inmunologia veterinaria
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I. INTRODUCCIÓN
Técnica para identificación y cuantificación de cualquiera de las
inmunoglobulinas. Se basa en la presencia de un precipitado visible,
resultado de la combinación antígeno-anticuerpo en determinadas
circunstancias.
Por medio de la Inmunodifusión Doble de Ouchterlony se pueden realizar
análisis cualitativos y cuantitativos de antígenos y anticuerpos en una
solución, mediante una inmunoprecipitación en gel de agarosa.
Cabe destacar que existen dos tipos de inmunodifusión, doble o simple; en
la inmunodifusión simple se mantiene fijo el antígeno o el anticuerpo; en la
inmunodifusión doble, ambos, antígeno y anticuerpo, están libres para
difundir (de forma radial o lineal) hacia el otro y formar un precipitado.
La técnica consiste en colocar en una placa de petri con gel de agarosa
distintas soluciones de Ag/Ac y se las deja difundir libremente; en la región
donde los gradientes de difusión se encuentran en proporciones de
equivalencia se forma un precipitado que se visualiza como una banda
opaca en el gel.
La precipitación ocurre, debido a la formación de complejos antígeno-
anticuerpo en una proporción justa en la cual se forma una gran matriz de
agregados (punto de equivalencia), por lo cual precipitan dando bandas.
La inmunodifusión radial es una técnica que permite la cuantificación de
antígenos. En esta técnica, el antígeno se aplica sobre unos pocillos
realizados en el gel de agarosa que contiene una concentración fijada de
antisuero específico. El antisuero específico es un suero sanguíneo que
contiene anticuerpos contra el antígeno que queremos cuantificar.
II. OBJETIVO
INMUNODIFUSIÓN DOBLE
El objetivo es el de realizar una inmunodifusión doble entre muestras de
albúmina bovina y caprina y el suero anti-albúmina bovina.
INMUNODIFUSIÓN RADIAL
Comprender la naturaleza de la reacción antígeno-anticuerpo in vitro.
Conocer los factores que intervienen en la reacción Ag-Ac y la forma en que afectan el resultado final.
Conocer la diferencia entre la reacción primaria y las reacciones secundarias.
Conocer los diferentes tipos de reacciones secundarias, sus ventajas, desventajas y sus aplicaciones.
El objetivo de la práctica es el de cuantificar por inmunodifusión radial la
concentración de inmunoglobulinas en suero sanguíneo bovino.
III. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
INMUNODIFUSIÓN
La inmunodifusión se basa en la formación de bandas de precipitación Ag-
Ac en medios semisólidos (generalmente de agarosa).
La formación de inmunocomplejos se ve afectada por variables como: pH,
temperatura, fuerza iónica del medio, características propias del Ac como
afinidad y avidez y, la más importante, la concentración relativa de Ag y Ac.
La zona óptima de concentración para la formación del precipitado Ag-Ac se
llama zona de equivalencia.
La inmunodifusión puede ser simple (sólo se mueve el Ag o el Ac) o doble
(se mueven Ag y Ac).
Para visualizar el resultado de la inmunodifusión, una vez terminada la
difusión se lava el gel y se tiñe con colorantes para proteínas (ej. Negro
amido o azul brillante de Coomassie).
La inmunodifusión se puede clasificar atendiendo a distintos criterios. Entre
otras modalidades podemos hablar de:
a. INMUNODIFUSIÓN RADIAL: en este caso se añade un antisuero
específico a la agarosa que, a su vez, se vierte sobre placas. Se forman
pozos en el gel y se colocan en ellos estándares de proteínas y problemas
(antígenos). El antígeno difunde en el gel durante varias horas y va
reaccionando con el Ac. Em la zona de equivalencia se produce un anillo de
precipitación.
TÉCNICA:
El antígeno en suspensión se mezcla con agar-agar en estado líquido y
luego éste se vierte sobre una placa (generalmente un portaobjetos de
microscopía). Una vez solidificado, con una pipeta Pasteur se hacen
agujeros (pocillos) que contendrán la muestra de suero. Se deja incubar de
modo que el suero con anticuerpos se difunde por la placa de agar y
reacciona con el antígeno embebido en la placa. Al cabo de 24 horas se ha
creado un precipitado fruto de la reacción entre antígeno y anticuerpo que
se muestra en la placa como una línea blanca rodeando al pocillo (en
ocasiones se pueden aplicar tintes para facilitar su visionado). El diámetro
de este círculo es un reflejo de la concentración de anticuerpos que
teníamos en la muestra de suero, de modo que a mayor diámetro, mayor
concentración de anticuerpo.
