienen, la cual les permite migrar verticalmente en la columna de agua
hasta hallar la intensidad luminosa favorable para su crecimiento. Esto significa que la presencia
de este género no está relacionada solo al nivel de eutrofización del medio, por lo que puede
encontrarse en aguas mesotróficas, eutróficas e hipertróficas, pero la cantidad de biomasa estará
relacionada con la cantidad de nutrientes disponibles. Muchos de los florecimientos de Microcystis
son encontrados en lagos con una concentración promedio de clorofila a de 20-50 µg L-1 y una
transparencia de Secchi de 1-2 m durante el verano (Mur et al., 1999).
Dispersión homogénea.
Esta comprende a especies como Planktothrix agardii y Limnothrix redeki, que son muy sensibles a
intensidades luminosas elevadas y no forman colonias. Debido a que sus filamentos son
relativamente pequeños, su capacidad de flotar se ve superada por el arrastre pasivo generado
por la circulación del agua. Por lo tanto, estas especies están homogéneamente dispersas en todo
el epilimnion. Los filamentos no pueden ser consumidos fácilmente por el zooplancton y no
sedimentan. Los florecimientos de este tipo de cianobacterias permiten prácticamente un
monocultivo virtual que puede prevalecer por mucho tiempo, incluso sin variación estacional. El
mecanismo por el cual sacan ventaja estas cianobacterias es aumentando la turbidez del agua, lo
cual impide el crecimiento de otros grupos del fitoplancton (Mur et al., 1999).
Estratificación.
En los cuerpos de agua donde se forma la termoclina pueden diferenciarse estratos, uno de ellos,
el metalimnion, donde organismos con el pigmento rojo ficoeritrina pueden establecerse,
absorbiendo la luz verde, que es la única longitud de onda presente a esa profundidad. La más
común es Planktothrix rubescens, pero otras especies de este mismo género también pueden
generar altas densidades de biomasa metalimnética. Los filamentos de este tipo de cianobacterias
difícilmente pueden presentar migración vertical, pero a finales del otoño, cuando está
terminando la temporada de crecimiento, las células pueden llegar a flotar, formando de esta
manera espumas de color rojo (Walsby et al., 1983).
Fijación de nitrógeno.
Algunos géneros tienen la capacidad para fijar nitrógeno atmosférico, como Anabaena,
Aphanizomenon, Cylindrospermopsis, Nodularia y Nostoc. Por este hecho podría pensarse que los
florecimientos de estas especies se dan solo en condiciones limitantes de nitrógeno, pero lo que
realmente regula la cantidad de biomasa de estos géneros es la cantidad de luz, ya que las
fijadoras de nitrógeno requieren de grandes cantidades de energía para realizar esta tarea (Smith,
1990).
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Cianobacterias bentónicas.
Además de las estrategias seguidas por las cianobacterias en la columna de agua, es posible
encontrarles adheridas a las superficies de los sedimentos, donde crecerán siempre y cuando el
agua sea lo suficientemente transparente para dejar penetrar una gran cantidad de luz. Este tipo
de cianobacterias también son importantes, pues la biomasa generada puede desprenderse del
fondo y llegar a la superficie, donde pueden ser ingeridas por animales o incluso, las toxinas que
producen podrían ser liberadas al medio y ocasionar diferentes problemas, algo que no se
esperaría en sistemas acuáticos oligotróficos (Gunn et al., 1992).
Metabolitos secundarios: Cianotoxinas.
La definición clásica de toxina menciona que son productos o componentes microbianos que
pueden causar daño celular a otros organismos en bajas concentraciones (Prescott et al., 2002),
pero cuando se extiende este término para incluir productos de plantas y animales, solo una parte
de ella aplica para las cianobacterias. Sin duda, las cianobacterias sintetizan compuestos con gran
potencial tóxico, como es el caso de las microcistinas, saxitoxinas y anatoxina-a, que puede afectar
a organismos vertebrados en dosis muy bajas (microgramos por kg de peso corporal) (Charmichel,
1997; Codd et al., 1999; Kuiper-Goodman et al., 1999), estos compuestos son definidos
correctamente como toxinas, a las cuales de manera general se les conoce como cianotoxinas.
(Codd et al., 2005).
Las cianotoxinas son un grupo muy diverso desde el punto de vista químico y toxicológico. Muchas
de las que han sido identificadas parecen ser más tóxicas para mamíferos terrestres que para los
organismos acuáticos. Las cianobacterias producen una variedad de metabolitos inusuales,
incluidas las cianotoxinas, cuya función natural es aún desconocida (Sivonen y Jones, 1999).
Los mecanismos de toxicidad producida por las cianotoxinas son muy diversos, con efectos
hepatotóxicos, neurotóxicos, dermatotóxicos e incluso la inhibición de la síntesis de proteínas.
Muchos de estos fueron descritos inicialmente en mamíferos, dado que los problemas de
contaminación generalmente son evaluados desde el punto de vista de salud pública, y por ello se
buscaron modelos animales que permitieran extrapolar los resultados hacia el ser humano. Para
evaluar los riesgos específicos de estas toxinas es necesario conocer su estructura química y sus
propiedades físicas, su ocurrencia en cuerpos de agua usados por la gente, la regulación de su
biosíntesis, y su curso en el ambiente.
Las cianotoxinas pueden ser clasificadas en tres grandes grupos, de acuerdo a su estructura
química: péptidos cíclicos, alcaloides y lipopolisacáridos, pero también pueden ser clasificadas de
acuerdo al tipo de daño que provocan (Cuadro 1) (Codd et al., 2005).
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Cuadro 1. Clasificación de las cianotoxinas de acuerdo a su efecto tóxico.
Toxina Número de variantes Estructura y Actividad Géneros registrados
Hepatotoxinas
Microcistinas 71 Heptapéptido cíclico, hepatotóxica, inhibición de la Proteínfosfatasa promotor de tumores
Microcystis, Anabaena, Nostoc Anabaenopsis, Planktothrix
,
Nodularinas 9 Pentapéptido cíclico, hepatotóxica; inhibición de la Proteínfosfatasa, promotor de tumores.
Oscillatoria, Hapalosiphon Nodularia, Theonella
Cilindrospermopsinas 3
Guanidin-alcaloides, inhibición de la Proteínfosfatasa, promotor de tumores, Inhidor de síntesis proteica, genotóxico.
Cylindrospermopsis, Anabaena, Aphanizomenon, Umezakia, Raphidiopsis
Neurotoxinas
Anatoxina-a incluyendo homoanatoxina-a
5 Alcaloides; postsináptico, Bloqueador de la despolarización neuromuscular
Anabaena, Oscillatoria, Phormidium, Aphanizomenon, Rhaphidiopsis
Anatoxina-a (s) 1 Éster de Guanidin metil fosfato; Inhibe la acetilcolinesterasa
Anabaena
Saxitoxinas 20 Alcaloides de Carbamato, bloqueadores de los canales de calcio
Aphanizomenon, Anabaena, Lyngbya, Planktothrix, Cylindrospermopsis
Dermatotoxinas y Citotoxinas
Lynbyatoxina 1 Alcaloides; agentes inflamatorios, Activadores de la protein cinasa C
Lynbya, Shizothrix, Oscillatoria
Aplisiatoxina 2 Alcaloides; agentes inflamatorios, Activadores de la protein cinasa C
Lyngbya, Schizothrix Oscillatoria
Endotoxinas
LPS varios LPS; agentes inflamatorios ¿Todas?
Tomada y modificada de Codd et al., 2005
Hepatotoxinas.
Microcistinas.
Estas son conocidas por ser producidas por varios géneros de cianobacterias incluyendo a
Microcystis, Anabaena, Planktothrix, Anabaenopsis, Nostoc y Hapalosiphon (Charmichael, 1992).
La biosíntesis y la liberación de ellas al medio han sido estudiadas bajo diversas condiciones de
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cultivo, encontrándose que puede incrementarse su producción mediante iluminación intensa y
luz roja, que puede tener implicaciones para la toxicidad de los florecimientos de cianobacterias
en los ecosistemas acuáticos (Kaebernick et al., 2001). Las microcistinas son heptapéptidos cíclicos
que consisten de 7 aminoácidos (Fig. 1), incluyendo varios D-aminoácidos y dos aminoácidos
inusuales, el N-metildehidroalanina (Mdha) y el b-amioácido hidrofóbico, ácido 3-amino-9-metoxi-
2-6,8-trimetil-10-fenildeca-4,6-dienoico (Adda) (Wiegand y Pflugmacher, 2005).
Figura 1. Estructura de la microcistina LR. Tomada y modificada de Wiegand y Plugmacher 2005.
Actualmente se conocen más de 70 variedades de microcistinas, las cuales difieren principalmente
en los L-aminoácidos, con alteraciones en las cadenas laterales, por ejemplo, entre el hidrógeno o
grupos metilo (Cuadro 2 ) (Ramírez et al., 2004).
Las microcistinas han sido identificadas en géneros como Anabaena, Microcystis, Planktothrix,
Nostoc y Anabaenopsis en ambientes acuáticos, mientras que en los ambientes terrestres ha sido
posible encontrarles en Hapalosiphon (Sivonen y Jones, 1999).
13
Cuadro 2. Variación estructural de las microcistinas y su peso molecular.
Tomado y modificado de Ramírez et al. 2004.
Propiedades fisicoquímicas de las microcistinas.
En ambientes naturales, la carga eléctrica de las microcistinas tiende a ser neutra o aniónica. Esto
es gracias a los grupos ionizables que posee, como los ácidos carboxílicos, que le permiten tener
diferente carga conforme varía el pH del agua, confiriéndole una gran solubilidad en este solvente.
La solubilidad de la microcistina-LR es mayor de 1g L-1. Debido a su hidrofilicidad y sus funciones
14
polares, las microcistinas permanecen en la fase acuosa más que estar adsorbidas en sedimentos o
en material particulado suspendido (Rivasseau et al., 1998).
Se sabe que las microcistinas son compuestos relativamente estables y persistentes en los cuerpos
de agua, posiblemente como resultado de su estructura cíclica. Se ha demostrado que la
microcistina-LR puede permanecer hasta por 21 días en solución. Otros datos refieren un periodo
de al menos 5 días para la reducción en un 50% de la concentración de estas cianotoxinas. (Jones
et al., 1994).
La biodegradación y la fotólisis pueden de manera natural disminuir la concentración de
microcistinas. La reducción en su concentración puede variar considerablemente por los cambios
en la temperatura del agua así como en tamaño de la población microbiana (Kenefick et al., 1993;
Tsuji et al., 1994; y Cousins et al., 1996). A la fecha se han descrito varias cepas de
microorganismos como Pseudomonas y Sphingomonas que tienen la capacidad de degradar las
microcistinas, aunque no se ha esclarecido el rol de estas cianotoxinas con dichas bacterias.
Las microcistinas son muy estables y resistentes a la hidrólisis enzimática. Se ha estudiado la vida
media de las microcistinas, la cual es alrededor de tres semanas en una solución a pH 1 y 40° C.
Para degradarlas completamente se requiere un tratamiento a reflujo con ácido 6N-hidroxiclórico
y ácido trifluroacético (Cousins et al., 1996). También se sabe que no se descomponen por
ebullición prolongada e incluso pueden permanecer varios años cuando se almacenan a
temperatura ambiente después del secado.
Existen diferentes métodos para la completa degradación de estas cianotoxinas, las cuales no
pueden ser degradadas por procesos de oxidación convencionales. Para ello se requiere el uso de
permanganato de potasio u ozono, pues son resistentes a la cloración que se emplea en el proceso
de potabilización del agua (Hoeger et al., 2002).
Efecto tóxico de las microcistinas.
El mecanismo de toxicidad descrito primeramente para estas toxinas fue la inhibición de las
proteinfosfatasas 1 y 2A (PP1 y PP2A) (Goldberg et al., 1995). El residuo de cisteína 273 de la
subunidad catalítica de la PP1 se une covalentemente al grupo carbonilo del Mdha de la
microcistina, pero no es un requisito para la inhibición. Es la introducción del Adda en la parte
hidrofóbica del sitio catalítico de la enzima lo que la vuelve inactiva.
Se han probado fosfatasas de diferentes organismos, encontrando que no difieren mucho en la
concentración inhibitoria media (CL50), teniendo valores entre 0.1-0.25 nM. Para ello se incluyeron
enzimas de mamíferos, bivalvos, zooplancton y algunas especies de plantas (DeMott y Dhawale,
1995; MacKintosh et al., 1990). También se ensayaron las proteinfosfatasas de uno de los géneros
productores de microcistinas, Microcystis; las cuales mostraron menos de 20 % de identidad
15
respecto al mismo tipo de enzimas de otros organismos. Estas diferencias podrían ser la clave del
por qué las proteinfosfatasas de las cianobacterias no son sensibles a la actividad inhibitoria del
ácido okadaico y las microcistinas (Shi y Carmichael, 1997).
La subunidad β de la ATP sintasa ha sido identificada como un blanco más para la unión con la
microcistina-LR, lo cual puede causar una señalización apoptótica mitocondrial a altas
concentraciones de MC-LR (Mikhailov et al., 2003).
Las microcistinas también pueden generar especies reactivas de oxígeno (ERO´s) y por ello ser un
factor más para producir estrés oxidativo. En algunos estudios con peces se ha evaluado el
aumento o disminución de enzimas como la catalasa, superoxidismutasa, glutatión peroxidasa,
entre otras, como mecanismos de prevención del estrés oxidativo. De dichos estudios puede
concluirse que las microcistinas tienen la capacidad para modificar las concentraciones tisulares de
dichas enzimas (Prieto et al., 2006).
Para la detoxificación de las microcistinas es necesario que se conjugue con el glutatión, sin
importar que tipo de organismo se trate, este es un paso muy importante para eliminar la toxina a
la que se está expuesto, tal cual se ha demostrado en peces zebra, dáfnidos, moluscos y
macrofitas acuáticas por Pflugmacher et al. (1998).
