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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
“EVALUACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ARSÉNICO EN AGUA EMPLEANDO BIOSENSORES
MICROBIANOS”
T E S I S
Q U E P A R A O B T E N E R E L G R A D O D E : MAESTRO EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS
P R E S E N T A
Q.B.P OLIVER VALENZUELA ROSAS
Directoras de Tesis
Dra. Enriqueta F. Amora Lazcano Dra. Sofía E. Garrido Hoyos
MÉXICO, D.F. 2010
El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Bioquímica Microbiana
y el Laboratorio de Fitopatología del departamento de Microbiología en la
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, bajo la dirección de la Dra.
Enriqueta Feliciana Amora Lazcano y la Dra. Sofia Esperanza Garrido
Hoyos.
El sustentante fue becario del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología
(CONACyT), en el periodo de Febrero 2008 a Diciembre 2009 y del
Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI) durante el
mismo periodo.
Este trabajo fue financiado por la Secretaría de Investigación y Posgrado
(SIP) mediante los proyectos SIP-20080976 y SIP-20090553 para la Dra.
Enriqueta Feliciana Amora Lazcano; para la Dra. Sofía Esperanza
Garrido Hoyos el proyecto SEP/CONACYT- 2004-C01-47076.
AGRADECIMIENTOS
Dra. Enriqueta Amora Lazcano por la confianza y paciencia depositada en mí para la
realización de este proyecto y por ser más que mi maestra, mi segunda mamá en todos
estos años.
Dra. Sofía Garrido Hoyos por compartir sus conocimientos conmigo y por confiar en mí a
pesar de no conocerme tanto.
Dra. Thelma Villegas Garrido por la valiosa ayuda proporcionada para la interpretación de
mis resultados
A los sinodales por todas las observaciones realizadas a mi trabajo y los consejos
proporcionados a lo largo de este tiempo.
A mis compañeros, Selene, Claudia, Denisse, Francisco, Héctor, Josam y Ariana.
A la nueva familia que me recibió con los brazos abiertos en su laboratorio Prof.
Cristina, Dr. Luis, Prof. Isaac, Prof. José Luis y David.
i
ÍNDICE GENERAL
Índice general i
Índice de figuras iv
Índice de tablas vii
Abreviaturas viii
Glosario ix
Resumen x
Abstract xi
I. Introducción. 1.1 El Arsénico 1
1.2 Características químicas 1
1.3 Química del arsénico en el agua 2
1.4 Ciclo del arsénico 4
1.5 Fuentes ambientales de exposición 6
1.6 Efectos tóxicos del arsénico en el hombre 7
1.6.1 Toxicocinética 7
1.6.2 Absorción 7
1.6.3 Distribución 7
1.6.4 Biotransformación 8
1.6.5 Excreción 9
1.6.6 Toxicodinamia 9
1.7 Mecanismos de toxicidad 10
1.8 Efectos adversos 10
1.8.1 Efectos agudos 10
1.8.2 Efectos crónicos 11
1.9 Presencia del arsénico en agua en diferentes estados
de la República Mexicana 12
II. Antecedentes 14
2.1 Métodos de análisis del arsénico en el agua 14
2.1.1 Métodos convencionales 14
2.1.2 Métodos no convencionales 15
ii
2.1.2.1 Wagtech Arsenator digital 15
2.1.2.2 Biosensores 16
2.1.2.2.1 Genes reporteros y usos 18
2.1.2.2.2 Ventajas y desventajas 22
2.1.2.3 Biosensor para la detección de Arsénico en agua
(E. coli modificada) 22
2.1.2.3.1 Construcción de los biosensores 24
2.1.2.3.2 Fundamento de los biosensores 27
III. Justificación 30
IV. Objetivos generales 31
4.1 Objetivos particulares 31
V. Materiales y métodos. 32
5.1 Muestra biológica 32
5.2 Medio de cultivo empleado 32
5.3 Solución patrón de arsénico 32
5.4 Muestras 32
5.5 Verificación de la pureza de las cepas 35
5.6 Conservación de las cepas 36
5.7 Cuantificación de arsénico en muestras de agua utilizando
la cepa de E. coli pMV132-arsR-ABS 36
5.8 Cuantificación de arsénico en muestras de agua utilizando
la cepa de E.coli pJAMA-arsR-ABS 39
5.9 Cuantificación de arsénico en agua por espectrofotometría en línea de absorción
atómica con generación de hidruros 40
5.10 Cuantificación de arsénico en agua utilizando
el Wagtech Arsenator Digital 41
5.11 Prueba semicuantitativa para la detección de arsénico en agua
en muestras de campo 42
5.12 Parámetros estadísticos empleados 43
iii
VI. Resultados 44
6.1 Cuantificación de arsénico en muestras de agua utilizando
la cepa de E. coli pMV132-arsR-ABS 44
6.2 Cuantificación de arsénico en muestras de agua utilizando
la cepa de E.coli pJAMA-arsR-ABS 46
6.3 Cuantificación de arsénico en agua por espectrofotometría en línea de absorción
atómica con generación de hidruros 48
6.4 Cuantificación de arsénico en agua utilizando
el Wagtech Arsenator Digital 48
6.5 Comparación de los métodos utilizados para evaluar la concentración de
arsénico en agua 49
6.6 Concentraciones de las muestras problema 50
6.7 Prueba semicuantitativa para la detección de arsénico
en agua en campo 52
VII. Discusión 54
VIII. Conclusiones 60
IX Perspectivas 61
X. Anexo 62
XI. Bibliografía 69
iv
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1 Estructura química del gas 2-cloroetenildicloroarsina (tomado de URL-1).
1
Figura 2
Representación esquemática de las estructuras químicas que presenta el arseniato (A) y arsenito (B) (tomado de URL-2, URL-3).
2
Figura 3 Diagrama pH-Eh de especies de arsénico en agua (Ferguson y Galvis, 1972).
3
Figura 4
Representación esquemática del ciclo del arsénico (modificado de (Mukhopadhyay et al., 2002).
5
Figura 5 Origen del arsénico en restos minerales (tomado de (Liu et al., 2008).
6
Figura 6 Biotransformación del arsénico inorgánico (modificado de Heck et al., 2009).
8
Figura 7
Lesiones hipercromicas causadas por el consumo de arsénico en agua por periodos muy prolongados (Tomado de URL-5).
11
Figura 8
Estados de la República Mexicana en la cual se han reportado concentraciones de arsénico en fuentes de abastecimientos de agua potable que sobrepasan la norma oficial.
13
Figura 9
Método no convencional para la cuantificación de arsénico de la marca Wagtech Arsenator Digital Kit (tomado de URL-6).
15
Figura 10
Representación esquemática de los eventos celulares que dan lugar a la expresión de la proteína reportera; el analito pasa a través de la membrana celular y se une a una proteína reguladora, activando la transcripción y traducción del gen reportero, tras la adición un sustrato externo se produce una señal fácil de medir (tomado de Daunert et al., 2000).
17
Figura 11
Representación esquemática del operón de resistencia a arsénico, está conformado por tres genes estructurales (arsA,arsB, arsC) y dos genes reguladores (arsD , arsR).
23
Figura 12
Representación esquemática del plásmido de E. coli pMV132-arsR-ABS (Stocker et al., 2003).
25
Figura 13
Representación esquemática del plásmido de E. coli pJAMA-arsR-ABS (Stocker et al., 2003).
26
v
Figura 14
Principio del biosensor de E. coli pJAMA-arsR-ABS. (A) La proteína ArsR regula la expresión de los genes reporteros, esta se encuentra unida al sito operador/ promotor de arsR, cuando no hay presencia de arsénico. (B) Cuando se detecta la presencia de arsénico; ésta se une a ArsR cambiando la conformación de la proteína, haciendo que esta se despegue del sitio operador /promotor para la expresión de los genes reporteros (luxA, luxB y lacZ) (Stocker et al., 2003).
27
Figura 15
Representación esquemática de la reacción que lleva a cabo la β-galactosidasa en presencia del ONPG (URL-7).
28
Figura 16 Reacción que lleva a cabo la luciferasa en presencia de su sustrato (n-decanal).
29
Figura 17 Sistema óptico del luminómetro Fluoroskan Ascent Fl, Thermo Electron Corporation.
29
Figura 18 Ubicación topográfica de las muestras manejadas en el estudio.
34
Figura 19
Método químico de la marca Wagtech Arsenator digital para la cuantificación de arsénico en agua.
40
Figura 20
Curva tipo de E. coli pMV132-arsR-ABS, el ensayo se llevo a cabo en un tiempo de incubación de 5 min a 28°C con la adición de SDS al 0.1%, los datos mostrados son el producto de 3 réplicas del ensayo.
43
Figura 21
Curva tipo de E. coli pMV132-arsR-ABS, el ensayo se llevo a cabo en un tiempo de incubación de 10 min a 28°C con la adición de SDS al 0.1%, los datos mostrados son el producto de 3 réplicas del ensayo.
44
Figura 22
Curva tipo de E. coli pMV132-arsR-ABS, el ensayo se llevo a cabo en un tiempo de incubación de 15 min a 28°C con la adición de SDS al 0.1%, los datos mostrados son el producto de 3 réplicas del ensayo.
44
Figura 23
Curva tipo de E. coli pMV132-arsR-ABS, el ensayo se llevo a cabo en un tiempo de incubación de 10 min a 28°C sin la adición de SDS al 0.1%, los datos mostrados son el producto de 3 réplicas del ensayo.
45
Figura 24
Curva tipo de E. coli pJAMA-arsR-ABS, la reacción se llevó a cabo en un tiempo de incubación una hora a 30°C en agitación, los datos mostrados son el producto de 3 réplicas del ensayo.
46
Figura 25
Curva tipo de E. coli pJAMA-arsR-ABS, la reacción se llevó a cabo en un tiempo de incubación de dos horas a 30°C en agitación, los datos mostrados son el producto de 3 réplicas del ensayo.
46
Figura 26 Curva tipo del espectrofotómetro de absorción atómica, con diferentes concentraciones conocidas de arsénico (0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 µM), las cuales fueron tratadas según lo marcado en la norma oficial mexicana.
47
vi
Figura 27
Curva tipo de Wagtech Arsenator digital, la reacción se llevó a cabo en un tiempo de incubación una 20 min a 30°C, los datos mostrados son el producto de 3 réplicas del ensayo.
48
Figura 28A
Prueba semicuantitativa para la detección de arsénico en agua empleando tiras de papel impregnadas con la cepa de E. coli pJAMA-arsR-ABS a diferentes concentraciones, A) 1.5 µL células y 20 µL Xgal (1mg/mL), B) 1.5 µL células y 20 µL Xgal (5mg/mL), C) 3 µL células y 20 µL Xgal (1mg/mL).
52
Figura 28B
Prueba semicuantitativa para la detección de arsénico en agua empleando tiras de papel impregnadas con la cepa de E. coli pJAMA-arsR-ABS a diferentes concentraciones D) 3 µL células y 20 µL Xgal (5mg/mL), E) 9 µL células y 20 µL Xgal (1mg/mL), F) 9 µL células y 20 µL Xgal (5mg/mL).
53
vii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Comparación de la toxicidad aguda de los compuestos arsenicales (Hamdi et al., 2009). 10
Tabla 2 Proteínas represoras, reacciones químicas y métodos de detección empleados en biosensores celulares (modificado de Daunert et al., 2000).
19
Tabla 3A Muestras de agua recolectadas de distintos lugares de la República Mexicana y Guatemala.
33
Tabla 3B Muestras de agua recolectadas de distintos lugares de la República Mexicana y Guatemala.
34
Tabla 4 Comparación de métodos analíticos, empleando pruebas iníciales de desempeño, con un nivel de confianza de p= 0.05 con n-2 grados de libertad.
49
Tabla 5 Resultados obtenidos de las muestras problemas, mediante la interpolación en las curvas tipo para cada método empleado.
50
Tabla 6 Promedio del porcentaje de recuperación (%R) para cada uno de los métodos probados.
50
viii
ABREVIATURAS A.C: Antes de Cristo.
As: Arsénico.
CNA: Comisión Nacional de Agua.
D.O: Densidad óptica.
DNA: Acido desoxiribonucleico.
EAA: Espectrofotometria de absorción
atómica
Fe: Fierro.
FI-HG-AAS: Espectrofotometría de
Absorción Atómica con Generación de
Hidruros.
FMN: Flavina Mononucleótido.
GFP: Proteína Verde Fluorescente.
IMTA: Instituto Mexicano de
Tecnología del Agua.
IPTG: Isopropil β-D-
tiogalactopiranósido.
L: Litro.
L: Luria .
mg: Miligramo.
mL: Mililitro.
OMS: Organización Mundial de la
Salud.
ONPG: o-Nitrofenil β-D
Galactopiranosido.
PCR: Reacción en Cadena de la
Polimerasa.
pH: Potencia de hidrogeno.