Para cuantificar la cantidad exacta de anticuerpos es preciso disponer de
una recta estándar o patrón previamente creada. Esta recta se hace a partir
de muestras de anticuerpos conocidas en cada pocillo, que reaccionan con
el antígeno; en el eje x el área del círculo y en el eje y la concentración de
anticuerpos conocida. Al final se comparan los valores obtenidos de la
muestra de suero frente a los valores de la recta patrón, obteniendo así el
valor de la concentración de anticuerpos para cada muestra de suero del
individuo.
Del mismo modo, se puede calcular mediante una metodología análoga la
cantidad de antígeno presente en una muestra, embebiendo esta vez en
agar anticuerpo y creando la recta patrón en base a concentraciones
conocidas de antígeno. y también se une a la inmunoglobulina M
b. INMUNODIFUSIÓN DOBLE O TÉCNICA DE OUCHTERLONY: se forman
pozos en el gel de agarosa, generalmente en patrón de roseta. Se
depositan antisueros específicos en los pozos centrales y los estándares de
proteínas y los problemas en los pozos circundantes. Al difundir las
muestras en el gel, donde el anticuerpo y el antígeno alcanzan la
equivalencia, se forman bandas de precipitados insolubles. La posición y
forma de la banda se determinan según la concentración del antígeno y del
anticuerpo, y sus tamaños. La distancia de las bandas con respecto al
anticuerpo es directamente proporcional a la cantidad de antígeno presente.
PROCEDIMIENTO:
Sobre una placa con gel se corta una serie de hoyos con atención a la
geometría entre un hoyo y los demás. Se coloca un extracto de células
humanas (extraídas de tejido de las amígdalas) en el pocillo del centro. Este
extracto contiene un cóctel de antígenos humanos naturales que se quiere
obtener. El suero sanguíneo del paciente es colocado luego en uno de los
pocillos exteriores y la placa se deja por 48 horas para su revelado. Durante
este tiempo, los antígenos de las amígdalas y los anticuerpos en el pocillo
del suero migrarán de manera radial hacia afuera de sus respectivos
pocillos. Al encontrarse ambos a mitad de camino y, de haber anticuerpos
en contra de los antígenos tonsilares, se unirán en una red de enlaces
llamado complejo inmune, el cual precipita en el gel revelando una línea
blanquecina.
PRINCIPIO:
La precipitación ocurre con la mayoría de los antígenos, debido a que éstos
tienden a ser multivalente, es decir, tienen varios determinantes antigénicos
por molécula, al que los anticuerpos pueden enlazarse. Cada anticuerpo, a
su vez, tiene por lo menos dos sitios de unión para los antígenos, de modo
que se entrecruzan formando una gran matriz de agregados
antígeno:anticuerpo.
Experimentalmente, una cantidad de antígeno se añade de manera
incrementada a una cantidad constante de anticuerpo en solución.
Inicialmente, a una baja concentración, todo el antígeno participa en el
precipitado, lo cual se conoce como una zona de exceso de anticuerpo o
fenómeno de prozona.
A medida que se añade más antígeno, la cantidad de proteína que
precipita, aumenta hasta que las moléculas de antígeno:anticuerpo
alcanzan una proporción óptima, llamada zona de equivalencia.
La zona de exceso se logra cuando la concentración del antígeno excede a
la de los anticuerpos, y la cantidad de precipitación disminuye.
INTERPRETACIÓN:
El precipitado que se forma al combinarse el antígeno con los anticuerpos
pueden forman una línea continua llamada identidad completa, una línea
continua con un espolón en un lado llamado línea de identidad parcial, o
bien dos líneas que se entrecruzan llamadas líneas de no-identidad. El tipo
de línea que se forma dictará si el paciente tiene alguna forma del
anticuerpo que puede estar asociado a un proceso de enfermedad.
Inconvenientes de la inmunodifusión:
1. Es necesario que las concentraciones de Ag y Ac sean similares o
de lo contrario no se alcanza la equivalencia y no se forma el
precipitado. El precipitado solo se forma en el punto de equivalencia
o cuando hay un ligero exceso de Ag.
2. Las moléculas más pequeñas migran con más rapidez que las de
gran tamaño y conforme la migración continúa el precipitado puede
re disolverse y volverse a formar de acuerdo con los cambios de
concentración de Ag o Ac en el gel.
3. Si hay grandes cantidades de Ac, el antígeno no se difunde muy
lejos antes de alcanzar la equivalencia y el anillo es más grueso o
espeso.
IV. BIBLIOGRAFÍA
Morilla, A., Bautista, C., 1986. Manual de Inmunología pag. 51 - 62.