En pruebas de consumo realizadas con Daphnia galeata, se emplearon tanto una cepa toxigénica
como su mutante (deficiente en los genes para la biosíntesis de las microcistinas). Ambas cepas
fueron consumidas en la misma proporción, indicando que los cladóceros no tiene la capacidad de
distinguir entre estas dos cepas. Sin embargo, los efectos letales fueron solo observados en el
genotipo silvestre, y no se observaron en la mutante de laboratorio. Por lo tanto, los efectos
tóxicos se debieron principalmente al consumo de microcistinas, cuyo carácter intracelular
complica la diferenciación del efecto tóxico de estas con respecto a otros compuestos que pueden
estar presentes en las mismas cepas, como las microviridinas (inhibidores de proteasas) (Dittman
et al., 1997; Rohrlack et al., 2003).
Impacto en la biota acuática.
La intoxicación de los animales con cianotoxinas puede ocurrir por varias vías como el consumo de
las células de cianobacterias del agua o la exposición a agua contaminada con microcistinas, y por
otra parte, a través del consumo de animales que se hayan alimentado con cianobacterias y
bioacumulado cianotoxinas. Como es sabido, estas toxinas pueden bioacumularse en vertebrados
e invertebrados acuáticos.
Es complicado atribuir la muerte de peces a cianotoxinas, pues el colapso de los florecimientos
provoca el abatimiento de la concentración de oxígeno disuelto, y la mortalidad en peces puede
ser debida a condiciones de anoxia y no precisamente a una intoxicación. Por ello, la mejor
evidencia para la evaluación del potencial tóxico de las cianobacterias proviene de ensayos de
16
laboratorio con organismos acuáticos, donde las variables son controladas, exponiéndolos a la
biomasa de cianobacterias o a las toxinas libres de células.
El efecto de las microcistinas sobre bacterias acuáticas no está del todo claro, ya que existen
informes de que no tiene efecto bactericida sobre Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus,
Escherichia coli o Pseudomonas hydrophila. Sin embargo, estos bioensayos no deben tomarse
como indicadores generales del efecto de las microcistinas sobre las bacterias. Es probable que las
cianotoxinas puedan afectar solo a algunas especies de microorganismos acuáticos y no a otros.
Incluso, es posible que algunas toxinas funcionen como infoquímicos para el establecimiento de
algún tipo de simbiosis, en los que se presume que las bacterias pueden proveer algún tipo de
factor de crecimiento a las cianobacterias y estas a su vez, aportarles materia orgánica para su
crecimiento (Sivonen y Jones, 1999).
Es aparente que las cianobacterias tiene un efecto adverso sobre los organismos del zooplancton,
pero su efecto es variable dependiendo del género y especie, incluso entre clonas de la misa
especie del zooplancton. Una cuestión importante por resolver es si el efecto observado se debe a
los bajos valores nutricionales de las cianobacterias, a una toxina en particular, a un compuesto no
identificado o a la interacción de algunos o todos estos factores. Existe una notable diferencia en
el diseño de los ensayos, con organismos expuestos a las cianotoxinas disueltas en agua o
alimentadas con cianobacterias toxigénicas. La segunda puede conducir a una mayor dosis de
exposición. Además, Jungmann y Benndorf (1994) reportaron que la exposición de Daphnia a
microcistinas disueltas mostró efectos solo en concentraciones más altas que las encontradas de
manera natural en muestras de campo. Dicho efecto puede ser resultado de la purificación de las
microcistinas, pues se ha visto que su toxicidad aumenta en cuanto están unidas a alguna proteína
que funciona como acarreador, que en este caso podrían ser las ficobilinas.
Hietala et al. (1997) observaron una variación en la susceptibilidad de más de tres órdenes de
magnitud en la toxicidad aguda de Microcystis aeruginosa a 10 clonas de Daphnia pulex. También
se ha sugerido que estas diferencias en susceptibilidad pueden deberse a la presión de selección
en ambientes naturales a favor de cepas o especies resistentes en los cuerpos de agua donde
florecimientos de cianobacterias tóxicas ocurren con frecuencia.
Los efectos en peces parecen ser muy semejantes en comparación con los datos histopatológicos
de ratones intoxicados por vía intraperitoneal. En los diferentes casos de estudio se encontró daño
en branquias, tracto gastrointestinal, hígado, riñones, corazón y bazo. Es cuestionable el efecto de
las cianotoxinas sobre los peces en ambientes naturales, ya que el daño en las branquias podría
deberse al alto pH resultado del consumo de CO2 por la fotosíntesis de las cianobacterias y al
incremento en la concentración de amonio, resultado de la degradación bacteriana de las
cianobacterias, además de la baja de oxígeno que esto produce, aunado al efecto que los
metabolitos de las cianobacterias pueden tener sobre ellas (Sivonen y Jones, 1999).
17
Aspectos moleculares de las microcistinas.
La estructura cíclica de las microcistinas, la ocurrencia de fracciones modificadas en algunos
residuos de aminoácidos y los enlaces poco comunes en el péptido, sugieren que estas toxinas son
sintetizadas por una vía no ribosomal. Mediante estudios metabólicos se logró establecer que las
microcistinas son sintetizadas a partir de L-metionina, L-fenilalanina, L-glutamato, acetato y
piruvato (Moore et al., 1991).
Las vías biosintéticas no ribosomales (NRPS; non ribosomal pathway synthesis) han sido descritas
en procariotes y también en algunos eucariotes inferiores. Estas catalizan la formación de péptidos
por un mecanismo de tiolación. Arment y Carmichael (1996) detectaron esta misma actividad en
extractos de Microcystis.
Los NPRS forman complejos multienzimáticos que varían entre 100 a 1700 KDa, los cuales se
encuentran estructurados por módulos, en los que cada uno puede tener la función de activación,
tiolación, modificación y / o condensación de un aminoácido específico, que funciona como
sustrato. Generalmente, el orden que presentan los módulos corresponde a la secuencia de
aminoácidos del péptido (Dittman y Börner, 2005). La activación del aminoácido precursor es
catalizada por los dominios de adenilación, los cuales comparten 10 secuencias de patrón repetido
(motif) que pueden ser usadas para diseñar iniciadores degenerados para la detección de los
genes de las NRPS en una gran variedad de organismos (Turgay y Marahiel, 1994).
Meissner et al. (1996) siguieron esta estrategia para la búsqueda de NRPS en Microcystis, estudio
que fue el parte aguas para la posterior elucidación de la vía biosintética de las microcistinas y el
reconocimiento del grupo de genes (cluster) asociado a dicha vía (Dittman et al., 1997).
El conjunto de genes para la biosíntesis de microcistinas (mcy) en Microcystis está compuesto de
10 genes que se transcriben bidireccionalmente. (Nishisawa et al., 1999). De las 48 reacciones
secuenciales necesarias para la síntesis de microcistinas, 45 de ellas pueden ser asignadas a los
dominios catalíticos de seis complejos multienzimáticos de sintasas/sintetasas (McyA-E, G) (Fig. 2)
18
Figura 2. Modelo propuestos para la biosíntesis de microcistinas. El complejo multienzimático está compuesto de módulos de péptido sintetasas y poliquetidos sintasas. Los círculos numerados indican el orden de los aminoácidos incorporados en la cadena creciente del péptido por NRPS (genes mcyA, B, C, Ep, Gp).Los genes mcyA y B contienen dos módulos, A1/A2. El primero también codifica para un dominio de N-metiltransferasa. Los rectángulos numerados muestran el orden de la síntesis de poliquetidos en la formación del Adda (mcyGk, Ek, D) (Tomado de Kaebernick et al., 2001)
La enzimas McyA-C son tres NRPS que contienen cinco de los siete módulos necesarios para la
biosíntesis de microcistinas. Por otra parte, las enzimas McyE y G son híbridas, es decir, incluyen
módulos de péptido sintetasas y poliquetido sintasas (PKS). Estas últimas sintasas incorporan
unidades de propionato o acetato a las estructuras de poliquetidos. Los módulos de las sintasas de
poliquetidos de McyG y E, junto con los dos módulos de McyD, son las responsables de síntesis del
Adda de las microcistinas (Dittman y Börner, 2005).
Evolución de los genes de las microcistinas.
De todos los géneros productores de microcistinas (mencionados con anterioridad) se sabe que
hay miembros de ellos que contienen los genes para la biosíntesis de microcistinas, mientras que
hay otros que no los contienen. Esta distribución irregular planteó la hipótesis de que pudiera
19
deberse a la adquisición reciente de estos genes mediante transferencia horizontal entre las
especies (Schwabe et al., 1988).
Mediante análisis parecidos al que se uso para elucidar la vía biosintética de las microcistinas en
Microcystis, se describieron posteriormente los genes mcy en Planktothrix agardii (Christiansen et
al., 2003) y Anabaena cepa 90 (Rouhiainen et al., 2004), además de los genes para la biosíntesis de
nodularina (toxina muy semejante a las microcistinas, en biosíntesis y estructura, con la diferencia
de que contiene solo 5 aminoácidos), denominados genes nda.
La organización de los conjuntos génicos es diferente para cada género, como puede verse en la
figura 3. En Microcystis, Anabaena y Nodularia, los genes se transcriben de manera unidireccional
a partir de una región promotora central, mientras que en Planktothrix, todos los genes excepto
mcyT se transcriben unidireccionalmente a partir del promotor localizado hacia el extremo 5’
(corriente arriba) del gen mcyD. A pesar de que los componentes mutienzimáticos son muy
semejantes, el arreglo de los genes claramente difiere entre Anabaena y Nodularia en un lado, y
Microcystis y Planktothrix por otro. Mootz et al. (2002) afirman que el orden de los genes refiere
un orden congruente con las reacciones enzimáticas individuales en las rutas biosintéticas,
siguiendo una “regla de colinearidad”, en la que el orden de los genes supone el orden en que se
llevan a cabo las reacciones enzimáticas para la síntesis del péptido final. Es así como lo llevan a
cabo los complejos multienzimáticos McyG de Nodularia y Anabaena, cuyo gen codificante es el
primero del operón mcyGDJE. Dichos dominios activan al fenil-acetato como iniciador de la síntesis
de microcistinas, cumpliendo así la regla descrita por este mismo autor. Sin embargo, en
Planktothrix y Microcystis, el operón comienza con mcyD, siendo esto una desviación a la “regla de
colinearidad”. De manera similar, los genes que codifican para un transportador putativo tipo ABC
difieren entre los géneros, excepto en Anabaena y Nodularia, cuya diferencia es la falta de dos
módulos y la subsecuente fusión de mcyA y mcyB. Las diferencias estructurales encontradas no
apoyan la idea de una reciente transferencia horizontal de genes entre los géneros. Un análisis
filogenético de las secuencias de mcyA, D y E y la comparación con la secuencia de genes
constitutivos de la mismas cepas aportan datos para pensar en un antecesor común de los genes
mcy en Anabaena, Microcystis, Nostoc y Planktothrix, así como de los genes nda de Nodularia.
(Dittman y Bôrner, 2005).
20
Figura 3. Conjuntos de genes mcy y nda de diferentes géneros. Tomada y modificada de Dittman y Börner, 2005.
Los genes 16S rRNA, rpoC1 y mcy han sido analizados por separado mediante topologías por
distancia, máxima parsimonia y máxima similitud, concluyendo que los genes mcy y genes
constitutivos han coevolucionado por mucho tiempo y que los genes codificantes para la
sintetasas de las microcistinas estuvieron presentes en el último antecesor común de un gran
número de cianobacterias, además de apoyar la idea de que la capacidad para la producción de
estas cianotoxinas se ha perdido en repetidas ocasiones durante la evolución (Rantala et al.,
2004).
La evolución de los genes mcy es un proceso dinámico y continuo. Las diferencias entre los
arreglos de los conjuntos génicos mcy y la coevolución de las secuencias conservadas de estos
genes y los constitutivos no favorecen la transferencia horizontal entre los géneros y afirma la
aparición temprana de los genes de las microcistinas en la evolución de las cianobacterias. Ha
habido una rápida evolución de algunas regiones de los genes mcy que albergan la información
para la gran variabilidad en la estructura de las microcistinas. Esta evolución ha ocurrido mediante
eventos de mutación y recombinación entre módulos y dominios (Dittman y Börner 2005).
21
Estrategias basadas en DNA para la detección de cianobacterias toxigénicas.
A la fecha se han llevado a cabo numerosos estudios que emplean los genes mcy para discriminar
entre cepas toxigénicas de las no toxigénicas, dado que las técnicas morfológicas y moleculares
clásicas, como el análisis de genes 16S rDNA o el ITS 16S-23S no han sido herramientas útiles para
esta tarea. El creciente conocimiento de los genes para la biosíntesis de microcistinas ha permitido
el desarrollo de iniciadores para técnicas de PCR, con las cuales pueden distinguirse cepas tóxicas
de un género particular productor de estas toxinas e incluso, se han descrito técnicas tan
novedosas como la PCR cuantitativa (Ouahid et al., 2005; Rudi et al., 1998; Rinta-Kanto et al.,
2005).
Hisbergues et al. (2003) diseñaron iniciadores para una detección general de cianobacterias
productoras de microcistinas, seguido por RFLP (Restriction Fragment Length Polimorphysm;
Polimorfismo de los Fragmentos de Restricción) para la asignación de género. Para su diseño se
alinearon las secuencias de los genes mcyA de Microcystis (Nishizawa et al., 2000; Tillet et al.,
2000) y la cepa NIVA-CYA126 perteneciente al género Planktothrix (Christiansen et al., 2003),
encontrándose que poseían una secuencia altamente conservada que codifica para el dominio de
condensación de McyA (mcyA-Cd), la cual fue empleada para la síntesis de los iniciadores mcyA-
Cd1 F y R, los cuales permiten la amplificación específica de este gen en los géneros Microcystis,
Anabaena y Planktothrix (Hisbergues, 2003) (Fig. 4). Sin embargo, el tamaño de los amplicones era
muy similar entre los géneros en estudio. Para poder discriminar en mezclas de cianobacterias a
que género debía atribuirse la toxicidad fue necesario emplear otras técnicas moleculares como la
secuenciación y RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism, polimorfismo de los fragmentos
de restricción) (Cuadro 3).
Cuadro 3. Tamaño esperado de los RFLP de mcyA-Cd de tres cepas de cianobacterias digeridos con las endonucleasas indicadas.
bp HindIII EcoRV HindIII/EcoRV
Anabaena 297 232 232 65 65 Microcystis 191 232 191 100 59 59 41 Planktothrix 261 297 261 36 36
Tomado de Hisbergues et al., 2003.