RNApol: RNA polimerasa.
rpm: Revoluciones por minuto.
SDS: Dodecil Sulfato de Sodio.
URL: Localizador Uniforme de
Recursos.
RLU: Unidades Relativas de Luz.
µg: Microgramo.
µM: Micromolar.
ix
GLOSARIO
Carcinogénico: Sustancia o agente físico que puede causar cáncer.
Carcinoma: Es una forma de cáncer con origen en células de tipo epitelial o
glandular, de tipo maligno.
Cianosis: La cianosis es la coloración azulada de la piel o de las membranas
mucosas causada por una deficiencia de oxígeno en la sangre.
Edema: Acumulación de líquido en el espacio tisular intercelular o intersticial,
además de en las cavidades del organismo.
Hiperemia: Aumento en la irrigación a un órgano o tejido.
Hiperqueratosis: Trastorno caracterizado por el engrosamiento de la capa externa
de la piel, que está compuesta de queratina.
Hipoproteinemia: Disminución de la concentración de proteínas en la sangre.
Hipovolemia: Disminución del volumen circulante de sangre debido a múltiples
factores como hemorragias, deshidratación, quemaduras, entre otros.
Mutagénico: Sustancia o agente físico que causa mutaciones, es decir, que altera de
forma permanente el DNA de las células.
Sorción: Retención de una sustancia por otra cuando están en contacto
Teratogénico: Cualquier sustancia que produzca defectos de nacimiento no
hereditarios.
x
RESUMEN
El origen más común del arsénico es la oxidación de minerales con un alto contenido en este
elemento, como pueden ser, la arsenopirita, la escorodita y la orpimenta que pueden
aparecer en diferentes ambientes geológicos. La toxicidad del arsénico es conocida a través
de reportes epidemiológicos de cánceres y problemas como la enfermedad de pie negro y
lesiones cutáneas, relacionados con la exposición crónica a arsénico en agua para uso y
consumo humano. En México se han identificado concentraciones de arsénico en fuentes de
abastecimiento de agua que alcanzan valores de 2.348 mg/L, rebasando el límite máximo de
la Norma Oficial Mexicana, 0.025 mg/L. Existen métodos para la cuantificación de arsénico
en agua como la espectrofotometría de absorción atómica, Kits comerciales y el uso de
biosensores. El objetivo de este trabajo es implementar los biosensores microbianos
(Escherichia coli) por medio de técnicas que nos permitan la cuantificación de arsénico en
muestras de agua de diversos orígenes. Se emplearon cepas transformadas de cepas E. coli
pMV132-arsR-ABS y E. coli pJAMA-arsR-ABS la cual tienen insertado un plásmido que les
confiere resistencia a la ampicilina así como genes reporteros que codifican para la β-
galactosidasa y luciferasa respectivamente. Se determinaron las condiciones óptimas de
operación en base a una serie modificaciones a métodos propuestos por Stocker y Van Der
Meer empleando soluciones conocidas de arsénico (0. 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 µM),
posteriormente se evaluaron estos métodos junto con EAA y Wagtech Arsenator digital
mediante un análisis estadístico, encontrándose que el EAA y Wagtech Arsenator digital
presentan mayor sensibilidad así como intervalo de trabajo más amplio y demás no
presentan ningún tipo de efecto matriz en comparación con los biosensores probados. Sin
embargo a pesar de estas desventajas se encontró que estos métodos basados en
biosensores presentaron un porcentaje de recuperación alta con muestras problemas
recolectas en diferentes puntos de la república mexicana y Ciudad de México, lo que indica
que estos pueden ser empleados como métodos alternativos para la cuantificación de
arsénico de agua, los cuales no generan productos tóxicos y son menos costosos. Además
se monto una prueba semicuantitativa con la cepa E. coli pMV132-arsR-ABS, sometiéndola a
una mezcla de diferentes soportes, los cuales ayudan al microorganismo a sobrevivir al
estrés tras la desecación después de colocarlos en tiras de papel Whatman 3M, estas
mismas fueron sometidas a concentraciones de arsénico conocidas (0. 0.05, 0.1, 0.2, 0.4,
0.6, 0.8 y 1.0 µM), encontrándose una buena respuesta con 3µL de células y 20 µL de Xgal
5mg/mL
xi
ABSTRACT
The most common source of arsenic is the oxidation of minerals with a high content of this
element, for example, arsenopyrite, scorodite and orpimenta that may appear in different
geological environments. The toxicity of arsenic is known through epidemiological reports of
cancers and problems such as black foot disease and skin lesions associated with chronic
exposure to arsenic in water for human use and consumption. In Mexico has found
concentrations of arsenic in water sources that reach values of 2.348 mg / L, exceeding the
ceiling of the Norma Oficial Mexicana, 0.025 mg / L. There are methods for the quantification
of arsenic in water as atomic absorption spectrophotometry, commercial kits and the use of
biosensors. The aim of this work is to implement the microbial biosensors (Escherichia coli)
by means of techniques that allow us the quantification of arsenic in water samples from
different origins. We used E. coli pMV132-arsR-ABS y E. coli pJAMA-arsR-ABS strains
transformed, which they have inserted a plasmid that confers resistance to ampicillin and
reporter genes coding for β-galactosidasa and luciferase, respectively. We determined the
optimum operating conditions based on a number changes to methods proposed by Stocker
and Van Der Meer using known solutions of arsenic (0. 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 µM),
these methods were subsequently evaluated with EAA and Wagtech Arsenator digital by
statistical analysis, finding that the EAA and Wagtech Arsenator digital have greater
sensitivity and broader range of work and others do not have any effect compared with the
parent biosensor tested. However was found that methods based of biosensors showed a
high recovery rate problems with samples collected at different points of the Mexican
Republic and Mexico City, indicating that these can be used as alternative
methods quantification of arsenic in water, don’t generate toxic compounds and less
expensive. In addition, a test amount with the strain semiquantitative E. coli pMV132-arsR-
ABS, subjecting a mixture of different materials, which help the organism to survive the stress after
drying after they are placed on strips of Whatman 3M paper, the same were subject to known
concentrations of arsenic (0. 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 µM), found a good answer with
3µL cells and 20 µL of 5 mg / ml Xgal.
1
1. INTRODUCCIÓN
1.1 El Arsénico
Los compuestos arsenicales tienen una larga historia como agentes
medicinales y venenos. Su uso fue descrito desde el año 400 A.C por
Hipócrates, quien recomendó la aplicación de una pasta (AsS) para tratar
ulceras cutáneas. Durante la edad media, el arsénico blanco (trióxido de
arsénico) fue el veneno de elección, debido a su alta toxicidad. Durante la
primera guerra mundial, se desarrollaron y utilizaron como armas químicas los
gases arsenicales, entre ellos el gas Lewisita (Fig. 1) (2-
cloroetenildicloroarsina), que es un potente agente vesicante, irritante local y
tóxico sistémico (Liu et al., 2008).
A principios del siglo pasado, los arsenicales orgánicos se emplearon para
combatir enfermedades como la tripanosomiasis y la sífilis mientras que
algunos compuestos de arsénico inorgánico, se usaron para el tratamiento de
enfermedades pulmonares. Su uso medicinal esta actualmente limitado a
casos avanzados de la enfermedad del sueño y como componente de drogas
antiparasitarias de uso tópico (Liu et al., 2008).
1.2 CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS DEL ARSÉNICO
El arsénico (As) es un elemento ubicuo, está clasificado como metaloide que
junto con el nitrógeno y el fosforo, con los que comparte propiedades,
pertenece al grupo V de la tabla periódica. En el estado oxidado, el As puede
tener las valencias +3 [As(III)] y +5 [As(V)](Georgiadis et al., 2006).
Fig 1 Estructura química del gas 2-cloroetenildicloroarsina (tomado de URL-1)
2
Los compuestos de As (III) forman derivados piramidales con un par de
electrones no compartidos, lo que le permite formar complejos con ácidos de
Lewis y metales de transición. En contraste, los compuestos de As (V) tienen
una estructura trigonal bipiramidal, en los cuales los enlaces suelen ser más
largos. El As (V) no tiene electrones no compartidos, lo que probablemente
contribuye a su estabilidad en la naturaleza (Fig.2) ( Georgiadis et al., 2006).
1.3 QUÍMICA DEL ARSÉNICO EN EL AGUA
El arsénico puede estar presente en cuatro estados de oxidación en el agua;
según las condiciones de óxido-reducción, como arseniato (As5+), arsenito
(As3+), arsina (As3-) o su estado elemental (As0), pero generalmente se
encuentra en las formas trivalente y pentavalente.
Su carácter químico está determinado por el hecho de que cambia
rápidamente de un estado de oxidación a otro, a través de reacciones químicas
o biológicas que ocurren en el ambiente. Así, el control del equilibrio en la
solubilidad y movilidad del arsénico depende de las condiciones de oxido-
reducción, el pH y la actividad biológica (Ferguson & Galvis, 1972). La
especiación del arsénico en el agua, se muestra en la Figura 3, que presenta
las diferentes especies de arsénico en función del pH y el potencial redox.
A B
Fig. 2 Representación esquemática de las estructuras químicas que presenta el arseniato (A) y arsenito (B) (tomado de URL-2, URL-3).
3
En la construcción de este diagrama se asume una sola fase (agua), siendo los
únicos componentes el arsenato, el arsenito y los iones hidrógeno. Un aspecto
sobresaliente del diagrama es que el As (III) se presenta como una especie
soluble sin carga en el intervalo de pH neutro y el As (V) como anión para todo
el intervalo de pH.
Las reacciones ácido–base del arsénico son muy rápidas, pero las de óxido-
reducción son lentas, a menos que se aplique un oxidante fuerte. Las
investigaciones demuestran que el As (III) es estable por varios días en
presencia de oxígeno, es decir, a un potencial redox lo suficientemente alto
para causar la oxidación espontánea a As (V), por lo que esta se lleva a cabo
lentamente. En aguas que contienen oxígeno, el As (V) es predominante,
existiendo en formas aniónicas como H2AsO4-, HAsO4
2- o AsO43- en el pH
común del tratamiento de agua (pH 5-12).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
-0,20
-0,40
-0,60
-0,80
Eh (volts)
3H AsO3
-3
AsO
2 3H AsO-
4HAsO=
-4
H AsO2
4H AsO3
3HAsO=
tot
AGUA CON PODER OXIDATIVO
AGUA CON PODER REDUCTIVO
pH
AsO
4-3
3
Fig. 3 Diagrama pH-Eh de especies de arsénico en agua (Ferguson y Galvis, 1972).
4
Bajo condiciones anóxicas, el As (III) es estable, con especies no iónicas
(H3AsO3) y aniónicas (H2AsO3-), las cuales predominan por arriba y por debajo
de un pH de 9.22, respectivamente. Soluciones fuertemente ácidas o alcalinas,
así como la presencia de sales de cobre, carbón o altas temperaturas pueden
incrementar la tasa de oxidación (Ferguson & Galvis, 1972).
Sustancias como el cloro, el óxido de manganeso, el permanganato y otro tipo
de oxidantes pueden transformar directamente el As (III) en As (V) en ausencia
de oxígeno. Dentro de zonas oxigenadas, el As (V) es estable y puede
permanecer en solución o coprecipitar con óxidos de hierro o manganeso si
éstos se encuentran presentes. Altas concentraciones de ortofosfatos pueden
competir con el As (V) por los sitios de sorción en esta zona, incrementando las
concentraciones de arsénico soluble, así como su movilización (Ferguson &
Galvis, 1972).
La principal vía de dispersión del arsénico en el ambiente es el agua. Aún si se
considera la sedimentación, la solubilidad de los arseniatos y arsenitos es
suficiente para que este elemento se transporte en los sistemas acuáticos. La
concentración del arsénico en aguas naturales frescas es muy variable y
probablemente depende de las formas de arsénico en el suelo (URL-4).
1.4 CICLO DEL ARSÉNICO
Las industrias que son la mayor fuente de contaminación al ambiente con
arsénico son: la quema de carbón, la metalúrgica y más recientemente la de
los semiconductores; así como, la liberación de minerales ricos en arsénico por
la industria minera (Fig. 4).
5
El arseniato es absorbido por organismos marinos que van desde el
fitoplancton, algas, crustáceos, moluscos y peces; estos los convierten en
pequeños compuestos orgánicos (tales como: el acido metilarsonico ó el acido
dimetilarsinico) o se convierten en forma de depósitos orgánicos, los cuales
son excretados al medio (Mukhopadhyay et al., 2002).
Sin embargo, algo de ese arsénico es retenido por el fitoplancton que lo
metaboliza a compuestos orgánicos complejos. La transformación del arsénico
inorgánico en compuestos liposolubles podría ser un mecanismo adaptativo
para el fitoplancton marino, compensando así la limitada disponibilidad de
nitrato. Algunas algas transforman los compuestos arsenicales en formas más
complejas que son solubles en agua tal como los arsenosacáridos
(dimetilarsenosacárido) o lípidos. Mientras que el fitoplancton y algunas
macroalgas son productores primarios de arsénico orgánico complejo
(Mukhopadhyay et al., 2002).