Alonso et al. 1992. Manual de diagnóstico de laboratorio de las enfermedades vesiculares.
La INMUNODIFUSIÓN DOBLE DE OUCHTERLONY es un método inmunológico sencillo y rutinariamente usado en el laboratorio clínico para la detección de antígenos o anticuerpos en una muestra biológica. Es considerado el proceso estándar para la detección de Antígenos Nucleares Extraibles (ENA).
PROCEDIMIENTOSobre una placa con gel se corta una serie de hoyos con atención a la geometría entre un hoyo y los demás. Se coloca un extracto de células humanas (extraídas de tejido de las amígdalas) en el pocillo del centro. Este extracto contiene un cóctel de antígenos humanos naturales que se quiere obtener. El suero sanguíneo del paciente es colocado luego en uno de los pocillos exteriores y la placa se deja por 48 horas para su revelado. Durante este tiempo, los antígenos de las amígdalas y los anticuerpos en el pocillo del suero migrarán de manera radial hacia afuera de sus respectivos pocillos. Al encontrarse ambos a mitad de camino y, de haber anticuerpos en contra de los antígenos tonsilares, se unirán en una red de enlaces llamado complejo inmune, el cual precipita en el gel revelando una línea blanquecina.PRINCIPIO
La precipitación ocurre con la mayoría de los antígenos, debido a que éstos tienden a ser multivalente, es decir, tienen varios determinantes antigénicos por molécula, al que los anticuerpos pueden enlazarse. Cada anticuerpo, a su vez, tiene por lo menos dos sitios de unión para los antígenos, de modo que se entrecruzan formando una gran matriz de agregados antígeno:anticuerpo.
Experimentalmente, una cantidad de antígeno se añade de manera incrementada a una cantidad constante de anticuerpo en solución. Inicialmente, a una baja concentración, todo el antígeno participa en el precipitado, lo cual se conoce como una zona de exceso de anticuerpo o fenómeno de prozona.
A medida que se añade más antígeno, la cantidad de proteína que precipita, aumenta hasta que las moléculas de antígeno:anticuerpo alcanzan una proporción óptima, llamada zona de equivalencia.
La zona de exceso se logra cuando la concentración del antígeno excede a la de los anticuerpos, y la cantidad de precipitación disminuye.
INTERPRETACIÓN:El precipitado que se forma al combinarse el antígeno con los anticuerpos pueden forman una línea continua llamada identidad completa, una línea continua con un espolón en un lado llamado línea de identidad parcial, o bien dos líneas que se entrecruzan llamadas líneas de no-identidad. El tipo de línea que se forma dictará si el paciente tiene alguna forma del anticuerpo que puede estar asociado a un proceso de enfermedad.
La INMUNODIFUSIÓN RADIAL es una técnica de análisis inmunológico de tipo cuantitativo. Se utiliza para detectar la cantidad de anticuerpos IgG, IgM e IgA que hay en el suero de un individuo.
La técnica de inmunodifusión radial es lenta y poco sensible ya que necesita mucha cantidad de anticuerpos (o antígeno) para que se formen complejos.
TÉCNICA:
El antígeno en suspensión se mezcla con agar-agar en estado líquido y luego éste se vierte sobre una placa (generalmente un portaobjetos de microscopía). Una vez solidificado, con una pipeta Pasteur se hacen agujeros (pocillos) que contendrán la muestra de suero. Se deja incubar de modo que el suero con anticuerpos se difunde por la placa de agar y reacciona con el antígeno embebido en la placa. Al cabo de 24 horas se ha creado un precipitado fruto de la reacción entre antígeno y anticuerpo que se muestra en la placa como una línea blanca rodeando al pocillo (en ocasiones se pueden aplicar tintes para facilitar su visionado). El diámetro de este círculo es un reflejo de la concentración de anticuerpos que teníamos en la muestra de suero, de modo que a mayor diámetro, mayor concentración de anticuerpo.
Para cuantificar la cantidad exacta de anticuerpos es preciso disponer de una recta estándar o patrón previamente creada. Esta recta se hace a partir de muestras de anticuerpos conocidas en cada pocillo, que reaccionan con el antígeno; en el eje x el área del círculo y en el eje y la concentración de anticuerpos conocida. Al final se comparan los valores obtenidos de la muestra de suero frente a los valores de la recta patrón, obteniendo así el valor de la concentración de anticuerpos para cada muestra de suero del individuo.
Del mismo modo, se puede calcular mediante una metodología análoga la cantidad de antígeno presente en una muestra, embebiendo esta vez en agar anticuerpo y creando la recta patrón en base a concentraciones conocidas de antígeno. y también se une a la inmunoglobulina M