22
Figura 4. A los diferentes dominios de mcyA y la región conservada amplificada con los iniciadores mcyA-Cd. A, adenilación; NMT, N-metil transferasa, C, condensación; T, tiolación, Ep, epimerasa. B Alineamineto de las secuencias de mcyA-Cd de Planktothrix NIVA-CYA126 (AJ441056), Microcystis aeruginosa PCC7806(AF183408) y M. aeruginosa(AB019578). Las regiones seleccionadas para el diseño de los iniciadores están en negritas y subrayado. Los residuos que son idénticos en las tres secuencias están marcados con un asterisco, y aquellas que solo están en dos fueron sombreadas. Tomada de Hisbergues et al., 2003.
Por lo anterior, los genes mcy son las herramientas más adecuadas para el monitoreo molecular
de cianobacterias toxigénicas. En muchos casos pueden ser auxiliadas por técnicas químicas para
la cuantificación de las toxinas, como la cromatografía de líquidos de alta resolución acoplada a
espectrometría de masas (HPLC-MS) o a espectrometría de tiempo de vuelo de desorción-
ionización láser asistida por matrices (MALDI-TOF, matrix-assisted laser desorption/inozation-time
of flight spectrometry). Sin embargo, solo las técnicas moleculares pueden asignar con claridad
cual de los géneros de cianobacterias de una mezcla es la productora de las microcistinas (Dittman
y Börner, 2005).
23
Enfermedades y mortalidad asociadas a cianotoxinas.
Descripciones ocasionales por viajeros, historiadores y escritores indican que la presencia de
espumas y florecimientos ha sido un hecho tangible durante largo tiempo, como lo sugiere la
descripción del Lago Llangorse, Gales, hecha por Geraldus Cmabrensis en 1118, donde se hace
referencia a la presencia de cianobacterias flotantes: “El lago tiene muchas propiedades
milagrosas, algunas veces se torna de un color verde brillante, y en nuestros días se le ha conocido
por volverse rojo escarlata, no todo, pero como si la sangre estuviera fluyendo a lo largo de ciertas
corrientes y remolinos”. También existe evidencia que sugiere el conocimiento de la toxicidad de
cianobacterias entre nativos de Norteamérica, África y Australia (Codd et al., 2005).
El entendimiento de la verdadera incidencia de los casos de enfermedades y mortalidad continua
siendo restringido por procedimientos inadecuado para el reconocimiento y definición de los
casos clínicos, epidemiología analítica y su notificación. Estas limitaciones han sido reducidas hasta
cierto punto en años recientes, donde los casos han sido estudiados y una investigación de
soporte con base en toxicología de cianotoxinas ha sido desarrollada. Sin embargo, las deficiencias
permanecen en muchas partes del mundo donde es frecuente la exposición de diversas
poblaciones a cianotoxinas (Codd et al., 2005).
Actualmente se cuenta con diversos informes de la incidencia de intoxicaciones tanto en animales
(Chittick et al., 2002; Codd et al., 2003) como en humanos (Cuadro 4) expuestos a células de
cianobacterias o a sus toxinas. Todos estos episodios han aumentado la atención y colaboración
de personal clínico, epidemiólogos, profesionales en salud pública y diversos grupos de
investigación, con el objetivo de formular e implementar acciones que conlleven a la reducción de
riesgos por exposición a cianotoxinas. Sin embargo puede ser una tarea muy complicada dado que
no siempre se identifican los signos y síntomas de intoxicación por cianotoxinas (Codd et al.,
2005).
24
Cuadro 4. Casos humanos de exposición a cianotoxinas.
Año Ubicación (origen
a) Cianobacteria
b Toxina c Problema de salud
d
Agua para consumo 1981 Austalia (ATR) M MC DH
1972-1990 China (AS) M MC CPH, M
1988 Brasil (ATR) M, Ana
G, M
1994 Suecia (ATR, CR) Pl MC G, DM, F, DA
Recreacional/ocupacional
1989 Reino Unido (Ky) M MC G, IG, V, DA, F, CP
1995 Australia (N) M, Ana, Aph, Nod Hepatotoxinas G, STG, F, IO
1996 Reino Unido (B) Pl MC EC, F
Hemodialisis
1974 Estados Unidos (AH) presente LPS F, Mi, Es, V
1996 Brasil (AH) presente MC, Cyn DV, N, V, DH, M
2001 Brasil (AH) Ana, M MC No reportados
A ATR, agua tratada de reservorio; AS, agua superficial; CR, contaminada con agua de río. B, M, Microcystis; Ana, Anabaena; Pl, Planktothrix; Nod, Nodularia. C, Cyn, cilindrospermopsina; MC, microcistina; LPS, lipopolisacárido. D, DH, daño hepático; CPH, Cáncer primario de hígado; M, Muerte; G, gastroenteritis; DM, dolor muscular; F, fiebre; DA, dolor abdominal; IG, irritación de garganta; V, vómito; CP, consolidación pulmonar; STG, síntomas tipo gripa; IO, irritación de ojos y oídos; EC, erupciones cutáneas; Mi, mialgias, Es, escalofríos; DV, distorsión de la visión; N, nausea. Tomado y modificado de Codd et al., 2005.
25
Antecedentes.
Con relación a la presencia de florecimientos de cianobacterias en fuentes de abastecimiento de
agua para consumo humano en México, se ha informado su presencia en el Lago de Chapala, en el
estado de Jalisco y en Valle de Bravo, en el Estado de México. De esta última zona se tienen
registros de florecimientos de 1998 a la fecha y de la presencia de microcistina-LR. La presa Valle
de Bravo y los diferentes cuerpos de agua que conforman el sistema Cutzamala proveen cerca del
30% del agua potable a los habitantes de la Ciudad de México (COPODF). En estos sitios, durante
casi seis meses al año se aprecia la presencia de cianobacterias con florecimientos durante el
verano y se detectó la presencia de microcistina-LR en los meses de junio, septiembre y noviembre
de 1999. Las concentraciones más altas se observaron en el mes de junio con valores de 2,551
mg/kg, peso en base seca. El valor más bajo se determinó en noviembre, cuando aparentemente
el florecimiento había desaparecido; en este mes el valor máximo fue de 109 mg/kg, peso en base
seca (Ramírez et al., 2004) (Fig. 5).
Figura 5. Concentración de microcistinas en la presa de Valle de Bravo en 1999. Tomada de Ramírez et al., 2004.
En el año 2000 no se registraron florecimientos de cianobacterias, pero durante 2001 las
concentraciones de microcistina-LR se incrementaron de enero a julio y la mayor concentración
fue de 3,761 μg de toxina/g. Aunque en agosto se identificó un decremento en la concentración de
microcistina-LR, los niveles observados en julio se alcanzaron en septiembre y octubre, para
disminuir nuevamente en noviembre (Ramírez et al., 2004) (Fig. 6).
26
Figura 6. Concentración de Microcistinas en la presa de Valle de Bravo en 2001. Tomada de Ramírez et al., 2004.
Una situación similar podría presentarse en otros cuerpos de agua eutrofizados en nuestro país,
como es el caso del Lago de Chapala. Ante esta evidencia surge la necesidad de establecer un
programa de vigilancia y monitoreo en los cuerpos de agua, ya que debido a los procesos de
eutrofización es factible la presencia de florecimientos de cianobacterias con niveles de
microcistina-LR por arriba del valor guía recomendado por la OMS de 1μg/L (WHO 1998).
En la literatura podemos encontrar algunos trabajos referentes a la toxicidad de las cianobacterias
encontradas en lagos de la Ciudad de México, donde previamente han sido descritos los
florecimientos de Microcystis (Alva 1999).
Los estudios que se han hecho hasta la fecha con la biomasa colectada en lagos urbanos en
México D.F. han permitido evaluar algunos parámetros poblacionales en diferentes especies de
cladóceros y rotíferos alimentados con Microcystis, cuyas colonias fueron disgregadas mediante
sonicación. De estos bioensayos se concluyó que conforme aumenta la concentración de la
cianobacteria la tasa de reproducción y la supervivencia se ven afectadas de manera adversa (Alva
et al., 2007).
Hasta la fecha estos son de los pocos estudios que se tienen respecto a las cianobacterias
toxigénicas presentes en los lagos de la Ciudad de México y en la República Mexicana en general.
27
Justificación.
Los problemas de contaminación ambiental que mayor atención han recibido son aquellos
ocasionados por sustancias químicas o mezclas de ellas, sin embargo, poco ha sido el interés que
reciben los contaminantes de origen biológico, como pueden ser las toxinas que a muy bajas
concentraciones pueden producir diversos efectos adversos en las comunidades acuáticas.
Algunas cianobacterias tienen la capacidad de producir metabolitos secundarios con carácter
tóxico para diversos organismos, entre ellos el ser humano. Existen datos históricos de la
presencia de cianobacterias, la liberación de toxinas al agua y casos clínicos, en diversos países de
Europa, en Australia, Norteamérica y también de países latinoamericanos como Brasil, Argentina y
Uruguay (De León, et al., 2002).
En nuestro país, la mayoría de los estudios que se realizan en torno a las cianobacterias han sido
de tipo florístico, describiendo las especies que están presentes en los cuerpos de agua. Este tipo
de investigaciones ha sido conducido en cuerpos de agua importantes por las actividades
económicas, recreativas y/o deportivas que ahí se practican.
Actualmente, la Ciudad de México cuenta con diversos cuerpos de agua, donde se llevan a cabo
actividades recreativas, de esparcimiento y deportivas, además de que algunos como el lago del
Bosque de Aragón y La Alameda Oriente fungen como refugios para aves migratorias.
Las condiciones que presentan todos estos lagos corresponden a cuerpos de agua eutróficos, en su
mayoría por la entrada constante de nutrientes minerales provenientes de agua de las plantas de
tratamiento secundario con las que se cuenta en el Distrito Federal. El constante aporte de
nutrientes y la escasa variabilidad de temperatura e iluminación en la Ciudad de México, han
favorecido el desarrollo de florecimientos de cianobacterias en estos cuerpos de agua. Estos
tienden a modificar las condiciones organolépticas del agua, a abatir el oxígeno disuelto, aumentar
el pH y también resulta desagradable desde el punto de vista estético. Lo anterior son resultados
que pueden esperarse de cualquier florecimiento de cianobacterias, sin embargo, es importante
tomar en cuenta que pueden estarse liberando cianotoxinas de manera continua, la cuales afectan
a las poblaciones acuáticas y pueden ser un factor de riesgo para la gente, que por exposición
ocupacional o recreacional entren en contacto con ellas. Es por ello, que resulta importante contar
con herramientas diagnósticas que nos permitan evaluar el riesgo potencial de la exposición tanto
a la biomasa de los florecimientos como al agua de esos cuerpos de agua, siendo las más sensibles
las técnicas moleculares como la PCR.
Además de la evaluación por biología molecular, también es importante caracterizar el efecto que
puede tener sobre los organismos acuáticos, para lo cual es posible emplear organismos del
zooplancton, como cladóceros, con los cuales puede extrapolarse, hasta cierto punto, la
información colectada en el laboratorio hacia lo que pudiera ocurrir en una ambiente natural.
28
Objetivos.
General.
Determinar la presencia de cianobacterias toxigénicas pertenecientes al género
Microcystis en cuerpos de agua eutrofizados de la Ciudad de México, mediante métodos
moleculares, además de ensayos toxicológicos con organismos zooplanctónicos.
Particulares.
Llevar a cabo colectas de agua para evaluar el potencial toxigénico de las cianobacterias de
algunos cuerpos de agua de la Ciudad de México, donde previamente se ha informado la
presencia de florecimientos de cianobacterias, y mediante bioensayos de toxicidad aguda
con cladóceros comprobar la posible liberación de toxinas al medio.
Evaluar la respuesta aguda de Daphnia magna frente a los componentes intracelulares
tanto de la biomasa colectada como la de los aislados en el laboratorio, los cuales pueden
contener metabolitos tóxicos, como diferentes cianotoxinas.
Seleccionar aquellos aislados cuyos caracteres morfológicos sean los del género
Microcystis, y mediante la amplificación de marcadores moleculares como los genes mcy
se puedan identificar aislados de este género potencialmente productores de
microcistinas.
Determinar mediante métodos inmunoquímicos (ELISA) la biosíntesis de microcistinas por
los aislados que contienen los genes mcy, como una confirmación de la expresión de
dichos genes.
Reunir la información aportada por los diversos métodos para comprobar si en las
condiciones de cultivo se están expresando los genes para la biosíntesis de microcistinas, o
la toxicidad aguda provocada por los extractos crudos es debida a otras moléculas activas.
29
Materiales y métodos.
Colecta en los diferentes cuerpos de agua.
Se colectaron muestras de diferentes cuerpos de agua presentes en el Valle de México, donde
previamente se han reportado florecimientos de cianobacterias: Lago de Chapultepec Primera
Sección (Alcocer, 1988), Alameda Oriente (Alva, 1999), Pista Olímpica de Remo y Canotaje “Virgilio
Uribe” (Alva y Ruíz, 1998) y Bosque de Aragón, además de Valle de Bravo (Ramírez et al., 2004) y
de la Laguna de Villa Victoria, lugar del que no se tiene reporte alguno de esta cianobacteria.
Figura 7. Sitios de colecta en la Ciudad de México. A, Chapultepec 1ª sección; B, Pista Olímpica de Remo y Canotaje “Virgilio Uribe” y C, Alameda Oriente (antes bordo Xochiaca).
Durante la colecta se realizaron anotaciones de las condiciones ambientales al momento de tomar
la muestra como temperatura, nubosidad, hora del día, presencia de viento o lluvia, y además se
tomó nota de las actividades realizadas en el sitio.
Se colectaron dos muestras de agua en frascos de PET de 500 mL, que fueron previamente
filtradas con un tamiz con malla de 25 µm. Una de estas muestras se empleó para medir las
variables fisicoquímicas oxígeno disuelto (OD), pH, salinidad, conductividad, concentración de
nitratos y fósforo de ortofosfatos. La otra muestra se guardó hasta su uso para los ensayos
toxicológicos con Daphnia magna.
30
Figura 8. Almacenamiento del material de colecta en botellas de PET. Muestra libre de células(izquierda) y muestra completa (derecha).