Fig 4 Representación esquemática del ciclo del arsénico (modificado de (Mukhopadhyay et al., 2002).
6
Los peces y animales invertebrados acumulan el 99% del arsénico en su forma
orgánica; los tejidos de algunos crustáceos y moluscos llegan a contener
concentraciones de arsénico más altas que los peces. El compuesto de
arsénico orgánico más comúnmente aislado de organismos marinos en la
arsenobetaína (Fig. 4). Este está presente en algas, almejas, langostas,
camarones y tiburones (Mukhopadhyay et al., 2002).
No se conoce cuantos arsenolípidos y arsenosacáridos son convertidos en
arsenobetaína en animales superiores marinos. Esta es degradada en los
sedimentos marinos por los microorganismos que la transforman acido
metilarsonico y arsénico inorgánico.
1.5 FUENTES AMBIENTALES DE EXPOSICIÓN
El arsénico se encuentra contenido en minerales como la arsenopirita (FeAsS),
la escorodita (FeAsO4 2H2O) y la oropimenta (As2S3) (Fig. 5) las cuales se
encuentran en diferentes ambientes geológicos (Peters & Blum, 2003; Scareck
et al., 2004); este elemento también puede ser liberado al ambiente por la
actividad volcánica, la erosión de depósitos minerales y por diversas
actividades humanas (Liu et al., 2008).
Fig. 5 Origen del arsénico en restos minerales (tomado de (Liu et al., 2008).
Oropimenta Arsenopirita
7
1.6 EFECTOS TÓXICOS DEL ARSÉNICO EN EL HOMBRE
1.6.1 TOXICOCINÉTICA
Las principales vías de entrada del arsénico al organismo son el tracto
gastrointestinal (TGI) por el consumo de agua y el respiratorio debido a la
aspiración de aerosoles generados por la aspersión de plaguicidas o
compuestos que lo contengan. La absorción por vía dérmica es baja y alcanza
solamente el 2% (Heck et al., 2009).
1.6.2 ABSORCIÓN
En los seres humanos, y en la mayoría de las especies animales, la absorción
de compuestos arsenicales a través del TGI es alta (95%) cuando se
administran en solución acuosa. La absorción de arsénico por vía respiratoria
depende del tamaño de las partículas inhaladas, de su solubilidad y de la forma
química del compuesto. La principal forma química presente en el aire es el
As(III), el cual es de origen antropogénico. Las partículas grandes se depositan
en vías superiores, son removidas por el movimiento ciliar y transportadas al
TGI, en donde son absorbidas dependiendo de su solubilidad. Las partículas
menores a 7 mm se absorben en un 75 a 85 % (Heck et al., 2009).
1.6.3 DISTRIBUCIÓN
Los compuestos arsenicales tienden a acumularse principalmente en hígado,
riñón, pulmón y bazo. El As(III) se une preferentemente a los grupos sulfhidrilo
de las proteínas como la queratina, por lo que se deposita en pelo y uñas (Liu
et al., 2008, Heck et al., 2009).
8
1.6.4 BIOTRANSFORMACIÓN
El metabolismo del arsénico se realiza principalmente en hígado y, aunque su
mecanismo no está bien establecido, se propone que en él intervienen dos
procesos:
Reacciones de reducción que convierten el As (V) en As (III),
Reacciones de metilación oxídativa que transforman el As (III) en especies
metiladas (Fig. 6).
El proceso de metilación propuesto es la reducción del As (V) a As (III);
seguida, de la adición del primer grupo metilo para obtener ácido monometil-
arsónico (MMA); seguida de una reducción de MMA(V) a MMA(III) antes de la
segunda metilación, lo que produce el ácido dimetil-arsinico (DMA). Se ha
propuesto a la S-adenosilmetionina como donador de los grupos metilo y al
glutatión reducido (GSH) como principal agente reductor transportador del
arsénico (Thomas et al., 2007).
Fig 6 Biotransformación del arsénico inorgánico (modificado de Heck et al., 2009)
9
Existen varios factores que pueden influir en la capacidad de metilación del
arsénico, entre ellos: la dosis, el tiempo de exposición y una dieta alta en
metionina y proteínas azufradas.
Se ha encontrado un incremento significativo de DMA que son excretados en la
orina de individuos que han estado expuestos crónicamente a altas
concentraciones de arsénico en agua de consumo (Heck et al., 2009).
1.6.5 EXCRECIÓN
El arsénico se elimina principalmente por el riñón en forma de DMA (50-70 %)
y un 20% se excreta sin metilar en la orina (Fig. 6). Las proporciones relativas
de As(III), As(V), MMA y DMA en la orina pueden variar, dependiendo de la
forma química, el tiempo de exposición, la dosis y la especie animal expuesta
(Drobná et al., 2005, Liu et al., 2008).
En comparación con el hombre, en la mayoría de las especies animales la
excreción de MMA es muy baja (<4 %) mientras que, en la rata, la retención y
distribución de arsénico difieren de las observadas en otras especies, pues la
mayoría del DMA formado se une a los eritrocitos (Drobná et al., 2005).
1.6.6 TOXICODINAMIA
La toxicidad del arsénico es compleja pues depende de la vía de exposición,
del estado de valencia y de la forma química (inorgánica u orgánica) del
compuesto. El arsénico inorgánico es el responsable de la mayoría de los
casos de intoxicación en humanos. El gas Arsina es considerado como la
forma más tóxica del arsénico, debido a que actúa como un potente agente
hemolítico, sin embargo, este gas difícilmente alcanza niveles tóxicos en el
ambiente (Drobná et al., 2005). Generalmente las sales inorgánicas de As (III)
son mas toxicas que las de As (V) (Tabla 1) y la solubilidad de los compuestos
de arsénico inorgánico está relacionada con su toxicidad (Hamdi et al., 2009).
10
CCoommppuueessttoo DDLL5500 ((mmgg//KKgg)) AAnniimmaall//VVííaa AArrsseenniittoo ddee ssooddiioo 44..55 RRaattaa//iinnttrraappeerriittoonneeaall
AArrsseenniiaattoo ddee ssooddiioo 1144--1188 RRaattaa//iinnttrraappeerriittoonneeaall
MMMMAA 11 880000 RRaattaa//OOrraall DDMMAA 11 220000 RRaattaa//OOrraall
AArrsseennoobbeettaaiinnaa 11 00000000 RRaattaa//OOrraall
1.7 MECANISMOS DE TOXICIDAD
El mecanismo más importante para explicar la toxicidad de los compuestos
arsenicales trivalentes es a través de su afinidad por los grupos sulfhidrilo de
las proteínas. Las enzimas son particularmente afectadas si el grupo –SH está
ubicado en un sitio critico para su actividad. El As(V) puede substituir al grupo
fosfato en las reacciones que son catalizadas enzimáticamente, afectando
procesos como la producción del ATP y la síntesis del DNA; sin embargo, el
daño que produce es difícil de evaluar pues el As(V) se reduce a As(III) en el
organismo (Ratnaike.,2003).
1.8 EFECTOS ADVERSOS
1.8.1 EFECTOS AGUDOS
Los efectos característicos de la exposición aguda al arsénico son alteraciones
gastrointestinales, cardiovasculares, nerviosas, renales y hepáticas. Es posible
observar vasodilatación e hiperemia, edema debido al daño capilar, con caída
de la presión arterial, lo que a menudo conduce a un estado de choque.
También ocurre perdida de los movimientos voluntarios, confusión, psicosis,
delirio, coma y muerte. Otras manifestaciones incluyen cambios de la piel,
como hiperpigmentaciones y la aparición de líneas transversales blanquesinas
en la uñas. Algunos compuestos arsenicales, como el trióxido de arsénico, son
muy irritantes (Ratnaike., 2003).
Tabla 1 Comparación de la toxicidad aguda de los compuestos arsenicales (tomado de Hamdi et al., 2009)
11
1.8.2 EFECTOS CRÓNICOS
Los efectos de la exposición crónica al arsénico dependen de la vía de
exposición y se presentan en varios sistemas incluyendo piel, sistema
cardiovascular, vías respiratorias, riñón, hígado y sistema nervioso. El arsénico
es un agente teratogénico, mutagénico y carcinogénico. Los efectos crónicos
más importantes se resumen a continuación (Ratnaike, 2003).
LESIONES CUTÁNEAS
La exposición crónica al arsénico en el agua de consumo causa lesiones muy
características; se presentan hipocromías e hipercromías (Fig. 7)
principalmente en las partes no expuestas del cuerpo, hiperqueratosis
palmoplantar y papular en cualquier parte del cuerpo, así como lesiones
ulceradas compatibles con un diagnostico de carcinoma epidermoide (McCarty
et al., 2007, Rosen et al., 2009).
ALTERACIONES EN EL SISTEMA CARDIOVASCULAR
La exposición crónica por inhalación de compuestos de arsénico inorgánico
afecta el sistema cardiovascular, pues altera las contracciones del miocardio y
causa arritmias cardiacas. Se presentan dilatación e incremento de la
permabilidad capilar, lo que ocaciones hipovolemia, hipoproteinemia.
Fig. 7 Lesiones hipercromicas causadas por el consumo de arsénico en agua por periodos muy prolongados (URL-5).
12
En poblaciones expuestas a arsénico en el agua de consumo en Taiwan (Lui et
al., 2003); Estados Unidos (Peters y Blum, 2003) y la India (Ahmed et al., 2004)
se han descrito efectos vasculares periféricos caracterizados por cianosis y
pérdida progresiva de la circulación en las extremidades, que pueden finalizar
en gangrena seca, mejor conocida como enfermedad del pie negro (States et
al., 2009).
MUTAGENICIDAD Y CÁNCER
El arsénico inorgánico está clasificado por la Agencia Internacional de
Investigación sobre el Cáncer (IARC) como un agente carcinogénico. Los
trabajadores expuestos a arsénico por vía aérea presentan un incremento en
cáncer de pulmón, mientras que la exposición oral a arsénico incrementa el
riesgo de presentar cáncer de piel, aunque también se presentan tumores en
vejiga, riñón, hígado y pulmón (Liu et al., 2008, States et al., 2009, Heck et al.,
2009).
1.9 PRESENCIA DEL ARSÉNICO EN AGUA EN DIFERENTES ESTADOS DE LA REPÚBLICA MEXICANA En México (Fig. 8) se han identificado concentraciones de arsénico en fuentes
de abastecimiento de agua potable (Baja California Sur, Chihuahua, Coahuila,
Durango, Guanajuato, Hidalgo y Morelos) que alcanzan valores de 2.348 mg/L,
rebasando el límite máximo permisible de la Norma Oficial Mexicana, 0.025
mg/L (NOM-127-SSA1-1994; CNA, 2000).
13
Se estima que alrededor de 500,000 habitantes de las zonas rurales que
habitan los estados anteriormente nombrados se encuentran expuestos a
concentraciones de arsénico mayores de 0.05 mg/L por el agua que ingieren
(Del Razo, et al., 1990; Cebrían et al., 1994; Rodríguez et al., 1996).
Fig. 8 Estados de la República Mexicana en la cual se han reportado concentraciones de arsénico en fuentes de abastecimientos de agua potable que sobrepasan la norma oficial.
14
2 ANTECEDENTES
2.1 MÉTODOS DE ANÁLISIS DEL ARSÉNICO EN AGUA
2.1.1 MÉTODOS CONVENCIONALES
La espectroscopia en línea de absorción atómica con generación de hidruros
(Flow injection hybride generation atomic absortion spectroscopy, FI-HG-AAS),
la cual se basa en la conversión del As+3 a un hidruro volátil en presencia de
borohidruro de sodio, el hidruro generado es arrastrado por una corriente de
gas inerte (argón ó nitrógeno) a una celda de cuarzo a temperatura elevada en
la que se realiza la atomización de la muestra, de esta manera los átomos
tienen la capacidad de absorber una cantidad discreta de energía luminosa de
una sola longitud de onda (193,7 nm), siendo esta proporcional a la
concentración de arsénico presente en la muestra (NOM-117-SSA1-1994).
Los métodos con “kits” comerciales más utilizados son: 1) Arsen-test (Merck) el
cual trabaja a concentraciones menores de 10 µg/L o mayores de 100 µg/L.
Además, durante su desarrollo se produce gas de arsina que es muy tóxico.
La parte más débil de éste método es la escala de color y los tubos de reacción
que son de cristal. 2) Hach, tiene una gama de colores más amplia y la escala
de concentraciones es entre 10 y 70 µg/L. Los tubos de reacción tienen una
tapa, la cual atrapa el gas arsina producido en la determinación (Erickson,
2003).