En los mismos sitios se colectó biomasa del florecimiento que en su mayoría eran cianobacterias
del género Microcystis, con el fin de utilizarla para ensayos toxicológicos y para el aislamiento de
esta cianobacteria.
Figura 9. Biomasa colectada en el Lago de Chapultepec 1ª sección. Izquierda, acercamiento al florecimiento registrado el 23 de enero de 2008. Derecha, concentrado de la biomasa.
Aislamiento de cianobacterias del género Microcystis.
Se inocularon cajas Petri conteniendo medio mineral Z8 (modificado en este trabajo) semisólido
por estría cruzada y por espatulado (0.1 mL de agua en cada placa), las cuales se incubaron a 25°
+/- 2° C, con fotoperiodo de 16 horas luz / 8 horas oscuridad con iluminación propiciada mediante
lámparas fluorescentes de luz blanca fría, hasta por 30 días. Las colonias aisladas fueron
transferidas a viales de vidrio con 10 mL de medio de cultivo adicionado de bicarbonato de sodio.
Otro método por el cual se llevó a cabo el aislamiento de cianobacterias fue mediante
micromanipulación. Las colonias de Microcystis se seleccionaron usando una micropipeta capilar
31
hasta obtener solo una colonia por campo, para transferirla a un vial de vidrio con 1 mL de medio
mineral Z8 adicionado de bicarbonato de sodio.
Los viales con crecimiento de la cianobacteria fueron revisados al microscopio para confirmar la
morfología colonial de Microcystis. Posteriormente se escalaron los cultivos en el mismo medio
mineral hasta obtener la cantidad de biomasa requerida para cada ensayo.
Figura 10. Aislamiento de Microcystis sp. y escala del cultivo.
Cultivos de referencia. Para contar con testigos positivos y negativos en los bioensayos y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se emplearon las cepas de Microcysts aeruginosa LB2385 (toxigénica) y M. aeruginosa LB2386 (No toxigénica), ambas de la colección de la Universidad de Texas, que se propagaron en el medio mineral Z8. Las cepas fueron identificadas y caracterizadas por los grupos de investigación que las depositaron en dicha colección.
Figura 11. Cultivo de las cepas de referencia provenientes de la colección UTEX.
Izquierda, LB2386 (no toxigénica) y derecha, LB2385 (toxigénica).
32
Ensayos de toxicidad aguda con Daphnia magna. Se realizaron de acuerdo con el procedimiento descrito en la Norma Oficial Mexicana NMX-AA-
087-1995 “Análisis de agua – Evaluación de toxicidad aguda con Daphnia magna Status
(Crustacea-Cladocera) – Método de prueba”.
El material de prueba se obtuvo a partir de 200 mg de biomasa seca, tanto de los florecimientos
como de los aislados de laboratorio. El extracto celular se preparó rompiendo las células mediante
congelación en cama de hielo seco en un mortero. Una vez congelada se realizó la molienda hasta
obtener un polvo uniforme. La biomasa tratada de esta forma se resuspendió en agua dura
reconstituida (ADR) y se centrifugó a 3,500 rpm por 30 minutos.
Para los bioensayos fueron preparadas al menos 5 concentraciones diferentes del extracto crudo,
teniendo siempre una concentración máxima de 1,000 mg de biomasa seca / L.
Figura 12. Esquema para la obtención del extracto crudo celular. A, molienda en cama de hielo seco; B y C, eliminación de detritus celulares; D, preparación de las diluciones de prueba, y E, Daphnia magna adulto (derecha) y neonato (izquierda).
Las condiciones de la prueba se detallan en el cuadro 5.
33
Cuadro 5. Bioensayos de toxicidad aguda con D. magna
Condiciones.
Tipo de prueba Estática sin renovación
Duración 48 h
Luminosidad 600 - 1000 luxes
Fotoperiodo 16 h luz / 8 h oscuridad
Volumen de los recipientes 50 mL
Volumen de prueba 30 mL
Edad de los organismos Menores de 24 h
Número de réplicas por concentración 3
Número de organismos por réplica 10
Aireación de los recipientes de prueba No
Agua de dilución Dura reconstitutida
Temperatura 20° C ± 2° C
Alimentación No
Respuesta evaluada Inmovilidad a 24 y 48 h
Criterio de aceptación de la prueba Sobrevivencia mayor a igual al 90 % en los testigos.
Tomada de Norma Oficial Mexicana NMX-AA-087-1995
Las pruebas de toxicidad aguda (48 horas) fueron realizadas con neonatos (individuos con menos
de 24 horas de haber sido expulsados de la cámara incubatriz de la progenitora) de Daphnia
magna, una especie de cladócero zooplanctónico dulceacuícola utilizado como especie de
referencia en toxicología acuática, a nivel internacional. Estos organismos fueron obtenidos de
lotes estables de reproductoras que fueron alimentadas con la microalga Ankistrodesmus falcatus.
La reproducción de Daphnia magna es de tipo asexual mediante partenogénesis, teniendo a lo
largo de su ciclo de vida, que va de los 24 hasta los 85 días, un gran número de camadas. En cada
una de estas puede llegar a tener más de 20 neonatos, por lo cual se le ha considerado como una
especie adecuada para la obtención de un gran número de neonatos para la realización de
ensayos toxicológicos (Martínez-Jerónimo et al., 1994).
La respuesta evaluada al final del periodo de prueba fue la inmovilidad o muerte de los organismos de prueba. Se registraron los datos de cada bioensayo para posteriormente calcular la Concentración letal media (CL50) mediante el software educativo LC50, el cual devuelve este valor por el método de Probit (Stephan 1977).
Prueba de consumo con Daphnia magna.
El primer paso fue realizar una curva de calibración con la cepa de referencia Microcystis
aeruginosa LB2385, en la cual se tomaron en cuenta variables como la densidad óptica a 620 nm
(máxima absorbancia), peso seco y número de células por mililitro.
34
Con los datos de esta curva se ajustó la concentración celular de Microcystis para que fuese
equivalente en peso seco a 400,000 células de A. falcatus / mL (1.26 mg / mL), que es la cantidad
de alimento óptima para el desarrollo de Daphnia magna (Martínez-Jerónimo et al., 1994) y a
0.315 mg de biomasa seca/ mL, siendo equivalente a 100 000 células / mL de A. falcatus.
Para cada concentración se ensayaron 10 réplicas con un organismo cada una, a fin de poder
evaluar la tasa reproductiva durante el periodo de prueba (21 días). Cuando los organismos son
sometidos a estresores, una de las variables que puede verse modificada es precisamente la
reproducción, bajando el número de camadas y de individuos por camada, además de que puede
aumentar la edad de la primera reproducción y el tiempo intercamada.
Figura 13. Desarrollo de la prueba de consumo con Daphnia magna. De izquierda a derecha, A. falcatus y concentraciones crecientes de Microcystis aeruginosa.
Desde la primera reproducción los neonatos fueron retirados de los recipientes y contabilizados,
mientras que la renovación del medio (agua y alimento) se realizó cada 48 horas.
Los organismos muertos fueron eliminados de la prueba sin remplazar. Al final del ensayo se
fijaron los organismos sobrevivientes en una solución de formol-glucosa al 4 % hasta el momento
de medir la longitud corporal, longitud de la espina y ancho, con ayuda de un microscopio óptico y
un ocular micrométrico. Los cladóceros continúan creciendo durante todo su ciclo de vida, por lo
cual es importante evaluar si existe alguna modificación por los diversos factores a los que puede
estar sometido el organismo, que genere que los organismos en condiciones de estrés alcancen
tallas menores que las de los organismos mantenidos en óptimas condiciones ambientales y
nutricionales.
Los datos registrados del tratamiento con A. falcatus fueron comparados con su equivalente de
Microcystis mediante una prueba de t de Student, misma que se utilizó para comparar entre los
grupos de alimentados con Microcystis aeruginosa LB2385. Adicionalmente se trazaron las gráficas
de sobrevivencia, progenie total y número de individuos promedio por camada.
35
Extracción de DNA. (Allers y Lichten, 2000; modificado por Rodríguez, 2004) (Anexo 1)
El rompimiento celular se realizó mediante congelación en un mortero con cama de hielo seco,
sobre la cual se depositó la biomasa hasta su congelamiento para proceder a la molienda hasta la
obtención de un polvo fino. Posteriormente se homogenizó con la suspensión de CTAB I. Se
continuó con extracciones con cloroformo-alcohol isoamílico para la eliminación de los diversos
componentes celulares. Finalmente el DNA se precipitó con etanol al 70 % y se resuspendió en
agua inyectable.
La integridad del DNA se comprobó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% y por su
relación A260nm/A280nm.
Caracterización molecular del material de colecta y aislados de
Microcystis.
Se seleccionaron 3 blancos diferentes del genoma de Microcystis: un fragmento del operón de la
ficocianina, el cual sirve como un testigo positivo de la presencia de DNA en la reacción de
amplificación, además de confirmar que se trata de una cianobacteria y no de una microalga, pues
solo estas sintetizan la ficocianina; una región del 16 S rDNA específica para este género, de
manera tal que se pueda comprobar por este método que los aislados con los que se trabaja
pertencen a dicho género; y finalmente, la región codificante para el dominio de condensación del
gen mcyA (mcyA-Cd), con la cual se pueden identificar los aislados potencialmente productores de
microcistinas. Estos tres pares de iniciadores se utilizaron para realizar la PCR múltiple. La
secuencia de cada uno de los iniciadores se detalla a continuación en el cuadro 6.
Cuadro 6. Iniciadores empleados para PCR Múltiple.
Iniciadores Tamaño del amplificado Referencia
Micr184F GCCGCRAGGTGAAAMCTAA Micr431R AATCCAAARACCTTCCTCCC
220 bp Neilan et al. (1997)
mcyA-Cd1F AAAATTAAAAGCCGTATCAAA mcyA-Cd1R AAAAGTGTTTTATTAGCGGCTCAT
300 bp Hisbergues et al. (2003)
PCβF GGCTGCTTGTTTACGCGACA PCαR CCAGTACCACCAGCAACTAA
650 bp Neilan et al. (1995)
36
La mezcla de reacción se compuso de la siguiente manera: regulador para PCR 1X, 2.5 mM MgCl2,
250 µM de cada dNTP, 10 pmol de cada iniciador, Taq polimerasa 0.5 U, y 5-10 ng de DNA, en un
volumen final de 50 µL.
Las condiciones de la reacción fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 95° C por 10 min,
35 ciclos de 94° C por 60 s, 54° C por 60 s, 72° C por 90 s, y un paso de extensión final a 72° C por
10 min.
Electroforesis.
Dos microlitros de cada mezcla de PCR, junto con un marcador de 100 bp, se corrieron en geles de
agarosa al 1.5% con TBE 1X a 80 mV por 60 minutos.
Los geles se tiñeron con bromuro de etidio por 10 minutos y fueron lavados con agua por un
periodo igual. Se documentaron los geles mediante transiluminación UV.
Secuenciación y BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).
Los productos de PCR fueron secuenciados mediante el sistema ABI® para introducirlos en el
programa en línea BLAST, de manera que pudiera establecerse, por estos marcadores moleculares,
la identidad de los aislados. El alineamiento se llevó a cabo con los parámetros preestablecidos en
el programa.
ELISA (Enzyme Link immunosorbent assay).
La determinación de microcistinas en los cultivos se realizó con el QuantiPlate™ Kit for
Microcystins de Envirologix™.
De la misma manera que en pasos anteriores se obtuvo el extracto crudo celular, ajustando la
concentración a 1 mg de biomasa seca / mL.
Los pasos subsecuentes se hicieron de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
37
Resultados.
Colecta en los diferentes cuerpos de agua
En las colectas se tomaron anotaciones de las condiciones ambientales y de las variables
fisicoquímicas que imperaban al momento de la toma de muestras. Los resultados de esta etapa
del trabajo se resumen en los siguientes cuadros (7 y 8).
Cuadro 7. Caracterización de los sitios de colecta durante el 2007.
Lugar Fecha Condiciones Ambientales
Fauna Usos Biota acuática observada
Villa Victoria 28-ene Soleado, medio día, 20° C, sin viento.
Diversas aves, peces
Pesca, paseo en lancha, agricultura cerca laguna, restaurantes, asentamientos humanos
Notonectas
Valle de Bravo
4-feb Soleado, medio día, 20° C, sin viento.
Diversas aves
pesca, paseo en lancha, actividades deportivas, restaurantes, asentaminetos humanos
Cladóceros
Chapultepec 1a Secc.
8-mar Soleado, medio día, 26° C, sin viento.
Paseo recreativo en lancha Rotíferos
Alameda Oriente, 2a exclusa
13-mar Nublado, medio día, sin viento
Patos cría de pato Notonectas
3a exclusa 13-mar Nublado, medio día, sin viento
Patos Paseo recreativo en lancha Notonectas
4a exclusa 13-mar Nublado, medio día, sin viento
Diversas aves
ninguno
5a exclusa 13-mar Nublado, medio día, sin viento
Diversas aves
ninguno
Villa Victoria 18-mar Soleado, medio día, viento
Peces, Aves diversas
Pesca, paseo en lancha, agricultura cerca laguna, restaurantes, asentamientos humanos
Notonectas
PORC 19-mar Soleado, medio día, sin viento
Diversas aves
Remo y canotaje Copépodos
Bosque de Aragón
27-abr Nublado, medio día, sin viento
Patos Paseo recreativo en lancha Copépodos
Chapultepec 1a Secc.
8-may Soleado, medio día, sin viento, lluvia en días anteriores
Patos Paseo recreativo en lancha Rotíferos
PORC 25-jul Nublado, medio día, sin viento
Diversas aves
Remo y canotaje Copépodos
AO 3 26-jul Soleado, media mañana Diversas aves
cría de pato Ninguno
Chapultepec 1a Secc.
27-jul Soleado, media mañana Diversas aves
Paseo recreativo en lancha Rotíferos, copépodos
PORC Pista Olímpica de Remo y Canotaje; AO, Alameda Oriente
38
Cuadro 8. Caracterización fisicoquímica del agua de los sitios de colecta.
Lugar Fecha pH Oxígeno Disuelto,
mg/L
Conductividad, uS/cm2
Salinidad NO3
-,
mg/L PO4
-3,
mg/L
Cociente PO4
-3 /
NO3-
Villa Victoria 28-ene-2007 8.15 4.72 204.3 0.1 1.4 1.54 1.10
Valle de Bravo 4-feb-2007 8.25 7.4 160.7 0.1 0.2 1.1 5.50
Chapultepec 1a Secc. 8-mar-2007 10.67 5.08 493.2 0.2 1.5 1.75 1.17 Alameda Oriente, 2a exclusa
13-mar-2007 10.74 5.7 1923 1 0.6 4.4 7.33
3a exclusa 13-mar-2007 10.56 5.6 2413 1.2 0.9 5.28 5.87
4a exclusa 13-mar-2007 10.41 5.3 2736 1.4 0.9 6.03 6.70
5a exclusa 13-mar-2007 10.25 4.44 4439 2.4 1 6.12 6.12
Villa Victoria 18-mar-2007 9.5 6.68 139.3 0.1 0.1 0.1 1.00
PORC 19-mar-2007 10.28 8.68 914 0.5 0.7 1.62 2.31
Bosque de Aragón 27-abr-2007 10.84 6.97 1632 0.8 0.3 4.1 13.67
Chapultepec 1a Secc. 8-may-2007 10.84 5.3 531 0.3 0.4 5.3 13.25
PORC 25-jul-2007 10.4 5.23 1120 0.5 0.9 1.4 1.56
AO 3 26-jul-2007 10 3.5 2665 1.4 0.8 8.3 10.38
Chapultepec 1a Secc. 27-jul-2007 10.38 4.56 524.5 0.3 1.3 5.6 4.31
PORC Pista Olímpica de Remo y Canotaje; AO, Alameda Oriente
Los sitios de colecta en los que se encontró Microcystis generalmente tienen valores de pH≥10,
además de un cociente PO4-3
/ NO3- con valores mayores de 1.
Aislamiento y cultivo de Microcystis spp.
Inicialmente se propuso el uso de medio mineral BG11, pero este tiene el inconveniente de que el
pH óptimo para su uso es alrededor de 7. Cuando se ajusta a pH 10 algunas de sus sales tienden a
precipitarse, por lo cual pudiera explicarse la baja tasa de crecimiento de esta cianobacteria.
En la literatura encontramos que puede emplearse el medio Z8, que ofrece las siguientes ventajas:
puede ajustarse a pH 10 sin precipitarse, al esterilizarse no genera peróxidos y la concentración de
nitratos es menor que la del BG11. Todo ello conlleva a tener un medio mineral más efectivo para
el aislamiento de cianobacterias (Rippka, 1988a). La solución de micronutrientes fue modificada en
este trabajo, pues varios de los elementos que contiene no son importantes para la nutrición
mineral, por lo cual pueden omitirse en la formulación, y emplear aquellos que son comunes entre
el BG11 y el Z8.
39
En el siguiente cuadro se resumen los sitios de colecta a partir de los cuales se consiguió el
aislamiento de Microcystis sp.
Cuadro 9. Sitios de colecta de los cuales se han conseguido aislado clonales.
Lugar Aislamiento de Microcystis sp. (No. de aislados) Calidad del aislado Medio Mineral
Villa Victoria 3 NA, C Z8α
Valle de Bravo 0 - -
Chapultepec 1a Sección 10 NA,C Z8*
Alameda Oriente 1 NA, C Z8 α
PORC 12 NA, C Z8 α
Bosque de Aragón 3 NA, NC Z8 α
NA, No axénico; C, Clonal; NC, No Clonal. * Ajustado a pH 10. α Modificado en este trabajo.
Por cultivo clonal se hace referencia a aislados que provienen de una sola colonia, obtenidos por
cualquiera de los métodos descritos en la sección de Materiales y Métodos, por lo cual se trata de
una sola especie de cianobacteria. Estos cultivos no son axénicos pues no se eliminó la microbiota
asociada a las colonias, la cual básicamente comprende bacterias heterótrofas. El pH del medio de
cultivo fue ajustado a 10 para favorecer el crecimiento del género en estudio, siendo más efectiva
la modificación al Z8 (anexo 2).
Los aislados provenientes del lago del Bosque de Aragón no fueron utilizados en lo subsecuente
por la gran facilidad que tienen de asociarse con Anabaena sp., creciendo de manera conjunta en
el medio de cultivo.
Bioensayos de toxicidad aguda con Daphnia magna.
La primera fase de los bioensayos se realizó con agua de la colecta libre de células. En ninguna de las estaciones de muestreo se encontró mortalidad de los organismos expuestos (Cuadro 10).
Cuadro 10. Resultado del bioensayo de toxicidad con neonatos de Daphnia magna empleando muestras de agua de las diferentes colectas.
Lugar Mortalidad, %
PORC Cero
Villa Victoria Cero
Chapultepec 1a Sección Cero
AO 2 exclusa Cero
AO 3 exclusa Cero
AO 4 exclusa Cero
AO 5 exclusa Cero
Bosque de Aragón Cero
PORC: Pista Olímpica de Remo y Canotaje Virgilio Uribe; AO: Alameda Oriente.
40
Dado el carácter intracelular de las microcistinas, parece ser mejor exponer a los organismos de
prueba a extractos crudos celulares simulando de esta manera lo que sucede en el ambiente al
lisarse las cianobacterias en la columna de agua.
Posteriormente se realizaron los ensayos con biomasa de las colectas (Cuadro 11) y los aislados del
laboratorio (Cuadro 12). Los resultados de la prueba de toxicidad aguda con el extracto crudo son
expresados en mg de biomasa seca / L, obtenidos por el método de Probit. Además de la CL50 se
muestra el intervalo de confianza (95 %) obtenido mediante el programa LC50 (Stephan 1977).
Cuadro 11. Concentración letal media (CL50) para D. magna del extracto crudo de Microcystis sp. (biomasa total de cianobacterias de los sitios de colecta).
Procedencia CL50, mg de biomasa seca / L
Límites de confianza (95 %).
Alameda Oriente 2: 139 132-145
Alameda Oriente 4 180.5 174-186
Chapultepec 1ª Sección. 440 380-490
PORC 314.32 280-355
PORC, Pista Olímpica de Remo y Canotaje.
Se esperaba que la CL50 para la biomasa de los aislados fuera menor que la de la biomasa total del
sitio de colecta, sin embargo, se encontró que en algunos casos no se podía determinar este
parámetro con las concentraciones probadas.
Cuadro 12. Concentración letal media (CL50) para D. magna del extracto crudo de los aislados de Microcystis sp.
Procedencia CL50, mg de biomasa seca / L
Límites de confianza (95%).
Cepa de referencia LB2385 178 170-187
Cepa de referencia LB2386 >1000 NA
AO2-3 277 233-333
AO3-15 203 195-210
Ch-10 >2000 NA
Ch-16 >1000 NA
PORC-4 >1000 NA
PORC-5 193 172-213
PORC-6 >1000 NA
Z1 >1000 NA
Las cepas de referencia se obtuvieron de la colección UTEX. Las letras indican el lugar de procedencia de los aislados. AO,
Alameda Oriente; Ch, Chapultepec 1ª sección, PORC, Pista Olímpica de Remo y Canotaje “Virgilio Uribe”, y Z, Zumpango
(donada por la Dra Roxana Olvera Ramírez). El número indica el orden de aislamiento.
41
Bioensayos de consumo con Daphnia magna.
Los resultados de este bioensayo se encuentran con detalle en el anexo 3.
En el Cuadro 13 se resumen las variables medidas en el testigo y los tratamientos. Se esperaba
encontrar disminución de las diferentes variables evaluadas en los tratamientos con respecto al
testigo. Esto se debe a que la cianobacteria empleada como fuente de alimento puede no ser de la
misma calidad nutricional que la microalga, causando así la baja en las diferentes respuestas. De
acuerdo con la Colección de la Universidad de Texas (UTEX), la cepa empleada LB2385 está
referida como productora de microcistinas, las cuales pueden causar la reducción en el
crecimiento y la reproducción de D. magna, e incluso disminuir la sobrevivencia de este cladócero
(Fig. 14).
Cuadro 13. Reproducción de D magna alimentada con Ankistrodesmus falcatus o Microcystis aeruginosa.
Microcystis aeruginosa
A. falcatus 4M 1M
Reproducción total (Número de neonatos)
114.8 0.6 0.5
Número de camadas
6.8 0.5 0.4
Individuos promedio por camada
17.25 0.4 0.5
Edad primera reproducción (días)
6.3 15.33 18.25
M, Microcystis aeruginosa: 4M (1.26 mg/mL) y 1M (0.315mg/mL).
Edad
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
No.
de
org
anis
mo
s
4
5
6
7
8
9
10
11
Ankistrodesmus falcatus
M. aeruginosa 4M
M. aeruginosa 1M
Figura 14. Sobrevivencia de D. magna durante la prueba de consumo.
42
Como se ha mencionado antes, la talla de los organismos puede tomarse en cuenta como un
indicador de desarrollo adecuado en los cladóceros, que siguen creciendo durante toda su ciclo
vital. En caso contrario, como ha sucedido con los tratamientos, puede deberse a que Microcystis
sp. no es una buena fuente nutricional para los cladóceros además de producir cianotoxinas que
afectan el desarrollo de estos organismos zooplanctónicos (Cuadro 14).
Cuadro 14. Media de las dimensiones corporales medidas al final de la prueba de consumo.
Alimento Longitud corporal
(mm) Ancho (mm)
Longitud de la espina (mm)
A falcatus 68.1 44.9 13
4M 40.2 25.2 8.4
1M 39.7 25.0 8.6
M, Microcystis aeruginosa: 4M(1.26 mg/mL), y 1M(0.315mh/mL).
La comparación por t-student entre los tratamientos que son equivalentes en peso seco
(alimentados con A. falcatus y 4M) refleja que hay diferencia significativa entre ellos (t=20.43, P <
0.05) y entre los alimentados con Microcystis aeruginosa (a diferente concentración) no existe
diferencia significativa (t= 0.264135272, P= 0.79). El análisis de variancia de una sola vía (ANOVA)
no refleja diferencias estadísticamente significativas entre los organismos alimentados con
Microcystis aeruginosa, aunque si con los testigos (F= 492.92, P<0.05).
Extracción de DNA.
La referencia original hace hincapié en que el pretratamiento de la muestras, es decir, la molienda
es de suma importancia para la obtención de material genético de calidad, por lo que sugiere el
uso de nitrógeno líquido para dicho procedimiento. Sin embargo, en este trabajo se empleó el
hielo seco como el agente para congelar las muestras, además de servir como cristales que
ayudaban a la ruptura de las células. Una vez lisadas las células el procedimiento es el mismo a
seguir. Finalmente se obtuvieron muestras de DNA total de los diferentes aislados mediante el
protocolo del CTAB (Allers et al. 2000, Rodríguez 2004).
43
Reacción en cadena de la Polimerasa.
Inicialmente, se siguió el protocolo descrito por Hisbergues et al. (2003), con el cual se obtuvieron
amplificados de 300 bp, indicando así la presencia de los genes responsables de la biosíntesis de
microcistinas (Fig. 15). Estos aislados pueden tener la capacidad para producir microcistinas, sin
embargo se requiere de otros análisis para corroborar su producción. Entre las cepas de referencia
se contó con la LB2386, que de acuerdo al catálogo de la UTEX no produce microcistinas, pero en
la amplificación del gen mcyA-Cd dio positivo, lo cual nos indica que podría tratarse de una cepa
potencialmente productora de microcistinas. Sin embargo, se requiere de otros métodos para
comprobar que los aislados con los cuales se obtuvo mortalidad de los cladóceros y que presentan
los genes mcyA-Cd son realmente productores de estas cianotoxinas.
Figura 15. Amplificación de la región mcyA-Cd (300 bp). Carril 1, AO3; 2, AO15; 3, Ch10; 4, Ch14; 5, Ch17; 6, PORC6; 7, PORC8; 8, LB2558; 9, LB2385.
Posteriormente, se cambió el protocolo de la PCR tradicional por la múltiple, con la cual se
obtuvieron tres amplicones de distinto tamaño; una región del operón de la ficocianina (650 bp),
la región mcyA-Cd (300 bp) y un fragmento del 16 S (220 bp) correspondiente solo al género en
estudio (Fig. 16). En el protocolo descrito en la literatura refieren el uso de una temperatura de
alineamiento de 59° C, pero durante el desarrollo de este trabajo encontramos mediante un
gradiente de temperatura (52-59° C) que la temperatura ideal para la amplificación de las tres
regiones seleccionadas es de 54° c, dado que a la temperatura informada se generan bandas
inespecíficas.
44
Estos tres amplificados se obtuvieron a partir del material de los sitios de colecta (Alameda Oriente, Pista Olímpica de Remo y Canotaje y Chapultepec 1ª sección), las cepas de referencia y en los aislamientos realizados durante este proyecto (Fig. 17).
Figura 17. PCR Múltiple del operón de la ficocianina (650bp), gen mcyA–Cd gene (300bp) y un fragmento del gen 16S rRNA (220bp). Carril 1, AO3; 2, AO15; 3, Ch10; 4, Ch14; 5, Ch17; 6, PORC6; 7, PORC8; 8, LB2385. M Marcador de tamaño molecular (100 bp).
Los genes amplificados mediante la PCR múltiple pueden resumir en una solo imagen con que tipo
de organismo se cuenta en el laboratorio, o incluso en una muestra de campo. Al amplificar los
tres genes seleccionados como blanco, podemos afirma que se trata de una cianobacteria (650
bp), del género Microcystis (220 bp) y que es además capaz de sintetizar metabolitos tóxicos como
las microcistinas (300).
Figura 16. PCR múltiple de dos sitios de colecta y una cepa de referencia, en la cual se observan los tres amplificados: del operón de la ficocianina (650 bp), mcyA-Cd (300 bp) y 16 S rDNA (220 bp). AO, Alameda Oriente; PORC, Pista Olímpica de Remo y Canotaje “Virgilio Uribe”.