15
2.1.2 MÉTODOS NO CONVENCIONALES
2.1.2.1 Wagtech Arsenator digital
El Wagtech Arsenator digital (Fig. 9) permite determinar concentraciones de
arsénico en un intervalo de 2-100 μg/L. A concentraciones mayores de 100
μg/L se realiza por comparación de tonalidad con una carta estándar de
colores (100-500 μg/L).
El equipo utiliza dos reactivos A1 (ácido sulfámico en polvo) y A2 (borohidruro
de sodio en tableta); dos filtros de prueba, uno en el frasco con etiqueta negra
el cual está revestido de bromuro de mercurio y el otro en el frasco con
etiqueta roja que contiene un filtro revestido con yoduro de potasio que actúa
como depurador y absorbente del exceso de gas arsina liberado en la reacción.
La prueba se realiza en un recipiente de reacción cerrado y el método químico
se basa en una variación del método Gutzeit, que consiste en reducir el
arsénico (V) a arsénico (III) con el ácido sulfámico (Reactivo A1) ya que el
arsénico presente en la muestra puede encontrarse en estado de oxidación (III)
y/o (V) y no puede medirse en su forma soluble; posteriormente, se agrega el
borohidruro de sodio generándose la arsina por acción del hidrógeno
proveniente de los compuestos arsenicales. La arsina reacciona con un papel
recubierto de bromuro de mercurio (Br2Hg) formando complejos coloridos.
(Erickson, 2003).
Fig 9 Método no convencional para la cuantificación de arsénico de la marca Wagtech Arsenator Digital Kit (tomado de URL-6)
16
2.1.2.2 BIOSENSORES
Un biosensor ó bioreportero es un dispositivo de medición que está
conformado por un componente de detección biológico que es capaz de
reconocer cambios físicos o químicos, unido o acoplado a un elemento de
transducción que produce una señal medible en respuesta a cambios en el
ambiente (Daunert et al., 2000). Los biosensores pueden clasificarse en tres
tipos, basados en el componente de detección:
Moleculares
Celulares
Tisulares
Los biosensores moleculares utilizan componentes subcelulares ó
macromoléculas como elementos de detección. Estos elementos incluyen
anticuerpos, ácidos nucleídos, enzimas, canales iónicos y bicapas lipidicas.
Los biosensores basados en tejidos y células, se obtienen a partir de aislados
de células enteras (bacterias, animales, plantas) o tejidos intactos (Daunert et
al., 2000).
Las ventajas de los biosensores moleculares, son su alta especificidad,
selectividad y reacción rápida. Sin embargo, estos sistemas no proveen
información verídica sobre la biodisponiblidad del analito. Por otra parte, la
extracción y aislamiento de macromoléculas acorta su vida, las cuales pueden
ocasionar reacciones (Daunert et al., 2000).
A través de la ingeniería genética, los biosensores celulares, pueden presentar
una alta especificidad y selectividad por el analito y ser estables en diversos
ambientes, incluyendo variaciones en el pH y temperatura. Una de las ventajas
de estos sistemas es su capacidad de proporcionar datos fisiológicos
importantes en respuesta al analito, así como su biodisponibilidad (Daunert et
al., 2000).
17
Los biosensores tisulares se componen de varios tipos de células, estos
proporcionan datos funcionales del analíto, sin embargo este tipo de sistemas
son generalmente menos estables y por lo tanto su aplicación es limitada
(Daunert et al., 2000). Los biosensores celulares se pueden clasificar de
acuerdo a la respuesta al elemento de detección, como son: cambios en el
metabolismo celular, pH, expresión de genes alterados en organismos
genéticamente modificados.
Estos biosensores basados en la tecnología del DNA recombinante, puede
provocar una respuesta en presencia del analito por medio del acoplamiento de
los genes de detección con un reportero por medio de una fusión de genes, la
cual producirá una señal fácil de medir (Daunert et al., 2000).
Los genes de detección están compuestos por proteínas reguladoras y
secuencias promotoras de DNA cromosómico o plasmidico. La especificidad de
estos elementos por el analito, confiere selectividad al sistema, mientras que la
proteína reportera determina el límite de detección y sensibilidad. Como
observamos en la figura 10, el analito disponible pasa a través de la membrana
celular, por transporte activo o pasivo y se une a la proteína reguladora,
activando así la transcripción del gen reportero que se traduce el mRNA, dando
así una proteína reportera, esta genera una señal en presencia del sustrato ó
estimulo externo (Daunert et al., 2000).
Fig.10 Representación esquemática de los eventos celulares que dan lugar a la expresión de la proteína reportera; el analito pasa a través de la membrana celular y se une a una proteína reguladora, activando la transcripción y traducción del gen reportero, tras la adición un sustrato externo se produce una señal fácil de medir (tomado de Daunert et al., 2000).
18
2.1.2.2.1 GENES REPORTEROS Y USOS
La expresión de genes reporteros produce una señal fácil de medir, que puede
ser distinguida de la actividad de proteínas endógenas. Para usos analíticos,
los genes reporteros o sus respectivas proteínas a menudo se unen a
elementos de detección que reconocen al analito y así confiere selectividad al
sistema, mientras que las proteínas reporteras producen señales, las cuales se
pueden medir, confiándole una alta sensibilidad. Estos elementos de detección
pueden ser enzimas, receptores, anticuerpos (Daunert et al., 2000, Van Der
Meer et al., 2004).
Para que un gen pueda ser usado como reportero, es necesario que cumpla
algunas condiciones; primero, la cuantificación ó actividad de su expresión
tiene que ser llevado a cabo usando un ensayo simple. Segundo, la cantidad o
actividad de la proteína represora tiene que ser el reflejo del analito estudiado.
Se han desarrollado biosensores celulares con genes reporteros en el estudio
de una amplia variedad de analitos endógenos y exógenos; estos incluyen
metales pesados tales como el antimonio, arsénico, mercurio, cadmio, cobalto,
níquel, cromo, cobre y zinc; también compuestos orgánicos (benceno, tolueno,
xileno, naftaleno), antígenos virales ó bacterianos que afectan el aparato
respiratorio del hombre y por ultimo una variedad de sustancias endógenas
que incluyen azucares y aminoácidos. A continuación mencionaremos los
genes reporteros más usados en biosensores celulares (Daunert et al., 2000).
Cloranfenicol transferasa (CAT)
El CAT es derivado de Escherichia coli, esta fue la primera de las proteínas
usadas como reporteros en el monitoreo de la transferencia de genes, así
como identificar y medir mecanismos moleculares de toxicidad asociados a
carcinógenos (Daunert et al., 2000).
19
β-galactosidasa (β-gal)
Proveniente de Escherichia coli, la β-gal, esta codificada por el gen lac z; la
enzima cataliza la hidrólisis de β-galactósidos. La β-gal es usada como
proteína reportera que ha sido utilizada en el estudio de la transcripción y
traducción genética. Se han desarrollado biosensores con este gen reportero,
el cual ha permitido identificar una variedad de analitos que incluyen metales
pesados, sales toxicas, en ambientes naturales (Daunert et al., 2000).
Por medio de la cristalografía de rayos x se ha identificado que la β-gal es un
tetrámero compuesto por un 40% de β-plagadas, 35% de α-hélices, 13% de
espirales y un 12 % de horquillas aleatorias. Existen varios métodos de
detección de para la β-gal, entre las cuales tenemos métodos colorimétricos,
histoquímicos, fluorescentes, luminiscentes y electroquímicos (Tabla 2).
Las estrategias de detección dependen del sustrato usado, el más empleado
es el ONPG (o-nitrofenil β-D-galactopiranósido) para la detección colorimétrica.
También tenemos al Xgal (5-bromo-4-cloro-3-indolil β-galactósido) que está
adaptado principalmente a métodos de detección histoquímicos (Daunert et al.,
2000).
hvCOOHROHFMNOCHORFMNH +−++→+−+ 222
CoAdiacetilCoAacetilacetilacetilCoACATacetil
CoACATacetilacetilCAT
CAT 3,1 CAT 1CAT 1 3
3CoA
+−→+−−↔+−
+−→+
Tabla 2 Proteínas represoras, reacciones químicas y métodos de detección empleados en biosensores celulares (modificado de Daunert et al., 2000).
20
Luciferasa bacteriana (Lux)
Luciferasa es el nombre genérico para la enzima que cataliza la reacción de
emisión de luz. Esta liberación de luz es llevada a cabo por algunos
organismos que contienen a esta enzima. El término para describir este
fenómeno se le conoce como bioluminicencia. Los organismos bioluminicentes
incluyen bacterias, algas e insectos entre otros. En este caso nos enfocaremos
a la biolumicencia bacteriana, en el que hay tres géneros representativos:
Vibrio, Photobacterium y Xenorhabdus. La luciferasa bacteriana cataliza la
oxidación de la flavina mononucleotida reducida (FMNH2) a monoflavina
oxidada (FMN) en presencia de aldehídos grasos de cadena larga y
transformándola en oxigeno. Esta reacción da como resultado la emisión de
una luz azul-verdosa.
Todas la luciferasa bacterianas son proteínas heterodiméricas, compuestas por
dos subunidades, una α (40KDa) y una β (37KDa) cuya secuencia de
aminoácidos puede variar hasta un 45% y 55% entre especies bacterianas.
(Daunert et al., 2000, Meighen., 1991).
Las subunidades α y β de la luciferasa bacteriana son codificadas por los
genes luxA y luxB respectivamente, localizandose en el operón lux, donde
además están tres genes adicionales (luxC, luxD, luxE) que codifican
proteínas asociadas para formar una reductasa para la síntesis de ácidos
grasos así como su reciclado. Estos cinco genes están conservados en todas
las especies identificadas de este grupo bacteriano. La expresión de los genes
luxA y luxB en una célula hospedera, es suficiente para una señal de
bioluminicencia, sin embargo la expresión de los cinco genes representa una
ventaja ya que no se requiere de la adición de un sustrato (Meighen, 1991).
21
Al fusionar el operón lux con sus respectivos promotores y la expresión del
mismo en células hospederas ha permitido aplicar como un marcador de
exposición de algunos contaminantes como metales pesados, compuestos
orgánicos y el ion nitrato, en bioensayos con células completas. Aunque la
luciferasa bacteriana es útil para una detección muy precisa, su aplicación es
limitada en sistemas con células eucariotas, debido a que estas enzimas son
sensibles a temperaturas superiores a los 30ºC (Daunert et al., 2000).
Proteína verde fluorescente (GFP)
La Proteína verde fluorescente (GFP) es una fotoproteína que ha sido aislada y
clonada de la medusa Aequorea victoria. La principal ventaja de la GFP como
proteína reportera es su autofluorescencia, su uso no requiere la adición de
cofactores o sustratos exógenos para producir luz. Esta es el resultado de la
formación de un cromóforo imidazolinona. La formación de este cromóforo
ocurre por modificaciones pos-traduccionales, resultado de la ciclización de 3
residuos de aminoácidos de la proteína (Ser65-Tyr66-Gly67) (Daunert et al.,
2000).
La GFP tiene numerosas cualidades lo que la hacen ideal como gen reportero,
esta se ha utilizado para medir la expresión de genes, así como identificar
células transformadas, también se ha usado como reportero en biosensores
celulares con fibra óptica para la detección de L-arabinosa. Este sistema es
altamente selectivo ya que es capaz de discriminar esteroisómeros de D-
arabinosa de una amplia variedad de pentosas y hexosas (Daunert et al.,
2000).
22
2.1.2.2.2 VENTAJAS Y DESVENTAJAS
La mayor ventaja de los biosensores es tienen la capacidad de detectar la
biodisponiblidad del contaminante, lo que permite una evaluación más precisa
del sitio y de los riesgos potenciales involucrados (Strosnider, 2003).
Además los biosensores son rápidos, seguros, menos costosos esta al
compararlos con los métodos químicos convencionales: tal es el ejemplo del
espectrofotómetro de absorción atómica. Los resultados obtenidos a partir de
los biosensores son comparables con los métodos tradicionales; además,
pueden ser aplicados en trabajo de campo (Strosnider, 2003).
Sin embargo, el funcionamiento de estos sistemas es limitado, además es
difícil determinar las condiciones del procedimiento en el rendimiento de los
biosensores, tales como temperatura, pH, tiempo de incubación, medio de
cultivo, reactivos empleados, sin embargo con la ayuda de la ingeniería
genética se pueden hacer algunas mejoras a estos sistemas, superando así
algunos de estos factores (Strosnider, 2003).
2.1.2.3 BIOSENSOR PARA LA DETECCIÓN DE ARSÉNICO EN AGUA (E.
coli modificada) El uso de biosensores microbianos puede ser una alternativa para la detección
de arsénico en agua potable, para tal efecto se utilizó a Escherichia coli, la cual
posee un mecanismo de resistencia natural al arsenito, arsenato. Que esta
codificada en el plásmido de E. coli R773, este tiene un operón denominado
ars, formado por una serie de genes estructurales (arsA, arsB y arsC) y dos
genes reguladores (arsR y arsD) (Fig. 11).