45
Cuadro 15. Resultados de la PCR múltiple
Aislado AO PORC LB2385 LB2386 AO2-3 AO2-15 PORC1 PORC2
PCR-Ficocianina + + + + + + + +
PCR-16S + + + + + + + +
PCR-mcy + + + + + + + +
Aislado PORC3 PORC4 PORC5 PORC6 PORC7 PORC8 PORC10 PORC11
PCR-Ficocianina + + + + + + + +
PCR-16S + + + + + + + +
PCR-mcy + + + + + + + +
Aislado Ch5 Ch10 Ch17 Ch20 VV4 Z1
PCR-Ficocianina + + + + + +
PCR-16S + + + + + +
PCR-mcy + + + + + +
AO, Alameda Oriente; PORC, Pista Olímpica de Remo y Canotaje. AO y PORC seguidas por número son aislados clonales, sin número es proveniente de la biomasa total del sitio de colecta. LB2385 y LB2386, cepas de referencia. Ch, Chapultepec 1ª sección; V, Villa Victoria; y Z, Zumpango. El número indica el orden de aislamiento, aquellas que no tienen son provenientes de la biomasa total del sitio de colecta. LB2385 y LB2386, cepas de referencia.
ELISA. El cálculo de la concentración de ELISA se realizó de acuerdo al procedimiento descrito por el fabricante, en el cual se utiliza una “curva de calibración” con los siguientes datos. Cuadro 16. Curva de calibración ELISA
Concentración mcyst, ppb mcyst-Ab (proporción)
0.16 0.80985692
0.6 0.47281399
2.5 0.11383148
La ecuación de la recta es la siguiente:
mcyst-Ab = 0.345 – [0.583 * log (concentración)], r2=1.0 Donde la mcyst-Ab hace referencia a la cantidad del conjugado microcistina-enzima que se une a los anticuerpos (Ab) de la microplaca. Este es un ELISA de tipo competitivo, en el cual a mayor concentración de analito en la muestra, menor será la cantidad del conjugado que reaccionará con los Ab´s de la placa. Por eso la pendiente de la recta es negativa.
46
Con la ecuación anterior se calculó la concentración de microcistinas en los extractos crudos utilizados en los bioensayos de toxicidad aguda. Dado que estos se encontraban en una concentración de 1000 mg de biomasa seca / L, podemos expresar la concentración de microcistinas en partes por billón (ppb) o en µg de microcistinas/g de biomasa en peso seco (cuadro 17). Cuadro 17. Concentración de microcistinas en los extractos crudos de Microcystis sp.
Aislado Unión Ag-Ab Concentración de microcistinas, ppb
AO3 0.67124 0.27568
AO15 0.02703 3.51082
Ch10 0.87822 ND
Ch16 0.18347 1.89267
Ch12 0.05056 3.19926
PORC2 0.02957 3.47572
PORC4 0.02417 3.55072
PORC10 0.03307 3.42804
PORC5 0.02448 3.54627
LB2385 0.02989 3.47136
LB2386 0.84515 ND
Z1 0.06455 3.02727
VV4 0.25819 1.40898
El límite de detección de la prueba de ELISA es de 0.147 ppb y tiene un rango de detección de 0.16-2.5 ppb. Por ello, los datos que se presentan se obtuvieron a través de la extrapolación de los datos de mcyst-Ab en la curva de calibración, ya que algunos quedan por arriba del valor máximo de dicho rango. Se ha considerado como ND a aquellos que están por debajo del límite de detección, de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Secuenciación. Se obtuvieron las secuencias de nucleótidos de los productos de PCR del fragmento del gen ribosomal 16S (220bp) y el fragmento del gen mcyA-Cd (300 bp). Las secuencias se muestran con detalle en el Anexo 4.
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Los alineamientos realizados mostraron una identidad máxima mayor o igual al 95% con las secuencias del GenBank correspondientes al género Microcystis, perteneciendo la mayoría a la especie M. aeruginosa, aunque pueden encontrarse otras especies como M. wesenbergii, M. ichthyoblabe, M. novacekii y M. viridis, todas ellas posibles productoras de microcistinas.
AO, Alameda Oriente; Ch, Chapultepec 1ª Sección; PORC, Pista Olímpica de Remo y Canotaje “Virgilio Uribe”, LB2385 y LB2386, cepas de la colección UTEX; Z1, Zumpango; VV, Villa Victoria. ND, No detectable, por debajo del límite de detección de la prueba.
47
A manera de resumen, en el Cuadro 18 se presentan de manera condensada los resultados de las diversas pruebas realizadas para la caracterización de los aislados. Cuadro 18. Resumen de los resultados de las ensayos realizados a los diferentes aislados.
Aislado CL50; mg/L Operón Ficocianina
16 S DNA Microcystis sp.
mcyA-Cd ELISA; ppb
AO2-3 277 + + + 0.27
AO3-15 203 + + + 3.51
Ch10 >2000 + + + FLD
Ch16 >1000 + + + 1.89
Ch12 ND + + + 3.19
PORC2 ND + + + 3.47
PORC4 >1000 + + + 3.55
PORC10 ND + + + 3.42
PORC5 193 + + + 3.54
LB2385 178 + + + 3.47
LB2386 >1000 + + + FLD
Z1 >1000 + + + 3.02
VV4 ND + + + 1.41 +, presencia del gen; ND, no determinado. FLD, Fuera del límite de detección.
Todos los aislados utilizados pertenecen al género Microcystis, los cuales presentan los genes para la biosíntesis de microcistinas, sin embargo, en las condiciones de cultivo no en todos ellos se encontró la producción de dichas cianotoxinas.
48
Discusión.
En general, durante este trabajo se observó que los cuerpos de agua en donde se encuentra
Microcystis tienen características fisicoquímicas semejantes, como lo son el elevado valor de pH
(mayor o igual a 10), una relación fosfatos / nitratos mayor a la unidad, temperatura entre los 20-
25° C, desafortunadamente, no en todas las localidades se tuvieron dichas condiciones al
momento de la colecta, lo que redujo el número de sitios a partir de los cuales pudiera contarse
con biomasa para los pasos subsecuentes. Los valores de las variables fisicoquímicas determinadas
concuerdan con los datos de la literatura, en los que se informa que el crecimiento óptimo de las
cianobacterias es alrededor de los 20-25° C, siempre y cuando se cuente con nutrientes minerales
importantes como los nitratos y fosfatos, los cuales fueron abundantes en los lagos urbanos
seleccionados. La alta concentración de nutrientes en estos sitios es debida al aporte de agua de
las plantas de tratamiento secundario, que no los eliminan y los vierten finalmente a los diversos
cuerpos de agua.
Es importante destacar que en los ecosistemas acuáticos hay tres grupos principales del
zooplancton aunque pueden o no estar presentes, estas son cladóceros, copépodos y rotíferos. La
ausencia de estos grupos podría ser indicador de disturbio en el ecosistema, o tal vez que existe
uno o varios factores en la columna de agua impidiendo su viabilidad. Gustafsson et al. (2004)
afirman que la ausencia de cladóceros cuando existen florecimientos de cianobacterias puede
deberse a la presencia de algún material tóxico como las microcistinas y por depredación, puesto
que forman una especie de efecto “sándwich”, en la que el grupo de los consumidores primarios
se ve disminuido o eliminado en su totalidad del ecosistema. Una forma de inferir la presencia de
cladóceros es mediante la búsqueda de notonectas, una familia de insectos acuáticos, que son sus
depredadores naturales. Aún encontrando a estos hemípteros acuáticos no podemos asegurar que
haya cladóceros, pues las notonectas podrían alimentarse de larvas de mosco u otros organismos
del zooplancton, por eso se necesita concentrar la muestra a través de un tamiz y buscar los
organismos más grandes: cladóceros y copépodos; sin pasar por alto la observación a la lupa y
microscopio, dirigiendo la búsqueda hacia el hallazgo de rotíferos y protozoarios.
En los sitios de colecta dentro de la Ciudad de México no ha sido posible encontrar cladóceros
durante los florecimientos, a diferencia de otros grupos como los copépodos y los rotíferos, que
coincide con las observaciones realizadas por otros grupos de investigación (Escobar-Briones et
al., 2002). La reducción en el número o la ausencia de cladóceros es un indicador de disturbio
ambiental, el cual puede estar asociado a la presencia de cianobacterias en la columna de agua, de
manera tal que si este grupo fitoplanctónico es el dominante, muchos de los cladóceros no son
capaces de consumirlas, puesto que han desarrollado una serie de estrategias de defensa, como es
la formación de colonias o filamentos con vainas mucilaginosas, o la liberación de alguna sustancia
49
que impide su consumo, denominados infoquímicos, aunque en el caso de las micrositinas aún no
se conoce del todo el rol que tienen estas en dicha comunicación química. Se ha observado que
algunas cianobacterias son capaces de aumentar su toxicidad en cuanto son sometidas a la
presencia de organismos fitoplanctívoros (Jang et al., 2003; Schatz et al., 2007) o generar
alelopatía al competir por nutrientes con microalgas (Babica et al., 2006). Todo esto puede
explicar porque las poblaciones de cladóceros tienden a disminuir o a cambiar de organismos de
talla relativamente grande hacia aquellos de talla más pequeña, evento que sucede con frecuencia
en los ambientes eutróficos subtropicales y tropicales (Sarma et al., 2005; Alva et al., 2007).
Partiendo de la biomasa colectada se realizó el aislamiento de cianobacterias del género
Microcystis con la finalidad de obtener cepas clonales, es decir, que provengan de una sola colonia
para evitar tener mezcla de características que no permitan la identificación mediante los
marcadores moleculares seleccionados.
Inicialmente se trató de aislarla en medio mineral BG11, pero a pesar de partir de inóculos
concentrados de esta cianobacteria, no se lograba crecer en ella, dado que el pH de trabajo con
este medio de cultivo es cercano a la neutralidad, mientras que el pH óptimo para el desarrollo de
Microcystis varia de 8-12, siendo el óptimo a un valor de 10 (Gerloff et al., 1952). Por esta razón se
buscó un medio de cultivo en el que los componentes no se precipitaran a este pH, por lo cual
seleccionamos el Z8, con modificaciones en la formulación original (Rippka, 1988), eliminando los
elementos que no son importantes para la nutrición mineral y empleando aquellos que son
comunes con el BG11. La ventaja que tiene este medio es que contiene una menor cantidad de
cobre, el cual puede inhibir el crecimiento de algunas especies de cianobacterias, además de que
no emplea citrato férrico amoniacal como fuente de hierro, sino al cloruro férrico, de esta manera
se evita la formación de peróxidos que igualmente dañan a las células de cianobacterias
impidiendo su crecimiento (Rippka, 1988).
A la fecha muchos de los estudios que se realizan con cianobacterias refieren el uso de cepas de
alguna colección específica o el empleo de material de colecta, ya sea para bioensayos de
toxicidad aguda o crónica (Alva et al., 2004; Alva et al., 2007). Son pocos los laboratorios que
cuentan con cepas propias, y por los registros que se tienen en nuestro país, parece que no hay
una colección en la que se cuente con cepas de Microcystis ya caracterizadas de acuerdo a su
potencial toxigénico.
Con respecto a los bioensayos con neonatos de Daphnia magna, no se observó mortalidad de los
organismos expuestos al agua de las colectas, a pesar de haber encontrado en varios casos
florecimientos muy evidentes, con formación de scums y blooms, pero esto no descarta la
posibilidad de que se encontraran presentes metabolitos tóxicos de las cianobacterias, los cuales
posiblemente se encontraban en una concentración subletal. Si solo se toma en cuenta el
resultado de estos bioensayos, se podría caer en el error de subestimar el efecto nocivo que estos
50
florecimientos pueden tener. Por este motivo se requirió de otros métodos para la evaluación del
potencial tóxigénico de la biomasa de los florecimientos, como la exposición al extracto crudo de
la biomasa colectada y cultivada, la PCR y la determinación de microcistinas por el método de
ELISA.
Los resultados obtenidos mediante los bioensayos con el extracto crudo acuoso reflejan lo que
puede suceder durante una exposición aguda al contenido intracelular de la biomasa de
Microcystis, simulando lo que sucede durante la lisis de un “bloom”, aunque no necesariamente se
liberen cianotoxinas al medio. Tal como puede verse en los resultados de los bioensayos de
toxicidad aguda, en algunos de los extractos usados se encontró mortalidad de los organismos de
prueba, mientras que en otros no la hubo. Los datos obtenidos de CL50 oscilan entre los 170 y los
300 mg de biomasa seca/L, los cuales son semejantes a los obtenidos por Sotero-Santos et al.
(2006), donde también se evaluó el efecto del extracto crudo de cepas toxigénicas de Microcystis.
En los bioensayos con biomasa de los sitios de colecta la CL50 determinada fue mayor que la de las
cepas provenientes de esos lugares. Una posible explicación a este fenómeno es el hecho de que
en el mismo sitio, incluso durante el florecimiento, pueden coexistir cepas toxigénicas y no
toxigénicas, dada la gran variabilidad genética que pueden presentar las poblaciones de
cianobacterias (Bañares-España et al., 2007; Saker et al., 2005). Por ello se requiere de una mayor
cantidad de biomasa para causar el mismo efecto en los organismos de prueba. Otra posible
explicación es que cada una de las cepas presentes puede producir diferentes isoformas de
microcistinas (Rohrlack et al., 2001) cuya toxicidad será diferente dependiendo de los
sustituyentes que tenga la molécula básica (un heptapéptido) -las cuales afectan su perfil de
hidrofilicidad- además de las condiciones ambientales (o de prueba) (Prieto et al., 2006).
A pesar de haber encontrado mortalidad de los cladóceros expuestos a dicho extracto, no puede
atribuirse este efecto a las microcistinas, aún cuando la cepa empleada contenga los genes para la
biosíntesis de estas cianotoxinas, pues pueden no expresarse bajo las condiciones de cultivo, por
lo que resulta importante seguir algún método analítico para cuantificación de microcistinas, como
la prueba de ELISA, con la cual detectamos a los aislados que son productores de microcistinas
(bajo las condiciones de cultivo). El efecto adverso observado en los cladóceros puede ser debido a
la interacción de diversos compuestos celulares y no a uno solo en particular. Se sabe que las
cepas de Microcystis pueden producir más de una variedad de microcistinas y otros compuestos
como aeruginosinas, anabaenopeptinas y otros compuestos no identificados a la fecha (Saker et
al., 2005), cuyas interacciones aún no han sido caracterizadas.
Para evaluar de manera integral el efecto de las células completas de Microcystis aeruginosa
LB2385 sobre el desarrollo de Daphnia magna se llevó a cabo la prueba de consumo, en la cual se
midieron diferentes respuestas, como el aumento de talla y la reproducción, encontrando que las
diferencias respecto al testigo pueden ser debidas por una parte a la deficiencia nutricional que
51
algunos autores refieren con respecto al consumo de cianobacterias por parte de los cladóceros.
Esto puede indicar que la reducción en las respuestas evaluadas con respecto al testigo
(alimentado con A. falcatus) puede deberse a una diferencia en los componentes celulares de
ambas especies, siendo más fácilmente asimilable la microalga que la cianobacteria, que a pesar
de ser consumida puede no ser digerida y/o asimilada. Para comprobar esto sería necesario hacer
la disección del tracto digestivo de los cladóceros para observar el grado de descomposición del
alimento, lo cual nos daría información más precisa del aprovechamiento de los microorganismos
filtrados por D. magna. También se sugiere realizar análisis bromatológicos, pero aunque la
cantidad de proteínas, lípidos y carbohidratos fueran muy semejantes, no quiere decir que sean
igualmente asimilables por los cladóceros, aunque en conjunto podrían ayudar a definir la calidad
nutricional de la cianobacteria empleada.
Por otro lado, la sobrevivencia de los organismos que estuvieron expuestos a una mayor cantidad
de células toxigénicas fue menor, viéndose reducida a la mitad hacia el final de la prueba. Este
puede ser un indicador de que a medida que aumenta la biomasa de Microcystis aumenta el
efecto tóxico sobre los organismos, pues no solo están en contacto con los metabolitos de las
cianobacterias al lisarse, sino también al consumirlas. Además, se ha documentado que el
contacto con algunos componentes de la pared de las cianobacterias podría afectar
negativamente a sus consumidores (Best et al., 2002). Si todos estos efectos se suman, es posible
suponer que los organismos expuestos a Microcystis tenderán a gastar más energía en
mecanismos de detoxificación que en otras respuestas biológicas evaluadas, como la reproducción
o el crecimiento. Para poder discriminar entre el efecto de las toxinas y de la alimentación podría
sugerirse seguir un esquema de trabajo diferente, en el cual se complemente la dieta de los
cladóceros con alguna microalga.
Al comprobar el efecto adverso del extracto crudo o la intoxicación por el consumo de Microcystis
aeruginosa por D. magna, es necesario tomar en cuenta los resultados obtenidos mediante la PCR,
pues el hallazgo o no de los genes responsables para la biosíntesis de estos compuestos pueden
orientar mejor la búsqueda de los elementos tóxicos presentes en el material de prueba, sin
descartar la posible interacción con los demás componentes celulares.
En un inicio se planteó tan solo el uso de los iniciadores mcyA-Cd, los cuales amplifican una región
de los genes involucrados en la biosíntesis de las microcistinas (300 bp), sin tomar en cuenta otras
características moleculares para poder definir si la especie de prueba se trata realmente del
género de interés. Por esta razón, se introdujeron dos pares de iniciadores más, uno para la
amplificación de un fragmento del operón de la ficocianina (650 bp) y el otro una región del gen
ribosomal 16S (220 bp). El primero de ellos funciona como un testigo positivo de la presencia de
DNA de cianobacterias, al ser estas las únicas que llevan a cabo la síntesis de ficocianina; mientras
que el segundo par de iniciadores amplifican una región del gen 16S rRNA solo del género
52
Microcystis, es decir, son te tipo genérico. De manera tal que al obtener los tres amplificados se
puede establecer con claridad que se trata de una cianobacteria del género en estudio que en su
genoma tiene incluidos los genes mcyA, los cuales le confieren el potencial para producir estas
hepatotoxinas.
De acuerdo con Hisbergues et al. (2003), la presencia de los genes mcyA muestra una buena
correlación con la capacidad de las cepas para producir microcistinas, sin embargo, puede no ser
del todo cierta, dado que se requiere de todos los genes del cluster para que se lleve a cabo la
síntesis de estas toxinas, pues la falta o mutación en uno de ellos impediría este proceso
bioquímico (Pearson et al., 2004). También se ha informado de una cepa con mutación en uno de
los genes mcy que tiene la capacidad para afectar a los dáfnidos expuestos (Kaebernick et al.,
2001).
Al encontrar estos genes en DNA de la biomasa total de los sitios de colecta se esperaba que al
menos uno de los aislados los presentara, y ha sido posible identificar aislados con dichos genes.
En los cuerpos de agua donde se han encontrado estos genes a partir de la biomasa total,
pudieran no estar relacionados con la presencia de Microcystis, sino con otro género productor.
En las cepas de referencia obtenidas de la colección de la Universidad de Texas (UTEX), se ha
encontrado que la cepa reportada como no toxigénica (LB2386) presenta los genes para la
biosíntesis de microcistinas. Es un hecho que puede explicarse de manera sencilla. Seguramente la
caracterización de la cepa se hizo mediante técnicas químicas o biológicas, como la inhibición de la
fosfatasa, HPLC, bioensayos, etc. por los cuales pudo no haber sido detectada. También es posible
que las condiciones de cultivo no favorezcan la expresión de los genes mcy, y por ello no hay
metabolito que cuantificar. Ahora, al usar una técnica más sensible como la PCR, podemos
encontrar cepas aparentemente no toxigénicas pero que presentan estos genes. Con estos datos
podríamos definir a las cepas como potencialmente toxigénicas dado que no sabemos si hay o no
expresión de los genes mcy. El paso siguiente, sería el diseño experimental que nos permita
evaluar bajo que condiciones de cultivo pueden expresarse estos genes y comprobar si son o no
productoras de microcistinas. Actualmente existe controversia en con el concepto de expresión
entre diversas áreas de las ciencias biológicas. Algunos grupos de investigación que trabajan con
biología molecular le llaman así a la síntesis del mRNA, pero por otro lado, la gente dedicada a la
fisiología le llama expresión a aquella actividad enzimática o metabolito que pueda ser
cuantificado. Con este concepto podemos hacer mención que algunas de las cepas aisladas, que
presentan los genes mcy, los están expresando, pues ha sido posible la cuantificación de las
microcistinas en ellos. No en todas las cepas fue posible cuantificarlas, por las razones que han
sido expuestas con anterioridad. En algunos casos no fue posible determinar la CL50, lo cual sugería
la falta de expresión de estos genes, sin embargo, al realizar el ELISA se encontró que la cantidad
de microcistinas era muy similar a la de otros aislados con los cuales se obtuvo el 100% de
53
mortalidad. Con el ELISA no es posible determinar el tipo de microcistina presente, solo se da el
resultado de microcistina total. Sabiendo que hay más de 70 variedades de microcistinas y que
tienen propiedades fisicoquímicas, toxodinámicas y toxocinéticas diferentes, sería importante
poder discriminar entre ellas para saber el porque de esta aparente contradicción. Otra posible
explicación es que a pesar de ser una de las técnicas más sensibles, el ELISA tiene el inconveniente
de que puede generar falsos positivos. Por ello, considero que debe contarse con más de un
método para la determinación de estas cianotoxinas, como puede ser la cromatografía de líquidos
acoplada a espectrometría de masas, con la cual incluso se puede conocer las probables isoformas
en las muestras.
Es importante mencionar que las microcistinas no son las únicas cianotoxinas que pudieran estar
relacionadas con el efecto tóxico sobre los organismos. El hecho de no detectar la presencia de
estos genes solo hace referencia a uno de los grupos de toxinas que este género tiene la capacidad
de producir, ya que puede sintetizar una gran variedad de compuestos tóxicos (Czarnecki et al.,
2006; Saker et al., 2005).
Con la falta de amplificación de los genes mcy puede descartarse la participación de las
microcistinas en el proceso de intoxicación de los cladóceros expuestos, pero no así la presencia
de otras variedades de cianotoxinas, para las cuales será necesario en un futuro, seguir un diseño
experimental que nos permita ponerlas de manifiesto.
Finalmente mediante la secuenciación y BLAST de los productos de PCR ha sido posible identificar
los aislados obtenidos como integrantes del género Microcystis, teniendo ambas secuencias una
identidad máxima de 95-100% respecto a las secuencias depositadas a la fecha en el GenBank,
algo que confirma el resultado obtenido mediante la PCR múltiple, con el cual es posible afirmar
que los aislados pertenecen al género Microcystis y tienen en su genoma la información para la
biosíntesis de microcistinas. La mayoría de las secuencias coloca a estos aislados con diversas
especies del mismo género, las cuales pueden no ser tan representativas, dado que la
identificación inicial debe realizarse mediante claves taxonómicas, las cuales pueden causar
conflicto dado que algunas de las características tomadas en cuenta como el tamaño de la colonia
y célula pueden traslaparse entre las diferentes especies de este género. Es por ello que Otsuka et
al. (2001) proponen la unificación de las especies de Microcystis en una sola, puesto que
comparten una gran similitud genética.
54
Conclusiones.
Microcystis spp puede estar presente en una gran variedad de ambientes acuáticos, sin
embargo, requiere de ciertas condiciones para su desarrollo: elevadas concentraciones de
nitrógeno y fósforo además de pH alcalino, sin verse afectada aparentemente por la
salinidad del medio, pues incluso se le ha encontrado coexistiendo con Spirullina sp.
(Arthrospira sp.) en el Lago de la Alameda Oriente en el quinto estanque, donde la salinidad
llega a ser de 2.4 unidades de salinidad.
El aislamiento de esta cianobacteria requiere un medio en el cual todos los componentes
presenten un estado soluble al pH de trabajo y así estar disponibles para la nutrición
mineral de Microcystis spp. El medio que ha presentado esta ventaja es la modificación
hecha aquí al medio de cultivo Z8.
Los ensayos de toxicidad aguda muestran que hay una respuesta de intoxicación aguda del
cladócero Daphnia magna a las concentraciones de prueba, siendo posible establecer en
algunos casos una CL50 relativamente baja, indicando que existen metabolitos que afectan la
sobrevivencia de los organismos expuestos.
Los efectos adversos sobre los organismos de prueba pueden ser debidos a un compuesto
tóxico como las microcistinas, pero también pueden ser el resultado de la interacción de las
diversas sustancias presentes en el extracto crudo y que pueden también generar
respuestas de intoxicación.
La calidad nutricional del alimento así como la presencia de sustancias tóxicas, en este caso
microcistinas, generan una baja en las respuestas biológicas evaluadas (reproducción,
crecimiento, sobrevivencia), pero es necesario el diseño de experimentos que nos permitan
evaluar la interacción entre estos dos factores.
La presencia de los genes mcyA pueden estar relacionados con la capacidad de las cepas
para producir microcistinas, sin embargo, pueden existir diversos factores que no permitan
su expresión.
55
Anexo 1. Extracción de DNA por el Método de CTAB.
1. Alícuotas de 10mL de cultivo se obtienen de manera aséptica en tubos para centrífuga de
15 mL.
2. Se centrifugan a 3000G durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se descarta el
sobrenadante y el paquete celular puede guardarse en congelación hasta su utilización.
3. Resuspender el paquete celular con una cantidad mínima de agua destilada estéril.
4. Colocar en un mortero frío, adicionar nitrógeno líquido a la muestra y triturar.
5. Agregar 2-4 mL de CTAB 2% a 65º C.
6. Agregar un volumen de cloroformo: alcohol isoamílico 24:1 y mezclar bien con vortex.
7. Centrifugar a máxima velocidad por 10 minutos a temperatura ambiente.
8. Recuperar la fase acuosa.
9. Agregar 1/10 volúmenes de regulador CTABII y 1.1 volúmenes de cloroformo: alcohol
isoamílico.
10. Mezclar con vortex.
11. Centrifugar a máxima velocidad por 10 minutos a temperatura ambiente.
12. Recuperar la fase acuosa.
13. Agregar 1 volumen de cloroformo: alcohol isoamílico. Repetir desde el paso 10. Recuperar
la fase acuosa.
14. Adicionar 1 volumen de isopropanol frío (-20º C) y mezclar ligeramente.
15. Dejar a -20º C durante 12 horas.
16. Centrifugar a máxima velocidad durante 15 minutos a 4º C.
17. Decantar y lavar con etanol al 70%.
18. Centrifugar a máxima velocidad durante 15 minutos a 4º C.
19. Decantar y evaporar el etanol.
20. Resuspender el DNA de cada tubo en 30 µL de agua desionizada estéril y colocar el
contenido de todos los tubos en uno solo.
21. Correr un gel para comprobar la integridad y pureza del DNA.
56
Anexo 2. Cuadro comparativo de los componentes de los medios minerales
empleados en el aislamiento de Microcystis spp. (Rippka, 1988a).
Macronutrientes:
Concentración mM en el medio.
Componente ASM1 BG11 Z8
NaNO3 2.00 17.65 5.49
K2HPO4 0.10 0.18 0.18
Na2HPO4 0.10
MgSO4 0.20 0.30 0.10
MgCl2 0.20
CaCl2 0.20 0.25
Ca(NO3)2 0.25
Na2CO3 0.19 0.20
EDTA disódico 0.020 0.01
EDTA disodio-magnesio 0.01
Ácido cítrico 0.03
Citrato férrico amoniacal 0.03
FeCl3 0.004 0.01
Micronutrientes:
Concentración µM en el medio. Nombre de
la solución
de metales
traza Medio Al B Br Cd Co Cr Cu I Mn Mo Ni V W Zn
BG11 46 0.17 0.32 9.2 1.6 A5 + Co
Z8 0.1 5 0.1 0.05 0.05 0.01 0.05 0.05 1 0.05 0.05 0.01 0.01 0.1 Graffron
ASM1 40 40 0.08 0.0008 7 3.2 A5
Las cantidades en negritas son los elementos que no se usaron en la preparación de la solución de micronutrientes
empleada en este trabajo.
57
Anexo 3. Datos de la prueba de consumo de Microcystis aeruginosa LB2385 por
Daphnia magna Straus.
Alimento: A. falcatus. Concentración: 400,000 células/mL Fotoperiodo: 16 horas luz/8 horas
oscuridad. Temperatura: 25° C.