23
La expresión de los genes reguladores da como resultado ArsR la cual controla
los niveles básales de la proteína de expresión y ArsD controla los niveles
máximos de esta misma proteína (Daunert et al., 2000, Stoker et al., 2003).
En ausencia de arsenito, el represor ArsR está unido al sito operador/promotor
del operón ars y evita la expresión de los genes estructurales. Cuando el
arsenito entra en la célula por una arsenito reductasa, interacciona con ArsR
uniéndose a ésta, ocasionando un cambio en la conformación del represor lo
que trae como consecuencia la disociación de ArsR del sito operador/promotor
y subsecuentemente hay una elevada expresión de los genes del operón ars
(Stoker et al., 2003).
Las bacterias nativas contienen el operón ars, el cual no produce por si solo
una señal analítica útil, por tal motivo Stoker et al (2003) adicionaron por medio
de técnicas de biología molecular un marcador que estando unido al gen arsR
produzca la expresión de una proteína fácilmente medible (Stoker et al., 2003).
Fig 11 Representación esquemática del operón de resistencia a arsénico, está conformado por tres genes estructurales (arsA,arsB, arsC) y dos genes reguladores (arsD , arsR).
24
Actualmente, el uso de biosensores posee una alta demanda debido a su
exactitud, precisión y facilidad de uso, así como a su prácticamente nula
generación de productos tóxicos. (Erickson, 2003; Stocker et al., 2003).
2.1.2.3.1 CONSTRUCCIÓN DE LOS BIOSENSORES BIOSENSOR CON EL GEN REPORTERO Lac Z
El biosensor fue construido en E.coli DH5α. La parte sensible de sensor deriva
del gen arsR proveniente del plásmido pBGD23, que contiene clonado el
fragmento del operón de resistencia al arsénico. Usando la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) se amplio el gen arsR del plásmido pBGD23
incluyendo el promotor arsR y excluyendo la parte arsD.
Los iniciadores usados en la PCR fueron: ArsRfor640 (5´ccc ttt cgt ctt ttc caag
3´; 129 pb rioarriba del inicio de arsR e introduciendo un sito HindIII) y
ArsRrev1120 (5´aac ata tga att cag gca aat ttt ttag 3´, obteniendo un codón de
terminación de arsR e introduciendo un sitio único EcoRI). Los fragmentos
fueron clonados dentro de pGEM-T-Easy (Promega Corp., Catalys AG,
Wallisenllen, Switzerland) produciendo ArsR regulable en la expresión del gen
lac z. El fragmento fue recuperado del plásmido cortando con HindIII y EcoRI.
El fragmento arsR fue ligado en pMV132, que contiene los promotores de la
β galactosidasa. Después se llevo a cabo la transformación en E. coli dando
como producto al plásmido pMV-arsR.
Para reducir la formación en la expresión del promotor arsR, fue clonada una
segunda copia de DNA del sito de unión a ArsR y su respectivo gen reportero
(lac Z). El sito de unión de ArsR fue amplificado por PCR con los iniciadores
001126 (5´gaa ttc caa gtt atc tca cct acc 3´, 124 pb río arriba del inicio de
arsR) y 010834 (5´aat tca cata ac caa aaa cgc ata tga tg 3´, 52 pb rio arriba de
arsR).
25
Posteriormente el fragmento fue clonado con pGEM-T-Easy, el fragmento de
60 pb fue recuperado y cortado con EcoRI. El fragmento fue insertado en el
plásmido pPR-arsR (proveniente de la fusión de arsR con una proteína de
fluorescencia verde ó gfp), dando origen a pPR-arsR-ABS.
Para la obtención del plásmido pMV132-arsR-ABS (Fig. 12), el cual se utilizó
en ese estudio, fue cortado el plasmido pPR-arsR-ABS con SphI y SpeI
recuperando el fragmento arsR-ABS. Posteriormente este fragmento se ligó al
plásmido pMV132 cortando con EcoRI (Stocker et al., 2003).
BIOSENSOR CON LOS GENES LUX A y LUX B COMO REPORTEROS
El biosensor fue construido en E.coli DH5α. La parte sensible de sensor deriva
del gen arsR proveniente del plásmido pBGD23, que contiene clonado el
fragmento del operón de resistencia al arsénico. Usando la PCR fue
amplificado el gen arsR del plásmido pBGD23 incluyendo el promotor arsR y
excluyendo la parte arsD.
Los iniciadores usados fueron: ArsRfor640 (5´ccc ttt cgt ctt ttc caag 3´; 129 pb
rioarriba del inicio de arsR e introduciendo un sito HindIII) y ArsRrev1120
(5´aac ata tga att cag gca aat ttt ttag 3´, obteniendo un codón de terminación
de arsR e introduciendo un sitio único EcoRI).
Fig. 12 Representación esquemática del plásmido de E. coli pMV132-arsR-ABS (Stocker et al., 2003).
26
Los fragmentos fueron clonados dentro de pGEM-T-Easy (Promega Corp.,
Catalys AG, Wallisenllen, Switzerland) produciendo ArsR regulable en la
expresión del gen reportero. El fragmento fue recuperado del plásmido
cortando con SphI y SpeI. El fragmento arsR fue insertado en pJAMA8, cortado
con SphI y XbaI, el cual contiene promotores de los genes de la luciferasa
(genes lux A y lux B) provenientes de Vibrio harveyi.
Para reducir la formación en la expresión del promotor arsR, fue clonada una
segunda copia de DNA del sito de unión a ArsR y su respectivo gen reportero
(lux A y lux B). El sito de unión de ArsR fue amplificado por PCR con los
iniciadores 001126 (5´gaa ttc caa gtt atc tca cct acc 3´, 124 pb río arriba del
inicio de arsR) y 010834 (5´aat tca cata ac caa aaa cgc ata tga tg 3´, 52 pb rio
arriba de arsR).
Posteriormente el fragmento fue clonado con pGEM-T-Easy, el fragmento de
72 pb fue recuperado y cortado con EcoRI. El fragmento se insertó en el
plásmido pPR-arsR (proveniente de la fusión de arsR con una proteína de
fluorescencia verde ó gfp), dando origen a pPR-arsR-ABS. Para la obtención
del plásmido pJAMA-arsR- ABS, el cual se utilizó en este estudio, fue cortado
el plásmido pPR-arsR-ABS con SphI y SpeI recuperando el fragmento arsR-
ABS. Posteriormente este fragmento fue ligado al plásmido pJAMA8 cortando
con SphI y XbaI (Fig.13) (Stocker et al., 2003).
Fig. 13 Representación esquemática del plásmido de E. coli pJAMA-arsR-ABS (Stocker et al., 2003).
27
2.1.2.3.2 FUNDAMENTO DE LOS BIOSENSORES
Como podemos observar en la figura 14B, el gen arsR controla la expresión de
los genes reporteros (luxA, luxB y lacZ), así como la expresión de los mismos.
La expresión del gen nos da como resultado una proteína represora (ArsR), la
cual se une en ausencia de arsenito a su sitio específico que se encuentra río
arriba del promotor. Cuando la célula entra en contacto con el arsenito, este se
une a ArsR cambiando su conformación ocasionando que la proteína se
separe del sito de unión permitiendo que la RNApol transcriba los genes
reporteros los cuales llevan a cabo la expresión de la luciferasa y/o β
galactosidasa (Stocker et al., 2003).
Fig. 14 Principio del biosensor de E. coli pJAMA-arsR-ABS. (A) La proteína ArsR regula la expresión de los genes reporteros, esta se encuentra unida al sito operador/ promotor de arsR, cuando no hay presencia de arsénico. (B) Cuando se detecta la presencia de arsénico; ésta se une a ArsR cambiando la conformación de la proteína, haciendo que esta se despegue del sitio operador /promotor para la expresión de los genes reporteros (luxA, luxB y lacZ) (Stocker et al., 2003).
28
En la figura 14A, el principio es similar, la diferencia radica que en este caso se
encuentran dos sitios de unión a ArsR, los cuales están ubicados, uno río abajo
de arsR y el segundo se encuentra río arriba del mismo gen. Cuando la célula,
no detecta la presencia de arsenito, la proteína represora esta unida en los dos
sitios antes mencionado impidiendo la transcripción y subsecuentemente la
síntesis de los genes reporteros (Stocker et al., 2003).
La cantidad sintetizada a partir del gen LacZ ó de los genes lux A y B
dependerá de:
a. La cantidad de arsenito detectada por las células.
b. El tiempo de exposición de las células al arsenito.
c. La constitución genética de la célula de E.coli usada.
La actividad de β-galactosidasa puede ser cuantificada de diferentes maneras,
una de las más simples es usando un sustrato específico para la enzima que
permita la formación de color (Fig. 15). Este, puede ser medido un
espectrofotómetro (Stocker et al., 2003).
Fig. 15 Representación esquemática de la reacción que lleva a cabo la β-galactosidasa en presencia del ONPG (URL-7).
29
La actividad de luciferasa puede ser cuantificada por medio de una reacción de
luminiscencia (Fig. 16). El sustrato específico para la enzima es el n-decanal
que en presencia de oxigeno produce un ácido, agua y luz (Meighen, 1991).
Este, puede ser medido empleando un luminómetro (Fluoroskan Ascent FL,
Thermo Electron Corporation) el cual posee un sistema óptico (Fig. 17), y
consta de una lámpara de halógeno, un filtro de excitación, un espejo y un
fotomultiplicador, que capta la luz emitida desde el micropozo y reflejada a
través de un espejo que la desvía hacia un filtro de excitación llegando así al
fotomultiplicador, el cual nos dará una señal de lectura (Thermo Electron
Corporation).
Luciferasa + n- decanal (C10H20O) + O2 H2O + R-COOH + hv
Fig. 16 Reacción que lleva a cabo la luciferasa en presencia de su sustrato (n-decanal).
Fig. 17 Sistema óptico del luminómetro Fluoroskan Ascent Fl ( Thermo Electron Corporation).
Lámpara de halógeno
Filtro de excitación
Espejo
Micropozo
Fotomultiplicador
30
3 JUSTIFICACIÓN
Se ha reportado que en diferentes regiones de nuestro país el agua de
consumo excede los niveles de Arsenico permitidos; esto aunado a los
reportes que demuestran que la exposición a este elemento a través de la
ingesta de agua de consumo, da lugar a cambios en la pigmentación y textura
de la piel; a enfermedades vasculares periféricas y a trastornos
gastrointestinales. Se considera necesario evaluar las concentraciones de este
metal con técnicas que ofrecen un respuesta mas rápida, eficaz y segura,
siendo una aopcion el uso de biosensores microbianos (E.coli modificada), ya
que los métodos convencionales (espectrofotómetro de absorción atómica y
“kints” comcerciales) producen sustancias toxicas y peligrosas durante el
proceso.
31
4 OBJETIVO GENERAL
Implementar el uso de biosensores microbianos (Escherichia coli) que nos
permitan la cuantificación de arsénico en muestras de agua de diversos
orígenes.
4.1 OBJETIVOS PARTICULARES
Encontrar las condiciones adecuadas para la cuantificación de arsénico en
agua de una manera rápida, eficaz y segura con las cepas E. coli pMV132-
arsR-ABS y E. coli pJAMA-arsR-ABS.
Evaluar la concentración de arsénico en las muestras problema con los
biosensores y comparar los resultados con los obtenidos a través de las
técnicas en las cuales se utilizan el Wagtech Arsenator digital ó el
espectrofotómetro de absorción atómica con generación de hidruros.
Desarrollar pruebas semicualitativas para la detección de arsénicos para la
detección de arsénico en agua, en campo.
32
5 MATERIALES Y MÉTODOS 5.1 MUESTRA BIOLÓGICA
Se utilizaron las cepas modificadas de E. coli pMV132-arsR-ABS y E. coli
pJAMA-arsR-ABS, las cuales poseen genes reporteros Lac Z y Lux AB,
respectivamente, ambas cepas fueron proporcionadas por el Dr. Jan Roelof
Van Der Meer del Instituto Federal Suizo de Ciencia y Tecnología Ambiental,
Dübendorf Suiza.
5.2 MEDIO DE CULTIVO EMPLEADO
Se empleo el medio Luria (L) (ver anexo) para mantener y propagar las cepas
bacterias, las cuales fueron utilizadas para las determinaciones de arsénico en
agua.
5.3 SOLUCIÓN TIPO DE ARSÉNICO
Se preparó una serie de diluciones a partir de una solución tipo de Arsénico, la
cual contiene 1 g de As/ L (13 mM) (J. T. Baker, Deventer, The Netherlands)
las concentraciones utilizadas fueron: 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 µM.