Réplica
Edad 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
6 2 2 4 1 2 0 2 4 4 0
7 0 1 0 0 0 2 0 0 0 0
8 0 4 0 0 0 0 0 0 0 6
9 8 5 15 12 11 9 12 10 12 6
10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
11 17 8 10 0 0 0 0 0 0 0
12 0 15 4 22 21 18 23 16 0 21
13 0 0 0 0 0 0 0 0 15 0
14 18 16 28 26 28 26 27 28 0 25
15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
16 17 21 0 0 0 0 0 0 21 27
17 0 18 21 28 30 24 23 24 0 0
18 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
19 32 0 35 33 20 29 32 32 28 28
20 0 28 0 0 0 0 0 0 0 0
21 16 23 0 0 0 0 0 0 10 2
Total 110 141 117 122 112 108 119 114 90 115
No. Camadas 7 11 7 6 6 6 6 6 6 7
Individuos Promedio/ camada 15.7 12.8 16.7 20.3 18.7 18 19.8 19 15 16.4
Edad Primera reproducción. 6 6 6 6 6 7 6 6 6 8
58
Tratamiento: (4M). Alimento: Microcystis aeruginosa. Concentración: 1.26 mg/mL
Fotoperiodo: 16 horas luz /8 oscuridad. Temperatura: 25° C.
Réplica
Edad 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
12 0 0 0 M 0 0 0 0 M 1
13 M 0 0 M 0 1 0 0 M 0
14 M 0 0 M 0 0 0 0 M 1
15 M 0 0 M 0 0 0 0 M 0
16 M 0 0 M 0 0 0 0 M M
17 M 0 0 M 0 0 0 0 M M
18 M 0 0 M 0 0 0 0 M M
19 M 0 0 M 0 1 0 0 M M
20 M 0 0 M 0 0 0 0 M M
21 M 0 M M 0 0 0 2 M M
Total
0 0 0 0 0 2 0 2 0 2
Número de camadas
0 0 0 0 0 2 0 1 0 2
Individuos Promedio/
camada
0 0 0 0 0 1 0 2 0 1
Edad Primera
reproducción.
0 0 0 0 0 13 0 21 0 12
M, muerto
59
Tratamiento: (M). Alimento: Microcystis aeruginosa. Concentración: 0.321 mg/mL
Fotoperiodo: 16 horas luz /8 oscuridad. Temperatura: 25° C.
Réplica
Edad 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
14 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
16 0 0 M 0 0 0 0 0 M 0
17 0 0 M 0 0 0 0 0 M 0
18 0 0 M M 0 0 0 0 M 0
19 0 2 M M 0 0 0 1 M 0
20 0 0 M M 0 0 0 0 M 0
21 0 0 M M 1 0 0 0 M 0
Total
1 2 0 0 1 0 0 1 0 0
No. Camadas
1 1 0 0 1 0 0 1 0 0
Individuos Promedio/
camada
1 2 0 0 1 0 0 1 0 0
Edad Primera
reproducción.
14 19 0 0 21 0 0 19 0 0
60
Anexo 4. Secuencias de los productos de PCR del gen ribosomal 16S
rRNA.
Aislado AO2-3
NNCCGCGTAGCTGCGCCGATAGCTGTTGGTGGGGTAGAGCCCTACCAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGAGCAGCC
ACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAA
CGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTTGGATTAANNNNNNNNNNNNNNNNNN
Aislado AO3-15
NNGGGGCGTGAGCTGCTCTGATATCANNTGGGGGGGTAAAGCCTACCATGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGAGCAGC
CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCA
ACGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTTGGATTANNNNNNNNNNNNNNNNNN
Aislado Ch5
NNNNAAGCTGAACTGCTTTGATATCAGNTGGNGGGGTAAGGCCTACCAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGAGCAGC
CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCA
ACGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTTGGATTAAANNNNNNNNNNNNNNNN
Aislado Ch 10
CTCTTTTGGTATTATACCTCCGCCAGGCACGGCCACAAACCTGAGAACACTGCATAGTCTGCGTGATGCAAACGTCGCATATACTACC
CCGCGGACACGGCAGTCAGCGTATGACTAACTATCCGTCGTGCCATGATCAGTCTAGGTACGCTACGTCCCATGCGAGACCACCGAC
TTCGGAATATACAACACGAGGTGGTCCGGTGTCCGCCCTGCGACGTCCTG
Aislado Ch 17
NNNCCCGGAAGCTGCGTCGATTACAGNTGGTGGGGTAAGGCCTACCAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGAGCAGCC
ACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAA
CGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTTGGATTAANNNNNNNNNNNNNNNNNN
Aislado Ch 20
NNGGCCGCGAACTACGTTTGATATCANNTGGTGGGGTAAGGCCCTACCAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGAGCAG
CCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGC
AACGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTTGGATTAANNNNNNNNNNNNNNNNN
Aislado PORC2
NNNCCAGGGAGCTGCTTGATATCAGNTGGTGGGGTAGAGCCTACCAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGAGCAGCCA
CACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAAC
GCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTTGGATTANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
Aislado PORC 4
NNCCCCGCTGACCTGGTTTGATATCAGNTGGTGGGGTAGAGCCTACCAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGAGCAGCC
ACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAA
CGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTTGGATTAANNNNNNNNNNNNNNNNN
Aislado PORC 10
61
NNNNNGGTCTGAAGTAGGTTTGATACNANTTGGGGGGGGTAGAGCCCTACAGGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGA
GCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACG
GAGCAACGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTTGGATTATNNNNCNNNNNNNN
LB2385
TTTCGACGCGGACAATCAAAGAGATTTGTTGNNGNNNTANAGCCTACCAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGAGCAG
CCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGC
AACGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTTGGATTAACNNNCNNNCNNNNNNC
LB2386
NNNNTTCGTAGCTGCGCGATAGCAGNTGGTGGGGTAGAGCCTACCAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGAGCAGCCA
CACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAAC
GCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTTGGATTAAANNNNNNNNNNNNNNNNNN
Aislado V4
NNGGTCGCTAACTGGTATTATTACTGTTGGTGGGGTAGAGCCTACCAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGAGCAGCCA
CACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAAC
GCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTTGGATTAAANNNNNNNNNNNNNNNNN
Aislado Z1
NACGGGTAAAATTGAACTGATAAGAGNTGCTGGGGCAAGAGCCTCCTTCGCGTCCATCACTAAAGGGTGCGAAAGGAAAGACGCTC
CAAGGGGCGTATGAAAACTGGAACCGTAGGGGCAAGGTATGCAGAAATGAGCCTAATTTCTTCTTCGCCATCAGCTGCTTCTAGCCG
TCCATTAGAGACTGAACCCGTGACATTGTCCTACTGATTATTCAGTAAACTTAAT
Secuencias de los productos de PCR del gen mcyA-Cd. Aislado AO3 NNNCCCCTACTTGCTCTGATTCCAGAATGGGNNNCTTCGCCAGATAAGCATTCTCTTTCACATCAAAAGCTTGCTTAACTAAATCGCTCCAAAGGCCTCCAGATAACTCTAAACGTAGGGGCAAAGTATTCAAAAATAAACCTAATATCTTTTCCCCATCGGCTGCTTCTAACCGTCCATTAGAGACTAAACCCGTAACACTATACCTCTGATTATTCAGTAAACTTAAAACCCGAAGATGCGCCGGCAATAGAATACATATAAACGGCTGGGCGTAACAAGTTCTTTGCGGTGAAAAAAGTTCAA Aislado A15 NNNNNAAGTAGACTTGTATACCGAGTAGGATTCTTCGCCAGATAAGCATTCTCTTTCACATCAAAAGCTTGCTTAACTAAATCGCTCCAAAGGCCTCCAGATAACTCTAAACGTAGGGGCAAAGTATTCAAAAATAAACCTAATATCTTTTCCCCATCGGCTGCTTCTAACCGTCCATTAGAGACTAAACCCGTAACAATATCCCTCTGATTATTCAGTAAACTTAATACCCGAAAATGAGCCGCTAATAAAACACTTTTAAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN Aislado Ch 5 NGGGCCAGTATGAAGCTAATAATATTTAAGGNNTCTTCGCCAGATAAGCATTCTCTTTCAACATCAAAAGCTTGCTTAACTAAATCGCTCCAAAGGCCTCCAGATAACTCTAAACGTAGGGGCAAAGTATTCAAAAATAAACCTAATATCTTTTCCCCATCGGCTGCTTCTAACCGTCCATTAGAGACTAAACCCGTAACAATATCCCTCTGATTATTCAGTAAACTTAATACCCGAAAATGAGCCGCTAATAAAACACTTTTAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN Aislado Ch 10 NGGGGAAGTCTGCAGTAATATATTTAAGGNNNCTTCGCCAGATAAGCATTCTCTTTCAACATCAAAAGCTTGCTTAACTAAATCGCTCCAAAGGCCTCCAGATAACTCTAAACGTAGGGGCAAAGTATTCAAAAATAAACCTAATATCTTTTCCCCATCGGCTGCTTCTAACCGTCCATTAGAGACTAAACCCGTAACAATATCCCTCTGATTATTCAGTAAACTTAATACCCGAAAATGAGCCGCTAATAAAACACTTTTAAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN Aislado Ch17 GGGCGAGAGGGAGTTCGTTATAATTATTTATGNTGAGTAGGNNNTTNTNCTTTGCCGCGCCGCCGAGAATATAGCGCGGTGTGCAC
62
TCCCTTATCTGCACAATTCCTGATAGAGGCGCTCGCCCCCTCTATTTTATATAATACTGACACCGCGCGAGAGAGGGTCTCTCGCACGAGATGATACCATACCTTAAATCCGCGTCGTGTGCGCGCAAGATGGTATTCTCGACAAGATAGTCCATACTGCTTATAGTCATACCTCTCTATCACCCCAGGTCGAAGCGTGTCGGTTACATAAACA Aislado Ch 20 GGGCCAGTCTGCACTATACAATTTAAGGNNTCTTCGCCAGATAAGCATTCTCTTTCAACATCAAAAGCTTGCTTAACTAAATCGCTCCAAAGGCCTCCAGATAACTCTAAACGTAGGGGCAAAGTATTCAAAAATAAACCTAATATCTTTTCCCCATCGGCTGCTTCTAACCGTCCATTAGAGACTAAACCCGTAACAATATCCCTCTGATTATTCAGTAAACTTAATACCCGAAAATGAGCCGCTAATAAAACACTTTTATANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN Aislado PORC 2 NNNNNAAAGTGCGATTGTACTCGCGAGGGGATTCTTCGCCAGATAAGCATTCTCTTTCACATCAAAAGCTTGCTTAACTAAATCGCTCCAAGGGCCTCCAGATAACTCTAAACGTAGGGGCAAAGTATTCAAAAATAAACCTAATATCTTTTCACCATCGGCTGCTTCTAACCGTCCATTAGAGACTAAACCCGTAACAATATCCCTCTGATTATTCAGTAAACTTAATACCCGAAAATGAGCCGCTAATAAAACACTTTTAAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN Aislado PORC4 NNNNNNACGTCGATTTGTACTCGCGAGGGGATATCTTCGCCAGATAAGCATTCTCTTTCAACATCAAAAGCTTGCTTAACTAAATCGCTCCAAGGGCCTCCAGATAACTCTAAACGTAGGGGCAAAGTATTCAAAAATAAACCTAATATCTTTTCACCATCGGCTGCTTCTAACCGTCCATTAGAGACTAAACCCGTAACAATATCCCTCTGATTATTCAGTAAACTTAATACCCGAAAATGAGCCGCTAATAAAACACTTTTAAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN Aislado PORC 10mcy NNNNNNACGTCGATTTGTACTCGCGAGGGGATTCTTCGCCAGATAAGCATTCTCTTTCAACATCAAAAGCTTGCTTAACTAAATCGCTCCAAGGGCCTCCAGATAACTCTAAACGTAGGGGCAAAGTATTCAAAAATAAACCTAATATCTTTTCACCATCGGCTGCTTCTAACCGTCCATTAGAGACTAAACCCGTAACAATATCCCTCTGATTATTCAGTAAACTTAATACCCGAAAATGAGCCGCTAATAAAACACTTTTAAAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN LB2385 NGGCCCAGCATGAGCTAATAACACTTTATAGGNTTCTTCGCCAGATAAGCATTCTCTTTCACATCAAAAGCTTGCTTAACTAAATCGCTCCAAAGGCCTCCAGATAACTCTAAACGTAGGGGCAAAGTATTCAAAAATAAACCTAATATCTTTTCCCCATCGGCTGCTTCTAACCGTCCATTAGAGACTAAACCCGTAACAATATCCCTCTGATTATTCAGTAAACTTAATACCCGAAAATGAGCCGCTAATAAAACACTTTTATANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN LB2386 NNNNNAAGGAGACGTTGTAACACTTTTAGGATTCTTCGCCAGATAAGCATTCTCTTTCAACATCAAAAGCTTGCTTAACTAAATCGCTCCAAAGGCCTCCAGATAACTCTAAACGTAGGGGCAAAGTATTCAAAAATAAACCTAATATCTTTTCCCCATCGGCTGCTTCTAACCGTCCATTAGAGACTAAACCCGTAACAATATCCCTCTGATTATTCAGTAAACTTAATACCCGAAAATGAGCCGCTAATAAAACACTTTTAAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN Aislado Z1 GGGCCCATCTAAGTTATATATATTTAAGGNNNCTTCGCCAGATAAGCATTCTCTTTCAACATCAAAAGCTTGCTTAACTAAATCGCTCCAAAGGCCTCCAGATAACTCTAAACGTAGGGGCAAAGTATTCAAAAATAAACCTAATATCTTTTCCCCATCGGCTGCTTCTAACCGTCCATTAGAGACTAAACCCGTAACAATATCCCTCTGATTATTCAGTAAACTTAATACCCGAAAATGAGCCGCTAATAAAACACTTTTAAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN Aislado VV4 NNNNNAAGCATGACGTTATAAAATTTATAGGNNNCTTCGCCAGATAAGCATTCTCTTTCAACATCAAAAGCTTGCTTAACTAAATCGCTCCAAAGGCCTCCAGATAACTCTAAACGTAGGGGCAAAGTATTCAAAAATAAACCTAATATCTTTTCCCCATCGGCTGCTTCTAACCGTCCATTAGAGACTAAACCCGTAACAATATCCCTCTGATTATTCAGTAAACTTAATACCCGAAAATGAGCCGCTAATAAAACACTTTTAAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
63
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