Las diluciones se hicieron con agua de grado II para HPLC (Harms et al., 2005).
5.4 MUESTRAS
Cada muestra fue recolectada en dos envases de plástico con tapones del
mismo material de un litro, uno se ocupo para la cuantificación de arsénico de
acuerdo a la norma oficial mexicana (NOM-117-SSA1-1994) y el otro se utilizo
para la determinación de arsénico usando los biosensores y el Wagtech
Arsenator digital.
33
El muestreo se realizó tomando un poco del agua que se va a analizar, se
cierra el envase agitandose fuertemente para enjuagar, esta operación se
realizó dos o tres veces y enseguida se tomó la muestra, la cual se colocó en
una hielera con bolsas refrigerantes o bolsas de hielo para su transporte al
laboratorio. Las muestras provinieron de lugares donde se ha reportado ó no la
existencia de arsénico en el agua (Tabla 3 y Fig.18) (Ngo et al., 2002; CNA,
2000).
No. Muestra Lugar de procedencia
M1 Delegación Gustavo A. Madero, México, D.F M2 Cuemanco, Delegación Xochimilco, México, D.F M3 Ecatepec, Estado de México. M4 Delegación Miguel Hidalgo, México, D.F M5 Chapultepec, Delegación Miguel Hidalgo, México, D.F M6 Cuemanco, Delegación Xochimilco, México, D.F M7 Hígado, Pachuca, México. M8 Yurecuaro, Michoacán, México. M9 Tenancingo, Toluca, Estado de México.
M10 Ixtapa de la sal, Toluca, Estado de México. M11 Cuautitlan Izcali, Estado de México. M12 Ciudad de Nezahualcoyotl, Estado de México. M13 Ciudad de Nezahualcoyotl, Estado de México. M14 Torreón, Coahuila, México. M15 Torreón, Coahuila, México.
Tabla 3A Muestras de agua recolectadas de distintos lugares de la República Mexicana y Guatemala
34
No. Muestra Lugar de procedencia
M16 Torreón, Coahuila, México. M17 Torreón, Coahuila, México. M18 Torreón, Coahuila, México. M19 Torreón, Coahuila, México. M20 Mixco, Guatemala, Centro América. M21 Mixco, Guatemala, Centro América. M22 Torreón, Coahuila, México. M23 Torreón, Coahuila, México. M24 Torreón, Coahuila, México. M25 Torreón, Coahuila, México. M26 Torreón, Coahuila, México. P6 Torreón, Coahuila, México.
P10 Torreón, Coahuila, México. P23 Torreón, Coahuila, México. P32 Torreón, Coahuila, México. P65 Torreón, Coahuila, México.
Tabla 3B Muestras de agua recolectadas de distintos lugares de la República Mexicana y Guatemala
35
5.5 VERIFICACIÓN DE LA PUREZA DE LAS CEPAS
Para la cepa E. coli pMV132-arsR-ABS, se tomó una asada y se sembró por
estría cruzada en medio L con 50 µg/mL ampicilina, adicionado con Xgal (20
µg/mL) a 37ºC por 48 horas. Posteriormente se revisó el crecimiento y la
morfología de las colonias, estas hidrolizan al X-gal por medio de la β-
galactosidasa a galactosa y 5-bromo-4-cloro-3-hidroxindol. Este último es
oxidado a 5,5'-dibromo-4,4'-dicloro-indigo, un compuesto azul insoluble.
Fig.18 Ubicación topográfica de las muestras manejadas en el estudio
36
La cepa E. coli pJAMA-arsR-ABS se sembró por estría cruzada en medio L
(ver anexo) con y sin de ampicilina (50 µg/mL) a 37ºC por 48 horas.
Posteriormente se revisó el crecimiento y la morfología colonial. Se realizó el
mismo procedimiento con una cepa silvestre de E. coli como testigo.
5.6 CONSERVACIÓN DE LAS CEPAS Para mantener las cepas de E. coli pMV132-arsR-ABS y E. coli pJAMA-arsR-
ABS se inoculó una asada de cada microorganismo en 5 mL de medio L con
50 µg/mL de ampicilina a 37ºC, se dejó en un cultivo de toda la noche,
posteriormente se tomó un mL del cultivo y se transfirió a un matraz
Erlenmeyer que contenía 50 mL del mismo medio el cual se incubó a 37ºC en
agitación, ajustando a una concentración celular de 1 x 108 cel/mL.
El cultivo se colocó en un baño de hielo durante 15 min, posteriormente se le
adicionó 10 mL de glicerol frío (87% v/v), la mezcla se dividió en alícuotas de
1.0 mL en tubos eppendorf de 2 mL; estos se transfirieron a una mezcla
hielo/etanol durante un minuto, posteriormente se colocó en un congelador a -
72ºC para su conservación.
5.7 CUANTIFICACIÓN DE ARSÉNICO EN MUESTRAS DE AGUA UTILIZANDO LA CEPA DE E. coli pMV132-arsR-ABS
La metodología utilizada fue propuesta, por Van Der Meer et al., 2004 se
hicieron las modificaciones necesarias para adaptarla a nuestras condiciones
de trabajo.
Se tomó un vial congelado de la cepa E. coli pMV132-arsR-ABS la cual se
descongelo a temperatura ambiente, se realizó una dilución 1:10 con medio L
fresco. En un tubo eppendorf, se adicionaron 500 µL de la suspensión celular
diluida y 500 µL de la muestra problema.
37
Los ensayo se realizaron en tubos de vidrio de 13 x 100 mm y se incubaron a
37°C por 60 minutos en una plataforma rotatoria a 120 rpm, posteriormente se
colocó en baño de hielo por 10 minutos, después se centrifugó a 13 000 rpm
por 2 minutos, se elimino el sobrenadante y se adicionaron 500 µL del
regulador P frio (ver anexo).
Se resuspendieron las células nuevamente con 500 µL de regulador P frio y se
centrifugaron a 13 000 rpm por 2 minutos, se desecho el sobrenadante e
inmediatamente se les adicionó 100 µL de regulador P frio. El paquete celular
se resuspendió; de la suspensión se tomaron 50 µL colocándose en un tubo
eppendorf nuevo y se les adiciono 700 µL de regulador Z (ver anexo), 80 µL de
cloroformo y 40 µL de SDS al 0.1 % (ver anexo); se agitó en vortex a máxima
velocidad por 20 segundos y se incubó 20 minutos a temperatura ambiente,
después se agregaron 150 µL de ONPG 4 mg/mL (ver anexo) y se incubó
nuevamente a 28°C, observándose la aparición de color, inmediatamente se
detuvo la reacción agregando 400 µL de carbonato de sodio 1M (ver anexo).
Por último se extrajo el sobrenadante y se midió la D.O en un
espectrofotómetro (BioMateTM 3 Series Spectrophotometers, Termo Spectronic)
a 420 nm.
Las modificaciones que se hicieron fueron las siguientes:
Caso 1
Se cambió el tiempo de incubación al momento de agregar la muestra con
arsénico a las células pasando de 60 a 120 min y se decido fijar un tiempo de
incubación después de la permeabilización de las células con 80 µL de
cloroformo y 40 µL de SDS al 0.1 %, que fue de 30 minutos, transcurrido ese
tiempo se agrego 150 µL de ONPG 4 mg/mL, en este punto fue requerido
establecer un tiempo de incubación de 5 minutos a 28°C.
38
Caso 2
Las condiciones antes mencionadas fueron las mismas a excepción del tiempo
de incubación después de la adición de ONPG 4 mg/mL que fue de 10 minutos
a 28°C.
Caso 3
El tiempo de incubación tras la permeabilización de las celular, no cambio, solo
se modificó el tiempo de incubación tras la adición del ONPG 4 mg/mL que fue
de 15 min a 28°C.
Caso 4
Se decidió eliminar el SDS al 0.1% en la permeabilización de las células, así
como cambiar el tiempo de incubación después de la adición del ONPG 4
mg/mL, que fue de 10 min.
En todos los casos, se construyeron curvas tipo con diferentes
concentraciones de arsénico (0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 µM) a partir
de una solución tipo.
39
5.8 CUANTIFICACIÓN DE ARSÉNICO EN MUESTRAS DE AGUA UTILIZANDO LA CEPA DE E. coli pJAMA-arsR-ABS
La técnica propuesta por Stocker et al.,(2003) fue también modificada hasta
obtener resultados confiables de acuerdo a nuestras condiciones de trabajo.
Se tomó uno de los tubos congelados de la cepa E. coli pJAMA-arsR-ABS, se
colocó en un baño con agua a 25°C y una vez descongelada, en una
microplaca negra (Corning Incorporated, Costar) de 96 pozos se colocaron 50
µL de las células descongeladas en cada uno de los pozos a utilizar, en esto se
agregaron 100 µL de cada una de las concentraciones que compone la curva
tipo la cual fue elaborada a partir de una solución tipo de arsénico (J. T. Baker,
Deventer, The Netherlands) y las muestras problema. La microplaca se cubrió
e incubó a 35°C en agitación (190 rpm) por treinta minutos. Posteriormente se
adicionaron 25 µL de n- decanal 2mM a cada uno de los pozos (ver anexo). La
microplaca se incubó nuevamente con agitación durante 3 minutos. Se midió la
intensidad de luz con un tiempo de integración de 10 segundos en el
luminómetro (Fluoroskan Ascent FL, Thermo Electron Corporation). Los
resultados de las muestras problema, se interpolaron en la curva tipo (0, 0.05,
0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 µM de arsénico) para obtener la concentración de
arsénico, la cantidad de arsénico presente en las muestras es directamente
proporcional a la cantidad de luz emitida.
Las modificaciones realizadas a la técnica fueron las siguientes:
Caso 1
Se realizó una dilución 1:2.5 de la suspensión bacteriana descongelada,
tomando de ella 25 µL. El tiempo de incubación se incremento de 30 minutos a
una hora a 30°C.
40
Caso 2
Las condiciones antes mencionadas se conservaron excepto el tiempo de
incubación que fue de dos horas a 30°C.
Como se ha mencionado, los resultados obtenidos a partir de muestras
problemas, para ambas cepas de E. coli, se compararon con resultados
obtenidos a través de técnicas usadas por normas oficiales y aquellas
recomendadas por las OMS, como son la espectrofotometría de absorción
atómica con generación de hidruros y el Wagtech Arsenator digital.
5.9 CUANTIFICACIÓN DE ARSÉNICO EN AGUA POR ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA CON GENERACIÓN DE HIDRUROS. Para esta metodología se construyó una curva tipo con diferentes
concentraciones de arsénico (0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 µM), a las
cuales previamente se les adicionó ácido nítrico concentrado hasta obtener un
pH menor a 2, posteriormente se siguió el protocolo marcado por la noma
oficial mexica (NOM-117-SSA1-1994) empleando un espectrofotómetro de
absorción atómica (Marca Varian, Modelo Spectra AA220). Este procedimiento
fue aplicado también a las muestras problema.
41
5.10 CUANTIFICACIÓN DE ARSÉNICO EN AGUA UTILIZANDO EL “WAGTECH ARSENATOR DIGITAL”
Para este método se procedió a agregar 50 mL de la muestra en un matraz de
125 mL, posteriormente se adicionó cuidadosamente un sobre con el reactivo
A1 (ver anexo) evitando que el reactivo quedara adherido a las paredes del
matraz y mezclar hasta disolver el reactivo. Se colocaron los filtros respectivos
en la tarjeta negra y roja, estos capturaran el producto de la reacción, y se
pondrán en la trampa de arsénico, se agrego una pastilla con el reactivo A2
(ver anexo) en el matraz e inmediatamente se tapó con la trampa de arsénico y
se dejo incubar durante 20 min. Transcurrido este tiempo, se retiro la tarjeta
negra y se colocó en la ranura del fotómetro que previamente se calibró
usando una tarjeta negra con un filtro nuevo, una vez hecho esto se espero el
resultado (Fig. 19). Los pasos mencionados anteriormente fueron aplicados
tanto a las muestras problemas así como a la elaboración de una curva tipo
con diferentes concentraciones de arsénico (0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0
µM).
Fig. 19 Método químico de la marca Wagtech Arsenator digital para la cuantificación de arsénico en agua.
42
5.11 PRUEBA SEMICUANTITATIVA PARA LA DETECCIÓN DE ARSÉNICO EN AGUA EN CAMPO
Se tomó uno de los tubos congelados de la cepa E. coli pJAMA-arsR-ABS, se
colocó en un baño con agua a 25°C, una vez descongelada la muestra se
sembró por estría cruzada en medio L con ampicilina (100 µg/mL) y se incubó
a 37°C por 48 horas, transcurrido ese tiempo se tomó una colonia y se sembró
en 50 mL de medio L con ampicilina (100 µg/mL) posteriormente se incubó a
37°C por 16 horas obteniendo una densidad celular de 1.8 x 1010 cel/mL . El
cultivo se centrifugó a 5000 rpm por 10 min, se eliminó el sobrenadante al cual
se le adicionaron 2 mL de regulador de fosfatos pH 7, se resuspendió el
paquete celular y se volvió a centrifugar, se eliminó el sobrenadante y se
obtuvo el paquete celular. Por otro lado, se preparo una mezcla de los
siguientes soportes (Stocker et al., 2003):
Soporte Cantidad
Gelatina al 15% 400 µL Peptona de caseína al 1% 250 µL Ascorbato de sodio al 1% 200 µL Extracto de levadura al 1% 250 µL Rafinosa al 5% 300 µL Glutamato al 5% 300 µL
Todo se homogenizó perfectamente, posteriormente. A estos se le adicionó por
separado 1.5, 3 y 9 µL de la suspensión celular y se impregnaron en tiras de
papel Whatman 3M de 5 cm x 0.45 mm estériles, las tiras se dejaron secar por
2 hrs, después se sumergieron en 100 µL de cada una de las soluciones que
contenían arsénico (0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 µM de arsénico). Se
incubaron a 60 min a temperatura ambiente. Pasado este tiempo se le adicionó
a cada tira 20 µL de Xgal 1 mg/mL ó 5 mg/mL, se incubó por 30 min a
temperatura ambiente.
43
Se observó la presencia de un color azul índigo, la intensidad fue directamente
proporcional a la cantidad de arsénico presente en la muestra.
5.12 PARÁMETROS ESTADÍSTICOS EMPLEADOS (VER ANEXO)
Los parámetros empleados en el análisis estadísticos de las curvas tipo son:
intervalo de linealidad, intervalo de trabajo, lectura estadística del blanco (YB),
sensibilidad (S), error estándar de la regresión (Sy/x), limite de detección (LD),
limite de cuantificación (LC), limite de decisión (Ld) y centro de gravedad de la
recta (Xprom,Yprom) (Miller y Miller, 2002).
44
6 RESULTADOS
6.1 CUANTIFICACIÓN DE ARSÉNICO EN MUESTRAS DE AGUA
UTILIZANDO LA CEPA DE E. coli pMV132-arsR-ABS
En las figuras 20, 21, 22 y 23, se muestran las diferentes curvas tipo obtenidas
al modificar el método propuesto por Van Der Meer et al.,(2004) empleando la
cepa de E. coli pMV132-arsR-ABS, para así llegar a las condiciones de trabajo
que nos dieron los datos más confiables (Fig. 23).
Fig. 20 Curva tipo de E. coli pMV132-arsR-ABS, el ensayo se llevó a cabo con un tiempo de incubación de 5 min a 28°C con la adición de SDS al 0.1%, los datos mostrados son el producto de 3 réplicas del ensayo.
45
Fig. 22 Curva tipo de E. coli pMV132-arsR-ABS, el ensayo se llevo a cabo en un tiempo de incubación de 15 min a 28°C con la adición de SDS al 0.1%, los datos mostrados son el producto de 3 réplicas del ensayo
Fig. 21 Curva tipo de E. coli pMV132-arsR-ABS, el ensayo se llevo a cabo en un tiempo de incubación de 10 min a 28°C con la adición de SDS al 0.1%, los datos mostrados son el producto de 3 réplicas del ensayo
46
6.2 CUANTIFICACIÓN DE ARSÉNICO EN MUESTRAS DE AGUA
UTILIZANDO LA CEPA DE E.coli pJAMA-arsR-ABS
Las figuras 24 y 25, muestran las variantes a las condiciones propuestas por el
método de Stocker et al,(2003) empleando la cepa de E. coli pJAMA-arsR-
ABS, observándose una curva tipo con una r2 de 0.997, por lo que
consideramos que es confiable.
Fig. 23 Curva tipo de E. coli pMV132-arsR-ABS, el ensayo se llevo a cabo en un tiempo de incubación de 10 min a 28°C sin la adición de SDS al 0.1%, los datos mostrados son el producto de 3 réplicas del ensayo
47
Fig. 24 Curva tipo de E. coli pJAMA-arsR-ABS, la reacción se llevó a cabo en un tiempo de incubación una hora a 30°C en agitación, los datos mostrados son el producto de 3 réplicas del ensayo.
Fig. 25 Curva tipo de E. coli pJAMA-arsR-ABS, la reacción se llevó a cabo en un tiempo de incubación de dos horas a 30°C en agitación, los datos mostrados son el producto de 3 réplicas del ensayo.
48
Fig. 26 Curva tipo del espectrofotómetro de absorción atómica, con diferentes concentraciones conocidas de arsénico (0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 µM), las cuales fueron tratadas según lo marcado en la norma oficial mexicana.
6.3 CUANTIFICACIÓN DE ARSÉNICO EN AGUA POR ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA CON GENERACIÓN DE HIDRUROS
En la figura 26 se presenta la curva de tipo para la cuantificación de arsénico
empleando un espectrofotómetro de absorción atómica, utilizando el método
indicado en la norma oficial mexicana (NOM-117-SSA1-1994). Se obtuvo una
recta con una r2 de 0.999.
6.4 CUANTIFICACIÓN DE ARSÉNICO EN AGUA UTILIZANDO EL “WAGTECH ARSENATOR DIGITAL”
En la figura 27 se presenta la curva tipo obtenida con el Wagtech Arsenator
Digital, utilizando las soluciones tipo. La curva presentó una r2 de 0.998.
49
Fig. 27 Curva tipo obtenida de Wagtech Arsenator digital, la reacción se llevó a cabo en un tiempo de incubación una 20 min a 30°C, los datos mostrados son el producto de 3 réplicas del ensayo.
6.5 COMPARACIÓN DE LOS MÉTODOS UTILIZADOS PARA EVALUAR LA CONCENTRACIÓN DE ARSÉNICO EN AGUA
En la tabla 4 se pueden observar los parámetros llamados pruebas de
desempeño, los cuales nos permiten saber, si las curvas tipo pueden ser
usadas para generar resultados confiables.
50
6.6 CONCENTRACIONES DE LAS MUESTRAS PROBLEMA
En la tabla 5 y 6 se muestran las concentraciones obtenidas de las muestras
problemas por interpolación en las curvas tipo para cada uno de los métodos
probados, así como el promedio del porcentaje recuperación (%R).
Parámetro EAA β-galactosidasa Luciferasa Wagtech Arsenator Digital
Intervalo de
linealidad r=0.9998 0-1 µM r=0.9973 0-1 µM r=0.9989 0-1 µM r=0.9995 0-1 µM
Intervalo de
Trabajo r=0.9998 5-74.57
µg/L r=0.9973 0.15 -0.24 Abs r=0.9989
4.82E+05 - 1.57E+06
URL r=0.9995 9.5-74. 41
µg/L
YB -0.0302 0.1297 2.31E+05 -0.0919 S 74.5741 0.1042 1.34E+06 74.41
S y/x 0.6147 0.0031 2.52E+04 0.9794 LD 0.0247 0.0883 0.0563 0.0395 LC 0.0824 0.2945 0.1876 0.1316 Ld 0.0495 0.1797 0.1125 0.079
Xprom, Yprom 0. 3938, 29.33 0.3938, 0.1707 0.3938, 7.59E+05 0.3938, 29.2083
Tabla 4 Comparación de métodos analíticos, empleando pruebas iníciales de desempeño, con un nivel de confianza de p= 0.05 con n-2 grados de libertad.
51
Muestras Biosensor β-
galactosidasa µg/L
Biosensor Luciferasa
µg/L Arsenator
µg/L EAA µg/L
M1 6.1 6.1 5 6.2 M2 0 0 0 0 M3 12.8 12.9 10.9 13 M4 1.1 1.15 0 1.2 M5 0 0 1 0 M6 0 0 0 0.005 M7 7.2 7.38 10 7.4 M8 0 0 6 0.005 M9 0 0 9 0.005
M10 354.6 355 353 355.9 M11 6.1 6.15 6 6.2 M12 0 0 0 0.005 M13 0 0 0 0.005 M14 42.8 43.5 44 43.9 M15 19.8 20 22 20.5 M16 23.1 23.9 22 24.3 M17 29.2 29.3 31 29.7 M18 26.8 26.8 26 27.2 M19 42.8 43 44 43.1 M20 120 120.02 13 12.08 M21 110 110.24 10 11.36 M22 58 60 59 61 M23 71 71 70 72 M24 99.6 100 95 101.3 M25 95.8 96.1 92 96.9 M26 71.9 70.8 69 72.4 P6 49 48.5 49 50
P10 49.2 48.9 49 50 P23 68.45 69.1 67 69 P32 74.6 74.8 74 75 P65 58.2 58.7 57 59
Tabla 5 Resultados obtenidos de las muestras problemas, mediante la interpolación en las curvas tipo para cada método empleado.
52
% Recuperación Promedio
MÉTODOS β-galactosidasa Luciferasa Arsenator
98.36±1.82 99.01±1.03 98.10±9.25
6.7 PRUEBA SEMICUANTITATIVA PARA LA DETECCIÓN DE ARSÉNICO EN AGUA EN CAMPO. Las determinaciones que se muestran a continuación se realizaron con
soluciones de concentración conocida de arsénico, un aumento en la
intensidad de color azul debido a la actividad de la β-galactosidasa sobre la
molécula de Xgal (Fig. 28).
Tabla 6 Promedio del porcentaje de recuperación (%R) para cada uno de los métodos probados.
Fig .28 A Prueba semicuantitativa para la detección de arsénico en agua empleando tiras de papel impregnadas con la cepa de E. coli pJAMA-arsR-ABS a diferentes concentraciones, A) 1.5 µL células y 20 µL Xgal (1mg/mL), B) 1.5 µL células y 20 µL Xgal (5mg/mL), C) 3 µL células y 20 µL Xgal (1mg/mL).
53
Fig .28B Prueba semicuantitativa para la detección de arsénico en agua empleando tiras de papel impregnadas con la cepa de E. coli pJAMA-arsR-ABS a diferentes concentracionesD) 3 µL células y 20 µL Xgal (5mg/mL), E) 9 µL células y 20 µL Xgal (1mg/mL), F) 9 µL células y 20 µL Xgal (5mg/mL).
54
7 DISCUSIÓN La presencia de arsénico en altas concentraciones en el agua de consumo, ha
traído como consecuencia que se desarrollen técnicas para evaluar las
concentraciones de este elemento, estas como ya se mencionaron pueden ser
por análisis químicos (EAA, Kits y el Wagtech Arsenator Digital) sin embargo,
estas presentan la formación de sustancias tóxicas como la arsina. Por otro
lado, el desarrollo de las ingeniería genética y la creación de biosensores ha
revolucionado la forma de llevar a cabo la evaluación de ciertos compuestos;
así aprovechando la capacidad que tiene E.coli de ser resistente a la presencia
de arsénico fue que Van Der Meer et al., (2004) desarrollaron dos cepas
modificadas genéticamente para utilizarlas en la cuantificación de arsénico en
agua. En este trabajo se llevó a cabo la adecuación del uso de estas bajo
nuestras condiciones de trabajo y se hizo una comparación con los métodos
químicos.
Los cambios realizados al método propuesto por Van Der Meer et al.,(2004)
para trabajar con la cepa de E. coli pMV132-arsR-ABS, que tiene a la β-
galactosidasa como proteína reportera, se presentan a continuación:
Variables
β-galactosidasa
MÉTODO ORIGINAL MÉTODO MODIFICADO
Tiempo de incubación
con el biosensor y la
muestra
60 minutos 120 minutos
Adición de SDS al 0.1
% 40 µL Sin SDS
Tiempo de incubación
después de la
permeabilización
20 minutos a
temperatura ambiente
30 minutos a temperatura
ambiente
Tiempo de incubación
tras la adición del
ONPG
Hasta la aparición de
color 10 minutos
55
Se sabe que el SDS afecta a las proteínas desnaturalizándolas, debido al
rompimiento de enlaces no covalentes, provocando que las proteínas pierdan
su conformación nativa, en este caso podría estar inhibiendo la actividad de la
β-galactosidasa (Garay et al., 2008).
Al comparar los parámetros estadísticos del método del biosensor con β-
galactosidasa con los del método de EAA podemos observar que la recta
obtenida para él primero, presentó un intervalo de trabajo con una r=0.9973 de
0 a 1 µM, mientras que la del método de EAA presentó un intervalo de
linealidad con una r=0.9998. Cumpliendo ambas con el requisito de ser lineales
en un intervalo de concentración (Miller y Miller, 1993).
Por otro lado, tenemos que el intervalo de trabajo para el biosensor con β-
galactosidasa es de 0.15 a 0.24 unidades de absorbancia, siendo mucho
mayor el de EAA por lo que éste último nos permite trabajar con muestras con
baja o alta concentración de arsénico sin la necesidad de concentrarlas o
diluirlas (Miller y Miller, 2002).
Otro de los parámetros a evaluar fue la desviación de estándar de la recta
(Sy/x), como su nombre indica este valor nos permite ver la dispersión de los
puntos en la recta; además nos es útil para poder obtener con un nivel de
confianza aceptable para los valores de YB (la ordenada de origen), y así como
su sensibilidad (S), representada por la pendiente ,si observamos estos
parámetros para el método de EAA, veremos que el valor de Sy/x es bajo
teniendo en cuenta que la sensibilidad es muy alta (74.57±0.61); así como que
la ordenada al origen que pasa por el cero(-0.0302), lo cual es indicativo de
que este método no presenta ningún tipo de absorción de fondo es decir, la
lectura arrojada por el blanco es cero y por lo tanto no hay ningún componente
que pueda darnos una señal extra que la presentada por el blanco (Miller y
Miller, 2002).
56
Si comparamos los valores para el método de β-galactosidasa, YB (0.1297) y S
(0.1042±0.003) lo que indica que el método presenta baja sensibilidad así
como una absorción de fondo propia del blanco. Los límites de detección (LD),
de cuantificación (LC), de decisión y centro de gravedad de la recta
(Xprom,Yprom); nos indican que el método EAA es más confiable que el biosensor
de β-galactosidasa, ya que para este los valores son más altos, demostrando
que este último es menos sensible (Miller y Miller, 1993).
Para el método propuesto por Stocker et al., (2003) empleando la cepa de E.
coli pJAMA-arsR-ABS que contiene a la luciferasa, se realizaron dos
modificaciones las cuales se muestran a continuación:
Al comparar los parámetros estadísticos de este, con los de EAA se determinó
que para el intervalo de linealidad para este método es menor que el que
presenta la EAA, sin embargo ambas curvas son lineales en un intervalo de
concentración de 0 a 1 µM. Por otra parte el intervalo de trabajo para el método
de la luciferasa fue de 4.82x 105 a 1.57 x 106 URL (unidades que representa la
cantidad de luz generada por la reacción de oxidación entre la luciferasa y el n-
decanal), comparando este valor con el método de EAA este ultimo presenta
un intervalo de trabajo amplio.
Variables
Luciferasa MÉTODO ORIGINAL MÉTODO MODIFICADO
Adición de células Células sin diluir Células diluidas 1:2.5
Tiempo de incubación con el
biosensor y la muestra 30 minutos a 35°C 120 minutos a 30°C
57
El valor de Sy/x para el método de EAA, es bajo, teniendo en cuenta que su
sensibilidad es muy alta (74.57±0.61); la ordenada al origen pasa por el cero.
Comparando estos valores para el método de luciferasa, YB (2.31x 105) y S
(1.34x 106±2.52x 104), el método presenta una alta sensibilidad pero presenta
una absorción de fondo. Los parámetros LD, LC, Ld y (Xprom,Yprom); nos indica
que el valor el método de EAA, es más confiable que el biosensor de
luciferasa, ya que estos valores son altos (Miller y Miller, 2002).
Para el método Wagtech Arsenator digital, presenta valores muy similares a los
encontrados con el método de EAA, lo que sugiere, que este método presenta
un intervalo de linealidad muy buena, además de tener un intervalo de trabajo
amplio así como poseer una alta sensibilidad y tiene la capacidad de medir
pequeños cantidades de analito (Miller y Miller, 2002).
Los porcentajes del recuperación obtenidas de las muestras (%R) refiriéndose
al cociente del valor obtenido experimentalmente y el valor de referencia de las
muestras probadas, tomando este como el valor obtenido por el EAA,
observamos que dichos porcentajes son muy similares entre los métodos
empleados con biosensores y así como el método Wagtech Arsenator digital, lo
que nos indica que el valor obtenido experimentalmente se aproxima al valor
de referencia (Quattrocchi et al., 1992).
De las veinte y seis muestras que se analizaron, veinte y cuatro dieron positivo
a la presencia de arsénico (tabla 6); las muestras M10, M14, M17, M18, M19
así como P6, P10, P23, P32 y P65 presentan concentraciones de arsénico por
encima de lo estipulado por la norma, las muestras provienen del estado de
Torreón Coahuila, aquí se dedican a la extracción de plomo, plata, zinc, oro y
cadmio en los cuales el arsénico se encuentra unido a estos elementos, demás
que se han reportado casos de intoxicación de arsénico (Bucio, 2004).
58
Las muestras M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8, M9, M11,M12 y M13
representan concentraciones de arsénico que están por debajo de la norma
oficial mexicana (NOM-127-SSA1-1994), aun así estas pequeñas cantidades
nos indica un aumento incontrolado en la población así como un aumento en la
creación de nuevas industrias, afectando seriamente la calidad del medio
ambiente y representando un riesgo para la salud humana (Morton et al.,
2009). La muestra M10 se encontró una concentración alta de arsénico (355
µg/L) que supera los límites permisibles en la norma oficial mexicana, dicha
concentración se debe a que dicha muestra proviene de aguas con actividad
geotermal en donde hay una predominancia por el azufre, el cual es un
elemento muy afín al arsénico (Ferguson y Galvis, 1972; Instituto de Geología
2000).
En la prueba semicuantitativa, utilizando la cepa de E. coli pJAMA-arsR-ABS,
se observa en la figura 27D, las cantidades necesarias para obtener una
escala de color, cuya intensidad aumenta conforme se incrementaba la
concentración de arsénico, fue de 3µL de células mas 20 µL de Xgal a una
concentración de 5 mg/mL, la mezcla de soportes nos brindo una preservación
del biosensor, para que este fuera capaz de resistir el estrés causado por la
desecación (Bjerkettorp et al.,2006), evitando así que perdiera su viabilidad y
su capacidad de reaccionar con el arsénico contendía en el agua. Este tipo de
pruebas nos será de gran utilidad ya que esta será aplicada en muestras de
campo, sin la necesidad de emplear equipos sofisticados y costosos.
59
Ya se ha observado que el método de EAA y Wagtech Arsenator digital
presentan varias ventajas competitivas con respecto a otros métodos mediante
el análisis estadístico de su recta, sin embargo hay que considerar algunos
aspectos técnicos tales como, que en ocasiones la disponibilidad del equipo es
muy difícil de tener ya que estos en la mayoría de los casos son muy costosos
además generan desechos muy tóxicos tanto para el hombre como al medio
ambiente, en estos métodos se tiene que realizar tratamientos previos a las
muestras lo que dificulta la obtención de resultados. Considerando todo esto es
conveniente el uso de biosensores ya estos a pesar de sus desventajas ya
mencionadas esos nos dan resultados similares con respecto al EAA y
Wagtech Arsenator digital (ver tabla 6), además estos no generan desechos
tóxicos para el hombre y son menos costos (Strosnider, 2003).
60
8 CONCLUSIONES
Se establecieron las condiciones optimas para la cuantificación de arsénico en
agua de una manera rápida, eficaz y segura con las cepas E. coli pMV132-
arsR-ABS y E. coli pJAMA-arsR-ABS.
El método empleado para la cuantificación de arsénico en agua usando la cepa
de E. coli pJAMA-arsR-ABS posee una buena sensibilidad comparándola con
el método marcado por la norma oficial mexicana.
Las determinaciones de arsénico en las nuestras problema nos dio respuestas
equiparables con los métodos usados por la norma oficial mexicana.
Se desarrollo pruebas semicuantitativas, para la detección de arsénico para ser
aplicados en muestras de campo empleando la cepa de cepas E. coli pMV132-
arsR-ABS.
61
9 PERSPECTIVAS
Aun se requiere hacer más estudios, acerca de la prueba semicuantitativa para la
detección de arsénico en agua en muestras de campo. Por ello se recomienda
establecer una escala de colores a diferentes concentraciones de arsénico a su
vez usando cálculos de matrices para poder predecir las mejores combinaciones
de color, lo que nos permitirá saber la concentración aproximada que tiene la
muestra. También sería ideal establecer una prueba cuantitativa usando las tiras
de papel impregnadas con el biosensor, diseñando un método colorimétrico y así
saber la concentración exacta en la muestra problema.
62
10 ANEXO
MEDIOS DE CULTIVO
Medio de cultivo Luria (L)
Peptona de caseína 10.0 g
Extracto de levadura 5.0 g
NaCl 10.0 g
H2O destilada 1000 mL
pH 7.0-7.2
• Disolver los componentes uno a uno en agua destilada.
• Ajustar el pH 7.0 – 7.2 con NaOH.
• Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
• Para preparar medio sólido adicionar agar a una concentración del 1.5%
• Aforar y esterilizar.
Cuando se requiera medio L con antibióticos:
• Esterilizar por filtración los antibióticos.
• Adicionar los antibióticos al medio de cultivo estéril y enfriado a 75°C
aproximadamente.
• Las concentraciones finales de los antibióticos son:
Ampicilina 50 µg/mL
Tetraciclina 10 µg/mL
Kanamicina 25 µg/mL
63
REACTIVOS Regulador P (5 mM) pH 7
NaH2PO4•H2O 0. 69 g
Na2HPO4•7 H2O 1. 34 g
H2O desionizada 1000 mL
• Disolver los componentes uno a uno en agua destilada.
• Ajustar el pH 7.0 con NaOH.
• Esterilizar por filtración.
Regulador Z pH 7
NaH2PO4• H2O 5.5 g
Na2HPO4•7 H2O 16.1 g
KCl 0.75 g
MgSO4•7 H2O 0.246 g
β-mercaptoetanol 2.7 mL
H2O desionizada 1000 mL
• Disolver los componentes uno a uno en agua destilada.
• Ajustar el pH 7.0 con NaOH.
• Esterilizar por filtración.
ONPG (o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido) 4 mg /mL
Pesar 0.08 g de ONPG y disolverlo en 2 mL de regulador p, conservar en
refrigeración a 4°C.
64
SDS (Dodecil Suldato deSodio) al 1%. Pesar 1 g de SDS y aforar a un volumen final de 100 mL con agua desionizada. SDS (Dodecil Suldato deSodio) al 0.1% Tomar un mL de la solución de SDS al 1% y aforar aun un volumen final de 100 mL Carbonato de sodio 1M Pesar 117 g de carbonato de sodio y disolverlo en 1000 mL de agua
desionizada.
Xgal (5-bromo-4-cloro-3-indolil β-galactósido) 5 mg/mL.
Pesar 10 mg de Xgal en un tubo eppendorf de 2 mL, posteriormente adicionar
1mL de dimetilformamida, mezclar y cubrir el tubo con papel aluminio,
almacenar a – 20°C.
IPTG (Isopropil-β-D-tiogalactosido) 100 mM.
Pesar 0.23 g de IPTG, disolverlo en 10 mL de agua desionizada, esterilizar por
filtración y conservar en alícuotas de 1 mL en congelación.
Reactivo para realizar la reacción de luciferasa
N-Decanal 2 mM en etanol/agua (50% v/v)
Se realiza una solución 0.2 M (tomar 3.9 mL de n-decanal puro y aforar a 100
mL con una mezcla etanol/agua 50% v/v). Tomar un mL y aforar a 100 mL con
una mezcla de etanol / agua 50% v/v.
65
Reactivos Wagtech Arsenator Digital Reactivo A1
Ácido Sulfámico (NH2SO3H) 1.0 g
Reactivo A2
Borohidruro de sodio (NaBH4) 3.0 g
PARÁMETROS ESTADÍSTICOS EMPLEADOS Coeficiente de correlación: Donde:
𝑥𝑥𝑥𝑥, 𝑦𝑦𝑥𝑥= Puntos individuales de la recta.
�̅�𝑥 = Promedio de los valores de 𝑥𝑥𝑥𝑥
𝑦𝑦� = Promedio de los valores de 𝑦𝑦𝑥𝑥
Pendiente de la recta de mínimos cuadrados:
Donde:
𝑥𝑥𝑥𝑥, 𝑦𝑦𝑥𝑥= Puntos individuales de la recta.
�̅�𝑥 = Promedio de los valores de 𝑥𝑥𝑥𝑥
𝑦𝑦� = Promedio de los valores de 𝑦𝑦𝑥𝑥
66
Ordenada en el origen de la recta de mínimos cuadrados:
�̅�𝑥 = Promedio de los valores de 𝑥𝑥𝑥𝑥
𝑦𝑦� = Promedio de los valores de 𝑦𝑦𝑥𝑥
𝑏𝑏 = Pendiente de la recta
Error estándar de la regresión
Donde:
n-2= grados de libertad
Desviación estándar de la pendiente:
67
Desviación estándar de la ordenada en el origen:
Limite de detección (LD)= YB + 3SB
Limite de cuantificación (LC) = YB + 10 SB
Limite de decisión (Ld)= YB + 6 SB
Donde:
YB= Lectura del blanco
SB= Desviación estándar del blanco.
68
Tabla de distribución de t
69
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